JP3477651B2 - スーパーオキシドラジカルの検出・定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はスーパーオキシドラジカ
ル（Ｏ₂ ^-）の検出・定量法に関する。

【０００２】

【従来の技術】スーパーオキシドラジカル（Ｏ₂ ^-）は、
好中球，好酸球，好塩基球等の顆粒球系白血球，単球，
マクロファージ，メサンギウム細胞，血管平滑筋細胞，
血管内皮細胞などの種々の細胞より産生され、Ｏ₂ ^-から
過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂），ヒドロキシラジカル（・Ｏ
Ｈ），ヒポクロライト（ＯＣl^-），一重項酸素（¹Ｏ₂）
等が派生し、これらの活性酸素種は組織・細胞等に傷害
を与え種々の疾患に関与するといわれている（化学と生
物 第３０巻（Ｎo.3），第１８４頁，（1992））。従来
Ｏ₂ ^-の測定法としてはチトクロームＣ，ニトロブルーテ
トラゾリウム等を用いる分光的方法，ルミノール，ウミ
ホタル・ルシフェリン誘導体等を用いる化学発光法，電
子スピン共鳴法などがよく用いられている。このうち化
学発光法は、同一サンプル中での活性酸素産生をトレー
スし得る簡便な方法として多用されている。しかし、ル
ミノールはＯ₂ ^-に対して感受性が低く、ウミホタル・ル
シフェリン誘導体はＯ₂ ^-に対する感受性は高いが、自動
酸化の結果によりバックグランド値が高いという欠点を
有している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、Ｏ₂ ^-に感受性
が高くかつバックグランド値の低い発光性物質が見い出
されれば、より高感度な化学発光法によるＯ₂ ^-の測定が
可能となり、その結果、たとえば種々の細胞からのＯ₂ ^-
産生を調節する薬物のスクリーニングに有利に用いるこ
とができる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記実状に鑑み、本発明
者らはＯ₂ ^-の実用的な測定手段を確立すべく種々検討し
た結果、本発明を完成した。すなわち、本発明は （1）スーパーオキシドラジカル（Ｏ₂ ^-）と下記一般式
（I）

【化３】 [式中、Ｒ₁はそれぞれ置換されていてもよい炭化水素基
またはヘテロ環基を示し、Ｒ₂は水素、水酸基、チオー
ル基、アミノ基またはモノ置換アミノ基を示し、Ｒ₂が
モノ置換アミノ基の場合、Ｒ₂はＲ₁と一緒になって環を
形成していてもよい。Ｒ₃は水素原子、酸素原子、置換
されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ
基、置換されていてもよいチオール基、ハロゲン原子、
ヘテロ環基、ニトロ基、シアノ基、エステル化またはア
ミド化されていてもよいカルボキシル基、アジド基、ス
ルホ基または有機スルホニル基を示し、ただし、Ｒ₁が
脂肪族基の場合、Ｒ₃は水素原子ではない。Ｘは酸素原
子または硫黄原子を示す］で表されるピリドピリダジン
誘導体またはその塩とを反応させ化学発光を生じさせる
ことを特徴とするスーパーオキシドラジカルの検出・定
量法に関する。本発明方法を適用し得る試料としては、
Ｏ₂ ^-を含有または発生するものであれば、特に限定され
ない。例えば、細胞から産生されるＯ₂ ^-の測定に好まし
く適用できる。Ｏ₂ ^-を産生する細胞としては、白血球
系、脈管系もしくは神経系細胞およびこれらに由来する
株化細胞などが挙げられるが、Ｏ₂ ^-を産生するものなら
ばいずれの細胞，細胞株でもよい。白血球系細胞として
は、例えば、好中球，好酸球，好塩基球等の顆粒球系白
血球および単球、マクロファージなどが、脈管系細胞と
しては、メサンギゥム細胞、血管平滑筋細胞，血管内皮
細胞などが、神経系細胞としては、神経細胞，神経膠細
胞などが挙げられる。細胞浮遊液は、それぞれの細胞の
培養液［例えば、 ＲＰＭＩ（Canser Research 47, 4771
-4775 (1987))］もしくはHanks液［例えば、ＨＢＳＳ
（Methods in Enzymology 186, 585-591 (1990))]がよ
く、血清含有量は０〜２０％，好ましくは０〜１０％が
用いられる。血清としては牛胎児血清が好ましい。測定
に用いる細胞数は、検出可能な発光量を得るための細胞
数であればいずれの数でもよいが、１０⁴〜１０⁸個、好
ましくは１０⁵〜１０⁷個が用いられる。

【０００５】前記一般式（I）で示されるピリドピリダ
ジン誘導体における置換基Ｒ₁の炭化水素基の具体例と
しては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソ
プロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert
−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、ヘキシルのよ
うな直鎖状もしくは分枝鎖状の炭素数１〜６の低級アル
キル基;例えば、ビニール、アリルのような炭素数２〜
３のアルケニル基;例えば、エチニル、プロパルギルの
ような炭素数２〜３のアルキニル基;例えば、ベンジ
ル、フェネチルのような炭素数７〜１２のアラルキル
基;例えば、フェニル、ナフチルのような炭素数６〜１
０のアリール基が挙げられる。また、窒素、硫黄または
酸素の少なくとも１個、好ましくは１〜４個のヘテロ原
子を含む、不飽和または飽和された５ないしは６員環の
ヘテロ環基としては、２−ピリジル、４−ピリジル、２
−チエニル、２−フリル、イミダゾリル、トリアゾリ
ル、テトラゾリル、モルホリノ、ピペラジニル、４−チ
アゾリル、２−アミノ−４−チアゾリルなどが挙げられ
る。これらの置換基Ｒ₁が有していてもよい置換基とし
ては、式

【０００６】

【化４】

【０００７】[式中、Ｒ₄は−ＣＮ、−hal、−ＯＰＯ₃Ｍ
₂、−ＯＳＯ₃Ｍ、−ＣＯ₂Ｒ₅、−ＳＲ₆、−ＯＲ₆、−Ｎ
ＨＲ₆であり、Ａは硫黄、酸素、窒素原子を、nは１〜４
の整数を意味し、Ｍはアルカリ金属または水素原子を、
halはフッ素、塩素、臭素、よう素等のハロゲン原子を
示す。Ｒ₅は水素原子あるいはメチル、エチル、プロピ
ルのような低級アルキル基またはマレイミド、スクシン
イミドもしくは５−ノルボルネン−２,３−カルボキシ
イミド基のような複合体形成可能な活性イミドエステル
を形成する基、Ｒ₆は水素原子あるいはメチル、エチ
ル、プロピルのような低級アルキル基または式

【０００８】

【化５】

【０００９】[式中、Ｒ₇はマレイミド、スクシンイミ
ド、５−ノルボルネン−２,３−カルボキシイミド基を
示す]で表わされる複合体形成能を有するコハク酸ハー
フエステルのような活性イミドエステルを形成する基を
示す]で表わされる基が挙げられる。

【００１０】一般式(I)で示される置換基Ｒ₂におけるモ
ノ置換アミノ基の置換基の具体例としては、例えば、Ｒ
₁で例示したような直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜
６の低級アルキル基、炭素数２〜３のアルケニル基、炭
素数２〜３のアルキニル基、炭素数７〜１２のアラルキ
ル基および炭素数６〜１０のアリール基が挙げられる。
また、Ｒ₂が置換基Ｒ₁と一緒になって環を形成していて
もよいモノ置換アミノ基である場合の化合物の具体例と
しては、一般式

【００１１】

【化６】

【００１２】[式中、Ｒ₃およびＸは前記と同意義であ
り、環Ａは例えば、イミダゾール、チアゾール、ピロー
ルおよびピリダジン等の１〜２個の不飽和結合を有して
いてもよい含窒素５〜７員環またはベンゼン環もしくは
例えば、インドール、ベンゾフラン、キノリン等のヘテ
ロ環と縮合していてもよい含窒素５〜７員環を示す。環
Ａは例えば、メチル、エチル、プロピルのような炭素数
１〜６の低級アルキル基で置換されていてもよい]で表
わされる環状アミンが挙げられる。

【００１３】一般式(I)における置換基Ｒ₃で示される置
換されていてもよい水酸基としては、例えば、水酸基、
アルコキシ基、アリルオキシ基、アラルキルオキシ基が
挙げられる。アルコキシ基のアルキル基としては、Ｒ₁
で例示したような直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６
の低級アルキルが、アリールオキシ基のアリール基とし
てはフェニル、ナフチル等の炭素数６〜１０のアリール
基が、また、アラルキルオキシ基のアラルキル基として
はベンジル、フェネチル等の炭素数７〜１２のアラルキ
ル基が挙げられる。Ｒ₃で示される置換されていてもよ
いアミノ基としては、例えばアミノ基、モノ置換アミノ
基、ジ置換アミノ基が挙げられる。モノ置換アミノ基の
置換基としては、例えば、Ｒ₁で例示したような直鎖状
もしくは分枝鎖状の炭素数１〜６の低級アルキル基;例
えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシ
ルのような炭素数３〜６のシクロアルキル基;例えば、
ビニル、アリルのような炭素数２〜３のアルケニル基;
例えば、エチニル、プロパルギルのような炭素数２〜３
のアルキニル基;例えば、ベンジル、フェネチルのよう
な炭素数７〜１２のアラルキル基;例えば、フェニル、
ナフチルのような炭素数６〜１０のアリール基が挙げら
れる。ジ置換アミノ基における置換基としては、前記モ
ノ置換アミノ基の置換基が、同一または異なって用いら
れる。

【００１４】Ｒ₃で示される置換されていてもよいチオ
ール基としては、例えばチオール基、アルキルチオ基、
アリールチオ基、アラルキルチオ基が挙げられる。アル
キルチオ基のアルキル基としては、Ｒ₁で例示したよう
な直鎖状もしくは分枝鎖状の炭素数１〜６の低級アルキ
ルが、アリールチオ基のアリール基としては、例えば、
炭素数６〜１０のフェニル、ナフチルが、また、アラル
キルチオ基のアラルキル基としては、例えば、炭素数７
〜１２のベンジル、フェネチルが挙げられる。

【００１５】Ｒ₃で示されるハロゲン原子としては、よ
う素、臭素、塩素、フッ素が挙げられる。Ｒ₃で示され
るヘテロ環基としては、Ｒ₁について挙げたヘテロ環基
が挙げられる。Ｒ₃で示されるエステル化またはアミド
化されていてもよいカルボキシル基としては、例えば、
カルボキシル基、カルバモイル基およびアルコキシカル
ボニル基が挙げられる。Ｒ₃で示されるエステル化カル
ボキシル基としてのアルコキシカルボニル基におけるア
ルキル基としては、Ｒ₁について挙げたアルキル基が挙
げられる。Ｒ₃で示される有機スルホニル基は、アルキ
ルスルホニル基およびアリールスルホニル基を包含す
る。アルキルスルホニル基におけるアルキル基およびア
リールスルホニル基におけるアリール基としては、例え
ば、それぞれＲ₁について挙げたアルキル基およびアリ
ール基が挙げられる。アリール基、特にフェニル基は、
メチルまたはエチルのような低級アルキル基で置換され
ていてもよい。一般式（Ｉ）で表されるピリドピリダジ
ン環のカルボニルまたはチオカルボニル基は、容易にエ
ノル化して、一価または二価のカチオンと塩を形成する
ことができる。

【００１６】一価のカチオンとしては、アンモニウムイ
オンやアルカリ金属が挙げられ、たとえば、アンモニ
ア、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミンなどの
Ｃ_{1〜 4}モノアルキルアミン、ジメチルアミン、ジエチル
アミン、ジブチルアミンなどのジ（Ｃ_{1〜 4}）アルキル
アミン、トリメチルアミン、トリエチルアミンなどのト
リ（Ｃ_{1〜 4}）アルキルアミン、ピリジニウムあるいは
ヒドラジニウム等のアンモニウムイオンやリチウム、カ
リウム、ナトリウムなどのアルカリ金属が挙げられる。
二価のカチオンとしては、カルシウム、マグネシウムな
どのアルカリ土類金属が挙げられる。

【００１７】前記一般式（I）で表される化合物のう
ち、下記一般式（II）

【化７】 [式中、Ｒ₁は置換されていてもよいフェニル基を、Ｒ₂
は水素原子またはアミノ基を、Ｒ₃は水素原子、酸素原
子、置換されていてもよい水酸基、ハロゲン原子、ヘテ
ロ環基を示す］で表されるピリドピリダジン誘導体また
はそのナトリウム塩が好ましく、さらに好ましくは、上
記一般式（II）において、Ｒ₁がフェニル基、Ｒ₂がアミ
ノ基、Ｒ₃がハロゲン原子（好ましくはクロル）がとり
わけ好ましい。

【００１８】本発明における一般式（I）で表されるピ
リドピリダジン誘導体またはその塩としては、 ＥＰ公開
第０４９１４７７号公報や薬学雑誌第９２巻第１３３３
頁（１９７２）に記載のものが挙げられる。

【００１９】本発明方法は、試料中のＯ₂ ^-と一般式
（Ｉ）のピリドピリダジン誘導体またはその塩とを共存
させ化学発光を生じさせることによって実施される。発
光基質である一般式（Ｉ）のピリドピリダジン誘導体ま
たはその塩は用時溶液として、例えば緩衝液に溶解して
用いられるが、その緩衝液は該発光基質の希釈に用いる
ことができるものであればいずれでもよく、リン酸緩衝
液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などが挙
げられる。また、緩衝液のｐＨとしては、中性付近、例
えばｐＨ７〜８を選択することができる。また、反応温
度としては、０〜６０℃の範囲、特に２０〜３７℃が望
ましい。測定に用いられる基質濃度としては１０μＭ〜
１０ｍＭ，とりわけ３００μＭ〜１ｍＭの範囲が望まし
い。

【００２０】細胞由来のＯ₂ ^-を測定する場合、それぞれ
前述の濃度になるよう調製された細胞浮遊液と発光基質
を共存させて、化学発光を行わせ、速やかにその発光を
測定する。このとき混合液に、必要に応じてＯ₂ ^-産生を
誘導する刺激剤、例えば好中球の場合、ｆＭＬＰ（Ｎ−
formyl−Ｌ−methionyl−Ｌ−leucyl−Ｌ−phenylalani
ne），Ｃ５ａ（アナフィラトキシン）またはＰＡＦ（血
小板活性化因子）等を加えることができる。発光の測定
は、市販もしくは自作の測定装置（例えば高感度な光電
子増倍管を備えたフォトンカウンターなど）で行なうこ
とができる。すなわち、細胞浮遊液と発光基質を混合
後、もしくは混合して刺激剤を加えた後、直ちに測定を
開始し、数分ないし数十分後まで発光量を測定すればよ
い。以上のような方法を用いることにより、細胞から産
生されるＯ₂ ^-の定量が可能となる。従って、細胞からの
Ｏ₂ ^-の産生を調節する薬物をスクリーニングしたい場
合、対象薬物と対象細胞とを共存せしめ、産生されるＯ
₂ ^-を本発明方法を適用し検出定量することにより、対象
薬物の高感度な評価法として極めて有効に利用すること
ができる。

【００２１】

【実施例】以下に参考例および実施例を挙げ本発明をさ
らに具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限
するものではない。 参考例１ エチル３−アミノ−３−エトキシアクリレート シアノ酢酸エチル２２６g(２モル)、エタノール１０１g
(２.２モル)、乾燥ジエチルエーテル１００gに氷冷下、
塩酸ガス９３.５g(１.３eq)を吹き込み一晩放置した。
析出した無色プリズム晶をジエチルエーテルを用いてろ
取した(塩酸塩)。収量３５２.５g(９０.３％)。融点１
０３−１０５℃。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d₆)δ:１.２３(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２
Ｈz)、１.３７(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈz)、３.９４(２
Ｈ、br.)、４.１５(２Ｈ、q、Ｊ＝７.２Ｈz)、４.５１
(２Ｈ、q、Ｊ＝６.８Ｈz)。得られた結晶を氷冷した炭
酸水素ナトリウム２００g(１.２eq)水溶液に加えジエチ
ルエーテルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗
浄、硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去し、減圧蒸
留により精製した。収量２５３.８g(７９.７％)。沸点
_1.8７８℃。 ＩＲ(neat)ν:２９８０、１６６０、１６１０、１５４
０、１１６０、１０７０cm^-1。

【００２２】参考例２ ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−フェ
ニルピリジン塩酸塩 エチルベンゾイルピルベート１.１１g(５ミリモル)、エ
チル３−アミノ−３−エトキシアクリレート１.７５g
(２.２eq)を１００℃で１.５時間加熱した。減圧で低沸
点物質を留去した後、反応液に１０％塩酸２mlを加え、
生じた結晶をジエチルエーテルを用いてろ取した。酢酸
エチルから再結晶し淡黄色針状晶を得た。収量０.７g
(３９.８％)。融点７８−８１、１４５−１４８℃(二重
融点)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)δ:１.２６(３Ｈ、t、Ｊ＝７.５Ｈ
z)、１.３０(３Ｈ、t、Ｊ＝７.５Ｈz)、４.２７(２Ｈ、
q、Ｊ＝７.５Ｈz)、４.２８(２Ｈ、q、Ｊ＝７.５Ｈz)、
７.１７(１Ｈ、s)、７.４３(３Ｈ、m)、８.０５(２Ｈ、
m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７４０、１７００、１６５０、１３０
０cm^-1。 元素分析:計算値(Ｃ₁₇Ｈ₁₈Ｎ₂Ｏ₄・ＨＣl)Ｃ:５８.２
１; Ｈ:５.４６; Ｎ:７.９９。測定値Ｃ:５８.４５;
Ｈ:５.４８; Ｎ:８.０４。

【００２３】参考例３ ３,４−ジエトキシカルボニル−６−フェニル−２−ピ
リドン ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−フェ
ニルピリジン塩酸塩３.５０g(１０ミリモル)を２％塩酸
９０ml、ジオキサン６０mlに溶かし、亜硝酸ナトリウム
０.８３g(１.２eq)を水３mlに溶かして滴下した。室温
で４時間撹拌し、一晩放置した。溶媒を留去し析出した
結晶を水を用いてろ取した。エタノールから再結晶し淡
黄色プリズム晶を得た。収量１.９g(６０.３％)。融点
１４３−１４４℃。 ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)δ:１.３３(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈ
z)、１.３６(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈz)、４.３７(４Ｈ、
q、Ｊ＝７.２Ｈz)、６.９５(１Ｈ、s)、７.４７(３Ｈ、
m)、７.７９(２Ｈ、m)。ＩＲ(ＫＢr)ν:２９００−３０
００、１７４０、１６３５、１６１５、１２４５cm^-1。 元素分析:計算値(Ｃ₁₇Ｈ₁₇ＮＯ₅)Ｃ:６４.７５; Ｈ:５.
４３; Ｎ:４.４４。測定値Ｃ:６４.８２; Ｈ:５.５５;
Ｎ:４.４６。

【００２４】参考例４ ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−ピリドン ３,４−ジエトキシカルボニル−６−フェニル−２−ピ
リドン５.０gを無水酢酸１３mlに懸濁し、−１０℃に冷
却し発煙硝酸１.３２ml(２.０eq)を１時間で滴下、その
まま４５分間撹拌した。水４０mlを加え室温で撹拌し、
一晩放置した。生じた結晶をろ取、乾燥した。収量４.
６１g(８０.７％)。エタノールから再結晶し淡黄色針状
晶を得た。融点１７２−１７３℃。 ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)δ(ppm):１.３７(３Ｈ、t、Ｊ＝７.１
Ｈz)、１.３８(３Ｈ、t、Ｊ＝７.１Ｈz)、４.４０(２
Ｈ、q、Ｊ＝７.１Ｈz)、４.４２(２Ｈ、q、Ｊ＝７.１Ｈ
z)、７.５２(５Ｈ、m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:３４５０、１７４０、１６５０、１５２
５、１３４５、１２８５cm^-1。 元素分析:計算値(Ｃ₁₇Ｈ₁₆Ｎ₂Ｏ₇)Ｃ:５６.６７;Ｈ:４.
４８; Ｎ:７.７７。測定値Ｃ:５６.９６; Ｈ:４.５６;
Ｎ:７.６０。

【００２５】参考例５ ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−ピリドン１.０gに二塩化フェニルホスホン酸
１.３ml(３.３７eq)を加え、１５０℃、２.５時間加熱
した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機
層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムを用い
て乾燥した。溶媒を留去し残渣をシリカゲルカラム(溶
出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン１:２)で精製し油状生成
物を得た。収量９５０mg(９０.５％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)δ:１.３５(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈ
z)、１.４２(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈz)、４.４４(４Ｈ、
q、Ｊ＝７.２Ｈz)、７.５２(５Ｈ、m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:２９９０、１７５０、１５８０、１５５０
cm^-1。

【００２６】参考例６ ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−フェニルピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン４００mg、還元鉄５２０mg、
エタノール４mlを６０℃に加温し濃塩酸２.３mlを３０
分間で滴下した。氷冷下飽和炭酸水素ナトリウム水を用
いて中和しジクロロメタンで抽出した。有機層を乾燥
後、溶媒を留去し結晶を得た。収量３３７mg(９１.５
％)。ジクロロメタン−ヘキサンから再結晶し淡黄色プ
リズム晶を得た。融点９３−９４℃。 ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)δ(ppm):１.３７(３Ｈ、t、Ｊ＝７.０
Ｈz)、１.４３(３Ｈ、t、Ｊ＝７.０Ｈz)、４.３７(２
Ｈ、q、Ｊ＝７.０Ｈz)、４.４３(２Ｈ、q、Ｊ＝７.０Ｈ
z)、５.９３(２Ｈ、m)、７.４８−７.５７(５Ｈ、m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:３５１０、３４００、１７６０、１７２
５、１６１５、１２６５cm^-1。 元素分析:計算値(Ｃ₁₇Ｈ₁₇Ｎ₂Ｏ₄Ｃl)Ｃ:５８.５４;
Ｈ:４.９１; Ｎ:８.０３。測定値Ｃ:５８.４７; Ｈ:４.
８７; Ｎ:７.９７。

【００２７】参考例７ ８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド[３,４−
d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０１２) 参考例６で得た３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエ
トキシカルボニル−２−フェニルピリジン５５mgにヒド
ラジン１水和物１mlを加え１００℃、２５分間、窒素気
流下加熱した。氷冷下、反応液に水を加え、塩酸で中
和、pＨ５とし、生じた黄色粉末状結晶をろ取した。収
量２０mg(４３.９％)。融点３００℃以上。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d₆)δ(ppm):６.２９(２Ｈ、s)、７.
５１−７.６９(５Ｈ、m)。ＩＲ(ＫＢr)ν:３４７０、３
０５０、１６４５、１５８５cm^-1。 元素分析:計算値(Ｃ₁₃Ｈ₉Ｎ₄Ｏ₂Ｃl)Ｃ:５４.０９; Ｈ:
３.１４; Ｎ:１９.４１。測定値Ｃ:５４.１８; Ｈ:３.
０７; Ｎ:１９.６１。

【００２８】参考例８ ８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド[３,４−
d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン ナトリウム塩
(Ｌ−０１２ ナトリウム塩) ８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド[３,４−
d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０１２)の
１.５０gを、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液の５０mlにか
きまぜながら加えた。一旦溶解したのち折出する淡黄色
結晶を瀘取し、少量の１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、つ
いでエタノールで洗浄、乾燥すると１.４８gの目的化合
物が得られた。 mp >300℃ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d₆)δ(ppm):７.３５〜７.５５(３Ｈ,
ｍ),７.６５〜７.７０(２Ｈ,ｍ),７.４０〜８.２０(２
Ｈ,br.),１０.５(１Ｈ,br.s). ＩＲ(ＫＢr)υ:１６５０,１５５０,１４５５,８７０ｃ
ｍ^-1. 元素分析:計算値(Ｃ₁₃Ｈ₈Ｎ₄Ｏ₂ＣｌＮａ）:Ｃ:５０.２
６;Ｈ:２.６０;Ｎ:１８.０３.測定値:Ｃ:４９.９１;Ｈ:
２.３５;Ｎ:１７.６３.

【００２９】実施例１ 好酸球系細胞株（ＥoＬ−１）
より産生されるＯ₂ ^-の測定 ＥoＬ−１細胞は斉藤ら〔Blood, ６６，１２３３−１２
４０，（１９８５）〕によって、急性好酸球性白血病患
者から樹立されたヒト好酸球系細胞株である。ＥoＬ−
１細胞を５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＧＩＴ
培地（日本製薬）で５×１０⁵個／mlに調製し、ヒトＩ
ＦＮ−γを１００Ｕ／mlになるよう添加して３日間培養
を行った。ＩＦＮ−γを含む同培地で培地交換を行い、
さらに３日間培養することにより分化させた。分化させ
たＥoＬ−１細胞を５％ＦＣＳを含むＧＩＴ培地に５×
１０⁶個／mlの濃度になるよう懸濁させ、測定まで４℃
に静置した。この細胞懸濁液２００μlを３７℃で５分
間インキュベートした後、参考例７あるいは８で得られ
たピリドピリダジン誘導体Ｌ−０１２を５００μＭの濃
度になるよう添加し、２分後刺激剤を加え発光の測定を
開始した。ｆＭＬＰ１００nＭで刺激した場合、刺激後
直ちに発光が認められ、１分以内にピークを迎えた後速
やかに低下した。この発光は、ＳＯＤ（superoxide dis
mutase）の添加により濃度依存的に抑制され、３００Ｕ
／mlの添加でほぼ完全に抑制された（〔図１〕）。Ｃ５
ａ，血小板活性化因子（ＰＡＦ）で刺激した場合もｆＭ
ＬＰ刺激の場合と同様、刺激後、速やかに発光が認めら
れ、ＳＯＤの添加により抑制されることが分かった
（〔図２〕および〔図３〕）。

【００３０】実施例２ 発光基質の比較 Ｏ₂ ^-の発光基質として繁用されているルミノール，ウミ
ホタル・ルシフェリン誘導体（ＭＣＬＡ）とピリドピリ
ダジン誘導体Ｌ−０１２について、それぞれの至適濃度
を検討した。〔表１〕および〔表２〕はｆＭＬＰ１０^-7
ＭでＥoＬ−１細胞を刺激し、種々の濃度の発光基質で
Ｏ₂ ^-の検出を行なった結果を示したもので、ＭＣＬＡは
１０^-6Ｍ，Ｌ−０１２は５×１０^-4Ｍ，ルミノールは
１.２５×１０^-3Ｍの場合、最も特異発光量／バックグ
ラウンド発光量（Ｓ／Ｎ）比が高いことが分かった。こ
れらの至適濃度の発光基質を用いて、種々の濃度のｆＭ
ＬＰ，Ｃ５ａ，ＰＡＦ等でＥoＬ−１細胞を刺激して比
較したところ、何れの場合もＬ−０１２を発光基質とし
たとき最も良好な検出感度を示した（〔図４〕、〔図
５〕および〔図６〕）。細胞をＥoＬ−１細胞からモル
モット好酸球にかえた場合も同様の成績が得られた。

【表１】

【表２】

【００３１】

【発明の効果】本発明方法によると、従来法に比較して
特異発光量／バックグラウンド発光量（Ｓ／Ｎ）比が高
いので、Ｏ₂ ^-を高感度に検出定量することができる。従
って、例えば細胞由来Ｏ₂ ^-の検出・定量法に極めて高感
度に適用し得るので、種々の細胞のＯ₂ ^-産生を調節する
薬物のスクリーニングなどに有利に用いることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｅ₀Ｌ−１細胞をｆＭＬＰで刺激した場合の
Ｏ₂ ^-の産生パターンおよびＳＯＤによる阻害を示す。

【図２】 Ｅ₀Ｌ−１細胞をＣ５ａで刺激した場合のＯ₂
^-の産生パターンおよびＳＯＤによる阻害を示す。

【図３】 Ｅ₀Ｌ−１細胞をＰＡＦで刺激した場合のＯ₂
^-の産生パターンおよびＳＯＤによる阻害を示す。

【図４】 Ｅ₀Ｌ−１細胞をｆＭＬＰで刺激した場合誘
導されるＯ₂ ^-の各種発光基質による検出感度を示す。

【図５】 Ｅ₀Ｌ−１細胞をＣ５ａで刺激した場合誘導
されるＯ₂ ^-の各種発光基質による検出感度を示す。

【図６】 Ｅ₀Ｌ−１細胞をＰＡＦで刺激した場合誘導
されるＯ₂ ^-の各種発光基質による検出感度を示す。

【符号の説明】

〔図１〕の△を黒く塗った印、△および●は、それぞれ
ＳＯＤ ５Ｕ/ml、ＳＯＤ ３００Ｕ/ml、ＳＯＤ コント
ロール（０Ｕ/ml）を示す。〔図２〕の△を黒く塗った
印、△および●は、それぞれＳＯＤ ５Ｕ/ml、ＳＯＤ
３００Ｕ/ml、ＳＯＤ コントロール（０Ｕ/ml）を示
す。〔図３〕の△を黒く塗った印、△および●は、それ
ぞれＳＯＤ ５Ｕ/ml、ＳＯＤ ３００Ｕ/ml、ＳＯＤ コ
ントロール（０Ｕ/ml）を示す。〔図４〕の●、○およ
び△を黒く塗った印は、それぞれＬ−０１２、ルミノー
ル、ＭＣＬＡを示す。〔図５〕の●、○および△を黒く
塗った印は、それぞれＬ−０１２、ルミノール、ＭＣＬ
Ａを示す。〔図６〕の●、○および△を黒く塗った印
は、それぞれＬ−０１２、ＭＣＬＡ、ルミノールを示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 21/76 G01N 33/84 C07D 471/04

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】スーパーオキシドラジカル（Ｏ₂ ^-）と下記
   一般式（Ｉ） 【化１】 〔式中、Ｒ₁は式 【化２】 〔式中、Ｒ ₄ は−ＣＮ、−hal、−ＯＰＯ ₃ Ｍ ₂ 、−ＯＳＯ
   ₃ Ｍ、−ＣＯ ₂ Ｒ ₅ 、−ＳＲ ₆ 、−ＯＲ ₆ 、−ＮＨＲ ₆ であ
   り、Ａは硫黄、酸素、窒素原子を、ｎは１〜４の整数
   を、Ｍはアルカリ金属または水素原子を、halはハロゲ
   ン原子を、Ｒ ₅ は水素原子、低級アルキル基、マレイミ
   ド基、スクシンイミド基または５−ノルボルネン−２，
   ３−カルボキシイミド基を、Ｒ ₆ は水素原子または式 【化３】 〔式中、Ｒ ₇ はマレイミド基、スクシンイミド基または
   ５−ノルボルネン−２，３−カルボキシイミド基を示
   す。〕で表わされる基を示す。〕で表わされる基で置換
   されていてもよいフェニル基を示し、Ｒ₂は(1)水酸基、
   (2)チオール基、(3)アミノ基または(4)直鎖状または分
   枝鎖状の炭素数１〜６の低級アルキル基、炭素数２〜３
   のアルケニル基、炭素数２〜３のアルキニル基、炭素数
   ７〜１２のアラルキル基および炭素数６〜１０のアリー
   ル基から選ばれる置換基でモノ置換されたアミノ基を示
   し、Ｒ₃は(1)水素原子、(2)直鎖状または分枝鎖状の炭
   素数１〜６の低級アルキル基、炭素数６〜１０のアリー
   ル基および炭素数７〜１２のアラルキル基から選ばれる
   置換基で置換されていてもよい水酸基、(3)直鎖状また
   は分枝鎖状の炭素数１〜６の低級アルキル基、炭素数３
   〜６のシクロアルキル基、炭素数２〜３のアルケニル
   基、炭素数２〜３のアルキニル基、炭素数７〜１２のア
   ラルキル基および炭素数６〜１０のアリール基から選ば
   れる置換基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ
   基、(4)直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６の低級ア
   ルキル基、炭素数６〜１０のアリール基および炭素数７
   〜１２のアラルキル基から選ばれる置換基で置換されて
   いてもよいチオール基、(5)ハロゲン原子、(6)窒素原
   子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１〜４個のヘ
   テロ原子を含む不飽和または飽和された５ないし６員の
   ヘテロ環基、(7)ニトロ基、(8)シアノ基、(9)エステル
   化されていてもよいカルボキシル基、(10)カルバモイル
   基、(11)アジド基、(12)スルホ基または(13)有機スルホ
   ニル基を示し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を示す。〕
   で表わされるピリドピリジン誘導体またはその塩とを反
   応させ化学発光を生じさせることを特徴とするスーパー
   オキシドラジカルの検出・定量法。
2. 【請求項２】一般式（Ｉ）で表されるピリドピリダジン
   誘導体またはその塩におけるＸが酸素原子である請求項
   １記載の検出・定量法。
3. 【請求項３】一般式（Ｉ）で表されるピリドピリダジン
   誘導体またはその塩におけるＲ₂がアミノ基である請求
   項１記載の検出・定量法。
4. 【請求項４】一般式（Ｉ）で表されるピリドピリダジン
   誘導体が下記一般式（II） 【化４】 〔式中、Ｒ₁は式 【化５】 〔式中、Ｒ ₄ は−ＣＮ、−hal、−ＯＰＯ ₃ Ｍ ₂ 、−ＯＳＯ
   ₃ Ｍ、−ＣＯ ₂ Ｒ ₅ 、−ＳＲ ₆ 、−ＯＲ ₆ 、−ＮＨＲ ₆ であ
   り、Ａは硫黄、酸素、窒素原子を、ｎは１〜４の整数
   を、Ｍはアルカリ金属または水素原子を、halはハロゲ
   ン原子を、Ｒ ₅ は水素原子、低級アルキル基、マレイミ
   ド基、スクシンイミド基または５−ノルボルネン−２，
   ３−カルボキシイミド基を、Ｒ ₆ は水素原子または式 【化６】 〔式中、Ｒ ₇ はマレイミド基、スクシンイミド基または
   ５−ノルボルネン−２，３−カルボキシイミド基を示
   す。〕で表わされる基を示す。〕で表わされる基で置換
   されていてもよいフェニル基を示し、Ｒ₂はアミノ基を
   示し、Ｒ₃は(1)水素原子、(2)直鎖状または分枝鎖状の
   炭素数１〜６の低級アルキル基、炭素数６〜１０のアリ
   ール基および炭素数７〜１２のアラルキル基から選ばれ
   る置換基で置換されていてもよい水酸基、(3)ハロゲン
   原子または(4)窒素原子、硫黄原子および酸素原子から
   選ばれる１〜４個のヘテロ原子を含む不飽和または飽和
   された５ないし６員のヘテロ環基を示す。〕で表わされ
   るピリドピリジン誘導体である請求項１記載の検出・定
   量法。
5. 【請求項５】一般式（II）で表されるピリドピリダジン
   誘導体においてＲ₁がフェニル基、Ｒ₂がアミノ基、Ｒ₃
   がハロゲン原子である請求項４記載の検出・定量法。
6. 【請求項６】スーパーオキシドラジカルが白血球系、脈
   管系もしくは神経系細胞またはこれらの細胞株由来であ
   る請求項１記載の検出・定量法。
7. 【請求項７】スーパーオキシドラジカルが好中球，好酸
   球，好塩基球，単球，マクロファージ，メサンギウム細
   胞，血管平滑筋細胞，血管内皮細胞，神経細胞，神経膠
   細胞等の細胞またはこれらの細胞株由来である請求項１
   記載の検出・定量法。
8. 【請求項８】一般式（Ｉ）で表されるピリドピリダジン
   誘導体が、８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリ
   ド〔３，４−ｄ〕ピリダジン−１，４（２Ｈ、３Ｈ）ジ
   オンである請求項１記載の検出・定量法。