CN108138047B - 稳定剂以及稳定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是提供一种8‑氨基‑5‑氯‑7‑苯基吡啶并[3,4‑d]哒嗪‑1,4(2H,3H)‑二酮(L‑012)或它的盐的稳定剂等，通过在L‑012或它的盐中共存，在测定时不会造成不良影响，而且能够抑制曝光引起的检测灵敏度的下降。本发明涉及由通式[1]表示的L‑012或它的盐的稳定剂以及使该稳定剂在L‑012或它的盐中共存的L‑012或它的盐稳定化的方法等。在通式[1]中，p个M1分别独立地代表氢原子或碱金属原子，q个R1分别独立地代表羟基或磺酸基，m代表0或1，p代表整数1～3，q代表整数0～4，Y代表氮原子或CH基(次甲基)，Z代表特定结构的芳基或特定结构的吡唑基，通式[1]：

Description

稳定剂以及稳定化方法
技术领域
本发明涉及8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(下面，有时简写为L-012)或其盐的稳定剂、稳定化方法、组合物以及发光检测用试剂盒。
背景技术
基于化学发光反应的分析方法能够进行高灵敏度测定，因此，其作为免疫学领域的测定体系，一直很火热地推进研究。在用酶标定的抗原、抗体等的酶免疫测定法中，化学发光反应被用于测定酶活性，作为化学发光物质使用的是鲁米诺、异鲁米诺等鲁米诺衍生物。由于对生物体内仅微量存在的物质进行定量时需要以高灵敏度检出目标物，因此鲁米诺、鲁米诺衍生物作为具有优异的化学发光量子产率的化合物而被广泛使用。
另一方面，L-012(或它的盐)的发光强度比鲁米诺高10倍以上(例如非专利文献1)，已有用其来定量测定碱性成纤维细胞生长因子(例如非专利文献2)、检出和定量超氧自由基(例如非专利文献3)等的报道例。因此，L-012(或它的盐)作为代替鲁米诺的优异的化学发光物质，备受关注。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：今田等,生化学,第69卷,第7号,3423(1997)。
非专利文献2：Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.193,540-545(1993)。
非专利文献3：Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.193,554-559(1993)。
发明内容
发明要解决的课题
然而，L-012或它的盐存在的问题是，当其暴露于自然光(例如太阳光)或人造光(例如来自荧光灯的光)时检测灵敏度会下降。因此，对于采用L-012或它的盐的测定体系，在含L-012或它的盐的测定试剂的制造过程中或在使用该测定试剂时，有可能会由于暴露于上述自然光或人造光(曝光)而导致检测灵敏度下降、测定值产生误差。基于这些原因，当下期望开发一种在测定时不产生不良影响而且能够抑制因曝光而导致的检测灵敏度下降的L-012及其盐的稳定剂。
本发明是鉴于上述的状况而完成的，本发明提供一种稳定剂，其在测定时不产生不良影响而且能够抑制因曝光而导致的含L-012或它的盐的检测溶液(发光底物液)的检测灵敏度下降的现象。
解决课题的手段
本发明的构成如下。
(1)一种8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(L-012)或它的盐的稳定剂(下面，有时简写为本发明的稳定剂)，其中，其是由通式[1]表示。
通式[1]：
Figure GDA0001891102010000021
(式中，p个M1分别独立地代表氢原子或碱金属原子，q个R1分别独立地代表羟基或由通式[A]表示的磺酸基，m代表0或1，p代表整数1～3，q代表整数0～4，Y代表氮原子或CH基(次甲基)，Z代表由通式[Z-1]表示的基团、由通式[Z-2]表示的基团或由通式[Z-3]表示的基团。)
通式[A]：
Figure GDA0001891102010000022
(式中，M2代表氢原子或碱金属原子。)
通式[Z-1]：
Figure GDA0001891102010000031
(式中，r个R2分别独立地代表羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基，R3代表氢原子或羟基，R4代表氢原子或由上述通式[A]表示的磺酸基，R5代表氢原子、由式[B]表示的苯基氨基或由通式[C]表示的萘基偶氮基，n代表0或1，r代表整数0～4。)
式[B]：
Figure GDA0001891102010000032
通式[C]：
Figure GDA0001891102010000033
(式中，R12～R14分别独立地代表氢原子、羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基。)
通式[Z-2]：
Figure GDA0001891102010000034
(式中，R6～R9分别独立地代表氢原子、羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基。)
通式[Z-3]：
Figure GDA0001891102010000035
(式中，R10代表氢原子或由通式[D]表示的羧酸基，s个R11分别独立地代表羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基，s代表整数0～5。)
通式[D]：
Figure GDA0001891102010000041
(式中，M3代表氢原子或碱金属原子。)
(2)一种8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(L-012)或它的盐的稳定化方法(下面，有时简写为本发明的稳定化方法)，其中，其使由通式[1]表示的化合物在8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(L-012)或其盐中共存。
通式[1]：
Figure GDA0001891102010000042
(式中，p个M1分别独立地代表氢原子或碱金属原子，q个R1分别独立地代表羟基或由通式[A]表示的磺酸基，m代表0或1，p代表整数1～3，q代表整数0～4，Y代表氮原子或CH基(次甲基)，Z代表由通式[Z-1]表示的基团、由通式[Z-2]表示的基团或由通式[Z-3]表示的基团。)
通式[A]：
Figure GDA0001891102010000043
(式中，M2代表氢原子或碱金属原子。)
通式[Z-1]：
Figure GDA0001891102010000044
(式中，r个R2分别独立地代表羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基，R3代表氢原子或羟基，R4代表氢原子或由上述通式[A]表示的磺酸基，R5代表氢原子、由式[B]表示的苯基氨基或由通式[C]表示的萘基偶氮基，n代表0或1，r代表整数0～4。)
式[B]：
Figure GDA0001891102010000051
通式[C]：
Figure GDA0001891102010000052
(式中，R12～R14分别独立地代表氢原子、羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基。)
通式[Z-2]：
Figure GDA0001891102010000053
(式中，R6～R9分别独立地代表氢原子、羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基。)
通式[Z-3]：
Figure GDA0001891102010000054
(式中，R10代表氢原子或由通式[D]表示的羧酸基，s个R11分别独立地代表羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基，s代表整数0～5。)
通式[D]：
Figure GDA0001891102010000055
(式中，M3代表氢原子或碱金属原子。)
(3)一种组合物(下面，有时简写为本发明的组合物)，其中，其含有8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(L-012)和由上述通式[1]表示的化合物、或者含有8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(L-012)的盐和由上述通式[1]表示的化合物。
(4)一种发光检测用试剂盒(下面，有时简写为本发明的发光检测用试剂盒)，其中，其含有8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(L-012)和由上述通式[1]表示的化合物、或者含有8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(L-012)的盐和由上述通式[1]表示的化合物。
发明的效果
本发明的稳定剂是具有偶氮基和苯磺酸基或具有亚氨基和苯磺酸基的特定结构的化合物，通过使本发明的稳定剂在L-012或它的盐中共存，从而能够在保持L-012或它的盐自身具有的发光量的同时抑制由于光而引起的分解(劣化)等所导致的L-012或它的盐的发光强度的减弱(检测灵敏度的下降)。
另外，本发明的组合物和本发明的发光检测用试剂盒包含L-012和由上述通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)或者包含L-012的盐和由上述通式[1]表示的化合物，在该组合物或该试剂盒的制造过程中或其使用时(测定时)，曝光引起的L-012或它的盐的发光强度的减弱(检测灵敏度的下降)得到抑制，因此如果用本发明的组合物或试剂盒就能够以高灵敏度精确地测定目标物质。
具体实施方式
在本发明中，8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(L-012)或它的盐是指由式[X-1]表示的化合物或该化合物的盐。
式[X-1]：
Figure GDA0001891102010000061
上述式[X-1]表示的化合物的盐是指该化合物中的吡啶并哒嗪环的羰基被烯醇化，与一价或二价的阳离子形成的盐的化合物。所述一价的阳离子可举出：例如钠离子、钾离子、锂离子等碱金属离子，例如铵离子，例如甲基铵离子、乙基铵离子、丙基铵离子、丁基铵离子等碳数1～4的单烷基铵离子，例如二甲基铵离子、二乙基铵离子、二丙基铵离子、二丁基铵离子等碳数2～8的二烷基铵离子，例如三甲基铵离子、三乙基铵离子、三丙基铵离子、三丁基铵离子等碳数3～12的三烷基铵离子，例如四甲基铵离子、四乙基铵离子、四丙基铵离子、四丁基铵离子等碳数4～16四烷基铵离子、吡啶鎓离子、肼鎓离子等的铵离子等。所述二价的阳离子可举出，例如镁离子、钙离子等碱土金属离子等。在上述一价和二价的阳离子当中，优选钠离子。
作为上述由式[X-1]所表示的化合物的盐的具体例，可举出例如由式[X-2]表示的8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐。
式[X-2]：
Figure GDA0001891102010000071
上述8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(L-012)或其盐(由上述式[X-1]表示的化合物或其盐)当中，优选8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮(L-012：由上述式[X-1]表示的化合物)以及8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐(由上述式[X-2]表示的化合物)，它们当中更优选8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐(由上述式[X-2]表示的化合物)。需要说明的是，上述L-012或它的盐可以使用市售产品，也可以使用通过公知的方法适当合成的产品。
《本发明的稳定剂》
本发明的稳定剂由通式[1]表示。
通式[1]：
Figure GDA0001891102010000072
(式中，p个M1分别独立地代表氢原子或碱金属原子，q个R1分别独立地代表羟基或由通式[A]表示的磺酸基，m代表0或1，p代表整数1～3，q代表整数0～4，Y代表氮原子或CH基(次甲基)，Z代表由通式[Z-1]表示的基团、由通式[Z-2]表示的基团或由通式[Z-3]表示的基团。)
通式[A]：
Figure GDA0001891102010000081
(式中，M2代表氢原子或碱金属原子。)
通式[Z-1]：
Figure GDA0001891102010000082
(式中，r个R2分别独立地代表羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基，R3代表氢原子或羟基，R4代表氢原子或由上述通式[A]表示的磺酸基，R5代表氢原子、由式[B]表示的苯基氨基或由通式[C]表示的萘基偶氮基，n代表0或1，r代表整数0～4。)
式[B]：
Figure GDA0001891102010000083
通式[C]：
Figure GDA0001891102010000084
(式中，R12～R14分别独立地代表氢原子、羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基。)
通式[Z-2]：
Figure GDA0001891102010000085
(式中，R6～R9分别独立地代表氢原子、羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基。)
通式[Z-3]：
Figure GDA0001891102010000091
(式中，R10代表氢原子或由通式[D]表示的羧酸基，s个R11分别独立地代表羟基或由上述通式[A]表示的磺酸基，s代表整数0～5。)
通式[D]：
Figure GDA0001891102010000092
(式中，M3代表氢原子或碱金属原子。)
通式[1]中的p个M1、通式[A]中的M2以及通式[D]中的M3所表示的碱金属原子，优选为锂原子、钠原子、钾原子，当中更优选钠原子。
通式[1]中的Z优选为通式[Z-1]所表示的基团。
作为通式[Z-1]中的r个R2，所有的R2均优选为由通式[A]表示的磺酸基。
通式[Z-1]中的R3优选为羟基。
通式[Z-1]中的R4优选为氢原子。
通式[Z-1]中的R5优选为氢原子。
通式[Z-2]中的R6以及R7优选为由通式[A]表示的磺酸。
通式[Z-2]中的R8以及R9优选为羟基。
通式[Z-3]中的R10优选为由通式[D]表示的羧酸基。
作为通式[Z-3]中的s个R11，所有的R11均优选为由通式[A]表示的磺酸基。
通式[C]中的R12优选为羟基。
通式[C]中的R13以及R14优选为由通式[A]表示的磺酸基。
通式[1]中的m优选为1。
通式[1]中的m为0时，代表苯环，m为1时，代表萘环。需要说明的是，m为0时，意味着q个R1所表示的基团不存在。
通式[Z-1]中的n为0时，代表苯环，n为1时，代表萘环。需要说明的是，n为0时，意味着r个R2所表示的基团不存在。
通式[1]中的p优选为整数1～2，当中更优选为1。
将与-N＝Y-Z所表示的基团相连的碳原子当作苯环或萘环的1位碳原子时，优选通式[1]中的p个-SO3M1所表示的磺酸基与苯环或萘环的3位或4位的碳原子相连。
通式[1]中的q优选为整数0～2，当中更优选为0或2。需要说明的是，q为0时，意味着R1所表示的基团不存在。
将与-N＝Y-Z所表示的基团相连的碳原子当作萘环的1位碳原子时，优选通式[1]中的q个R1所表示的基团与萘环的6位或8位的碳原子相连。
通式[Z-1]中的r优选为2。需要说明的是，r为0时意味着R2所表示的基团不存在。
将与通式[1]中的Y所表示的基团相连的碳原子当作萘环的1位的碳原子时，优选通式[Z-1]中的r个R2所表示的基团与萘环的6位或8位的碳原子相连。
通式[Z-3]中的s优选为整数0～3，当中更优选1。需要说明的是，s为0时，意味着R11所表示的基团不存在。
将与吡唑啉环相连的碳原子当作苯环的1位的碳原子时，优选通式[Z-3]中的s个R11所表示的基团与苯环的4位的碳原子相连。
通式[Z-3]所表示的基团(由通式[Z-3]表示的结构)有时会异构化为通式[Z-4]所表示的基团(由通式[Z-4]表示的结构)。在本发明中，当通式[1]所表示的稳定剂是通式[Z-4]所表示的结构(烯醇型)时也包含于本发明的(由通式[1]表示的)稳定剂中。
通式[Z-4]：
Figure GDA0001891102010000101
作为上述通式[1]所表示的本发明的稳定剂的具体例，可举出例如由式[1-1]～[1-6]表示的化合物。需要说明的是，本发明的稳定剂不限于式[1-1]～[1-6]表示的化合物。
式[1-1]～[1-6]：
Figure GDA0001891102010000111
上述式[1-1]～[1-6]的名称如下。
式[1-1]：4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸：偶氮甲碱-H
式[1-2]：7-羟基-8-(4-磺基-1-萘基偶氮)-1,3-萘二磺酸
式[1-3]：2-(4-磺基苯基偶氮)-1,8-二羟基-3,6-萘二磺酸
式[1-4]：3-[4-(苯基氨基)苯基偶氮]苯磺酸
式[1-5]：3-羟基-4-[4-(4-磺基苯基偶氮)-2-磺基苯基偶氮]-2,7-萘二磺酸
式[1-6]：4,5-二氢-5-氧-1-(4-磺基苯基)-4-[(4-磺基苯基)偶氮]-1H-吡唑-3-羧酸
另外，上述式[1-1]～[1-6]所表示的稳定剂也可以与碱金属形成盐，例如可举出式[1-7]～[1-12]所表示的盐。需要说明的是，碱金属盐形态的本发明的稳定剂不限于下述式[1-7]～[1-12]所表示的化合物。
式[1-7]～[1-12]：
Figure GDA0001891102010000121
上述式[1-7]～[1-12]的名称如下。
式[1-7]：4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸钠盐或4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸二钠盐：偶氮甲碱-H-钠盐或偶氮甲碱-H-二钠盐
式[1-8]：7-羟基-8-(4-磺基-1-萘基偶氮)-1,3-萘二磺酸三钠盐：新胭脂红
式[1-9]：2-(4-磺基苯基偶氮)-1,8-二羟基-3,6-萘二磺酸三钠盐：对磺基苯偶氮变色酸钠
式[1-10]：3-[4-(苯基氨基)苯基偶氮]苯磺酸钠盐：皂黄
式[1-11]：3-羟基-4-[4-(4-磺基苯基偶氮)-2-磺基苯基偶氮]-2,7-萘二磺酸四钠盐：丽春红-S
式[1-12]：4,5-二氢-5-氧-1-(4-磺基苯基)-4-[(4-磺基苯基)偶氮]-1H-吡唑-3-羧酸三钠盐：酒石黄
本发明的稳定剂因为具有上述由通式[1]表示的特定的结构，所以通过使其在L-012或它的盐中共存，在测定时不产生不良影响而且能够抑制曝光引起的检测灵敏度下降。本发明的稳定剂，作为通常的水溶性色素而被知道。然而，并不是说只要是水溶性色素而不管是什么化合物都具有使L-012或它的盐稳定化的效果，另外，使L-012或它的盐稳定化的效果与色素的最大吸收波长无关。即，本发明的稳定剂的特征存在于具有偶氮基或亚氨基且有共振结构的由通式[1]表示的特定的结构中。因此，只有本发明的稳定剂兼具两种效果：使L-012或它的盐稳定化的效果和对测定不产生不良影响的效果。
上述通式[1]所表示的稳定剂当中，优选通式[2]所表示的稳定剂。
通式[2]：
Figure GDA0001891102010000131
(式中，p个M1、q个R1、r个R2、m、n、p、q、r和Y与上述相同。)
作为上述通式[2]所表示的稳定剂的具体例，可举出例如由上述式[1-1]、[1-2]、[1-7]和[1-8]表示的化合物。
本发明的稳定剂当中，上述通式[2]所表示的稳定剂在测定时起到不造成不良影响而且能够更有效抑制曝光引起的检测灵敏度下降的效果。
进一步，上述通式[2]所表示的稳定剂当中，优选通式[2']所表示的稳定剂。
通式[2']：
Figure GDA0001891102010000132
(式中，R15以及R16分别独立地代表氢原子或由通式[E]表示的磺酸基，q个R1、r个R2、n、q、r和Y与上述相同，但是，R15和R16当中至少一者是由通式[E]表示的磺酸基。)
通式[E]：
Figure GDA0001891102010000141
(式中，M1与上述相同。)
作为上述通式[2']所表示的稳定剂的具体例，可举出例如由上述式[1-1]、[1-2]、[1-7]和[1-8]表示的稳定剂。
本发明的稳定剂，可以使用市售产品，也可以使用通过公知的方法适当合成的产品。
《本发明的稳定化方法》
本发明的稳定化方法是使上述通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)在L-012或它的盐中共存的方法。
作为本发明的稳定化方法的具体方法，只要是能够最终使上述通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)在L-012或它的盐中共存的方法就没有特别限定，例如(1)在含有L-012或它的盐的溶液中添加通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)而使通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)在L-012或它的盐中共存的方法，(2)在含有通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的溶液中添加L-012或它的盐而使通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)在L-012或它的盐中共存的方法，或者(3)将L-012或它的盐和通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)添加到水、适当的缓冲液等的溶解液中而使通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)在L-012或它的盐中共存的方法等。
在本发明的稳定化方法中，通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)可以单独使用1种化合物(稳定剂)，也可以组合使用2种以上的化合物(稳定剂)。
在本发明的稳定化方法中，作为含有L-012或它的盐、和/或通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的溶解液，只要是在该领域中使用的溶解液就没有特别限定，具体可举出，例如水、缓冲液等。
作为本发明的稳定化方法所用的水，只要是该领域中使用的水就没有特别限定，具体可举出，例如蒸馏水、去离子水等净化水等。
作为本发明的稳定化方法所用的缓冲液，只要是该领域中使用的缓冲液就没有特别限定，具体可举出，例如使N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二醋酸(ADA)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟乙基)甲烷(Bis-Tris)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、2-羟基-3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、2-羟基-N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)等缓冲剂溶解而成的两性离子缓冲液(Good’s缓冲液)；例如溶解磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷等缓冲剂而成的缓冲液、佛罗拿缓冲液(Veronal buffer)、硼酸缓冲液等。另外，这些缓冲液可以单独使用1种缓冲液，也可以组合使用2种以上的缓冲液，这些缓冲液还可以与氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物组合而制成缓冲液。缓冲液组合的具体例可举出，3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)/氢氧化钠缓冲液、2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)/氢氧化钠缓冲液、硼酸/氢氧化钠缓冲液等。
作为本发明的稳定化方法中的通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的浓度，只要该浓度可以使含L-012或它的盐的试剂、检测溶液(发光底物液)等溶液中存在的L-012或它的盐稳定化就没有特别限定。作为使用浓度的一个示例，虽然其根据通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的种类、共存的L-012或它的盐的浓度、溶解液的纯度等会有所变化，但是作为在L-012或它的盐存在的溶液中的通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的浓度，其下限通常为0.001μM以上，优选为0.01μM以上，更优选为0.05μM以上，其上限通常为1000μM以下，优选为800μM以下，更优选为500μM以下。
作为本发明的稳定化方法中的L-012或它的盐的浓度，只要在化学发光检测领域中使用的浓度范围内适当选择即可，具体而言，作为溶液中的L-012或它的盐的浓度，其下限通常为0.01mM以上，优选为0.1mM以上，更优选为0.3mM以上，其上限通常为5mM以下，优选为2mM以下，更优选为1mM以下。
作为本发明的稳定化方法中的通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的浓度相对于L-012或它的盐的浓度(通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)相对于L-012或它的盐的浓度比)，只要该浓度比可以使L-012或它的盐稳定化就没有特别限定，作为浓度比的一个示例，相对于溶液中的L-012或它的盐的浓度1mM，溶液中的通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的浓度的下限，通常为0.002μM以上，优选为0.02μM以上，更优选为0.1μM以上，其上限通常为2000μM以下，优选为1600μM以下，更优选为1000μM以下。
作为本发明的稳定化方法中的缓冲液中的缓冲剂的浓度，通常为10～500mM，优选为10～300mM，只要在上述范围内适当选择即可。
作为本发明的稳定化方法中的缓冲液的pH，通常为pH3～12，优选为pH5～10，更优选为pH6.5～9，只要在上述范围内适当选择即可。
在本发明的稳定化方法中，除了通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)、L-012或它的盐、以及水和/或缓冲液之外，还可以使以下的本领域内使用的添加剂与其共存，例如叠氮化钠等保存剂、例如麦芽糖、蔗糖、海藻糖等糖类、例如蛋白质等稳定剂、例如氯化钠、氯化镁等盐类、例如5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、(+)-10-樟脑磺酸等防腐剂、表面活性剂等。
上述添加剂的添加量只要在本领域使用的范围内适当设定即可。
基于上述的具体的方法而实施的本发明的稳定化方法，该方法能够抑制因曝光引起的L-012或它的盐的分解(劣化)而使L-012或它的盐长期稳定化，进而能够抑制L-012或它的盐发光强度的减弱(检测灵敏度的下降)。另外，如果借助本发明的稳定化方法使L-012或它的盐稳定化，在使用含L-012或它的盐的试剂、检测溶液(发光底物液)时，由于通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)不会对测定造成不良影响，所以能够以高灵敏度又良好的精确度测定目标物质。
《本发明的组合物》
本发明的组合物含有L-012和由上述通式[1]表示的化合物(本发明的稳定剂)或含有L-012的盐和由上述通式[1]表示的化合物(本发明的稳定剂)，在该组合物的制造过程中或其使用时(测定时)，曝光引起的L-012或它的盐的发光强度的减弱(检测灵敏度的下降)得到抑制。例如如果在化学发光检测中采用本发明的组合物，能够以高灵敏度又良好的精确度测定生物体中的目标物质。
一般情况下本发明的组合物是溶液状态，也可以是冻结状态或冷冻干燥状态。
本发明的组合物以上述浓度比含有上述浓度范围的L-012或它的盐和上述浓度范围的通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)。
例如，在本发明的组合物为溶液状态的情况下，只要使L-012或它的盐和通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)以分别成为上述浓度范围以及浓度比的方式包含在适当的溶解液中即可。另外，在本发明的组合物为冻结状态或冷冻干燥状态的情况下，只要使L-012或它的盐和通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)以由溶解液制备时的浓度分别成为上述浓度范围以及浓度比的方式包含在冻结原液或者冷冻干燥原液中即可。此外，显然，在由溶解液制备该组合物时，只要使上述浓度范围的L-012或它的盐和上述浓度范围的通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)成为上述浓度比，就能使制备后的组合物中的L-012或它的盐稳定化。
作为本发明的组合物中使用的溶解液，可举出与上述的本发明的稳定化方法所使用的水、缓冲液的具体例相同的物质，其使用浓度、pH也与上述范围相同。
在本发明的组合物中，除了L-012或它的盐、通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)以及溶解液之外，还可以同时存在本领域内使用的添加剂，作为上述添加剂，可举出与本发明的稳定化方法中的添加剂的具体例相同的物质，其添加量可以在本领域使用的范围内适当设定。
《采用含L-012或它的盐和通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的检测溶液(发光底物液)的发光检测法》
通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)能够使用于在反应体系中存在L-012或它的盐的任意的发光检测法。
作为上述发光检测法的具体例，可举出例如检出/测定借助过氧化氢等氧化剂与L-012或它的盐的反应而产生的化学发光的方法等，测定原理可举出，三明治法(サンドイッチ法)、竞争法、双抗体法等自身公知的各种方法。
作为利用氧化剂与L-012或它的盐的反应的化学发光检测的具体例，可举出：使试样中的催化剂与氧化剂及L-012或它的盐反应而产生化学发光的方法，使试样中的氧化剂与催化剂及L-012或它的盐反应而产生化学发光的方法等。通常这些反应在溶液中进行，根据测定对象，有：(1)按适当的顺序混合含L-012或它的盐和通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的检测溶液(发光底物液)、含氧化剂的溶液以及含试样中的催化剂的溶液而使它们反应的方法，(2)按适当的顺序混合含L-012或它的盐和通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的检测溶液(发光底物液)、含试样中的氧化剂的溶液以及含催化剂的溶液而使它们反应的方法、(3)按适当的顺序混合含L-012或它的盐和通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的检测溶液(发光底物液)、含氧化剂的溶液、含催化剂的溶液以及含试样的溶液而使它们反应的方法等。需要说明的是，在上述化学发光检测中，目标物质可以是直接参与主反应的物质，也可以间接参与主反应的物质。
上述催化剂可举出，例如铁氰化钾等含铁离子、铜离子、钴离子等过渡金属络合物、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶等酶、血红蛋白等生物体成分等，当中优选过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶等酶，它们当中更优选过氧化物酶(POD)。
上述过氧化物酶(POD)只要在过氧化氢等氧化剂的存在下能够使L-012或它的盐产生化学发光就没有特别限定。具体可举出，例如源自辣根、菠萝、无花果等植物的酶、例如源自霉菌、酵母等微生物的酶、例如源自动物的白细胞、甲状腺等的酶等，当中优选源自辣根的酶。需要说明的是，所述过氧化物酶(POD)还包含通过基因工程制造的POD、或通过蛋白质分解酶等将源自天然的过氧化物酶(POD)的部分结构水解等而得到的具有POD活性的物质。另外，过氧化物酶(POD)可以是其原物质本身(未修饰的)，也可以是通过例如抗原、抗体等被化学修饰过的POD。
上述氧化剂可举出，例如过氧化氢、过氧化钠、高氯酸钠、高氯酸钾、过锰酸钠、过锰酸钾、碘等，当中优选过氧化氢。需要说明的是，这些氧化剂使用市售产品即可。
在上述化学发光检测中，在L-012或它的盐、通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)、催化剂以及氧化剂之外，还可以使用增敏剂(增强剂)。
上述增敏剂(增强剂)只要是本领域内使用的增敏剂(增强剂)就没有特别限定，具体可举出，例如4-(4-羟基苯基)噻唑等噻唑衍生物、例如4-(咪唑-1-基)苯酚等咪唑衍生物、例如4-(4-羟基苯基)噁唑等噁唑衍生物、例如对碘苯酚、4-羟基肉桂酸、4-(4'-噻唑基)苯酚等苯酚衍生物、例如1-溴萘酚等萘酚衍生物等，当中优选例如4-(4-羟基苯基)噻唑等噻唑衍生物。此外，这些增敏剂(增强剂)可以单独使用1种增敏剂(增强剂)，也可以组合使用2种类以上的增敏剂(增强剂)。需要说明的是，这些增敏剂(增强剂)使用市售产品即可。
在上述化学发光检测中使用的L-012或它的盐的量，有时根据测定方式而有所不同，因此不能一概而论，例如如果要测定总发光量时，相对于试样25μL，通常以0.01～5mM的浓度为5μL～1mL，优选以0.1～2mM的浓度为10～500μL，更优选以0.3～1mM的浓度为20～300μL。另一方面，如果要测定单位时间的发光量时，所使用的L-012或它的盐的量，相对于试样25μL，通常以0.01～5mM的浓度为5μL～1mL，优选以0.1～2mM的浓度为10～500μL，更优选以0.3～1mM浓度为20～300μL。
上述化学发光检测中使用的通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的量，有时根据测定方式而有所不同，因此不能一概而论，例如如果要测定总发光量时，相对于试样25μL，通常以0.001～1000μM的浓度为5μL～1mL，优选以0.01～800μM的浓度为10～500μL，更优选以0.05～500μM的浓度为20～300μL。另一方面，如果要测定单位时间的发光量时，所使用的通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的量，相对于试样25μL，通常以0.001～1000μM的浓度为5μL～1mL，优选以0.01～800μM的浓度为10～500μL，更优选以0.05～500μM的浓度为20～300μL。
在含L-012或它的盐和通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的检测溶液(发光底物液)中，作为通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的浓度相对于L-012或它的盐的浓度(通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)相对于L-012或它的盐的浓度比)，相对于浓度1mM的溶液中的L-012或它的盐，溶液中的通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)的浓度的下限通常是0.002μM以上，优选为0.02μM以上，更优选为0.1μM以上，上限通常是2000μM以下，优选为1600μM以下，更优选为1000μM以下。
作为在上述化学发光检测中使用的催化剂的量，有时根据使用的催化剂种类、测定方式而有所不同，因此不能一概而论，例如以过氧化物酶(POD)作为催化剂的情况下，如果要测定总发光量时，相对于试样25μL，通常以0.1～200U/mL的浓度为5μL～1mL，优选以0.2～100U/mL的浓度为10～500μL，更优选以0.5～50U/mL的浓度为20～300μL。另一方面，如果要测定单位时间的发光量时，所使用的过氧化物酶(POD)的量，相对于试样25μL，通常以0.1～200U/mL的浓度为5μL～1mL，优选以0.2～100U/mL的浓度为10～500μL，更优选以0.5～50U/mL的浓度为20～300μL。
作为在上述化学发光检测中使用的氧化剂的量，有时根据使用的氧化剂种类、测定方式而有所不同，因此不能一概而论，例如以过氧化氢作为氧化剂的情况下，如果要测定总发光量时，相对于试样25μL，通常以0.3μM～0.1mM的浓度为5μL～1mL，优选以0.5～500μM的浓度为10～500μL，更优选以0.7～200μM的浓度为20～300μL。另一方面，如果要测定单位时间的发光量时，所使用的过氧化氢的量，相对于试样25μL，通常以0.3μM～0.1mM的浓度为2.5～500μL，优选以浓度0.5～500μM为5～250μL，更优选以0.7～200μM的浓度为10～150μL。
作为在上述化学发光检测中使用的增敏剂(增强剂)的量，根据使用的增敏剂(增强剂)种类、测定方式而有所不同，因此不能一概而论，例如以噻唑衍生物作为增敏剂(增强剂)的情况下，如果要测定总发光量时，相对于试样25μL，通常以0.1μM～10mM的浓度为5μL～1mL，优选以1μM～2mM的浓度为10～500μL，更优选以100μM～1mM的浓度为20～300μL。另一方面，如果要测定单位时间的发光量时，所使用的噻唑衍生物的量，相对于试样25μL，通常以0.1μM～10mM的浓度为5μL～1mL，优选以1μM～2mM的浓度为10～500μL，更优选以100μM～1mM的浓度为20～300μL。
在上述化学发光检测中，为了避免试样中所含的目标物质以外的成分的影响、或者为了提高目标物质检出灵敏度等，可以在测定体系中添加表面活性剂、活化剂等本领域内使用的添加剂。另外，这些添加剂的添加量在本领域使用的范围内适当设定即可。
上述化学发光检测中的L-012或它的盐的发光反应，通常在pH3～12、优选在pH5～10、更优选在pH6.5～9的条件下进行即可。
通过调节检测溶液(发光底物液)等溶液的pH即可调节至上述pH，例如通过使用含有L-012或它的盐、通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)、催化剂或氧化剂的缓冲液来调节pH即可。该类缓冲液，可举出与在上述本发明的稳定化方法中列举的缓冲液的具体例相同的物质，其使用浓度也与上述范围相同。
上述化学发光检测中的L-012或它的盐的发光反应以及后续的发光检测，通常在10～60℃、优选在15～50℃、更优选在20～45℃的温度条件下进行即可。
上述化学发光检测中的L-012或它的盐的发光反应以及后续的发光检测的时间，通常为10秒～30分钟，优选为30秒～20分钟，更优选为30秒～10分钟。
作为催化剂使用通过过氧化物酶(POD)等酶标记的标记抗原或标记抗体，进行抗原抗体反应而形成酶标记免疫复合体，在将该复合体用于上述化学发光检测中的情况下，在与上述化学发光检测中的L-012或它的盐的发光反应相同的pH、温度条件下进行抗原抗体反应即可。
上述抗原抗体反应的反应时间，通常为10秒～120分钟、优选为30秒～60分钟、更优选为1～30分钟。
上述化学发光检测当中，使通过过氧化物酶(POD)标记的特定成分的抗体(标记抗体)与特定成分发生反应而生成特定成分与标记抗体的免疫复合体，然后使(结合着POD)该免疫复合体与过氧化氢及L-012或它的盐发生反应而产生化学发光，在这样的方法中很适合使用通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)。
以使用通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)来测定试样中的乙型肝炎病毒表面抗体(下面，有时简写为HBs抗体)的方法为例进行说明，例如测定方法如下。
在具备可使反应容器和/或测光室的反应容器周围的环境保持恒定的构件的合适的自动分析装置中，分别装入试样、含有结合有乙型肝炎病毒表面抗原(下面，有时简写为HBs抗原)的磁性粒子的溶液、含过氧化物酶(POD)标记HBs抗原的溶液、含L-012或它的盐和通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)及作为增敏剂(增强剂)的4-(4-羟基苯基)噻唑的溶液(发光底物液)、含过氧化氢的溶液。接下来，启动机器，使含HBs抗体的试样与含有结合有HBs抗原的磁性粒子的溶液反应，生成“结合有HBs抗原的磁性粒子-HBs抗体”复合体，进行B/F分离。然后，在含有“结合有HBs抗原的磁性粒子-HBs抗体”复合体的溶液中加入含POD标记的HBs抗原的溶液使其反应，形成“结合有HBs抗原的磁性粒子-HBs抗体-POD标记HBs抗原”复合体，进行B/F分离。继而，在实施了B/F分离的磁性粒子中添加含发光底物液和过氧化氢的溶液，混合后，测定试样发光即可。
上述化学发光检测中的磁性粒子只要是本领域内使用的磁性粒子就没有特别限定，可以使用市售产品，也可以使用通过公知的方法适当合成的产品。另外，采用了该磁性粒子的结合有HBs抗原的磁性粒子等的抗原或抗体结合的磁性粒子，按照自身公知的方法来制作即可。
在使用一般的分光测定装置代替自动分析装置来进行化学发光检测的情况下，用手动操作使试样与各种试剂等反应而发生发光反应后，安装至具备可使反应容器、反应容器和/或测光室的反应容器周边的环境保持恒定的构件的分光测定装置，测定试样发光即可。
在上述化学发光检测中列举了HBs抗体的测定体系的示例，只要使用通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)和L-012或它的盐，就能够测定各种目标物质(测定对象物质)。作为上述目标物质(测定对象物质)，只要是通过任何的方法能得到与其对应的抗体或抗原的物质就没有特别限定，可举出例如具有生物学及临床意义的试剂、代谢物质、维生素、杀虫剂、类固醇、肽、激素、肝炎标志物、癌标志物、抗体以及血清蛋白等所有的通常被认为能通过补体免疫测定法测定的测定对象物质。作为具体例，与内分泌功能相关的物质可举出：例如促甲状腺激素(TSH)、甲状旁腺激素(iPTH)、生长激素(GH)、促生长因子C(IGF-1)、促黄体生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、催乳素(PRL)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、加压素、催产素、生长抑素、脑啡肽、β-内啡肽、甲状腺素、碘甲状腺原氨酸、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体、抗T3抗体、抗T4抗体、抗TSH抗体、降钙素、儿茶酚胺、多巴胺、血清素、醛固酮、肾素、血管紧张素、皮质醇、脱氧皮质醇、可的松、皮质酮、脱氧皮质酮、雄素酮、黄体酮、孕烯醇酮、雌激素、雌酮、雌三醇、雌二醇、睾酮、促性腺激素、胰岛素、抗胰岛素抗体、C-肽、胰高血糖素、胃泌素、分泌素、环AMP、环GMP、前列腺素类、血栓素、促红细胞生长素、组胺等；与肿瘤相关的物质可举出：例如CEA、铁蛋白、β2-微球蛋白、弹性蛋白酶、α-甲胎蛋白、神经特异性烯醇化酶、前列腺特异性抗原、CA19-9等；与药物、维生素相关的物质可举出：例如苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、扑米酮、乙琥胺、丙戊酸、乙酰唑胺、舒噻嗪、格鲁米特、氯硝西泮、硝西泮、地西泮、戊巴比妥、司可巴比妥、布比卡因、甲哌卡因、利多卡因、普鲁卡因胺、奎尼丁、地高辛、洋地黄毒苷、茶碱、阿米替林、丙咪嗪、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、头孢氨苄、磺胺甲恶唑、甲氨蝶呤、环孢素、甲基泼尼松龙、水杨酸、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、别嘌呤醇、维生素A、胡萝卜素、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、叶酸、维生素C、维生素D、维生素E等；与血清或血浆蛋白相关的物质可举出：例如白蛋白、α1-微球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、结合球蛋白、血液结合素、转铁蛋白、肌红蛋白、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、纤维蛋白原、抗凝血酶、纤溶酶原、抗纤溶酶、蛋白质C、类风湿因子、抗DNA抗体、C反应性蛋白等；与病毒、传染病相关的物质可举出：例如HBs抗原、HBs抗体、HBc抗体、HTLV-I抗体、HTLV-III抗体、TPHA、各种病毒抗原、各种病毒抗体等。这些目标物质(测定对象物质)当中，优选促甲状腺激素(TSH)、甲状旁腺激素(iPTH)、醛固酮、肾素、皮质醇、HBs抗体、HBc抗体。
化学发光检测中的上述目标物质(测定对象物质)的浓度，可以根据目标物质(测定对象物质)的种类在本领域的浓度范围内适当选择即可。
如上所述，在使用L-012或它的盐而进行的化学发光检测中，通过使通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)在L-012或它的盐中共存，从而起到了如下效果：即使含L-012或它的盐的检测溶液(发光底物液)发生了曝光，也能够抑制L-012或它的盐的发光强度的减弱(检测灵敏度的下降)，而且因为对L-012或它的盐本身的发光量难以产生不良影响，所以测定时不产生不良影响，能够以高灵敏度又良好的精确度检测目标物质(测定对象物质)。进一步起到的效果是：只要使本发明的稳定剂在L-012或它的盐中共存就无需对含L-012或它的盐的检测溶液(发光底物液)进行遮光，因此能够更简便地进行测定。
《本发明的发光检测用试剂盒》
本发明的发光检测用试剂盒在利用L-012或它的盐的化学发光方法中使用，根据上述发光检测法的具体例可知，其包含在L-012或它的盐的化学发光检测法中所使用的催化剂、氧化剂等自身公知的试剂类、L-012或它的盐、和上述通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)。
作为本发明的发光检测用试剂盒的具体例，可举出：例如含L-012或它的盐、通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)及氧化剂的试剂盒，例如含L-012或它的盐、通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)及催化剂的试剂盒，例如含L-012或它的盐、通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)、氧化剂及催化剂的试剂盒等。
下面列举上述的本发明的发光检测用试剂盒的一个示例。
含有A)L-012或它的盐、B)通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)以及C)过氧化氢的发光检测用试剂盒。
含有A)L-012或它的盐、B)通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)及D)过氧化物酶(POD)的发光检测用试剂盒。
含有A)L-012或它的盐、B)通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)、C)过氧化氢及D)过氧化物酶(POD)的发光检测用试剂盒。
作为本发明的发光检测用试剂盒所包含的L-012或它的盐、通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)以及试剂类的含量，只要在化学发光检测时以使L-012或它的盐、通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)以及试剂类等各个成分的最终浓度和浓度比成为上述范围的方式含有这些成分即可。
在本发明的发光检测用试剂盒中，还可以含有上述试剂类以外的增敏剂(增强剂)、活化剂、保存剂、稳定剂、防腐剂、表面活性剂等本领域使用的添加剂。另外，这些添加剂的含量只要在本领域使用的范围内适当设定即可。
作为含上述添加剂等的本发明的发光检测用试剂盒，可举出如下示例。
含有A)L-012或它的盐、B)通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)、C)过氧化氢及E)增敏剂(增强剂)的发光检测用试剂盒。
含有A)L-012或它的盐、B)通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)、C)过氧化氢及F)磁性粒子的发光检测用试剂盒。
含有A)L-012或它的盐、B)通式[1]所表示的化合物(本发明的稳定剂)、C)过氧化氢、E)增敏剂(增强剂)及F)磁性粒子的发光检测用试剂盒。
上述本发明的发光检测用试剂盒中的组合物中的形态可以是溶液状态、冻结状态或冷冻干燥状态的任一种。
实施例
下面，基于实施例以及比较例具体地说明本发明，但是本发明不受这些示例的任何限定。
《在使用过氧化物酶(POD)的化学发光检测体系中的试剂的制备以及化学发光检测》
在一般的使用过氧化物酶(POD)的化学发光检测的方法中，试剂的制备、以及使用了各种稳定剂或水溶性色素的化学发光的检测方法以及评价方法如下。
<实施例1～15以及比较例1～14>
(1)发光检测用试剂第1液的制备
(a)发光检测用试剂第1-A液的制备(实施例1～15以及比较例1～12)
将8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐(和光纯药工业(株)制)15.6mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，以使化学发光检测时的最终浓度成为表1所示的规定浓度的添加量来添加表1所示的各种稳定剂或水溶性色素，进一步，添加2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.55)20mL之后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下均匀地混合而制备了发光检测用试剂第1-A液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。需要说明的是，表1所示的稳定剂以及水溶性色素使用的是下述的市售产品。
偶氮甲碱-H：和光纯药工业(株)制
新胭脂红：和光纯药工业(株)制
对磺基苯偶氮变色酸钠：和光纯药工业(株)制
皂黄：和光纯药工业(株)制
丽春红-S：和光纯药工业(株)制
酒石黄：和光纯药工业(株)制
N-苯甲酰基H酸单钾单钠盐：和光纯药工业(株)制
茜素黄GG：东京化成工业(株)制
甲酚红：和光纯药工业(株)制
(b)发光检测用试剂第1-B液的制备(比较例13)
将8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐(和光纯药工业(株)制)15.6mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，添加2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.55)20mL之后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第1-B液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(c)发光检测用试剂第1-C液的制备(比较例14)
将鲁米诺钠盐(和光纯药工业(株)制)40mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，添加硼酸/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.55)20mL之后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第1-C液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(2)过氧化物酶(POD)缓冲液的制备
用50mM的2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(pH6.8)以POD的浓度成为0.02μg/mL的方式稀释制备源自辣根的POD(罗氏诊断株式会社(ロシュ·ダイアグノスティックス(株))制)，获得POD缓冲液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(3)发光检测用试剂第2液的制备
将过氧化氢水溶液(和光纯药工业(株)制，试剂特级，浓度30重量％)67μL装入100mL的容量瓶。然后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第2液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(4)化学发光的检测
使用得到的各试剂，通过下述的检测方法，基于实施例1～15以及比较例1～14的发光检测用试剂第1液来测定发光量(平均值)，评价各种稳定剂或水溶性色素是否有光稳定化效果以及是否对L-012(的钠盐)的发光强度有影响。
首先，将由(1)得到的发光检测用试剂第1液(1-A液、1-B液、1-C液)以每支1mL的方式转移至2支5mL的试管，一支管在430～450Lx的荧光灯的光照下暴露30分钟(曝光发光检测用试剂第1液)，另一支试管用铝箔包裹进行遮光(遮光发光检测用试剂第1液)。
然后，在POD缓冲液50μL中分别同时加入曝光发光检测用试剂第1液(1-A液、1-B液、1-C液)或遮光发光检测用试剂第1液(1-A液、1-B液、1-C液)100μL和发光检测用试剂第2液100μL，在37℃温度下进行43秒钟发光反应，通过发光检测器(Lumat LB9507：贝特霍尔德公司(Berthold Japan，ベルトールドジャパン)制)测定同时添加发光检测用试剂第1液和第2液开始起43～45秒钟时间点的平均发光量。
(5)结果
根据得到的结果如下所示地算出“稳定剂或水溶性色素的光稳定化效果”以及“相对于鲁米诺的相对灵敏度”，进行了各种稳定剂或水溶性色素的评价。结果分别示于表1。
〈稳定剂或水溶性色素的光稳定化效果〉
针对各个发光检测用试剂第1液，算出曝光发光检测用试剂第1液中的平均发光量(曝光发光量)相对于遮光发光检测用试剂第1液中的平均发光量(遮光发光量)的比例〔曝光发光量/遮光发光量×100％＝发光量比〕。基于该发光量比来评价各种稳定剂或水溶性色素的光稳定化效果。
即，发光量比越接近100％，意味着各种稳定剂或水溶性色素对L-012(的钠盐)的光稳定化效果越高，基于在使用未添加稳定剂或水溶性色素的发光检测用试剂第1-B液的情况下的发光量比是64％，由此可将表现出70％以上的发光量比的发光检测用试剂第1-A液所包含的稳定剂或水溶性色素，评价为光稳定化效果较高并且能够抑制在曝光时检测灵敏度下降的稳定剂或水溶性色素。
〈相对于鲁米诺的相对灵敏度〉
针对各个发光检测用试剂第1-A液和1-B液，算出发光检测用试剂第1-C液中的遮光发光量(鲁米诺发光量)相对于各发光检测用试剂第1-A液或1-B液中的遮光发光量(L-012发光量)的比例〔L-012发光量/鲁米诺发光量×100％＝相对灵敏度〕。基于该相对灵敏度，评价各种稳定剂或水溶性色素的检测灵敏度。
即，将表现出比鲁米诺发光量(127,400cps)更高的L-012发光量的发光检测用试剂第1-A液，评价为是一种能够以比利用了鲁米诺发光的发光检测更高的灵敏度进行测定的检测灵敏度较高的试剂(L-012发光试剂)。换言之，将表现出100％以上的相对灵敏度的发光检测用试剂第1-A液所包含的稳定剂或水溶性色素，评价为是一种对L-012的发光强度不产生不良影响而能实现高灵敏度检测的稳定剂或水溶性色素。
[表1]
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根据表1结果可知，只有作为本发明的稳定剂的偶氮甲碱-H、新胭脂红、对磺基苯偶氮变色酸钠、皂黄、丽春红-S以及酒石黄，同时具有两种效果：能够抑制曝光引起的检测灵敏度下降的效果(光稳定化效果)和对L-012(的钠盐)的发光强度的影响较小而能实现高灵敏度测定的效果。
《在使用过氧化物酶(POD)的活性肾素测定体系中试剂的制备以及活性肾素的测定》
在使用过氧化物酶(POD)的活性肾素的测定体系中，试剂的制备、以及使用了各种稳定剂或水溶性色素的活性肾素的测定方法以及评价方法如下。
<实施例16～28以及比较例15～28>
(1)发光检测用试剂第1液的制备
(a)发光检测用试剂第1-A液的制备(实施例16～28以及比较例15～26)
将8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐(和光纯药工业(株)制)15.6mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，以化学发光检测时的最终浓度成为表2所示的规定浓度的添加量来添加表2所示的各种稳定剂或水溶性色素，进一步，添加2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.55)20mL之后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下均匀地混合而制备了发光检测用试剂第1-A液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(b)发光检测用试剂第1-B液的制备(比较例27)
将8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐(和光纯药工业(株)制)15.6mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，添加2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.55)20mL之后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第1-B液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(c)发光检测用试剂第1-C液的制备(比较例28)
将鲁米诺的钠盐(和光纯药工业(株)制)40mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，添加硼酸/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.55)20mL之后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第1-C液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(2)含磁性粒子的试剂(结合有抗肾素单克隆抗体(小鼠)的磁性粒子试剂)的制备
向装有50mL的含97重量％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液的带盖聚乙烯瓶中加入磁性粒子(按照WO2012/173002号公报记载的制造例1制作而成)12.5mL，在25℃温度下反应1小时后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体。然后，加入10mM的醋酸缓冲液(pH5.1)50mL并盖上瓶盖，慢慢倒置聚乙烯瓶2次来搅拌后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体而洗涤了磁性粒子。进行该洗涤操作4次。
将如此洗涤后的磁性粒子投入装有50mL的0.5重量％的琥珀酸酐乙醇溶液的带盖聚乙烯瓶中，在25℃温度下反应2小时。反应后，加入100mM的2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(pH5.0)50mL并盖上瓶盖，慢慢倒置聚乙烯瓶2次来搅拌后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体而洗涤了磁性粒子。进行该洗涤操作4次。
进一步，将如此洗涤后的磁性粒子加入装有50mL的含200μg/mL浓度的抗肾素单克隆抗体(小鼠)(ITM株式会社制)的100mM的MES缓冲液(pH5.0)的带盖聚乙烯瓶，在11℃温度下反应15～25小时。反应后，用钕磁铁收集磁性粒子，用MES缓冲液洗涤后，加入封闭液{50mM的含0.5％封闭艾斯(Block Ace)(雪印乳业株式会社制)的MES缓冲液(pH5.5)}，在11℃温度下反应15小时，由此制作了结合有抗肾素单克隆抗体(小鼠)的磁性粒子。用50mM的MES缓冲液(pH5.5)将其稀释使结合有抗肾素单克隆抗体的磁性粒子浓度成为0.5mg/mL，制备包含结合有抗体的磁性粒子的试剂(结合有抗肾素单克隆抗体(小鼠)的磁性粒子试剂)，在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(3)免疫反应用缓冲液的制备
制备50mM的3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)缓冲液(pH7.0)，得到了免疫反应用缓冲液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(4)酶标记试剂(过氧化物酶(POD)标记抗肾素单克隆抗体(小鼠)试剂)的制备
使用抗肾素单克隆抗体(小鼠)(ITM株式会社制)、源自辣根的POD(罗氏诊断株式会社(ロシュ·ダイアグノスティックス(株))制)，通过文献(S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,H.OGAWA；J Biochem(1982)Vol.92,(5):1413-1424)记载的方法制备了POD标记抗肾素单克隆抗体(小鼠)。用50mM的MES缓冲液(pH6.5)将其稀释而使POD标记抗肾素单克隆抗体浓度成为1.0mL/L，制备酶标记试剂(POD标记抗肾素单克隆抗体(小鼠)试剂)，在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(5)发光检测用试剂第2液的制备
将过氧化氢水溶液(和光纯药工业(株)制，试剂特级，浓度30重量％)67μL装入100mL的容量瓶。然后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第2液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(6)化学发光的检测
使用得到的各试剂，通过下述的检测方法，基于实施例16～28以及比较例15～28的发光检测用试剂第1液测定发光量(平均值)，评价各种稳定剂或水溶性色素是否有光稳定化效果以及是否对L-012(的钠盐)的发光强度有影响。
首先，将由(1)得到的发光检测用试剂第1液中的第1-A液和第1-B液分别以每支1mL的方式转移至2支5mL的试管中，一支管在430～450Lx的荧光灯的光照下暴露30分钟(曝光发光检测用试剂第1液)，另一支试管用铝箔包裹进行遮光(遮光发光检测用试剂第1液)。将第1-C液1mL转移至1支5mL的试管中，用铝箔包裹试管来进行遮光(遮光发光检测用试剂第1液)。
然后，将包含结合有抗体的磁性粒子的试剂(结合有抗肾素单克隆抗体(小鼠)的磁性粒子试剂)10～50μg、用15mM的含1％的牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(pH7.2)制备的肾素浓度为25pg/mL的标准肾素溶液25μL、以及免疫反应用缓冲液50μL加入试管中混合，在37℃温度下反应3分钟，使其形成“结合有抗肾素单克隆抗体(小鼠)的磁性粒子-肾素”复合体。反应后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体后，加入生理盐水100μL，使磁性粒子分散并收集磁粒后，通过吸气装置抽吸去除液体，进行3次这样的洗涤操作。
接着，将酶标记试剂(POD标记抗肾素单克隆抗体(小鼠)试剂)50μL加入试管，在37℃温度下反应3分钟，形成“结合有抗肾素单克隆抗体(小鼠)的磁性粒子-肾素-POD标记抗肾素单克隆抗体(小鼠)”复合体。反应后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体后，加入生理盐水100μL，使磁性粒子分散并收集磁粒后，通过吸气装置抽吸去除液体，进行2次这样的洗涤操作。
最后，同时分别加入曝光发光检测用试剂第1液(1-A液、1-B液)或遮光发光检测用试剂第1液(1-A液、1-B液、1-C液)100μL和发光检测用试剂第2液100μL，在37℃温度下进行43秒钟发光反应，通过发光检测器(Lumat LB9507：贝特霍尔德公司(Berthold Japan，ベルトールドジャパン)制)测定同时添加发光检测用试剂第1液和第2液开始起43～45秒钟时间点的平均发光量。
(7)结果
根据得到的结果如下所示地算出“稳定剂或水溶性色素的光稳定化效果”以及“相对于鲁米诺的相对灵敏度”，进行了各种稳定剂或水溶性色素的评价。结果分别示于表2。
〈稳定剂或水溶性色素的光稳定化效果〉
针对各个发光检测用试剂第1液，算出了曝光发光检测用试剂第1液中的平均发光量(曝光发光量)相对于遮光发光检测用试剂第1液中的平均发光量(遮光发光量)的比例〔曝光发光量/遮光发光量×100％＝发光量比〕。基于该发光量比来评价各种稳定剂或水溶性色素的光稳定化效果。
即，发光量比越接近100％，意味着各种稳定剂或水溶性色素对L-012(的钠盐)的光稳定化效果越高，基于使用未添加稳定剂或水溶性色素的发光检测用试剂第1-B液情况下的发光量比是75％，由此将表现出80％以上的发光量比的发光检测用试剂第1-A液所含的稳定剂或水溶性色素评价为光稳定化效果较高并且能够抑制在曝光时检测灵敏度下降的稳定剂或水溶性色素。
〈相对于鲁米诺的相对灵敏度〉
针对各个发光检测用试剂第1-A液和1-B液，算出了发光检测用试剂第1-C液中的遮光发光量(鲁米诺发光量)相对于各发光检测用试剂第1-A液或1-B液中的遮光发光量(L-012发光量)的比例〔L-012发光量/鲁米诺发光量×100％＝相对灵敏度〕。基于该相对灵敏度，评价各种稳定剂或水溶性色素的检测灵敏度。
即，将表现出比鲁米诺发光量(645,938cps)更高的L-012发光量的发光检测用试剂第1-A液，评价为能够以比利用了鲁米诺发光的发光检测更高的灵敏度进行测定的检测灵敏度较高的试剂(L-012发光试剂)。换言之，将表现出100％以上的相对灵敏度的发光检测用试剂第1-A液所包含的稳定剂或水溶性色素，评价为是一种对L-012的发光强度不产生不良影响而能实现高灵敏度检测的稳定剂或水溶性色素。
[表2]
Figure GDA0001891102010000351
根据表2的结果可知，作为本发明的稳定剂的偶氮甲碱-H、新胭脂红以及酒石黄，都具有两种效果：能够抑制曝光引起的检测灵敏度下降的效果(光稳定化效果)；和对L-012(的钠盐)的发光强度的影响小而能够实现高灵敏度测定的效果。
《在使用过氧化物酶(POD)的HBs抗体测定体系中的试剂的制备以及HBs抗体的测定》
在使用过氧化物酶(POD)的HBs抗体的测定体系中，试剂的制备、以及使用了各种稳定剂或水溶性色素的HBs抗体的测定方法以及评价方法如下。
<实施例29～44以及比较例29～30>
(1)发光检测用试剂第1液的制备
(a)发光检测用试剂第1-A液的制备(实施例29～44)
将8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐(和光纯药工业(株)制)15.6mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，以化学发光检测时的最终浓度成为表3所示的规定浓度的添加量来添加表3所示的各种稳定剂或水溶性色素，进一步，添加2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.55)20mL之后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下均匀地混合而制备了发光检测用试剂第1-A液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(b)发光检测用试剂第1-B液的制备(比较例29)
将8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐(和光纯药工业(株)制)15.6mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，添加2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.55)20mL之后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第1-B液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(c)发光检测用试剂第1-C液的制备(比较例30)
将鲁米诺的钠盐(和光纯药工业(株)制)40mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，添加硼酸/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.55)20mL之后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第1-C液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(2)含磁性粒子的试剂(结合有HBs抗原的磁性粒子试剂)的制备
向装有50mL的含97重量％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液的带盖聚乙烯瓶中加入磁性粒子(按照WO2012/173002号公报记载的制造例1制作而成)12.5mL，在25℃温度下反应1小时后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体。然后，加入10mM的醋酸缓冲液(pH5.1)50mL并盖上瓶盖，慢慢倒置聚乙烯瓶2次来搅拌后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体而洗涤了磁性粒子。进行该洗涤操作4次。
将如此洗涤后的磁性粒子加入装有9mL的25重量％戊二醛1mL/碳酸氢钠缓冲液的带盖聚乙烯瓶中，在25℃温度下反应1小时。反应后，加入蒸馏水并盖上瓶盖，慢慢倒置聚乙烯瓶2次来搅拌后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体而洗涤了磁性粒子。进行该洗涤操作3次。
进一步，将如此洗涤后的磁性粒子加入装有8mL的含有2.24mg/mL浓度的HBs抗原(特瑞纳生物反应公司(TRINA BIOREACTIVES AG)制)的15mM的磷酸缓冲液(pH7.2)的带盖聚乙烯瓶中，在25℃温度下反应2小时。反应后，用钕磁铁收集磁性粒子，用生理盐水洗涤后，加入封闭液{50mM的含0.5％封闭艾斯(Block Ace)的MES缓冲液(pH5.5)}，在37℃温度下反应15～25小时，以此制造了结合有HBs抗原的磁性粒子。用50mM的含0.5％的封闭艾斯(Block Ace)(雪印乳业株式会社制)的3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)缓冲液(pH7.5)将其稀释而使结合有HBs抗原的磁性粒子浓度成为0.5mg/mL，制备了包含结合有抗原的磁性粒子的试剂(结合有HBs抗原的磁性粒子试剂)，在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(3)酶标记试剂(过氧化物酶(POD)标记HBs抗原试剂)的制备
使用HBs抗原(特瑞纳生物反应公司(TRINA BIOREACTIVES AG)制)、源自辣根的POD(罗氏诊断株式会社(ロシュ·ダイアグノスティックス(株))制)通过文献(S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,H.OGAWA；J Biochem(1982)Vol.92,(5):1413-1424)记载的方法制备了POD标记HBs抗原。用50mM的MES缓冲液(pH6.8)将其稀释而使POD标记HBs抗原浓度成为1.0mL/L，制备酶标记试剂(POD标记HBs抗原试剂)，在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(4)发光检测用试剂第2液的制备
将过氧化氢水溶液(和光纯药工业(株)制，试剂特级，浓度30重量％)67μL装入100mL的容量瓶。然后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第2液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(5)化学发光的检测
使用得到的各试剂，通过下述的检测方法，基于实施例29～44以及比较例29～30的发光检测用试剂第1液来测定发光量(平均值)，评价各种稳定剂或水溶性色素是否有光稳定化效果以及是否对L-012(的钠盐)的发光强度有影响。
首先，将由(1)得到的发光检测用试剂第1液(1-A液、1-B液、1-C液)以每支1mL的方式转移至2支5mL的试管，一支管在430～450Lx的荧光灯的光照下暴露30分钟(曝光发光检测用试剂第1液)，另一支试管用铝箔包裹进行遮光(遮光发光检测用试剂第1液)。
然后，将包含结合有抗原的磁性粒子的试剂(结合有HBs抗原的磁性粒子试剂)10～50μg、以及用含2％的牛血清白蛋白的50mM的MOPS缓冲液(pH7.5)制备成的HBs抗体浓度为250mIU/mL的标准HBs抗体溶液25μL加入试管中并混合，在37℃温度下反应3分钟，形成“结合有HBs抗原的磁性粒子-HBs抗体”复合体。反应后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体后，加入生理盐水100μL，使磁性粒子分散并收集磁粒后，通过吸气装置抽吸去除液体，进行3次这样的洗涤操作。
接着，将酶标记试剂(POD标记HBs抗原试剂)50μL加入试管中，在37℃温度下反应3分钟，形成“结合有HBs抗原的磁性粒子-HBs抗体-POD标记HBs抗原”复合体。反应后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体后，加入生理盐水100μL，使磁性粒子分散并收集磁粒后，通过吸气装置抽吸去除液体，进行2次这样的洗涤操作。
最后，分别同时加入曝光发光检测用试剂第1液(1-A液、1-B液、1-C液)或遮光发光检测用试剂第1液(1-A液、1-B液、1-C液)100μL和发光检测用试剂第2液100μL，在37℃温度下进行43秒钟发光反应，通过发光检测器(Lumat LB9507：贝特霍尔德公司(BertholdJapan，ベルトールドジャパン)制)测定同时添加发光检测用试剂第1液和第2液开始起43～45秒钟时间点的平均发光量。
(6)结果
根据得到的结果，如下所示地算出“稳定剂或水溶性色素的光稳定化效果”以及“相对于鲁米诺的相对灵敏度”，进行了各种稳定剂或水溶性色素的评价。结果分别示于表3。
〈稳定剂或水溶性色素的光稳定化效果〉
针对各个发光检测用试剂第1液，算出了曝光发光检测用试剂第1液中的平均发光量(曝光发光量)相对于遮光发光检测用试剂第1液中的平均发光量(遮光发光量)的比例〔曝光发光量/遮光发光量×100％＝发光量比〕。基于该发光量比来评价各种稳定剂或水溶性色素的光稳定化效果。
即，发光量比越接近100％，意味着各种稳定剂或水溶性色素对L-012(的钠盐)的光稳定化效果越高，基于使用未添加稳定剂或水溶性色素的发光检测用试剂第1-B液的情况下的发光量比是67％，由此将表现出72％以上发光量比的发光检测用试剂第1-A液所含的稳定剂或水溶性色素，评价为光稳定化效果较高并且能够抑制在曝光时检测灵敏度下降的稳定剂或水溶性色素。
〈相对于鲁米诺的相对灵敏度〉
针对各个发光检测用试剂第1-A液和1-B液，算出了发光检测用试剂第1-C液中的遮光发光量(鲁米诺发光量)相对于各发光检测用试剂第1-A液或1-B液中的遮光发光量(L-012发光量)的比例〔L-012发光量/鲁米诺发光量×100％＝相对灵敏度〕。基于该相对灵敏度，评价各种稳定剂或水溶性色素的检测灵敏度。
即，将表现出比鲁米诺发光量(321,482cps)更高的L-012发光量的发光检测用试剂第1-A液，评价为能够以比利用了鲁米诺发光的发光检测更高的灵敏度进行测定的检测灵敏度较高的试剂(L-012发光试剂)。换言之，将表现出100％以上的相对灵敏度的发光检测用试剂第1-A液所包含的稳定剂或水溶性色素，评价为是一种对L-012的发光强度不产生不良影响而能实现高灵敏度检测的稳定剂或水溶性色素。
[表3]
Figure GDA0001891102010000401
根据表3的结果可知，作为本发明的稳定剂的偶氮甲碱-H、新胭脂红、对磺基苯偶氮变色酸钠、皂黄、丽春红-S以及酒石黄中的任一者，都具有两种效果：能够抑制曝光引起的检测灵敏度下降的效果(光稳定化效果)；和对L-012(的钠盐)的发光强度的影响小而能够实现高灵敏度测定的效果。
《在使用过氧化物酶(POD)的醛固酮测定体系中的试剂的制备以及醛固酮的测定》
在使用过氧化物酶(POD)的醛固酮的测定体系中，试剂的制备、以及使用了各种稳定剂或水溶性色素的醛固酮的测定方法以及评价方法如下。
<实施例45～48以及比较例31～36>
(1)发光检测用试剂第1液的制备
(a)发光检测用试剂第1-A液的制备(实施例45～48)
将8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐(和光纯药工业(株)制)15.6mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，以化学发光检测时的最终浓度成为表4所示的规定浓度的添加量来添加偶氮甲碱-H，进一步，添加3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.0)20mL后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下均匀地混合而制备了发光检测用试剂第1-A液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(b)发光检测用试剂第1-B液的制备(比较例31～33)
将8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮的钠盐(和光纯药工业(株)制)15.6mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，添加3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.0)20mL后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第1-B液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(c)发光检测用试剂第1-C液的制备(比较例34～36)
将鲁米诺的钠盐(和光纯药工业(株)制)40mg以及4-(4-羟基苯基)噻唑(和光纯药工业(株)制)3.5mg装入100mL的容量瓶。然后，添加硼酸/氢氧化钠缓冲液(250mM、pH8.55)20mL之后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第1-C液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(2)含磁性粒子的试剂(结合有抗小鼠IgG多克隆抗体(山羊)的磁性粒子试剂)的制备
在装有80mL的含97重量％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液的带盖聚乙烯瓶中加入磁性粒子(按照WO2012/173002号公报记载的制造例1制作而成)20mL，在25℃温度下反应1小时后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体。然后，加入10mM的醋酸缓冲液(pH5.1)80mL并盖上瓶盖，慢慢倒置聚乙烯瓶2次来搅拌后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体而洗涤了磁性粒子。进行该洗涤操作4次。
将如此洗涤后的磁性粒子加入装有80mL的0.5重量％的琥珀酸酐乙醇溶液的带盖聚乙烯瓶中，在25℃温度下反应2小时。反应后，加入100mM的2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(pH5.0)80mL并盖上瓶盖，慢慢倒置聚乙烯瓶2次来搅拌后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体而洗涤了磁性粒子。进行4次该洗涤操作。
进一步，将如此洗涤后的磁性粒子加入装有80mL的含有100μg/mL浓度的抗小鼠IgG多克隆抗体(山羊)(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immuno Research)制)的100mM的MES缓冲液(pH5.0)的带盖聚乙烯瓶中，在25℃温度下反应15～25小时。反应后，用钕磁铁收集磁性粒子，用MES缓冲液洗涤后，加入0.03％戊二醛水溶液8mL，在25℃温度下反应2小时。然后，加入硼氢化钠19.2mg，在25℃温度下反应30分钟后，用钕磁铁收集磁性粒子，用MES缓冲液洗涤后，加入封闭液{50mM的含0.5％封闭艾斯(Block Ace)(雪印乳业株式会社制)的MES缓冲液(pH5.5)}，在25℃温度下反应15～25小时，由此制作了结合有抗小鼠IgG多克隆抗体(山羊)的磁性粒子。进一步，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除封闭液后，用MES缓冲液(pH5.5)将其稀释而使结合有抗小鼠IgG多克隆抗体的磁性粒子浓度成为0.5mg/mL，由此制备了包含结合有抗体的磁性粒子的试剂(结合有抗小鼠IgG多克隆抗体(山羊)的磁性粒子试剂)，在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(3)免疫反应用缓冲液(含有抗醛固酮单克隆抗体(小鼠)的缓冲液)的制备
在200mM的N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)缓冲液(pH8.2)100mL中，添加抗醛固酮单克隆抗体(小鼠)(ITM株式会社制)0.1mL后，在25℃温度下搅拌5分钟，由此制备含有1mL/L浓度的抗醛固酮单克隆抗体(小鼠)的200mM的N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸缓冲液(pH8.2)，得到了免疫反应用缓冲液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(4)酶标记试剂(过氧化物酶(POD)标记醛固酮抗原试剂)的制备
使用醛固酮抗原(西格玛奥德里奇(SIGMA ALDRICH)制)、源自辣根的POD(罗氏诊断株式会社(ロシュ·ダイアグノスティックス(株))制)，通过文献(S.YOSHITAKE,M.IMAGAWA,E.ISHIKAWA,H.OGAWA；J Biochem(1982)Vol.92,(5):1413-1424)记载的方法制备了POD标记醛固酮抗原。用50mM的N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)缓冲液(pH7.2)将其稀释而使POD标记醛固酮抗原浓度成为1.0mL/L的浓度，由此制备了酶标记试剂(POD标记醛固酮抗原试剂)，在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(5)发光检测用试剂第2液的制备
将过氧化氢水溶液(和光纯药工业(株)制，试剂特级，浓度30重量％)67μL装入100mL的容量瓶。然后，用蒸馏水将溶液的容量定容至100mL，在25℃温度下混合均匀而制备了发光检测用试剂第2液。在用于测定之前冷藏(2～10℃)保存。
(6)化学发光的检测
使用得到的各试剂，通过下述的检测方法，基于实施例45～48以及比较例31～36的发光检测用试剂第1液测定了发光量(平均值)，评价偶氮甲碱-H是否有光稳定化效果以及对L-012(的钠盐)的发光强度是否有影响。
首先，将由(1)得到的发光检测用试剂第1液中的第1-A液和第1-B液分别以每支1mL的方式转移至2支5mL的试管中，一支管在430～450Lx的荧光灯的光照下暴露30分钟(曝光发光检测用试剂第1液)，另一支试管用铝箔包裹进行遮光(遮光发光检测用试剂第1液)。将第1-C液1mL转移至1支5mL的试管中，用铝箔包裹试管来进行遮光(遮光发光检测用试剂第1液)。
然后，将包含结合有抗体的磁性粒子的试剂(结合有抗小鼠IgG多克隆抗体(山羊)的磁性粒子试剂)10～50μg、用含1％的牛血清白蛋白的15mM的磷酸缓冲液(pH7.2)制备而成的醛固酮浓度为0～800pg/mL的标准醛固酮溶液25μL、以及免疫反应用缓冲液50μL加入试管中并混合，在37℃温度下反应3分钟后，进一步，将酶标记试剂(POD标记醛固酮抗原试剂)50μL加入试管中，在37℃温度下反应3分钟，形成“结合有抗小鼠IgG多克隆抗体(山羊)的磁性粒子-抗醛固酮单克隆抗体(小鼠)-POD标记醛固酮抗原”复合体。反应后，用钕磁铁收集磁性粒子，通过吸气装置抽吸去除液体后，加入生理盐水100μL，使磁性粒子分散并收集磁粒后，通过吸气装置抽吸去除液体，进行2次这样的洗涤操作。
最后，同时分别加入曝光发光检测用试剂第1液(1-A液、1-B液)或遮光发光检测用试剂第1液(1-A液、1-B液、1-C液)100μL和发光检测用试剂第2液100μL，在37℃温度下进行43秒钟发光反应，通过发光检测器(Lumat LB9507：贝特霍尔德公司(Berthold Japan，ベルトールドジャパン)制)测定同时添加发光检测用试剂第1液和第2液开始起43～45秒钟时间点的平均发光量。
(7)结果
根据得到的结果，如下所述地算出了“偶氮甲碱-H(稳定剂)的光稳定化效果”以及“相对于鲁米诺的相对灵敏度”，进行了偶氮甲碱-H(稳定剂)的评价。结果示于表4。
〈偶氮甲碱-H(稳定剂)的光稳定化效果〉
针对各个发光检测用试剂第1液，算出了曝光发光检测用试剂第1液中的平均发光量(曝光发光量)相对于遮光发光检测用试剂第1液中的平均发光量(遮光发光量)的比例〔曝光发光量/遮光发光量×100％＝发光量比〕。基于该发光量比，评价了偶氮甲碱-H(稳定剂)的光稳定化效果。
即，发光量比越接近100％，意味着偶氮甲碱-H(稳定剂)对L-012(的钠盐)的光稳定化效果越高，判断在表4所示的各醛固酮浓度中是否表现出比使用未添加偶氮甲碱-H(稳定剂)的发光检测用试剂第1-B液的情况下的发光量比更高的发光量比，由此评价醛固酮的浓度范围与光稳定化效果之间的关系。
〈相对于鲁米诺的相对灵敏度〉
针对各个发光检测用试剂第1-A液和1-B液，算出了发光检测用试剂第1-C液中的遮光发光量(鲁米诺发光量)相对于各发光检测用试剂第1-A液或1-B液中的遮光发光量(L-012发光量)的比例〔L-012发光量/鲁米诺发光量×100％＝相对灵敏度〕。基于该相对灵敏度，评价偶氮甲碱-H(稳定剂)的检测灵敏度。
即，判断在表4所示的各醛固酮浓度中是否表现出比鲁米诺发光量更高的L-012发光量，由此评价醛固酮的浓度范围与检测灵敏度之间的关系。
[表4]
Figure GDA0001891102010000451
根据表4的结果可知，当醛固酮的浓度为0～800pg/mL时，作为本发明的稳定剂的偶氮甲碱-H在很宽的浓度范围内都具有两种效果：能够抑制曝光引起的检测灵敏度下降的效果(光稳定化效果)；和对L-012(的钠盐)的发光强度的影响小而能够实现高灵敏度测定的效果，因此无论目标物质(测定对象物质)的浓度如何，本发明的稳定剂都兼具光稳定化效果和能够实现高灵敏度测定的效果。
根据表1～表4的结果可知，在将作为本发明的稳定剂的偶氮甲碱-H、新胭脂红、对磺基苯偶氮变色酸钠、皂黄、丽春红-S和酒石黄中的任一者用作L-012或它的盐的稳定剂的情况下，因为相较于不使用稳定剂的情况表现出更高的发光量比，所以本发明的稳定剂抑制了因曝光引起的L-012或它的盐的劣化(分解)(具有光稳定化效果)。因此，由于只要在化学发光检测中使本发明的稳定剂在含L-012或它的盐的检测溶液(发光底物液)中共存，就能抑制曝光引起的检测灵敏度下降，所以无需对含L-012或它的盐的检测溶液(发光底物液)进行遮光，能够更简便地用于测定。进一步可知，本发明的稳定剂不易对L-012或它的盐本身的发光量产生不良影响，相比于利用了鲁米诺发光的发光检测，能够以高灵敏度进行测定。因此，只要在化学发光检测中使本发明的稳定剂在含L-012或它的盐的检测溶液(发光底物液)中共存，就能够在不对测定产生不良影响的情况下以高灵敏度又良好的精确度检测目标物质(测定对象物质)。另外可知，在这些稳定剂当中，偶氮甲碱-H以及新胭脂红总体上光稳定化效果高，无论测定体系如何都能以高灵敏度又良好的精确度测定目标物质(测定对象物质)。而另一方面，N-苯甲酰基H酸单钾单钠盐、茜素黄GG以及甲酚红等水溶性色素不能获得光稳定化效果或者会对测定产生不良影响，不能高精确度地检测目标物质(测定对象物质)。考虑到上述效果与稳定剂的最大吸收波长不相关，这意味着上述效果与稳定剂的结构有关系。
综上可知，只有本发明的稳定剂兼具对L-012或它的盐的稳定化效果和对测定不产生不良影响的效果。因此，只要在化学发光检测中使本发明的稳定剂在含L-012或它的盐的检测溶液(发光底物液)中共存，就能够以高灵敏度又良好的精确度且简便地测定生物体中的各种目标物质(测定对象物质)。
工业上利用的可能性
本发明的由通式[1]表示的稳定剂是一种能够抑制作为化学发光物质的L-012或它的盐因曝光引起的分解(劣化)的化合物，通过在化学发光检测中使本发明的稳定剂在L-012或它的盐中共存，从而能够抑制因曝光引起的L-012或它的盐的分解(劣化)而使L-012或它的盐长期稳定化，进而能够抑制L-012或它的盐的发光强度的减弱(检测灵敏度的下降)。
另外，本发明的组合物以及本发明的发光检测用试剂盒含有L-012和由上述通式[1]表示的化合物(本发明的稳定剂)，或者含有L-012的盐和由上述通式[1]表示的化合物，在该组合物或该试剂盒的制造过程中或其使用时(测定时)，使曝光引起的L-012或它的盐的发光强度的减弱(检测灵敏度的下降)得到抑制，而且不易对L-012或它的盐自身的发光量产生不良影响，因此，例如只要将其用于化学发光检测中，就能够以高灵敏度又良好的精确度且简便地测定生物体中的目标物质(测定对象物质)。

Claims (8)

1.化合物在8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮或它的盐的稳定剂中的应用，其中，所述化合物选自4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸或它的盐、7-羟基-8-(4-磺基-1-萘基偶氮)-1,3-萘二磺酸或它的盐、2-(4-磺基苯基偶氮)-1,8-二羟基-3,6-萘二磺酸或它的盐、3-[4-(苯基氨基)苯基偶氮]苯磺酸或它的盐、以及3-羟基-4-[4-(4-磺基苯基偶氮)-2-磺基苯基偶氮]-2,7-萘二磺酸或它的盐。
2.如权利要求1所述的应用，所述化合物选自4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸或它的盐、以及7-羟基-8-(4-磺基-1-萘基偶氮)-1,3-萘二磺酸或它的盐。
3.一种8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮或它的盐的稳定化方法，其中，使化合物在8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮或它的盐中共存，所述化合物选自4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸或它的盐、7-羟基-8-(4-磺基-1-萘基偶氮)-1,3-萘二磺酸或它的盐、2-(4-磺基苯基偶氮)-1,8-二羟基-3,6-萘二磺酸或它的盐、3-[4-(苯基氨基)苯基偶氮]苯磺酸或它的盐、以及3-羟基-4-[4-(4-磺基苯基偶氮)-2-磺基苯基偶氮]-2,7-萘二磺酸或它的盐。
4.如权利要求3所述的稳定化方法，其中，所述化合物选自4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸或它的盐、以及7-羟基-8-(4-磺基-1-萘基偶氮)-1,3-萘二磺酸或它的盐。
5.一种组合物，其中，其包含8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮和化合物，所述化合物选自4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸或它的盐、7-羟基-8-(4-磺基-1-萘基偶氮)-1,3-萘二磺酸或它的盐、2-(4-磺基苯基偶氮)-1,8-二羟基-3,6-萘二磺酸或它的盐、3-[4-(苯基氨基)苯基偶氮]苯磺酸或它的盐、以及3-羟基-4-[4-(4-磺基苯基偶氮)-2-磺基苯基偶氮]-2,7-萘二磺酸或它的盐。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述化合物选自4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸或它的盐、以及7-羟基-8-(4-磺基-1-萘基偶氮)-1,3-萘二磺酸或它的盐。
7.一种发光检测用试剂盒，其中，其包含8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4(2H,3H)-二酮和化合物，所述化合物选自4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸或它的盐、7-羟基-8-(4-磺基-1-萘基偶氮)-1,3-萘二磺酸或它的盐、2-(4-磺基苯基偶氮)-1,8-二羟基-3,6-萘二磺酸或它的盐、3-[4-(苯基氨基)苯基偶氮]苯磺酸或它的盐、以及3-羟基-4-[4-(4-磺基苯基偶氮)-2-磺基苯基偶氮]-2,7-萘二磺酸或它的盐。
8.如权利要求7所述的发光检测用试剂盒，其中，所述化合物选自4-羟基-5-(亚水杨基氨基)-2,7-萘二磺酸或它的盐、以及7-羟基-8-(4-磺基-1-萘基偶氮)-1,3-萘二磺酸或它的盐。
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