JP3167762B2 - ピリドピリダジン誘導体およびその用途 - Google Patents

ピリドピリダジン誘導体およびその用途

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、化学発光を利用する測
定法において有用な化学発光性物質となるピリドピリダ
ジン誘導体またはその塩およびその用途、さらに詳しく
は、該ピリドピリダジン誘導体またはその塩を用いる高
感度な測定法に関する。
【０００２】
【従来技術および解決しようとする課題】化学発光反応
に基づく分析方法は、極めて高感度な測定方法となり得
る可能性があるため、活発な研究が展開されている。こ
の分析方法は特に、免疫学的測定の分野で注目されてお
り、種々の技術の導入が試みられている。すなわち、免
疫学的測定においては、まず初めに、放射性同位元素を
ラベルとして用いる方法が開発されたが、放射性同位元
素を用いることの欠点として、半減期の短いことや、放
射能によるハザードの問題、さらに感度が不十分とされ
る場合があるなど改善が求められていた。ついで、酵素
をラベルとする、いわゆる酵素免疫測定など比色や蛍光
で検出する方法が開発され、ＲＩＡの有する欠点を克服
する研究が進められた。しかしながら、なお、感度の向
上が望まれ、新たな技術の展開が計られている。これら
の中で、化学発光を検出手段として利用する方法は、最
も高感度が期待できるものとして研究が進められてい
る。
【０００３】化学発光反応を利用した免疫化学的測定法
は大きく分けてつぎの４種に分類される(辻 章夫等、
蛋白質 核酸 酵素、別冊第３１巻(１９８８)２５２〜
２６３頁)。(１)標識化合物としてルミノールやイソル
ミノール、アクリジニウム誘導体などの化学発光性物質
を抗体や抗原などに標識する方法、(２)酵素を抗体や抗
原などに標識した酵素免疫測定法(ＥＩＡ)において、酵
素活性の測定に化学発光反応を利用する方法、(３)補酵
素であるＮＡＤやＡＴＰを標識し、抗原抗体反応により
その補酵素活性が不活化する現象を利用したホモジニア
スな免疫測定方法、(４)生物発光反応を用いる酵素免疫
測定方法。 これらのうち、(１)においては、発光性物質を化学的に
結合させることによって、発光量子収率が低下し、結果
として期待した程に感度が向上しないこと、化学発光の
生じている時間が極めて短時間であるので計測の面で無
理があることなど若干の問題を内蔵している。(２)にお
いては、化学発光性物質は溶液中で抗体や抗原などと結
合していない状態で存在し、標識酵素により発光反応が
触媒されるシステムである。(３)については感度の向上
は望めないこと、(４)については酵素が特殊な場合が多
く、方法として一般化し難いという欠点を有する。
【０００４】このように、化学発光反応を利用する測定
法は高感度が期待されていることから幾多の研究が実施
されているが実際の測定系の確立において、例えば、線
維芽細胞成長因子、神経成長因子、エンドセリン−１
等、生体内に極く微量にしか存在しない物質の定量には
必ずしも満足できる感度を与えるものではなかった。こ
れらの問題点を解決するために種々の検討が行なわれ、
その１つとして化学発光収率において優れた化合物の合
成が必要とされている[今井一洋編、「生物発光と化学
発光」、第７５頁〜第１４９頁、広川書店(１９８９
年)]。例えば、ロフィン、ルミノール、ルシゲニンおよ
びそれらの誘導体が知られており、発光量子収率のより
大きな化学発光性物質の特定もしくは合成研究は、従来
より、数多くの研究者によりなされてきた。この中でル
ミノールおよびルミノール誘導体は極めて活発に研究さ
れたものである。ルミノールの化学発光はアルブレヒト
(Ａlbrecht)によって見い出され[ツァイトシュリフト・
フィジカリッシェ・ヘミイ(Ｚ．Ｐhys．Ｃhem.)、１３
６巻、３２１頁(１９２８年)]、現在までにおいて最も
広く用いられている化合物である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、発光量子収率
のより大きな化学発光性物質として一般式
【０００６】
【化７】
【０００７】[式中、Ｒ1はそれぞれ置換されていてもよ
い炭化水素基またはヘテロ環基を示し、Ｒ2は水酸基、
チオール基、アミノ基またはモノ置換アミノ基を示し、
Ｒ2がモノ置換アミノ基の場合、Ｒ2はＲ1と一緒になっ
て環を形成していてもよい。Ｒ3は水素原子、置換され
ていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、
置換されていてもよいチオール基、ハロゲン原子、ヘテ
ロ環基、ニトロ基、シアノ基、エステル化またはアミド
化されていてもよいカルボキシル基、アジド基、スルホ
基または有機スルホニル基を示し、Ｒ1が脂肪族基の場
合、Ｒ3は水素原子ではない。Ｘは酸素原子または硫黄
原子を示す。]で表わされるピリドピリダジン誘導体また
はその塩の化学発光を利用することを特徴とするアッセ
イ法を提供するものである。式(I)のうち、Ｒ3が水素で
Ｒ1が置換されていてもよいアラルキル基または非置換
のアリール基以外の化合物は新規化合物であり、本発明
はかかる新規化合物(以下、この新規化合物を一般式
(I')の化合物という場合がある)およびその製造法も提
供する。
【０００８】前記一般式(I)で示されるピリドピリダジ
ン誘導体における置換基Ｒ1の炭化水素の具体例として
は、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロ
ピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブ
チル、n−ペンチル、イソペンチル、ヘキシルのような
直鎖状もしくは分枝鎖状の炭素数１〜６の低級アルキル
基;例えば、ビニール、アリルのような炭素数２〜３の
アルケニル基;例えば、エチニル、プロパルギルのよう
な炭素数２〜３のアルキニル基;例えば、ベンジル、フ
ェネチルのような炭素数７〜１２のアラルキル基;例え
ば、フェニル、ナフチルのような炭素数６〜１０のアリ
ール基が挙げられる。また、窒素、硫黄または酸素の少
なくとも１個、好ましくは１〜４個のヘテロ原子を含
む、不飽和または飽和された５ないしは６員環のヘテロ
環基としては、２−ピリジル、４−ピリジル、２−チエ
ニル、２−フリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テト
ラゾリル、モルホリノ、ピペラジニル、４−チアゾリ
ル、２−アミノ−４−チアゾリルなどが挙げられる。こ
れらの置換基Ｒ1が有していてもよい置換基としては、
式
【０００９】
【化８】
【００１０】[式中、Ｒ4は−ＣＮ、−hal、−ＯＰＯ3Ｍ
2、−ＯＳＯ3Ｍ、−ＣＯ2Ｒ5、−ＳＲ6、−ＯＲ6、−Ｎ
ＨＲ6であり、Ａは硫黄、酸素、窒素原子を、nは１〜４
の整数を意味し、Ｍはアルカリ金属または水素原子を、
halはフッ素、塩素、臭素、よう素等のハロゲン原子を
示す。Ｒ5は水素原子あるいはメチル、エチル、プロピ
ルのような低級アルキル基またはマレイミド、スクシン
イミドもしくは５−ノルボルネン−２,３−カルボキシ
イミド基のような複合体形成可能な活性イミドエステル
を形成する基、Ｒ6は水素原子または式
【００１１】
【化９】
【００１２】[式中、Ｒ7はマレイミド、スクシンイミ
ド、５−ノルボルネン−２,３−カルボキシイミド基を
示す。]で表わされる複合体形成能を有するコハク酸ハ
ーフエステルのような活性イミドエステルを形成する基
を示す。]で表わされる基が挙げられる。
【００１３】一般式(I)で示される置換基Ｒ2におけるモ
ノ置換アミノ基の置換基の具体例としては、例えば、Ｒ
1で例示したような直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜
６の低級アルキル基、炭素数２〜３のアルケニル基、炭
素数２〜３のアルキニル基、炭素数７〜１２のアラルキ
ル基および炭素数６〜１０のアリール基が挙げられる。
また、Ｒ2が置換基Ｒ1と一緒になって環を形成していて
もよいモノ置換アミノである場合の化合物の具体例とし
ては、一般式
【００１４】
【化１０】
【００１５】[式中、Ｒ3およびＸは前記と同意義であ
り、環Ａは例えば、イミダゾール、およびピロール等の
１〜２個の不飽和結合を有していてもよい含窒素５〜７
員環またはベンゼン環もしくは例えば、インドール、ベ
ンゾフラン、キノリン等のヘテロ環と縮合していてもよ
い含窒素５〜７員環を示す。環Ａは例えば、メチル、エ
チル、プロピルのような炭素数１〜６の低級アルキル基
で置換されていてもよい。]で表わされる環状アミンが
挙げられる。
【００１６】一般式(I)における置換基Ｒ3で示される置
換されていてもよい水酸基としては、例えば、水酸基、
アルコキシ基、アリルオキシ基、アラルキルオキシ基が
挙げられる。アルコキシ基のアルキル基としては、Ｒ1
で例示したような直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６
の低級アルキルが、アリールオキシ基のアリール基とし
てはフェニル、ナフチル等の炭素数６〜１０のアリール
基が、また、アラルキルオキシ基のアラルキル基として
はベンジル、フェネチル等の炭素数７〜１２のアラルキ
ル基が挙げられる。Ｒ3で示される置換されていてもよ
いアミノ基としては、例えばアミノ基、モノ置換アミノ
基、ジ置換アミノ基が挙げられる。モノ置換アミノ基の
置換基としては、例えば、Ｒ1で例示したような直鎖状
もしくは分枝鎖状の炭素数１〜６の低級アルキル基;例
えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシ
ルのような炭素数３〜６のシクロアルキル基;例えば、
ビニル、アリルのような炭素数２〜３のアルケニル基;
例えば、エチニル、プロパルギルのような炭素数２〜３
のアルキニル基;例えば、ベンジル、フェネチルのよう
な炭素数７〜１２のアラルキル基;例えば、フェニル、
ナフチルのような炭素数６〜１０のアリール基が挙げら
れる。ジ置換アミノ基における置換基としては、前記モ
ノ置換アミノ基の置換基が、同一または異なって用いら
れる。
【００１７】Ｒ3で示される置換されていてもよいチオ
ール基としては、例えばチオール基、アルキルチオ基、
アリールチオ基、アラルキルチオ基が挙げられる。アル
キルチオ基のアルキル基としては、Ｒ1で例示したよう
な直鎖状もしくは分枝鎖状の炭素数１〜６の低級アルキ
ルが、アリールチオ基のアリール基としては、例えば、
炭素数６〜１０のフェニル、ナフチルが、また、アラル
キルチオ基のアラルキル基としては、例えば、炭素数７
〜１２のベンジル、フェネチルが挙げられる。
【００１８】Ｒ3で示されるハロゲン原子としては、よ
う素、臭素、塩素、フッ素が挙げられる。Ｒ3で示され
るヘテロ環基としては、Ｒ1について挙げたヘテロ環基
が挙げられる。Ｒ3で示されるエステル化またはアミド
化されていてもよいカルボキシル基としては、例えば、
カルボキシル基、カルバモイル基およびアルコキシカル
ボニル基が挙げられる。Ｒ3で示されるエステル化カル
ボキシル基としてのアルコキシカルボニル基におけるア
ルキル基としては、Ｒ1について挙げたアルキル基が挙
げられる。Ｒ3で示される有機スルホニル基は、アルキ
ルスルホニル基およびアリールスルホニル基を包含す
る。アルキルスルホニル基におけるアルキル基およびア
リールスルホニル基におけるアリール基としては、例え
ば、それぞれＲ1について挙げたアルキル基およびアリ
ール基が挙げられる。アリール基、特にフェニル基は、
メチルまたはエチルのような低級アルキル基で置換され
ていてもよい。一般式（Ｉ）で表されるピリドピリダジ
ン環のカルボニルまたはチオカルボニル基は、容易にエ
ノル化して、一価または二価のカチオンと塩を形成する
ことができる。
【００１９】一価のカチオンとしては、アンモニウムイ
オンやアルカリ金属が挙げられ、たとえば、アンモニ
ア、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミンなどの
Ｃ1〜4モノアルキルアミン、ジメチルアミン、ジエチル
アミン、ジブチルアミンなどのジ（Ｃ1〜4）アルキルア
ミン、トリメチルアミン、トリエチルアミンなどのトリ
（Ｃ1〜4）アルキルアミン、ピリジニウムあるいはヒド
ラジニウム等のアンモニウムイオンやリチウム、カリウ
ム、ナトリウムなどのアルカリ金属が挙げられる。二価
のカチオンとしては、カルシウム、マグネシウムなどの
アルカリ土類金属が挙げられる。
【００２０】一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｒ
1がフェニル、Ｒ2がアミノ、Ｒ3がクロル、Ｘが酸素で
ある化合物（Ｌ−０１２）のナトリウム塩がとりわけ好
ましい。
【００２１】一般式(I)の化合物は、本発明の一般式
(I')の新規化合物も含め、以下の反応式１に従って製造
できる。すなわち、一般式(I)で表わされる新規ピリド
ピリダジンまたはその塩は、一般式(II)または(III)で
表される化合物にヒドラジンを反応させる自体公知の方
法によって製造することができる。なお、以下の式にお
けるＲ、Ｒ'およびＲ"で表わされる低級アルキル基とし
ては、Ｒ1で示したような炭素数１〜６のアルキル基が
挙げられる。
【００２２】
【化１１】
【００２３】化合物(II)は、例えば、上野ら[薬学雑
誌、８２、５３２(１９６２)]の方法によって合成した
２−アミノニコチン酸エステル誘導体を反応式２に示す
ごとく、ユルギらの方法[Ｙurgi et al.,Ｃhem.Ｐharm.
Ｂull.,２４、２６９９(１９７６)]に従ってジアゾ化、
ニトロ化、クロル化反応に順次付し、ついで、活性なク
ロル原子に対する求核置換反応後、ニトロ基を還元、必
要とあればさらにジアゾ化反応に付すことによって得る
ことができる。
【００２４】
【化１２】
【００２５】また、以下の反応式３に示すごとく、松尾
ら[薬学雑誌、９２、７０３(１９７２)]の方法に従っ
て、オキサゾール誘導体と適当なジエノフィル(dienoph
ile)とのディールス−アルダー(Ｄiels−Ａlder)反応を
行なうことにより化合物(II)または(III)を得ることが
できる。
【００２６】
【化１３】
【００２７】化合物(II)または(III)とヒドラジンとの
反応は通常無溶媒または溶媒中で加熱することにより行
なわれる。溶媒としてはメタノール、エタノール、プロ
パノール、イソプロパノール等の低級アルコール、およ
びテトラヒドロフラン、ジオキサンの様なエーテル、ま
たは酢酸が用いられる。反応温度は１５℃ないし１２０
℃が最適である。また、(II)のＲがＨであるカルボン酸
の場合にはヒドラジンの代りに、３,３−ジメチルジア
ジリジンのようなヒドラジン誘導体を用いてもよい。
【００２８】一般式(I)のピリドピリダジン誘導体また
はその塩は優れた化学発光収率を示し、その化学発光反
応を利用して種々のアッセイ方法に利用することができ
る。具体的には、例えば、次のような方法が挙げられ
る。(１)標識化合物として、一般式(I)のピリドピリダ
ジン誘導体またはその塩で抗体、ハプテン、抗原または
核酸等を標識する方法、(２)酵素で抗体、ハプテン、抗
原または核酸等を標識し、酵素免疫測定法や核酸ハイブ
リダイゼーション法等において、酵素活性の測定に一般
式(I)のピリドピリダジン誘導体またはその塩の化学発
光反応を利用する方法などが有利に用いられる。
【００２９】(１)の方法としては、まずピリドピリダジ
ン誘導体、例えば、７−[４−(３−アミノプロピルオキ
シ)フェニル]−８−ヒドロキシピリド[３,４−d]ピリダ
ジン−１,４−(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(以下Ｌ−０１１と称
することがある)またはその塩を前記の被標識物質に結
合させる。結合させる方法としては、自体公知の方法を
用いることができる。例えば、グルタルアルデヒド架橋
法[イムノケミストリー(Ｉmmunochemistry)、第６巻(１
９６９年)、第４３頁、同誌、第８巻(１９７１年)、第
１１７５頁]、過ヨウ素酸架橋法[ジャーナル・オブ・ヒ
ストケミストリー・アンド・サイトケミストリー(Ｊ.Ｈ
istochem.Ｃytochem)、第２２巻(１９７４年)、第１０
８４頁]、あるいは特開昭５８−１４９７００号公報記
載の一般式：
【００３０】
【化１４】
【００３１】［式中、nは０〜５の整数を、Ｒ'''は化学
結合または６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。]で
表わされる結合剤を用いる方法等が特に有利に用いられ
る。
【００３２】さらに、一つの方法として、前記のピリド
ピリダジン誘導体を無水こはく酸を用いてヘミスクシネ
ートとし、さらに、Ｎ−ハイドロキシスクシンイミドと
カルボジイミドとで活性エステルとし、次に抗体、ハプ
テン、抗原または核酸等のアミノ基と反応させて標識化
することができる。当然のことながら当該分野で用いら
れるカップリング技術が適用できる。かくして得られた
ピリドピリダジン誘導体標識体を用いる測定試薬の一例
として、サンドイッチ法による免疫化学的測定キットを
以下に挙げる。
【００３３】(１) 担体上に保持された抗体 (２) ピリドピリダジン誘導体またはその塩標識抗体 (３) 被測定物質の標準品 (４) これら(２)〜(３)の試薬および被検試料の希釈に
用いる緩衝液(該試薬および該被検試料の希釈に用いる
ことができる緩衝剤であればいずれでもよいが、その一
例としてはpＨ６〜９のリン酸緩衝液またはグリシン緩
衝液が挙げられる。) (５) インキュベーション後、担体の洗浄に用いる緩衝
液(該担体の洗浄に用いることができる緩衝液であれば
いずれでもよいが、その一例としてはリン酸緩衝液また
はグリシン緩衝液が挙げられる。) (６) ピリドピリダジン誘導体またはその塩を化学発光
させるに必要な試薬（その一例としてアルカリ性溶媒に
溶解させた過酸化水素とマイクロペルオキシダーゼが挙
げられる。）
【００３４】このキットは、例えば、以下の方法により
使用することができる。被測定物質の標準品もしくは被
検液約１０〜２００μlに試薬(４)を加えて希釈し、一
定量の試薬(１)、次いで試薬(２)１０〜８００μlを加
えた後、約０〜４０℃で反応させる。約１０分〜４８時
間反応後、試薬(５)で洗浄し担体上に結合しているピリ
ドピリダジン誘導体またはその塩を化学発光させる。す
なわち、化学反応液約１０〜１０００μlを加えて直ち
に化学発光測定器にかけ、反応液中の化学発光量を測定
する。
【００３５】(２)の方法としては、例えば、通常の酵素
免疫測定法において用いられる酵素と抗原、ハプテン、
抗体等と共有結合させて標識体を作製する必要がある。
酵素として、例えば、ペルオキシダーゼを上記の免疫化
学的活性物質に結合させる方法としては、自体公知の方
法を用いることができる。例えば、グルタルアルデヒド
架橋法[イムノケミストリー(Ｉmmunochemistry)、第６
巻(１９６９年)、第４３頁、同誌、第８巻(１９７１
年)、第１１７５頁]、過ヨウ素酸架橋法[ジャーナル・
オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリ
ー(Ｊ．Ｈistochem．Ｃytochem．)、第２２巻(１９７４
年)、第１０８４頁]、あるいは特開昭５８−１４９７０
０号公報記載の一般式:
【００３６】
【化１５】
【００３７】[式中、nは０〜５の整数を、Ｒ'''は化学
結合または６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。]で
表わされる結合剤を用いる方法が特に有利に用いられ
る。
【００３８】かくして得られた酵素標識体を用いる測定
試薬の一例として、サンドイッチ法による免疫化学的測
定キットを以下に挙げる。 (１) 担体上に保持された抗体 (２) 酵素で標識した免疫化学的活性物質 (３) 被測定物質の標準品 (４) これら(２)〜(３)の試薬および被検試料の希釈に
用いる緩衝液(該試薬および該被検試料の希釈に用いる
ことができる緩衝剤であればいずれでもよいが、その一
例としてはpＨ６〜９のリン酸緩衝液またはグリシン緩
衝液が挙げられる。) (５) インキュベーション後、担体の洗浄に用いる緩衝
液(該担体の洗浄に用いることができる緩衝液であれば
いずれでもよいが、その一例としてはリン酸緩衝液また
はグリシン緩衝液が挙げられる。) (６) 酵素活性測定に必要な試薬(一例として酸化剤(過
酸化水素もしくはその類似体)、ピリドピリダジン誘導
体またはその塩さらに必要により化学発光増強剤(エン
ハンサー)が挙げられる。)
【００３９】このキットは、例えば、以下の方法により
使用することができる。被測定物質の標準品もしくは被
検液約１０〜２００μlに試薬(４)を加えて希釈し、一
定量の試薬(１)、次いで試薬(２)１０〜８００μlを加
えた後、約０〜４０℃で反応させる。約１０分〜４８時
間反応後、試薬(５)で洗浄し担体上に結合している酵素
活性を測定する。例えば、ペルオキシダーゼ活性測定時
において、ピリドピリダジン誘導体またはその塩、酸化
剤およびエンハンサーはそれぞれ一定量が用いられ、化
学発光量が微量領域のペルオキシダーゼの変化量に応じ
て敏感に変化する条件が選ばれる。化学発光反応は、エ
ンハンサーの採用により、発光反応の遅延が生じ、ま
た、発光量においても増大が認められることは公知であ
る[トルペ(Ｔhorpe)ら、アナリティカル・バイオケミス
トリー(Ａnal．Ｂiochem.)、第１４５巻、第９６頁〜第
１００頁(１９８５年); エム・エイ・デルカ(Ｍ．Ａ．
ＤeＬuca)編、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Ｍet
hods in Ｅnzymology)、第３３１頁〜第３５３頁(１９
８６年)、アカデミック・プレス(Ａcademic Ｐress)
社]。
【００４０】化学発光反応においては、通常、以下の条
件で実施されることが望ましい。反応温度としては０〜
６０℃の範囲の温度、特に、５〜３０℃が望ましい。用
いる緩衝液のpＨは、中性付近からアルカリ性の領域、
例えば、pＨ７〜１０、望ましくは、pＨ７.５〜９とす
ることができる。用いる緩衝液としては、各種緩衝液を
用いることができるが、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、
炭酸緩衝液、トリス緩衝液等が有利に用いることができ
る。
【００４１】試薬濃度としては、用いるエンハンサーの
種類によって異なるが、一般的に以下の濃度が好まし
い。 (a)酸化剤(過酸化水素) １μＭ〜３０mＭ (b)エンハンサー ０.１μＭ〜１０mＭ (c)ピリドピリダジン誘導体またはその塩 １μＭ〜１０mＭ とりわけ、(a)としては、２０μＭ〜２mＭ、(b)として
は４μＭ〜１mＭ、(c)としては１０μＭ〜２mＭが望ま
しい。
【００４２】先の担体上に結合しているペルオキシダー
ゼに(a)〜(c)を共存させて、化学発光反応を行なわせ
る。反応溶液から生じた光を、市販もしくは、自作の測
定装置(例えば、高感度な光電子増倍管を備えたフォト
カウンターなど)で測定することができる。すなわち、
最後の液を加えてから、数秒ないし数十分後の数秒ない
し数分間における発光量を測定することで定量に供する
ことができる。すなわち、計測された発光量と、例え
ば、ペルオキシダーゼ量との間に、良好な相関性が認め
られることになり、この関係から分析が可能となる。
【００４３】さらに別のタイプの方法として、例えば、
担体上に結合しているグルコースオキシダーゼにグルコ
ースを反応させて酵素量に対応した過酸化水素を発生せ
しめ、反応触媒として、例えば、ミクロペルオキシダー
ゼを用いてピリドピリダジン誘導体またはその塩を化学
発光させることができる。反応溶液から生じた光を、市
販もしくは、自作の測定装置(例えば、高感度な光電子
増倍管を備えたフォトカウンターなど)で測定すること
ができる。すなわち、最後の液を加えてから、数秒ない
し数十分後の数秒ないし数分間における発光量を測定す
ることで定量に供することができる。すなわち、計測さ
れた発光量と、例えばグルコースオキシダーゼ量との間
に、良好な相関性が認められることになり、この関係か
ら分析が可能となる。
【００４４】さらに異なったタイプの方法としてリポソ
ームを利用するシステムが有効な測定手段を提供する。
人工的に作製したリポソームの中に、例えば、(イ) ピ
リドピリダジン誘導体またはその塩もしくは(ロ) 化学
発光反応を触媒する物質、例えば、ペルオキシダーゼな
どの触媒、マイクロペルオキシダーゼやポリフィン構造
を有する化合物等を封入し、リポソームの表面に免疫化
学的活性物質、例えば、抗原、抗体、ハプテン等を共有
結合で固定する。リポソームの調製法としては自体公知
の方法で行なうことができる。例えば、コレステロー
ル、レシチン、ホスファチジン酸さらに少量の標識用の
成分(ジチオピリジルホスファチジルエタノールアミン
など)を加えた混合液から調製することができる。自体
公知の方法でアッセイを実施し、測定読み取り段階にお
いて、リポソームに、例えば、補体あるいはリポソーム
膜を破壊できる物質(酸、塩基、塩など)を添加して、中
に存在する物質を溶液中に移動させる。
【００４５】(イ)の場合は、例えば、必要により酸化剤
と触媒(ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ
やポリフィン構造を有する化合物)を共存させてピリド
ピリダジン誘導体またはその塩を化学発光させることが
できる。(ロ)の場合は、例えば、ピリドピリダジン誘導
体またはその塩と必要により酸化剤を共存させてピリド
ピリダジン誘導体またはその塩を化学発光させることが
できる。これらの化学発光反応において、適当な化学発
光増強剤(エンハンサー)を共存させてもよい。反応溶液
から生じた光を、市販もしくは、自作の測定装置(例え
ば、高感度な光電子増倍管を備えたフォトカウンターな
ど)で測定することができる。すなわち、最後の液を加
えてから、数秒ないし数十分後の数秒ないし数分間にお
ける発光量を測定することで定量に供することができ
る。以上のような方法を用いることにより生体に微量に
しか存在しない例えば塩基性および酸性線維芽細胞成長
因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、エンドセリ
ン等を抽出操作することなく直接測定することが可能と
なる。それにより、これら微量にしか存在しない物質の
増加あるいは減少と疾患の関係、例えばＦＧＦと癌、Ｎ
ＧＦと神経系疾患、エンドセリンと脈管系疾患の関係が
明確になることが期待され、高感度測定法が疾病の早期
診断法として利用できる。
【００４６】
【実施例】以下に参考例および実施例を挙げ本発明をさ
らに具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限
するものではない。参考例１ フェニルグリシンエチルエステル塩酸塩 Ｄ−フェニルグリシン(３０.０g)をエタノール５００ml
に懸濁し、氷冷下、塩酸ガス(約２５０g)を吹き込み、
室温で一晩放置した。溶媒を留去し、得られた結晶をジ
エチルエーテルを用いてろ取した。収量２７.７g(６４.
７％)。ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:１.１３(３Ｈ、t、Ｊ＝７.
２Ｈz)、４.１２(２Ｈ、q、Ｊ＝７.２Ｈz)、５.１３(１
Ｈ、s)、５.４２(５Ｈ、m)、９.１７(３Ｈ、br.)。ＩＲ
(ＫＢr)ν:２９８０−２９００、１７５５、１７３８、
１４９５、１２３５、７００cm-1。
【００４７】参考例２ Ｎ−ホルミルフェニルグリシンエチルエステル フェニルグリシンエチルエステル塩酸塩(２１.５g;０.
１モル)を、ぎ酸２００mlに溶かし、ぎ酸ナトリウム
(８.１６g;１.２eq)を加え、無水酢酸(２０ml;２.１eq)
を滴下した。２時間撹拌後、無水酢酸１０mlを滴下し、
５０−６０℃で１.５時間撹拌した。溶媒を留去後、炭
酸水素ナトリウム水で中和し酢酸エチルで抽出した。有
機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、
溶媒を留去し、油状生成物を得た。収量２２.７g。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:１.２０(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈ
z)、４.１８(２Ｈ、dq、Ｊ＝２.４、７.２Ｈz)、５.６
３(１Ｈ、d、Ｊ＝７.５Ｈz)、６.７８(１Ｈ、br.)、７.
３３(５Ｈ、s)、８.２２(１Ｈ、s)。 ＩＲ(neat)ν: ２９８０、１６４０、１５２０、１４９
５、１３８０、１３５０、１０１５cm-1。
【００４８】参考例３ ５−エトキシ−４−フェニルオキサゾール 五酸化リン(３２g; ２.１eq)、ハイフロスーパーセル
(登録商標)(９g)、ジクロロエタン(１２０ml)を、５０
−６０℃で激しく撹拌し、Ｎ−ホルミルフェニルグリシ
ンエチルエステル２２.７gを４０分間で滴下した。ジク
ロロエタン３０mlを加えて８時間撹拌した。氷冷下、炭
酸水素ナトリウム(８０g／水１００ml)を加え中和後、
ろ過し有機層を得た。水層をジクロロメタンを用いて抽
出した。有機層を合わせて硫酸マグネシウムで乾燥後、
溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラム(溶出溶媒:ジ
クロロメタン−ヘキサン１:１)で精製し、赤色油状物質
を得た。収量９.７g(４６.８％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:１.４４(３Ｈ、t、Ｊ＝６.９Ｈ
z)、４.３３(２Ｈ、q、Ｊ＝６.９Ｈz)、７.２３(３Ｈ、
m)、７.４９(１Ｈ、s)、７.８２(２Ｈ、d、Ｊ＝６.９Ｈ
z)。 ＩＲ(neat)ν: ２９８０、１６４０、１５２０、１４９
５、１３８０、１３５０、１０１５cm-1。
【００４９】参考例４ トランス−３,６−エポキシ−３−エトキシ−４,５−ジ
メトキシカルボニル−２−フェニル−３,４,５,６−テ
トラヒドロピリジン ５−エトキシ−４−フェニルオキサゾール(９.７g; ５
１.３ミリモル)に、フマル酸ジメチル(８.１３g; １.１
eq)を加え、１２０℃で反応させた。２時間後フマル酸
ジメチル(２.２g; ０.３eq)を追加し、さらに１.５時間
撹拌した。反応残渣をシリカゲルカラム(溶出溶媒:ジク
ロロメタン)で精製し、粗結晶を得た。ジクロロメタン
−ヘキサンから再結晶し無色針状晶を得た。収量６.５
３g(３８.２％)。融点９８.５−９９.５℃。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.３３(３Ｈ、t、Ｊ＝６.９Ｈ
z)、３.３０(１Ｈ、d、Ｊ＝４.２Ｈz)、３.４０(３Ｈ、
s)、３.６２(１Ｈ、d、Ｊ＝４.２Ｈz)、３.７８(３Ｈ、
Ｓ)、３.９０(２Ｈ、m)、６.０４(１Ｈ、s)、７.４０
(２Ｈ、m)、７.４３(１Ｈ、m)、７.９９(２Ｈ、m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: １７２５、１３１０、１２９５、１２
００、１１７０、９８５cm-1。 元素分析: 計算値Ｃ:６１.２５; Ｈ:５.７５; Ｎ:４.２
０; 測定値Ｃ:６１.０７; Ｈ:５.７５; Ｎ:４.０５。
【００５０】参考例５ ８−ヒドロキシ−７−フェニルピリド[３,４−d]ピリダ
ジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−００２) ３,６−エポキシ−３−エトキシ−４,５−ジメトキシカ
ルボニル−２−フェニル−３,４,５,６−テトラヒドロ
ピリジン(５００mg; 1.５ミリモル)をヒドラジン−水和
物(５ml)に加え、窒素気流下、１００℃で１時間加熱し
た。氷冷下、反応液に水を加え酢酸で中和した。析出し
た黄色粉末状結晶をろ取した。収量２１０mg(５５.０
％)。融点３００℃以上。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6) δ:７.４１(３Ｈ、m)、８.１７
(２Ｈ、m)、８.７３(１Ｈ、s)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:３４２０、３１７５、３０５０、１６５
０、１５８０cm-1。
【００５１】参考例６ Ｎ−Ｂoc−p−ヒドロキシフェニルグリシン p−ヒドロキシフェニルグリシン３３.４g(０.２モル)に
水１１０ml、トリエチルアミン４２ml(１.５eq)、Ｓ−
４,６,−ジメチルピリミジン−２−イルチオールカルボ
ン酸 t−ブチル５２.８g(１.１eq)、ジオキサン１１０
mlを加え室温で１４時間撹拌した。反応液に水３００ml
を加え４００ml酢酸エチルで抽出し、有機層を１００ml
の５％炭酸水素ナトリウム水で抽出、水層と合わせた。
水層を氷冷下５Ｎ塩酸でpＨ３とし、酢酸エチルで抽出
した。有機層を硫酸水素カリウム水、飽和食塩水で洗
い、硫酸マグネシウムを用いて乾燥、溶媒を留去した。
得られた結晶を酢酸エチル−ヘキサンを用いてろ取し
た。収量４６.０g(８６.1％)。ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)
δ:１.３８(９Ｈ、s)、４.９２(１Ｈ、d、Ｊ＝７.８Ｈ
z)、６.６７(２Ｈ、d、Ｊ＝８.４Ｈz)、７.1３(２Ｈ、
d、Ｊ＝８.４Ｈz)。
【００５２】参考例７ Ｎ−Ｂoc−p−メトキシフェニルグリシンメチルエステ
ル メタノール２００mlにナトリウム８.３g(２.２eq)を溶
かし、氷冷後Ｎ−Ｂoc−p−ヒドロキシフェニルグリシ
ン４６.０gを加え、次いでヨードメタン２３.６ml(２.
２eq)を滴下し２日間放置した。ヨードメタン２３.６ml
を滴下し、５時間４０−５０℃に加温した。２時間還流
後、溶媒を留去し、ＤＭＦ１００ml、ヨードメタン２０
mlを加え４０−５０℃に加温した。ヨードメタンを除去
後、氷水５００mlを加え酢酸エチルで抽出した。有機層
を水、飽和食塩水で洗い、硫酸マグネシウムを用いて乾
燥、溶媒を留去し、シリカゲルカラム(溶出溶媒:酢酸エ
チル−ヘキサン１:１)で精製して無色針状晶を得た。収
量３７.０g(７２.７％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:１.４３(９Ｈ、s)、３.７１(３
Ｈ、s)、３.８０(３Ｈ、s)、５.２２(１Ｈ、d、Ｊ＝７.
５Ｈz)、５.４５(１Ｈ、br.)、６.８７(２Ｈ、d、Ｊ＝
６.０Ｈz)、７.２８(２Ｈ、d、Ｊ＝６.０Ｈz)。
【００５３】参考例８ Ｎ−ホルミル−p−メトキシフェニルグリシンメチルエ
ステル Ｎ−Ｂoc−p−メトキシフェニルグリシンメチルエステ
ル３６.９gをぎ酸２５０mlに溶かし室温で３時間、４０
−５０℃で１時間撹拌した。無水酢酸２４.８ml(２.１e
q)を滴下し、室温で一晩、４０−５０℃で２時間撹拌し
た。溶媒を留去し、炭酸水素ナトリウム水で中和後、酢
酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗い、
硫酸マグネシウムを用いて乾燥、溶媒を留去し、結晶を
ヘキサンを用いてろ取した。収量２４g(８６.１％)。融
点９７−９９℃。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:３.７３(３Ｈ、s)、３.７９(３
Ｈ、s)、５.５７(１Ｈ、d、Ｊ＝７.５Ｈz)、６.６０(１
Ｈ、br.)、６.８７(２Ｈ、d、Ｊ＝８.７Ｈz)、７.２８
(２Ｈ、d、Ｊ＝８.７Ｈz)、８.２２(１Ｈ、s)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:３３４０、１７４５、１６７０、１５１
５、１３２０、１１８０cm-1。
【００５４】参考例９ ５−エトキシオキサゾール 五酸化リン(３０g; ２.１eq)、ハイフロスーパーセル
(１７.５g)、ジクロロエタン(１７５ml)を、６０−７０
℃で激しく撹拌し、Ｎ−ホルミルグリシンエチルエステ
ル１２.８６gを５０分間で滴下し、８時間撹拌した。氷
冷下、炭酸水素ナトリウム(１００g／水１００ml)を加
え中和後、ろ過し有機層を得た。水層をジクロロメタン
を用いて抽出した。有機層を合わせて硫酸マグネシウム
で乾燥後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラム
(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン１:２)で精製し、油状
物質を得た。収量５６０mg(５％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:１.４２(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈ
z)、４.１３(２Ｈ、q、Ｊ＝７.２Ｈz)、６.１１(１Ｈ、
s)、７.３３(１Ｈ、s)。
【００５５】参考例１０ ３,４−ジメトキシカルボニル−５−ヒドロキシピリジ
ン ５−エトキシオキサゾール(５５７.３mg; ４.９ミリモ
ル)に、フマル酸ジメチル(７８１mg;１.１eq)を加え、
１２０℃で１.５時間反応させた。反応残渣をシリカゲ
ルカラム(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン２:１)で精製
し、粗結晶を得た。収量７３０mg(７０.２％)。ジクロ
ロメタン−ヘキサンから再結晶し無色板状晶を得た。融
点１３６−１３７℃。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:３.９１(３Ｈ、s)、３.９５(３
Ｈ、s)、８.２８(１Ｈ、s)、８.５４(１Ｈ、s)、９.９
２(１Ｈ、s)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７４５、１７３０、１４３５、１３２
０、１３００、１２８５cm-1。
【００５６】参考例１１ ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニルピリジン ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−フェニルピリジン１００mg、トリエチルアミン
０.０８ml(２.０eq)、酢酸エチル８mlを１０％Ｐd−Ｃ
(５０％湿潤)１００mgを用いて、７時間接触還元した。
ろ過により触媒を除き、溶媒を留去した。収量８６mg
(９５.４％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３７(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２
Ｈz)、１.３９(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈz)、４.３８(４
Ｈ、q、Ｊ＝７.２Ｈz)、５.１７(２Ｈ、s)、７.４８−
７.６５(５Ｈ、m)、８.３３(１Ｈ、s)。 ＩＲ(neat)ν:３４７５、３３５５、２９７５、１７２
０、１６００、１４０５、１２８０、１２４０cm-1。
【００５７】参考例１２ ８−アミノ−７−フェニルピリド[３,４−d]ピリダジン
−１,４−(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０１０) ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニルピリジン２００mgにヒドラジン１水和物２mlを加え
１００℃、１時間、窒素気流下加熱した。氷冷下、反応
液に水を加え、塩酸で中和、pＨ５とし、生じた黄色粉
末状結晶をろ取した。収量９３mg(５７.５％)。融点３
００℃以上。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):７.１９(２Ｈ、s)、７.
４８−７.７１(５Ｈ、m)、８.３９(１Ｈ、s)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:３４３０、１６４０cm-1。
【００５８】参考例１３ エチルベンゾイルピルベート ナトリウム２５g(１.０８eq)をエタノール５６０mlに溶
かし、しゅう酸ジエチル１３５.６ml(１４６g;１モ
ル)、アセトフェノン１１６.７ml(１２０g;１モル）の
混合物を４０℃で滴下し、１時間後、３０分間還流し
た。溶媒を留去し、硫酸５５ｇ／水２００mlで中和、酢
酸エチルで抽出した。有機層を、水、飽和食塩水で洗
浄、硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去し、シリカ
ゲルカラム(溶出溶媒:ジクロロメタン−ヘキサン１:１)
で精製し無色板状晶を得た。酢酸エチル−ヘキサンを用
いてろ取した。収量１１４.６g(５２.０％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:１.４２(３Ｈ、t、Ｊ＝７.０Ｈ
z)、４.４０(２Ｈ、d、Ｊ＝７.０Ｈz)、７.０８(１Ｈ、
s)、７.５７(３Ｈ、m)、８.０２(２Ｈ、dd、Ｊ＝２.
１、７.５Ｈz)。
【００５９】参考例１４ エチル３−アミノ−３−エトキシアクリレート シアノ酢酸エチル２２６g(２モル)、エタノール１０１g
(２.２モル)、乾燥ジエチルエーテル１００gに氷冷下、
塩酸ガス９３.５g(１.３eq)を吹き込み一晩放置した。
析出した無色プリズム晶をジエチルエーテルを用いてろ
取した(塩酸塩)。収量３５２.５g(９０.３％)。融点１
０３−１０５℃。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ:１.２３(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２
Ｈz)、１.３７(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈz)、３.９４(２
Ｈ、br.)、４.１５(２Ｈ、q、Ｊ＝７.２Ｈz)、４.５１
(２Ｈ、q、Ｊ＝６.８Ｈz)。得られた結晶を氷冷した炭
酸水素ナトリウム２００g(１.２eq)水溶液に加えジエチ
ルエーテルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗
浄、硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去し、減圧蒸
留により精製した。収量２５３.８g(７９.７％)。沸
点1.8７８℃。 ＩＲ(neat)ν:２９８０、１６６０、１６１０、１５４
０、１１６０、１０７０cm-1。
【００６０】参考例１５ ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−フェ
ニルピリジン塩酸塩 エチルベンゾイルピルベート１.１１g(５ミリモル)、エ
チル３−アミノ−３−エトキシアクリレート１.７５g
(２.２eq)を１００℃で１.５時間加熱した。減圧で低沸
点物質を留去した後、反応液に１０％塩酸２mlを加え、
生じた結晶をジエチルエーテルを用いてろ取した。酢酸
エチルから再結晶し淡黄色針状晶を得た。収量０.７g
(３９.８％)。融点７８−８１、１４５−１４８℃(二重
融点)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:１.２６(３Ｈ、t、Ｊ＝７.５Ｈ
z)、１.３０(３Ｈ、t、Ｊ＝７.５Ｈz)、４.２７(２Ｈ、
q、Ｊ＝７.５Ｈz)、４.２８(２Ｈ、q、Ｊ＝７.５Ｈz)、
７.１７(１Ｈ、s)、７.４３(３Ｈ、m)、８.０５(２Ｈ、
m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７４０、１７００、１６５０、１３０
０cm-1。 元素分析:計算値(Ｃ17Ｈ18Ｎ2Ｏ4・ＨＣl)Ｃ:５８.２
１; Ｈ:５.４６; Ｎ:７.９９。測定値Ｃ:５８.４５;
Ｈ:５.４８; Ｎ:８.０４。
【００６１】参考例１６ ３,４−ジエトキシカルボニル−６−フェニル−２−ピ
リドン ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−フェ
ニルピリジン塩酸塩３.５０g(１０ミリモル)を２％塩酸
９０ml、ジオキサン６０mlに溶かし、亜硝酸ナトリウム
０.８３g(１.２eq)を水３mlに溶かして滴下した。室温
で４時間撹拌し、一晩放置した。溶媒を留去し析出した
結晶を水を用いてろ取した。エタノールから再結晶し淡
黄色プリズム晶を得た。収量１.９g(６０.３％)。融点
１４３−１４４℃。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:１.３３(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈ
z)、１.３６(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈz)、４.３７(４Ｈ、
q、Ｊ＝７.２Ｈz)、６.９５(１Ｈ、s)、７.４７(３Ｈ、
m)、７.７９(２Ｈ、m)。ＩＲ(ＫＢr)ν:２９００−３０
００、１７４０、１６３５、１６１５、１２４５cm-1。 元素分析:計算値(Ｃ17Ｈ17ＮＯ5)Ｃ:６４.７５; Ｈ:５.
４３; Ｎ:４.４４。測定値Ｃ:６４.８２; Ｈ:５.５５;
Ｎ:４.４６。
【００６２】参考例１７ ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−ピリドン ３,４−ジエトキシカルボニル−６−フェニル−２−ピ
リドン５.０gを無水酢酸１３mlに懸濁し、−１０℃に冷
却し発煙硝酸１.３２ml(２.０eq)を１時間で滴下、その
まま４５分間撹拌した。水４０mlを加え室温で撹拌し、
一晩放置した。生じた結晶をろ取、乾燥した。収量４.
６１g(８０.７％)。エタノールから再結晶し淡黄色針状
晶を得た。融点１７２−１７３℃。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３７(３Ｈ、t、Ｊ＝７.１
Ｈz)、１.３８(３Ｈ、t、Ｊ＝７.１Ｈz)、４.４０(２
Ｈ、q、Ｊ＝７.１Ｈz)、４.４２(２Ｈ、q、Ｊ＝７.１Ｈ
z)、７.５２(５Ｈ、m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:３４５０、１７４０、１６５０、１５２
５、１３４５、１２８５cm-1。 元素分析:計算値(Ｃ17Ｈ16Ｎ2Ｏ7)Ｃ:５６.６７;Ｈ:４.
４８; Ｎ:７.７７。測定値Ｃ:５６.９６; Ｈ:４.５６;
Ｎ:７.６０。
【００６３】参考例１８ ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−ピリドン１.０gに二塩化フェニルホスホン酸
１.３ml(３.３７eq)を加え、１５０℃、２.５時間加熱
した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機
層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムを用い
て乾燥した。溶媒を留去し残渣をシリカゲルカラム(溶
出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン１:２)で精製し油状生成
物を得た。収量９５０mg(９０.５％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:１.３５(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈ
z)、１.４２(３Ｈ、t、Ｊ＝７.２Ｈz)、４.４４(４Ｈ、
q、Ｊ＝７.２Ｈz)、７.５２(５Ｈ、m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:２９９０、１７５０、１５８０、１５５０
cm-1。
【００６４】参考例１９ ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−フェニルピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン４００mg、還元鉄５２０mg、
エタノール４mlを６０℃に加温し濃塩酸２.３mlを３０
分間で滴下した。氷冷下飽和炭酸水素ナトリウム水を用
いて中和しジクロロメタンで抽出した。有機層を乾燥
後、溶媒を留去し結晶を得た。収量３３７mg(９１.５
％)。ジクロロメタン−ヘキサンから再結晶し淡黄色プ
リズム晶を得た。融点９３−９４℃。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３７(３Ｈ、t、Ｊ＝７.０
Ｈz)、１.４３(３Ｈ、t、Ｊ＝７.０Ｈz)、４.３７(２
Ｈ、q、Ｊ＝７.０Ｈz)、４.４３(２Ｈ、q、Ｊ＝７.０Ｈ
z)、５.９３(２Ｈ、m)、７.４８−７.５７(５Ｈ、m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:３５１０、３４００、１７６０、１７２
５、１６１５、１２６５cm-1。 元素分析:計算値(Ｃ17Ｈ17Ｎ2Ｏ4Ｃl)Ｃ:５８.５４;
Ｈ:４.９１; Ｎ:８.０３。 測定値Ｃ:５８.４７; Ｈ:４.８７; Ｎ:７.９７。
【００６５】参考例２０ ５−メトキシ−４−(p−メトキシフェニル)オキサゾー
ル 五酸化リン(３０g; ２.１eq)、ハイフロスーパーセル
(登録商標)(１７.５g)、ジクロロエタン(１５０ml)を、
５０−６０℃で激しく撹拌し、ジクロロエタン５０mlに
溶かしたＮ−ホルミル−p−メトキシフェニルグリシン
メチルエステル(参考例８)２２.３g(０.１モル)を滴下
し、一晩撹拌した。氷冷下、炭酸水素ナトリウム(１０
０g／水１００ml)を加え中和後、ろ過し有機層を得た。
水層をジクロロメタンを用いて抽出した。有機層を合わ
せて硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣
をシリカゲルカラム(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン
１:２)で精製し、黄色針状晶を得た。収量１０.２g(４
９.８％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:３.８２(３Ｈ、s)、４.０３(３
Ｈ、s)、６.９２(２Ｈ、d、Ｊ＝８.７Ｈz)、７.４４(１
Ｈ、s)、７.７２(２Ｈ、d、Ｊ＝８.７Ｈz)。
【００６６】参考例２１ シス−３,６−エポキシ−３−メトキシ−４,５−ジメト
キシカルボニル−２−(p−メトキシフェニル)−３,４,
５,６−テトラヒドロピリジン ５−メトキシ−４−メトキシフェニルオキサゾール２０
０mgと、マレイン酸ジメチル１５７mg(１.１eq)を１２
０℃で１.５時間加熱した。シリカゲルカラム（溶出溶
媒：酢酸エチル−ヘキサン１:１)で精製した。エキソ
体: 無色板状晶。収量１３０mg(３８.２％)。融点１４
８−１５０℃。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:３.０４(２Ｈ、s)、３.５０(３
Ｈ、s)、３.７２(３Ｈ、s)、３.７４(３Ｈ、s)、３.８５
(３Ｈ、s)、６.２４(１Ｈ、s)、６.９８(２Ｈ、d、Ｊ＝
８.７Ｈz)、７.９６(２Ｈ、d、Ｊ＝８.７Ｈz)。 エンド体: 無色プリズム晶。収量４０mg(１１.８％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ:３.４９(３Ｈ、s)、３.５７(３
Ｈ、s)、３.６５(３Ｈ、s)、３.８３(２Ｈ、m)、３.８
６(３Ｈ、s)、５.９９(１Ｈ、d、Ｊ＝３.６Ｈz)、６.９
２(２Ｈ、d、Ｊ＝９Ｈz)、８.０４(２Ｈ、d、Ｊ＝９Ｈ
z)。
【００６７】実施例１ ８−ヒドロキシ−７−(p−メトキシフェニル)ピリド
[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−
００３) シス−３,６−エポキシ−３−メトキシ−４,５−ジメト
キシカルボニル−２−(p−メトキシフェニル)３,４,５,
６,−テトラヒドロピリジン(エキソ体)１.０gにヒドラ
ジン−水和物１０mlを加え、窒素気流下１００℃で１時
間加熱した。氷冷下、反応液に水を加え酢酸で中和しp
Ｈ３とした。析出した黄色粉末状結晶をろ取した。つい
で１Ｎ水酸化ナトリウムに溶かしＬＨ−２０で精製後、
凍結乾燥した。収量１９０mg(１８.４％)。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ:３.８０(３Ｈ、s)、６.９６
(２Ｈ、d、Ｊ＝９.０Ｈz)、８.３３(１Ｈ、s)、８.４５
(２Ｈ、d、Ｊ＝９.０Ｈz)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１６６０、１６１０、１５８５、１３６
５、１２５５cm-1。 元素分析:計算値(Ｃ14Ｈ10Ｎ3Ｏ4Ｎa・３Ｈ2Ｏ)Ｃ:４
６.５４; Ｈ:４.４６; Ｎ:１１.６３。測定値Ｃ:４６.
７５; Ｈ:４.４０; Ｎ:１１.６４。
【００６８】参考例２２ Ｎ−Ｂoc−４−(３−フタルイミドプロピルオキシ)フェ
ニルグリシンメチルエステル Ｎ−Ｂoc−p−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエス
テル２.８gと無水炭酸カリウム１.３８g(１.０eq)を無
水ＤＭＦ１０mlに加え、次いでＮ−(３−ブロモプロピ
ル)フタルイミド２.６８g(１.０eq)を加え、１００℃で
１時間加熱した。反応液を氷水にあけ酢酸エチルで抽
出、有機層を水、飽和食塩水で洗浄後乾燥、溶媒を留去
した。シリカゲルカラム(溶出:５％酢酸エチル−ジクロ
ロメタン)を用いて精製した。無色結晶を得た。収量３.
８８g(８２.６％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.４３(９Ｈ、s)、２.１８
(２Ｈ、m)、３.７１(３Ｈ、s)、３.９１(２Ｈ、t、Ｊ＝
６.８Ｈz)、４.０２(２Ｈ、t、Ｊ＝６.０Ｈz)、５.２３
(１Ｈ、d、Ｊ＝６.３Ｈz)、５.４６(１Ｈ、d、Ｊ＝６.
３Ｈz)、６.７８(２Ｈ、d、Ｊ＝８.８Ｈz)、７.２３(２
Ｈ、d、Ｊ＝８.８Ｈz)、７.７３(２Ｈ、m)、７.８５(２
Ｈ、m)。
【００６９】参考例２３ Ｎ−ホルミル−４−(３−フタルイミドプロピルオキシ)
フェニルグリシンメチルエステル Ｎ−Ｂoc−４−(３−フタルイミドプロピルオキシ)フェ
ニルグリシンメチルエステル３.０gに、ぎ酸２５mlを加
え、４０−５０℃で３０分間撹拌した。次いで、氷冷下
無水酢酸１.２７ml(２.１eq)を滴下し、一晩撹拌した。
無水酢酸１mlを追加し、４０−５０℃で２時間撹拌し
た。溶媒を留去し、炭酸水素ナトリウム水で中和し酢酸
エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、
乾燥、溶媒を留去した。生じた無色結晶をn−ヘキサン
を用いてろ取した。収量２.４３g(９５.７％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):２.１８(２Ｈ、m)、３.７４
(３Ｈ、s)、３.９０(２Ｈ、t、Ｊ＝６.９Ｈz)、４.０１
(２Ｈ、t、Ｊ＝６.０Ｈz)、５.５７(１Ｈ、d、Ｊ＝７.４
Ｈz)、５.５８(１Ｈ、d、Ｊ＝７.４Ｈz)、６.７８(２
Ｈ、d、Ｊ＝８.８Ｈz)、７.２３(２Ｈ、d、Ｊ＝８.８Ｈ
z)、７.７１(２Ｈ、m)、７.８５(２Ｈ、m)、８.２１(１
Ｈ、s)。
【００７０】参考例２４ ５−メトキシ−４−[４−(３−フタルイミドプロピルオ
キシ)フェニル]オキサゾール ハイフロスーパーセル(登録商標)０.７５g、五酸化リン
１.５gをジクロロエタン１５ml中で５０−６０℃に加温
し、激しく撹拌した。ジクロロエタン２０mlに溶かした
Ｎ−ホルミル−４−(３−フタルイミドプロピルオキシ)
フェニルグリシンメチルエステル２.０gを滴下した。一
晩撹拌した。氷冷下飽和炭酸水素ナトリウム水を用いて
中和しハイフロスーパーセル(登録商標)を用いてろ過後
分液した。水層をジクロロメタンで抽出し、有機層を合
わせて水洗、乾燥後、溶媒を留去した。析出した結晶を
酢酸エチル−n−ヘキサンを用いてろ取した。収量０.８
８g(４６.１％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):２.２０(２Ｈ、m)、３.９３
(２Ｈ、t、Ｊ＝７.０Ｈz)、４.０５(３Ｈ、s)、４.０６
(２Ｈ、t、Ｊ＝６.０Ｈz)、６.８４(２Ｈ、d、Ｊ＝８.８
Ｈz)、７.４７(１Ｈ、s)、７.６９(２Ｈ、d、Ｊ＝８.８
Ｈz)、７.７０(２Ｈ、m)、７.８６(２Ｈ、m)。
【００７１】参考例２５ シス−３,６−エポキシ−３−メトキシ−４,５−ジメト
キシカルボニル−２−[４−(３−フタルイミドプロピル
オキシ)フェニル]−３,４,５,６−テトラヒドロピリジ
ン ５−メトキシ−４−[４−(３−フタルイミドプロピルオ
キシ)フェニル]オキサゾール１２０mgにマレイン酸ジメ
チル０.５g(１０eq)を加え１２０℃、３時間加熱した。
残渣をシリカゲルカラム(溶出:酢酸エチル-ヘキサン１:
２)を用いて精製した。エキソ付加体:収量７５mg(４５.
４％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):２.２３(２Ｈ、m)、３.０５
(１Ｈ、s)、３.０６(１Ｈ、s)、３.５０(３Ｈ、s)、３.
７３(３Ｈ、s)、３.７７(３Ｈ、s)、３.９３(２Ｈ、t、
Ｊ＝６.０Ｈz)、４.１０(２Ｈ、t、Ｊ＝６.０Ｈz)、６.
２５(１Ｈ、s)、６.８７(２Ｈ、d、Ｊ＝８.８Ｈz)、７.
７３(２Ｈ、m)、７.８８(２Ｈ、m)、７.９１(２Ｈ、d、
Ｊ＝８.８Ｈz)。 エンド付加体:収量５９mg(３５.７％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):２.２３(２Ｈ、m)、３.４６
(３Ｈ、s)、３.５６(３Ｈ、s)、３.６３(３Ｈ、s)、３.
８０(２Ｈ、m)、３.９２(２Ｈ、t、Ｊ＝６.６Ｈz)、４.
１０(２Ｈ、t、Ｊ＝６.６Ｈz)、５.９８(１Ｈ、d、Ｊ＝
３.８Ｈz)、６.８１(２Ｈ、d、Ｊ＝９.２Ｈz)、７.７４
(２Ｈ、m)、７.８３(２Ｈ、m)、７.９８(２Ｈ、d、Ｊ＝
９.０Ｈz)。
【００７２】実施例２ ７−[４−(３−アミノプロピルオキシ)フェニル]−８−
ヒドロキシピリド[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,
３Ｈ)ジオン(Ｌ−０１１) シス−３,６−エポキシ−４,５−ジメトキシカルボニル
−３−メトキシ−２−[４−(３−フタルイミド−プロピ
ルオキシ)フェニル]−３,４,５,６−テトラヒドロピリ
ジン エキソ体０.５７gおよびエンド体０.５gの混合物
にヒドラジン−水和物１.５mlを加え、窒素気流下１０
０℃、４時間加熱撹拌した。塩酸を用いて中和し、pＨ
５としてろ取した。１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解しＡmb
erlite(登録商標)ＸＡＤ−２(Ｒohm ＆ Ｈaas社)カラム
(１５φ×２００)に付した。１Ｎ塩酸で溶出する画分を
集め溶媒を留去し得られた粉末状結晶をメタノールを用
いてろ取した。収量:７６mg。融点３００℃以上。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):２.０８(２Ｈ、m)、２.
９８(２Ｈ、m)、４.１６(２Ｈ、m)、７.０８(２Ｈ、d、
Ｊ＝９.０Ｈz)、８.０５(３Ｈ、br.)、８.２０(２Ｈ、
d、Ｊ＝９.０Ｈz)、８.７４(１Ｈ、s)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:３４５０、２９８０、２８７０、１６６
０、１６００、１４７５、１３５０、１２９５、１２８
０cm-1。 元素分析: 計算値(Ｃ16Ｈ16Ｎ4Ｏ4・２ＨＣl)Ｃ:４７.
８９; Ｈ:４.５２; Ｎ:１３.９６。測定値Ｃ:４７.５
９; Ｈ:４.６０; Ｎ:１３.９６。
【００７３】実施例３ ８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド[３,４−
d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０１２) 参考例１９で得た３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジ
エトキシカルボニル−２−フェニルピリジン５５mgにヒ
ドラジン１水和物１mlを加え１００℃、２５分間、窒素
気流下加熱した。氷冷下、反応液に水を加え、塩酸で中
和、pＨ５とし、生じた黄色粉末状結晶をろ取した。収
量２０mg(４３.９％)。融点３００℃以上。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):６.２９(２Ｈ、s)、７.
５１−７.６９(５Ｈ、m)。ＩＲ(ＫＢr)ν:３４７０、３
０５０、１６４５、１５８５cm-1。 元素分析:計算値(Ｃ13Ｈ9Ｎ4Ｏ2Ｃl)Ｃ:５４.０９; Ｈ:
３.１４; Ｎ:１９.４１。測定値Ｃ:５４.１８; Ｈ:３.
０７; Ｎ:１９.６１。
【００７４】参考例２６ ３,４−ジメトキシカルボニル−２−メトキシ−５−ニ
トロ−６−フェニルピリジン 参考例１８で得た２−クロロ−３,４−ジエトキシカル
ボニル−５−ニトロ−６−フェニルピリジン１.２gをメ
タノール２５mlに溶かし、１Ｎナトリウムメトキシドメ
タノール溶液６.３４ml(２.０eq)を加え、室温で３０分
間撹拌した。酢酸０.２ml(１.１eq)で中和し溶媒を留去
した。残渣に水を加え酢酸エチルで抽出、有機層を水、
飽和食塩水で洗浄後、乾燥、溶媒を留去した。残渣をシ
リカゲルカラム(溶出:酢酸エチル)を用いて精製、析出
した結晶をヘキサンを用いてろ取した。収量 １.１g(８
５.２％)。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):３.９２(３Ｈ、s)、３.９３
(３Ｈ、s)、４.１１(３Ｈ、s)、７.４９(３Ｈ、m)、７.
５８(２Ｈ、m)。
【００７５】参考例２７ ３−アミノ−４,５−ジメトキシカルボニル−６−メト
キシ−２−フェニルピリジン ３,４−ジメトキシカルボニル−２−メトキシ−５−ニ
トロ−６−フェニルピリジン１.０gを酢酸エチル１０ml
に溶かし、１０％Ｐd−Ｃ(５０％湿潤)５００mgを加
え、室温で３.５時間接触還元した。触媒をろ去後、乾
燥、溶媒を留去した。析出した結晶をヘキサンを用いて
ろ取した。収量 ０.８g(８７.６％)。ＮＭＲ(ＣＤＣl3)
δ(ppm):３.９０(３Ｈ、s)、３.９３(６Ｈ、s)、５.１
８(２Ｈ、br.)、７.４９(３Ｈ、m)、７.６８(２Ｈ、
m)。
【００７６】実施例４ ８−アミノ−５−メトキシ−７−フェニルピリド[３,４
−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０１３) ３−アミノ−４,５−ジメトキシカルボニル−６−メト
キシ−２−フェニルピリジン０.８gにヒドラジン１水和
物４mlを加え、１００℃、１時間、窒素気流下加熱し
た。氷冷下、反応液に水を加え、塩酸で中和、pＨ３と
し、生じた黄色粉末状結晶をろ取した。収量 ０.７g(９
８.７％)、融点２５０−２５１℃(分解)。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):３.８９(３Ｈ、s)、７.
４７(３Ｈ、m)、７.８１(２Ｈ、dd、Ｊ＝１.６、８.４
Ｈz)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:３４５０、１６４５、１５３０cm-1。 元素分析:計算値(Ｃ14Ｈ12Ｎ4Ｏ3)Ｃ:５９.１５;Ｈ:４.
２５; Ｎ:１９.７１;測定値Ｃ:５９.１１;Ｈ:４.１３;
Ｎ:１９.４９。
【００７７】実施例５ マイクロペルオキシダーゼ触媒による発光強度の比較 参考例５、１２、実施例１、２、３および４で得られた
ピリドピリダジン誘導体およびルミノール(５％水酸化
ナトリウム水溶液から再結晶化)それぞれを１００pgお
よび１００ng／mlになるように７５mＭバルビタール緩
衝液(pＨ８.６)で溶解した。それぞれ１００μlを試験
管に取り、マイクロペルオキシダーゼ５μg／ml(７５m
Ｍバルビタール緩衝液pＨ８.６)１００μlを加えさらに
蒸留水で希釈した３０mＭ Ｈ2Ｏ2液１００μlを加えて
化学発光反応を開始させた。測定装置にはアロカ製ルミ
ネッセンスリーダーＲＬＲ−２０１を用い３０秒間の化
学発光量を計測した。１０pg／管および１０ng／管にお
けるルミノール(Ｎa塩)の発光量をそれぞれ１００とし
て各種ピリドピリダジン誘導体の相対発光強度を算出し
た。結果を第１表にまとめる。第１表に示すごとく、ル
ミノール(Ｎa塩)を１００として比較して、最大約５５
倍の発光強度を与える。
【００７８】
【表１】
【００７９】実施例６ ペルオキシダーゼ触媒による発光強度の比較１ 参考例１２ならびに実施例３および４で得られたピリド
ピリダジン誘導体およびルミノールそれぞれを、０.２m
Ｍ濃度になるように０.１mＭエチレンジアミン四酢酸二
ナトリウム(ＥＤＴＡ)を含む０.２Ｍトリス緩衝液pＨ
８.６に溶解した。それぞれ５０μlを試験管に取り、西
洋ワサビペルオキシダーゼの１ngおよび１０ng／mlの濃
度の０.２Ｍトリス緩衝液(pＨ８.６)１００μlを加え、
さらに０.６mＭＨ2Ｏ2を含む０.２Ｍトリス緩衝液(pＨ
８.６)５０μlを加えて化学発光反応を開始させた。測
定はＨ2Ｏ2液添加後６０秒から７０秒までの１０秒間の
発光量を計測した。測定結果を第２表にまとめた。第２
表に示すごとく、ルミノール(Ｎa塩)と比べて最大約１
０倍の高い発光量を与えた。
【００８０】
【表２】
【００８１】実施例７ ペルオキシダーゼ触媒による発光強度の比較２ 実施例３で得られたピリドピリダジン誘導体(Ｌ−０１
２)およびルミノールそれぞれを０.２mＭ濃度になるよ
うに０.１mＭ ＥＤＴＡを含む０.２Ｍトリス緩衝液(pＨ
８.６)に溶解した。それぞれ９９０μlを試験管に取
り、化学発光増強剤(エンハンサー)として４０mＭ p−
ヨードフェノールのジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)溶
液１０μlを加えて混合した後、５０μlをそれぞれ別の
試験管に分取し、西洋ワサビペルオキシダーゼの１０p
g、１００pg、１ng、１０ng／mlの濃度の０.２Ｍトリス
緩衝液(pＨ８.６)１００μlを加えた。さらに０.６mＭ
Ｈ2Ｏ2を含むトリス緩衝液(pＨ８.６)５０μlを加えて
化学発光反応を開始した。測定はＨ2Ｏ2液添加後６０秒
から７０秒までの１０秒間の発光量を計測した。測定結
果を第３表にまとめる。第３表に示すごとく、実施例３
のピリドピリダジン誘導体(Ｌ−０１２)はルミノールと
比べて約４〜２０倍の化学発光量を与える。Ｌ−０１２
のナトリウム塩もＬ−０１２と同様の化学発光量を与え
た。
【００８２】
【表３】
【００８３】実施例８ 実施例２で得られたピリドピリダジン誘導体(Ｌ−０１
１)５マイクロモルをジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)０.
５mlに溶解した。無水こはく酸７.５マイクロモルを含
むＤＭＦ溶液０.１mlを加えて４℃で一夜反応させた。
次に５マイクロモルのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを
含むＤＭＦ溶液０.１ml、８.５マイクロモルのジシクロ
ヘキシルカルボジイミドを含むＤＭＦ溶液０.１mlを加
えて更に一夜反応させて、Ｌ−０１１の活性エステル体
とした。次にインターフェロンγ(ＩＦＮ−γ)に対する
単クローン抗体を０.０５Ｍホウ酸緩衝液(pＨ８)中に
２.１５mg／mlの濃度となるように調製した。この抗体
溶液５００μlにＬ−０１１:抗体の比が２０:１となる
ように前記の活性エステル溶液を添加し、４℃で一晩反
応させた。生成したＬ−０１１−モノクローナル抗ＩＦ
Ｎ−γ抗体コンジュゲートは、セファデックス(登録商
標)Ｇ−２５ファインを用いたゲル濾過[カラム容量１０
ml、０.０５Ｍホウ酸緩衝液(pＨ８)で平衡化]で精製し
た。
【００８４】調製したコンジュゲートを用いたイムノア
ッセイは、ポリスチレン製ビーズ(イムノケミカル社製
直径３mm)を固相として行った。ビーズを生理的リン酸
緩衝溶液(ＰＢＳ)で溶解した５０μg／mlＩＦＮ−γ溶
液中に浸し、４℃で一晩インキュベートした。ビーズを
ＰＢＳで３回洗った後、２５％ブロックエース(登録商
標)(雪印乳業製)を含むＰＢＳに浸し、４℃で使用時ま
で保存した。Ｌ−０１１−モノクローナル抗ＩＦＮ−γ
コンジュゲートを１０μg/ml〜１０pg／mlとなるように
２５％ブロックエースを含むＰＢＳで段階的に希釈し、
コンジュゲート溶液を調製した。各溶液２５０μl中に
ビーズを１個添加し、振盪しながら室温で２時間インキ
ュベートした。ビーズをＰＢＳで５回洗った後、２５０
μlの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液に浸し、１００℃で１
時間インキュベートすることによりＬ−０１１を抗体分
子上から遊離させた。遊離したＬ−０１１を含む上清を
１００μl用い、化学発光法によりＬ−０１１量を定量
した。すなわち、５μg/mlマイクロペルオキシダーゼ
(ＭＰ−１１)を含む７５mＭバルビダール緩衝液(pＨ８.
６)１００μlおよび３０mＭ過酸化水素を含む７５mＭバ
ルビタール緩衝液１００μlを加えて発光を開始させ、
ルミネッセンスリーダーＲＬＲ−２０１(Ａloka社製)で
計測した(３０秒間測光)。結果を第１図に示す。第１図
のごとく、抗体量の増加と共に発光カウントが増大す
る。
【００８５】実施例９ 化学発光検出法を用いるサンドイッチ酵素免疫測定法 ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(hbＦＧＦ)の測定を行っ
た。使用したモノクローナル抗体(３Ｈ３)は後記参考例
２８の方法で得たものである。 １) 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗体の調製 hbＦＧＦに対するモノクローナル抗体(３Ｈ３)７mg／ml
を０.１Ｍ ＮaＣlを含む０.１Ｍ酢酸緩衝液(pＨ４.５)
に対して４℃で２０時間透析し、ペプシン(シグマ社
製、米国)(０.１mg)を加え、３７℃で８時間消化した。
１Ｍトリス(Ｔｒｉｓ）でｐＨを８にして反応を止め、
ウルトロゲル(Ｕltrogel)ＡcＡ４４(ＩＢＦ社製、フラ
ンス)のカラムで０.１５Ｍ ＮaＣlを含む０.０２Ｍホウ
酸緩衝液(pＨ８.０)を溶出液として分離し、Ｆ(ab')2を
得た。
【００８６】これを、１mlに濃縮後、０.１Ｍリン酸緩
衝液(pＨ６.０)に対して４℃で２０時間透析し、０.２
Ｍメルカプトエチルアミン、５mＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍリ
ン酸緩衝液(pＨ６.０)０.１mlを加えて、３７℃、９０
分間還元した。反応液をセファデックス(Ｓephadex)(登
録商標)Ｇ−２５fine(ファルマシア・ファインケミカル
社製、スエーデン)(φ１×６０cm)で５mＭ ＥＤＴＡ、
０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ６.０)を溶出液として分離
し、Ｆab'画分を得た。一方、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ(ＨＲＰ)(ベーリンガーマンハイム社製、西ドイツ)
１０mgを１.５mlの０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)に溶
かし、Ｎ−(γ−マレイミドブチルオキシ)サクシンイミ
ド(ＧＭＢＳ)３.５mgをＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
(ＤＭＦ)１００μlに溶かして加え、３０℃で６０分間
撹拌後、セファデックス(登録商標)Ｇ−２５ fine(φ
１.２×６０cm)で０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)を溶
出液として分離し、マレイミド基の導入されたＨＲＰを
得た(マレイミド化ＨＲＰ)。Ｆab'とマレイミド化ＨＲ
Ｐをモル比で１:１となるように混ぜ、４℃で２０時間
反応した。反応液を、ウルトロゲルＡcＡ４４のカラム
で０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)を溶出液として分離
し、酵素標識抗体(３Ｈ３−ＨＲＰ)を得た。
【００８７】２) 抗体結合固相の調製 hbＦＧＦに対するモノクローナル抗体(ＭＡb５２および
ＭＡb９８)を０.１Ｍ炭酸緩衝液(pＨ９.５)で５０μg/m
lになるように希釈し、直径３.２mmのポリスチレン球を
浸漬して４℃で一夜放置して感作させた。０.１５Ｍ Ｎ
aＣlを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０;ＰＢＳ)で
洗浄し、０.１％ＢＳＡを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液(p
Ｈ７.０)中で用時まで冷所保存した。
【００８８】３) サンドイッチ法−ＥＩＡ(化学発光法) 前記２)で調製したポリスチレン球を試験管に取り、２
５％ブロックエース(大日本製薬)、０.１５Ｍ ＮaＣlを
含むpＨ７.０の０.０２Ｍリン酸緩衝液(緩衝液Ｂ)に溶
解した各種濃度のhbＦＧＦ２５０μlを加えて４℃で一
夜反応させた。ＰＢＳで２回洗浄後、前記１)で調製し
た西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗体(緩衝液Ｂで
１５０倍に希釈)２５０μlを加えて室温で３時間反応さ
せた。ＰＢＳで２回洗浄し、実施例３で得られたピリド
ピリダジン誘導体(Ｌ−０１２)２００μＭ、ＥＤＴＡを
５０μＭ化学発光増強剤として４−(４−ハイドロキシ
フェニル)チアゾールを１００μＭの割合で含む５０mＭ
トリス緩衝液(pＨ７.５)１００μl、３００μＭ過酸化
水素液１００μl、５％ＤＭＳＯを加えて化学発光反応
を生じせしめた。測定にはアロカルミネッセンスリーダ
ーを利用し、過酸化水素液添加後６０秒から７０秒まで
の１０秒間の化学発光量を計測した。得られたhbＦＧＦ
の標準曲線を第２図に示す。この結果からhbＦＧＦを約
２pg／mlまで測定できる。
【００８９】参考例２８ 免疫 ＢＡＬＢ／cマウス(♀８週令)に対し、フロインド完全
アジュバント(Ｄifco社製)に溶解させた５０μgの抗原
ヒトrhbＦＧＦムテインＣＳ２３(ヒトbＦＧＦ中７０位
および８８位のＣysがＳerで置換されているムテイン)
を腹腔に注射した。２週間後に、フロインド完全アジュ
バント０.４mlに溶かした５０μgの抗原rhbＦＧＦムテ
インＣＳ２３を腹腔に再投与した。さらに２週間後にフ
ロインド不完全アジュバント０.４mlに溶かした５０μg
の抗原rhbＦＧＦムテインＣＳ２３の追加免疫を行い、
その２週間後に生理食塩水に溶かした５０μgのヒトrb
ＦＧＦムテインＣＳ２３をマウス尾静脈内に接種した。
【００９０】細胞融合 前記の免疫マウスより、抗原最終投与の３日後脾臓を摘
出し、細胞融合に用いる細胞を得た。この細胞は、イス
コフ培地とハムＦ−１２培地を１:１の比率で混合した
培地(以下ＩＨ培地と略す)に懸濁した。マウス骨髄腫様
細胞ＳＲ２／０−Ａg１４は、１０％ウシ胎児血清を含
むＤＭＥＭ培地で５％炭酸ガス、９５％空気の条件で継
代培養した。細胞融合は、ケーラーおよびミルスタイン
らが確立した方法[ケーラー, Ｇ．およびミルスタイン,
Ｃ．:ネイチャー(Ｎature) ２５６, ４９５(１９７
５)]に準じて行った。このミエローマ細胞２×１０7個
と前記した方法で得られた免疫されたリンパ球１.５×
１０8個を混合、遠沈し、１mlのＩＨ培地に溶解した４
５％ポリエチレングリコール６０００(以下ＰＥＧ６０
００)を滴下した。ＰＥＧ６０００溶液は、予め３７℃
に温め、ゆっくりと１分間かけて滴下した。
【００９１】次にＩＨ培地１mlを１分間、１mlを１分
間、８mlを３分間かけて滴下した。その後室温で１,０
００回転５分間遠心し上清を除去した。この細胞沈澱物
を２０％仔牛血清を含むＩＨ培地３０mlに懸濁し、９６
穴マイクロプレート(ヌンク社)に１００μlずつ植えつ
けた。１日後、ＨＡＴ(ヒポキサンチン１×１０-4Ｍ、
アミノプテリン４×１０-7Ｍ、チミジン１.６×１０-5
Ｍ)を含んだＩＨ培地(２０％仔牛血清含有)(以下ＨＡＴ
培地と称する。)を各ウエルに１００μlずつ添加し、さ
らに３日おきに、培地の１／２量をＨＡＴ培地と交換し
た。このようにして生育した細胞は雑種細胞である。
【００９２】抗体産生細胞の検索 ２００ng／mlのrhbＦＧＦムテインＣＳ２３を含む固定
緩衝液(０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム(pＨ９.６)、０.０
２％アジ化ナトリウム)をポリスチレン製９６穴マイク
ロプレート(ヌンク社)に１００μl／穴加えた。２時間
後、洗浄液(０.０５％ツイーン２０、生理的リン酸緩衝
液)で洗った後、培養上清５０μlと希釈用緩衝液[０.０
５Ｍトリス・塩酸(pＨ８.０１、１mＭ塩化マグネシウ
ム、０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０.０５％ツイーン２
０、０.０２％アジ化ナトリウム、０.３％ゼラチン)]５
０μlを混合した溶液１００μlをマイクロプレートに加
えた。２時間後培養上清を洗浄液で洗った後、２次抗体
としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩgＧヤ
ギ抗体(バイオラッド社)を加えた。２時間後２次抗体を
洗浄液で洗った後、反応基質を加えた呈色反応を行った
(ＥＬＩＳＡ法)。この方法により４つのウエルにrhbＦ
ＧＦムテインＣＳ２３結合活性が認められた。
【００９３】bＦＧＦ中和抗体産生細胞の検索 ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を２.５％牛胎児血清を含む
ＧＩＴ培養液に懸濁し、９６穴マイクロプレートに２,
０００個／穴で１００μl播種した。翌日種々の濃度の
ハイブリドーマ培養上清、４ng／ml rhbＦＧＦ、２.５
％牛胎児血清を含むＧＩＴ溶養液１００μl／穴添加し
３日間３７℃、５％ＣＯ2、７％Ｏ2下で培養した。３日
後培養液を除去した後１mg／mlＭＴＴ(４,５−ジメチル
−２−チアゾリル)−２,５−ジフェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウムブロマイド)を含む２.５％牛胎児血清を含むＧ
ＩＴ培養液１００μl／穴加えた。４時間、３７℃、５
％ＣＯ2、７％Ｏ2下で培養した後、１０％ドデシル硫酸
ナトリウム(ＳＤＳ)を１００μl／穴加えた。４時間
後、ＯＤ５９０nmの吸光度を９６穴用分光度計(タイタ
ーテック社)で測定した(ＭＴＴ法)。この方法により１
つのウエルに強い中和活性が観察された。
【００９４】雑種細胞のクローニング このウエル中の細胞を、１ウエルあたり０.５個となる
ように、予めマウス胸腺細胞を栄養細胞としてまいてお
いた９６穴マイクロタイタープレートにまき、クローニ
ングを行った。その結果、ハイブリドーマ マウス３Ｈ
３細胞を得た。クローニングされた細胞は、１０％仔牛
血清を含むＩＨ培地に１０％となるようジメチルスルホ
キシド(ＤＭＳＯ)を加え液体窒素内に貯蔵した。
【００９５】モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラ
ス 前記で得られた３Ｈ３細胞の培養上清を、マウス抗体サ
ブクラス検出キット(バイオラッド社)により各種標品免
疫グロブリンと反応させた。その結果を第４表に示す。
【００９６】
【表４】
【００９７】表中、＋は反応陽性を、−は反応陰性を示
す。第４表より、３Ｈ３細胞培養上清中の抗体は免疫グ
ロブリンクラスＩgＧ1サブクラスに属する。
【００９８】培養上清、腹水からのモノクローナル抗体
の精製 結合緩衝液(３Ｍ塩化ナトリウム、１.５Ｈグリシン(pＨ
８.７))で平衡化したプロテインＡカラムに、マウス３
Ｈ３細胞の培養上清と結合緩衝液を１:１で混合したも
のを添着した。結合緩衝液で洗った後、溶出緩衝液(０.
１Ｍクエン酸(pＨ５))で溶出した。溶出液には１Ｍトリ
ス(pＨ８.０)を加え中性化して生理的リン酸緩衝液中で
透析した。標品のＩgＧ量定量は実施例２(２)の方法に
従って以下の様に行った。濃度のわかっているマウスＩ
gＧおよび３Ｈ３抗体を様々な希釈倍率で固定緩衝液で
ポリスチレン製９６穴マイクロプレートに固定した。２
時間後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩgＧ
ヤギ抗体(バイオラッド社)を加えた。２時間後反応基質
を加えた呈色反応を行った(ＥＬＩＳＡ法)。濃度のわか
っているマウスＩgＧ1について定量曲線を画き、それに
対して標品のＩgＧ量を定量した。これにより３Ｈ３抗
体６０μg／mlの溶液を調製した。１μg／mlのウサギ抗
bＦＧＦポリクローナル抗体を固定し、rhbＦＧＦムテイ
ンＣＳ２３を添加した後１μg／mlの３Ｈ３抗体を添加
し、１μg／mlのアルカリフォスファターゼ標識抗マウ
スＩgＧヤギ抗体を添加した。この方法により、３ng／m
lまでのrhbＦＧＦムテインＣＳ２３の検出が可能であ
る。さらに腹水からのモノクローナル抗体の精製を行っ
た。
【００９９】マウス３Ｈ３細胞株を、マウス(Ｂalb／c)
にて腹水化した。腹水からのＩgＧの精製は、常法に従
った。すなわち、腹水５mlを４５％飽和の硫酸アンモニ
ウムにて塩析し、沈澱を０.１５Ｍ ＮaＣlを含むホウ酸
緩衝液(ＢＢＳ、pＨ８.５)に溶解し、ＢＢＳに対して４
℃で２０時間透析した。これを、ＤＥ−５０(英国、Ｗh
atman社製、１×６０cm)カラムに付し、０.１Ｍリン酸
緩衝液(pＨ８.０)中のＮaＣl濃度を０.１Ｍから０.３５
Ｍに直線的に変化させる濃度勾配溶出法により、腹水５
mlからモノクローナル抗体３Ｈ３抗体を７mg得た。な
お、前記で得られたハイブリドーママウス３Ｈ３細胞
は、平成元年１１月１０日から財団法人発酵研究所(IF
O)に受託番号ＩＦＯ ５０２１６として寄託されてお
り、さらにこの細胞は通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所(ＦＲＩ)に、平成元年１１月１４日から受託
番号ＦＥＲＭＢＰ−２６５８として寄託されている。
【０１００】rhbＦＧＦムテインＣＳ２３は、形質転換
体エシェリヒア・コリ(Ｅscherichiacoli)ＭＭ２９４／
pＴＢ７６２(ＩＦＯ １４６１３, ＦＥＲＭ ＢＰ−１
６４５)を用いて、セノ(Ｓeno)ら、バイオフィジカル・
バイオケミカル・リサーチ・コミュニケーション(Ｂiop
hys．Ｂiochem．Ｒes．Ｃommun．) １５１, ７０１(１
９８８)、ヨーロッパ特許出願公開第２８１,８２２号公
報に記載の方法で製造されたものを用いた。前記エシェ
リヒア・コリＭＭ２９４／pＴＢ７６２は１９８７年５
月２７日からＩＦＯに受託番号ＩＦＯ １４６１３とし
て寄託されており、また本形質転換体はＦＲＩに１９８
７年６月１１日から受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−９４０９と
して寄託され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に
切り換えられて、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１６４５と
してＦＲＩに保管されている。
【０１０１】参考例２９ ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−６−ヒド
ロキシ−２−フェニルピリジン 参考例１７で得られた３,４−ジエトキシカルボニル−
５−ニトロ−６−フェニル−２−ピリドン ５００mg、
還元鉄６９０mg、エタノール５mlを６０℃に加温し濃塩
酸２.８３mlを３０分間で滴下した。氷冷下飽和炭酸水
素ナトリウム水を用いて中和しジクロロメタンで抽出し
た。有機層を乾燥後、溶媒を留去した。シリカゲルカラ
ム(溶出:酢酸エチル−ジクロロメタン１:６)を用いて精
製し、粗結晶を得た。ジクロロメタン−ヘキサンを用い
て再結晶し橙色粉末状結晶を得た。 収量：１０２mg(２２.３％).mp１０３−１０４℃.ＮＭ
Ｒ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.４０(６Ｈ,m),４.０５(２Ｈ,
s),４.４１(４Ｈ,m),７.４７(３Ｈ,m),７.６７(２Ｈ,
m),ＩＲ(ＫＢr)ν:１７４０,１７２０,１６３５,１５８
０cm-1.
【０１０２】参考例３０ ３,４−ジエトキシカルボニル−２−ジメチルアミノ−
５−ニトロ−６−フェニルピリジン 参考例１８で得られた２−クロロ−３,４−ジエトキシ
カルボニル−５−ニトロ−６−フェニルピリジン１００
mgをエタノール１mlに溶かし、１.５５Ｍジメチルアミ
ンエタノール溶液０.３４ml(２.０eq.)を加え、室温で
撹拌した。１.５時間後ジメチルアミン溶液０.１mlを追
加し、一晩放置した。溶媒を留去し、析出した結晶をヘ
キサンを用いてろ取した。 収量:５１.７mg(５０.５％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
１.３７(６Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),３.１７(６Ｈ,s),４.３
５(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.４０(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈ
z),７.４５(３Ｈ,m),７.６０(２Ｈ,m).
【０１０３】参考例３１ ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−６−ジメ
チルアミノ−２−フェニルピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−２−ジメチルアミノ−
５−ニトロ−６−フェニルピリジン５２mgを酢酸エチル
２mlに溶かし、１０％Ｐd−Ｃ(５０％ wet)５０mgを加
え、５.５時間接触還元した。触媒をろ去後、溶媒を留
去し、シリカゲルカラム(溶出溶媒酢酸エチル−ヘキサ
ン１:２)で精製した。 収量:４３mg(８９.６％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.
３７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),１.３９(３Ｈ,７,Ｊ＝７.
２Ｈz),２.８０(６Ｈ,s),４.３６(４Ｈ,m),５.０８(２
Ｈ,br.),７.４７(３Ｈ,m),７.６６(２Ｈ,m).
【０１０４】参考例３２ ３,４−ジエトキシカルボニル−６−メチル−２−ピリ
ドン ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−メチ
ルピリジン２.５２g(１０mmole)を２％塩酸９０mlに溶
かし、亜硝酸ナトリウム０.８３g(１.２eq)を水３mlに
溶かして滴下した。室温で１時間撹拌し、一晩冷蔵し
た。析出した結晶をろ取した。酢酸エチルから再結晶し
無色板状晶を得た。 収量：１.５g(５９.３％).融点１３８−１３９℃.ＮＭ
Ｒ(ＣＤＣl3)δ:１.３６(６Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),２.３
７(３Ｈ,s),４.３２(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.３６(２
Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),６.４３(１Ｈ,s).ＩＲ(ＫＢr)ν:
１７５５,１７２５,１６３５,１２６０cm-1.元素分析:
計算値(Ｃ12Ｈ15ＮＯ5)Ｃ:５６.９１;Ｈ:５.９７;Ｎ:
５.５３.測定値Ｃ:５６.９６;Ｈ:６.０４;Ｎ:５.３９.
【０１０５】参考例３３ ３,４−ジエトキシカルボニル−６−メチル−５−ニト
ロ−２−ピリドン ３,４−ジエトキシカルボニル−６−メチル−２−ピリ
ドン５.０gを無水酢酸１３mlに懸濁し、−１０℃に冷却
し発煙硝酸１.７２ml(２.１eq)を３０分間で滴下、その
まま３０分間撹拌した。水４０mlを加え室温で一晩撹拌
した。生じた結晶をろ取、乾燥した。 収量：２.１９g(３７.２％).ジクロロメタン−イソプロ
ピルエーテルから再結晶し淡黄色プリズム晶を得た。 融点１３４−１３５℃.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３
６(６Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),２.７２(３Ｈ,s),４.３８(４
Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz).ＩＲ(ＫＢr)ν:３４２０,１７５
５,１６５０,１５２５,１３５０,１２７０cm-1.元素分
析:計算値(Ｃ12Ｈ14Ｎ2Ｏ7)Ｃ:４８.３３;Ｈ:４.７３;
Ｎ:９.３９.測定値Ｃ:４８.４１;Ｈ:４.７６;Ｎ:９.３
６.
【０１０６】参考例３４ ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−メチ
ル−５−ニトロピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−６−メチル−５−ニト
ロ−２−ピリドン１.０gに二塩化フェニルホスホン酸
１.３ml(３.２eq.)を加え、１７０℃、２０分間加熱し
た。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層
を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムを用いて
乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラム(溶
出溶媒:酢酸エチル)で精製し油状生成物を得た。 収量：３６０mg(３４.０％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
１.３４(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),１.４０(３Ｈ,t,Ｊ＝
７.１Ｈz),２.６８(３Ｈ,s),４.４１(４Ｈ,m).ＩＲ(Ｋ
Ｂr)ν:２９９０,１７５０,１５９０,１５５０cm-1.
【０１０７】参考例３５ ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−メチルピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−メチ
ル−５−ニトロピリジン１.２gをエタノール１５mlに溶
かし、還元鉄１.９g(９eq.)を加え、塩酸７.１mlを滴下
した。室温で３０分間撹拌した。溶媒を留去し、炭酸水
素ナトリウムで中和し、酢酸エチルで抽出した。有機層
を和食塩水で洗浄後、乾燥、溶媒を留去し、油状生成物
を得た。 収量:１.１g.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３６(３Ｈ,
t,Ｊ＝７.０Ｈz),１.４０(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),２.４
５(３Ｈ,s),４.３５(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.４０(２
Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),５.７２(２Ｈ,br.).ＩＲ(neat)ν:
３５００,３０００,１７４０,１７１０,１２５５cm-1.
【０１０８】実施例１０ ８−アミノ−７−メチルピリド[３,４−d]ピリダジン−
１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０２３) ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−メチルピリジン５７mgにヒドラジン−水和物
０.５mlを加え、窒素気流下、１００℃、３０分間加熱
した。溶媒を留去し、析出した結晶をエタノールを用い
てろ取した。結晶に水を加え、１Ｎ塩酸で中和しろ取し
た。 収量:３７mg(８５.２％).融点３００℃以上.ＮＭＲ(Ｄ
ＭＳＯ−d6)δ(ppm):２.４３(３Ｈ,s),７.１６(２Ｈ,b
r.),８.１８(１Ｈ,s)ＩＲ(ＫＢr)ν:３４３０,３３５
０,３２４０,１６５５,１５９０cm-1.元素分析:計算値
(Ｃ8Ｈ8Ｎ4Ｏ2・０.１Ｈ2Ｏ)Ｃ:４９.５４;Ｈ:４.２６;
Ｎ:２８.８８.測定値Ｃ:４９.６６;Ｈ:４.１１;Ｎ:２
９.０４.
【０１０９】参考例３６ ４−メトキシアセトフェノン ４−ヒドロキシアセトフェノン３０.０gをエタノール２
００mlに溶かし、水６０mlに溶かした水酸化ナトリウム
１１.３g(１.２８eq.)とジメチル硫酸３３.９g(１.２２
eq.)を交互に滴下した。３０分間還流後、水１０mlに溶
かした水酸化ナトリウム２.８g(０.３２eq.)を加え、３
時間還流した。溶媒を留去後、水を加え、酢酸エチルで
抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、乾燥、溶
媒を留去した。析出した結晶をヘキサンを用いてろ取し
た。 収量:２６.１g(７８.８％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
２.５７(３Ｈ,s),３.８８(３Ｈ,s),６.９４(２Ｈ,d,Ｊ
＝９.０Ｈz.),７.９５(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈｚ．）．
【０１１０】参考例３７ エチル３−（４−メトキシベンゾイル)ピルベート ナトリウム４.２g(１.１eq.)をエタノール１００mlに溶
かし、還流しながら、４−メトキシアセトフェノン２
５.０gとしゅう酸ジエチル２７ml(１.２eq.)の混合物を
滴下した。２時間還流し、析出した結晶をエタノールを
用いてろ取した。１Ｎ塩酸２００mlを加え、酢酸エチル
で抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、乾燥、
溶媒を留去した。析出した結晶をヘキサンを用いてろ取
した。 収量:３４.７g(８３.１％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
１.４２(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),３.９０(３Ｈ,s),４.４
０(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),６.９９(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈ
z),７.０４(１Ｈ,s),８.００(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈz).
【０１１１】参考例３８ ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−
メトキシフェニル)ピリジン ３−(４−メトキシベンゾイル)ピルビン酸エチル４.０g
と３−アミノ−３−エトキシ−アクリル酸エチル５.３
４g(２.１eq.)を１００℃で、減圧下、低沸点物を留去
しながら１時間加熱した。１０％塩酸２５mlを加え、析
出した結晶をエタノールを用いてろ取した。炭酸水素ナ
トリウム水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を
水、飽和食塩水で洗浄後、乾燥、溶媒を留去した。析出
した結晶をヘキサンを用いてろ取した。 収量:２.７g(４８.７％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.
３５(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),１.３９(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２
Ｈz),３.８７(３Ｈ,s),４.３３(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),
４.３８(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),６.４２(２Ｈ,br.),６.
９７(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈz),７.０２(１Ｈ,s),７.９７
(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈz).ＩＲ(ＫＢr)ν:３４７０,３３
５０,１７２５,１６９５,１６００,１５６５cm-1.
【０１１２】参考例３９ ３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−メトキシフェ
ニル)−２−ピリドン ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−
メトキシフェニル)ピリジン１００mgに１Ｎ塩酸２ml、
ジオキサン５mlを加え、氷冷下、亜硝酸ナトリウム２６
mg(１.３eq.)を水０.５mlに溶かして滴下した。室温で
一晩撹拌した。溶媒を留去し、炭酸水素ナトリウムで中
和し、酢酸エチルで抽出した。有機層を和食塩水で洗浄
後、乾燥、溶媒を留去した。析出した粗結晶をエタノー
ルから再結晶した。 収量:４７mg(４６.８％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.
３７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),１.３９(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１
Ｈz),３.８８(３Ｈ,s),４.３９(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),
４.４１(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),６.９６(１Ｈ,s),７.０
１(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈz),７.８１(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈ
z).ＩＲ(ＫＢr)ν:１７４０,１７２５,１６３０,１６０
０,１５２０,１２６５,１１６５cm-1.
【０１１３】参考例４０ ３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−メトキシフェ
ニル)−５−ニトロ−２(１Ｈ)ピリドン ３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−メトキシフェ
ニル)−２(１Ｈ)ピリドン１.２gを無水酢酸８mlに懸濁
し、−３０℃に冷却、発煙硝酸０.３６mlを滴下し、４
５分撹拌した。水を加え１時間撹拌した。あめ状生成物
をろ取、ジエチルエーテルを用いて結晶化し洗浄した。 収量:０.６２g(４５.４％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
１.３７(６Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),３.８７(３Ｈ,s),４.４
０(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.４２(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈ
z),６.９９(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈz),７.５２(２Ｈ,d,Ｊ
＝８.８Ｈz).ＩＲ(ＫＢr)ν:１７４０,１６５５,１６１
０,１２６０cm-1.
【０１１４】参考例４１ ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−
メトキシフェニル)−５−ニトロピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−メトキシフェ
ニル)−５−ニトロ−２(１Ｈ)ピリドン３００mgにオキ
シ塩化リン０.５mlを加え、ＤＭＦ２滴を加え、１００
℃、１時間加熱した。氷水を加え、炭酸水素ナトリウム
で中和後、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食
塩水で洗浄後、乾燥、溶媒を留去した。残渣をシリカゲ
ルカラム(溶出:酢酸エチル−ヘキサン１:１)で精製し
た。 収量:２７０mg(８６.０％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
１.３５(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz)１.４１(３Ｈ,t,Ｊ＝７.
２Ｈz),３.８７(３Ｈ,s),４.３９(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈ
z),４.４６(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),６.９８(２Ｈ,d,Ｊ
＝８.８Ｈz),７.５９(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈz).ＩＲ(nea
t)ν:２９７０,１７５０,１６１０,１５７５,１５４０,
１２６０cm-1.
【０１１５】参考例４２ ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−(４−メトキシフェニル)ピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−
メトキシフェニル)−５−ニトロピリジン２８０mgをエ
タノール４mlに溶かし、還元鉄３４０mg(８.９eq.)を加
え、６０℃に加熱、濃塩酸１.５mlを滴下し、還流させ
た。２０分間加熱後、溶媒を留去、炭酸水素ナトリウム
水で中和、酢酸エチルで抽出した。沈澱物をろ去後、有
機層を得、水、飽和食塩水で洗浄後乾燥、溶媒を留去し
た。 収量:２１３mg(８２.４％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
１.３７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),１.４３(３Ｈ,t,Ｊ＝
７.２Ｈz),３.８６(３Ｈ,s),４.３６(２Ｈ,q,Ｊ＝７.１
Ｈz),４.４２(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),５.９３(２Ｈ,b
r.),７.０１(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈz),７.５６(２Ｈ,d,Ｊ
＝８.８Ｈz),ＩＲ(neat)ν:３４８０,３３６０,２９８
０,１７３５,１７００,１６０５,１５１５cm-1.
【０１１６】実施例１１ ８−アミノ−５−クロロ−７−(４−メトキシフェニル)
ピリド[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン
(Ｌ−０２４) ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−(４−メトキシフェニル)ピリジン２１０mgにヒ
ドラジン−水和物３mlを加え、窒素気流下、１００℃、
３０分間加熱した。溶媒を留去し、析出した結晶をエタ
ノールを用いてろ取した。結晶に水を加え、１Ｎ塩酸で
中和しろ取した。 収量:１０４mg(５８％).融点３００℃以上.ＮＭＲ(ＤＭ
ＳＯ−d6)δ(ppm):３.８３(３Ｈ,s),７.０８(２Ｈ,d,Ｊ
＝８.８Ｈz),７.３６(２Ｈ,br.),７.６４(２Ｈ,d,Ｊ＝
８.８Ｈz).ＩＲ(ＫＢr.)ν:１６４５,１６０５,１４９
５,１２５０cm-1.元素分析:計算値(Ｃ14Ｈ11Ｎ4Ｏ3Ｃl
・０.１Ｈ2Ｏ)Ｃ:５２.４６;Ｈ:３.５２;Ｎ:１７.４８.
測定値Ｃ:５２.２３;Ｈ:３.５４;Ｎ:１７.６８.
【０１１７】参考例４３ ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−メチ
ルピリジン 参考例３５で得た３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジ
エトキシカルボニル−２−メチルピリジン１.５g、トリ
エチルアミン１ml(２eq.)、酢酸エチル５０mlを１０％
Ｐd−Ｃ(５０％ wet)１.５gを用いて、接触還元した。
ろ過により触媒を除き、溶媒を留去した。残渣をシリカ
ゲルカラム(溶出:酢酸エチル−ジクロロメタン１:１)で
精製し標題化合物１.１gを油状生成物として得た。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３５(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈ
z),１.３７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),２.４５(３Ｈ,s),
４.３４(２Ｈ,q,Ｊ＝７.１Ｈz),４.３６(２Ｈ,q,Ｊ＝
７.１Ｈz),４.９８(２Ｈ,br.),８.１６(１Ｈ,s).ＩＲ(n
eat)ν:１７２０,１６１５,１４１５,１３０５,１２７
５,１２４０cm-1.
【０１１８】実施例１２ ８−アミノ−７−メチルピリド[３,４−d]ピリダジン−
１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−２６) ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−メチ
ルピリジン５７mgにヒドラジン−水和物０.５mlを加
え、窒素気流下、１００℃、３０分間加熱した。溶媒を
留去し、析出した結晶をエタノールを用いてろ取した。
結晶に水を加え、１Ｎ塩酸で中和しろ取した。 収量:３７mg(８５.２％).mp３００℃以上.ＮＭＲ(ＤＭ
ＳＯ−d6)δ(ppm):２.４３(３Ｈ,s),７.１６(２Ｈ,b
r.),８.１８(１Ｈ,s).ＩＲ(ＫＢr)ν:３４３０,３３５
０,３２４０,１６５５,１５９０cm-1.:元素分析:計算値
(Ｃ8Ｈ8Ｎ4Ｏ2・０.１Ｈ2Ｏ)Ｃ,４９.５４;Ｈ,４.２６;
Ｎ,２８.８８.測定値Ｃ:４９.６６;Ｈ:４.１１;Ｎ:２
９.０４.
【０１１９】参考例４４ ４−メトキシエトキシメトキシアセトフェノン ４−ヒドロキシアセトフェノン１６gをジクロロメタン
１６０mlに溶かし、ジイソプロピルエチルアミン３０.
７ml(１.５eq.)を加え、ＭＥＭクロリド２０.１３ml
(１.５eq.)を滴下した。室温で４時間撹拌後、水洗し
た。有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲ
ルカラム(溶出:酢酸エチル−ヘキサン１:２)で精製し
た。 収量:２９.５g.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):２.５６(３
Ｈ,s),３.３７(３Ｈ,s),３.５５(２Ｈ,m),３.８３(２
Ｈ,m),５.３４(２Ｈ,s),７.１０(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈ
z),７.９４(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈz).
【０１２０】参考例４５ エチル３−(４−メトキシエトキシメトキシ)ベンゾイル
ピルベート ナトリウム３.２g(１.１eq.)をエタノール７５mlに溶か
し、４−メトキシエトキシメトキシアセトフェノン２
８.５gとしゅう酸ジエチル２０.７ml(１.２eq.)の混合
物を室温で３０分で滴下し、１.５時間撹拌した溶媒を
留去し、水を加え、塩酸で中和後、酢酸エチルで抽出し
た。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、乾燥、溶媒を留
去した。 収量:３８.７g(９４％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.
４２(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),３.３７(３Ｈ,s),３.５５
(２Ｈ,m),３.８３(２Ｈ,m),４.４０(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２
Ｈz),５.３６(２Ｈ,s),７.０３(１Ｈ,s),７.１５(２Ｈ,
d,Ｊ＝９.０Ｈz),７.９８(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈz).
【０１２１】参考例４６ ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−
メトキシエトキシメトキシフェニル)ピリジン エチル３−(４−メトキシエトキシメトキシ)ベンゾイル
ピルベート３８.７gとエチル３−アミノ−３−エトキシ
アクリラート３９.９g(２.１eq.)を１００℃で加熱撹拌
した。減圧下、低沸点物を留去しながら３時間加熱し
た。水を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和
食塩水で洗浄後、乾燥、溶媒を留去した。残渣をシリカ
ゲルカラム(溶出:酢酸エチル−ヘキサン１:３)で精製し
た。 収量:３２.２g(６４.５％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
１.３５(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),１.３９(３Ｈ,t,Ｊ＝
７.１Ｈz),３.３８(３Ｈ,s),３.５６(２Ｈ,m),３.８４
(２Ｈ,m),４.３３(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.３８(２
Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),５.３３(２Ｈ,s),６.４１(２Ｈ,b
r.),７.０２(１Ｈ,s),７.１２(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈz),
７.９５(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈz).
【０１２２】参考例４７ ３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−メトキシエト
キシメトキシフェニル)−２−ピリドン ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−
メトキシエトキシメトキシフェニル)ピリジン３２.３g
を１Ｎ塩酸２５０ml、ジオキサン１００mlに溶かし、氷
冷下、亜硝酸ナトリウム６.９g(１.３eq.)を水３０mlに
溶かして滴下し、１時間撹拌し、一晩冷蔵した。炭酸水
素ナトリウムで中和し、ジオキサンを留去後、酢酸エチ
ルで抽出した。有機層を和食塩水で洗浄後、乾燥、溶媒
を留去した。残渣をシリカゲルカラム(溶出:ジクロロメ
タン→酢酸エチル)で精製した。 収量:１８.１g(５６％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.
３８(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),１.３９(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２
Ｈz),３.３９(３Ｈ,s),３.５８(２Ｈ,m),３.８４(２Ｈ,
m),４.３９(２Ｈ,q,Ｊ＝７.１Ｈz),４.４１(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.２Ｈz),５.３３(２Ｈ,s),６.９６(１Ｈ,s),７.３
０(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈz),７.８０(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈ
z).ＩＲ(ＫＢr)ν:２９８０,２９３０,１７３０,１６４
０,１６０５,１５２０,１２５５,１１９０cm-1.
【０１２３】参考例４８ ３,４−ジエトキシカルボニル−２−ヒドロキシ−６−
(４−メトキシエトキシメトキシフェニル)−５−ニトロ
ピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−メトキシエト
キシメトキシフェニル)−２−ピリドン１.０gを無水酢
酸３mlに溶かし、−２０℃に冷却し、発煙硝酸０.２ml
を滴下し、１時間撹拌した。水を加え、室温で２時間撹
拌後、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、炭酸水素ナ
トリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄後、乾燥、溶媒
を留去した。析出した結晶をジエチルエーテルを用いて
ろ取した。 収量:１９８mg(１７.９％).ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(pp
m):１.２２(２Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),３.２２(３Ｈ,s),
３.４５(２Ｈ,m),３.７１(２Ｈ,m),４.２８(４Ｈ,m),
５.２６(２Ｈ,s),７.０４(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈz.),７.
２５(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈz.).ＩＲ(ＫＢr)ν:１７７０,
１７２０,１５７０,１２３０cm-1.
【０１２４】参考例４９ ３,４−ジエトキシカルボニル−２−ヒドロキシ−６−
(４−ヒドロキシフェニル)−５−ニトロピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−２−ヒドロキシ−６−
(４−メトキシエトキシメトキシフェニル)−５−ニトロ
ピリジン(粗精製物)２.２gをジクロロメタン３０mlに溶
かし、氷冷下、四塩化チタン２.６mlを滴下、室温で１.
５時間撹拌した。水を加えた後、溶媒を留去し、酢酸エ
チルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後乾
燥、溶媒を留去した。ジエチルエーテルを用いて結晶化
しろ取した。 収量:３３０mg.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３８(６
Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),４.４１(４Ｈ,m),６.９０(２Ｈ,d,
Ｊ＝８.８２Ｈz),７.４５(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈz).ＩＲ
(ＫＢr)ν:１７３０,１６５０,１６０５,１２８０cm-1.
【０１２５】参考例５０ ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−
ヒドロキシフェニル)−５−ニトロピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−２−ヒドロキシ−６−
(４−ヒドロキシフェニル)−５−ニトロピリジン１３０
mgをオキシ塩化リン２.５mlに懸濁し、ＤＭＦ０.４mlを
加え、１００℃、３０分間加熱した。ＤＭＦ０.４mlを
追加し、さらに３０分間加熱した。溶媒を留去し氷水を
加え、炭酸水素ナトリウムで中和後、酢酸エチルで抽出
した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、乾燥、溶媒を
留去した。残渣をシリカゲルカラム(溶出:酢酸エチル)
で精製した。 収量:１１７mg(８５％,約２０％０−ホルミル体混入).
ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３４(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈ
z),１.４１(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),４.３８(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.２Ｈz),４.４５(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),６.９２
(２Ｈ,d,Ｊ＝８.６Ｈz),７.５２(２Ｈ,d,Ｊ＝８.６Ｈ
z).
【０１２６】参考例５１ ３−アミノ−６−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニ
ル−６−(４−ヒドロキシフェニル)ピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−(４−
ヒドロキシフェニル)−５−ニトロピリジン８００mgを
エタノール５０mlに溶かし、還元鉄１.０g(８.８eq.)を
加え、６０℃に加温、濃塩酸４mlを滴下し、還流させ
た。１.５時間後、還元鉄２５０mgと濃塩酸０.４mlを加
え、３時間還流した。溶媒を留去、炭酸水素ナトリウム
水で中和、酢酸エチルで抽出した。沈澱物をろ去後、有
機層を得、水、飽和食塩水で洗浄後乾燥、溶媒を留去し
た。 収量:５３０mg(７１.７％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
１.３７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),１.４３(３Ｈ,t,Ｊ＝
７.２Ｈz),４.３７(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.４３(２
Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),５.９２(２Ｈ,br.),６.９２(２Ｈ,
d,Ｊ＝８.４Ｈz),７.４８(２Ｈ,d,Ｊ＝８.４Ｈz).ＩＲ
(neat)ν:１７３５,１７００,１６０５,１５９０cm-1.
【０１２７】実施例１３ ８−アミノ−５−クロロ−７−(４−ヒドロキシフェニ
ル)ピリド[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジ
オン(Ｌ−０２７) ３−アミノ−６−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニ
ル−６−(４−ヒドロキシフェニル)ピリジン２００mgに
ヒドラジン−水和物２mlを加え、窒素気流下、１００
℃、１時間加熱した。溶媒を留去し、析出した結晶をエ
タノールを用いてろ取した。結晶に水を加え、１Ｎ塩酸
で中和しろ取した。メタノールに溶かしオクタデシルシ
リル化シリカゲルＯＤＳカラムで精製後、水を用いてろ
取した。 収量:１２８mg(８６.７％).融点３００℃以上.ＮＭＲ
(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):６.９０(２Ｈ,d,Ｊ＝８.６Ｈ
z),７.５３(２Ｈ,d,Ｊ＝８.６Ｈz),９.８４(１Ｈ,s).Ｉ
Ｒ(ＫＢr)ν:１６５０,１６１０cm-1.元素分析:計算値
(Ｃ13Ｈ9Ｎ4Ｏ3Ｃl・０.９Ｈ2Ｏ)Ｃ:４８.６６;Ｈ:３.
３９;Ｎ:１７.４６.測定値Ｃ:４８.８９;Ｈ:３.５５;
Ｎ:１７.２３.
【０１２８】参考例５２ ２−ブロモ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン 参考例１７で得た３,４−ジエトキシカルボニル−５−
ニトロ−６−フェニル−２(１Ｈ)ピリドン０.５gにホス
ホリルブロマイド７gを加え、１００℃に加熱、ＤＭＦ
０.５mlを滴下し１５分間加熱した。氷水を加え、炭酸
水素ナトリウムで中和後、酢酸エチルで抽出した。有機
層を水、飽和食塩水で洗浄後、乾燥、溶媒を留去した。 収量:０.５４g(９２％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.
３４(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),１.４３(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２
Ｈz),４.３９(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.４７(２Ｈ,q,
Ｊ＝７.２Ｈz),７.５２(５Ｈ,m).ＩＲ(neat)ν:１７４
０,１５７０,１５４０,１２５５,１２２０cm-1.
【０１２９】参考例５３ ３−アミノ−６−ブロモ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−フェニルピリジン ２−ブロモ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン５５０mgをエタノール２５ml
に溶かし、還元鉄０.３６g(５eq.)を加え、６０℃に加
温、酢酸１.５ml(１６eq.)を滴下し、１時間還流した。
溶媒を留去、炭酸水素ナトリウム水で中和、酢酸エチル
で抽出した。沈澱物をろ去後、有機層を得、水、飽和食
塩水で洗浄後乾燥、溶媒を留去した。シリカゲルカラム
(溶出:酢酸エチル)で精製した。 収量:３９０mg(７６％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.
３７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),１.４４(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２
Ｈz),４.３６(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.４３(２Ｈ,q,
Ｊ＝７.２Ｈz),５.９４(２Ｈ,br.),７.５１(５Ｈ,m).Ｉ
Ｒ(ＫＢr)ν:１７３０,１７００,１５９０,１４０５,１
３００,１２３５cm-1.
【０１３０】実施例１４ ８−アミノ−５−ブロモ−７−フェニルピリド[３,４−
d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０３５) ３−アミノ−６−ブロモ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−フェニルピリジン９０mgをエタノール１ml、ヒ
ドラジン−水和物２mlに溶かし、室温で２時間撹拌し
た。溶媒を留去し、析出した結晶をエタノールを用いて
ろ取した。結晶に水を加え、１Ｎ塩酸で中和しろ取し
た。メタノールに溶かしシリカゲルにまぶし、シリカゲ
ルカラム(溶出:酢酸エチル→酢酸エチル−メタノール
１:１)で精製後、水を用いてろ取した。 収量:２１mg(２７％).融点２８６−２８８℃(dec.).Ｎ
ＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):７.５３(３Ｈ,m),７.６７
(２Ｈ,m).ＩＲ(ＫＢr)ν:１６４５,１５８５cm-1.
【０１３１】参考例５４ ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−(４−ヒドロキシフェニル)ピリジン−０−リン
酸ナトリウム塩 参考例５１で得た３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジ
エトキシカルボニル−２−(４−ヒドロキシフェニル)ピ
リジン１００mgをトルエン４mlに懸濁し、ピリジン０.
１g(５eq.)を加え溶解し、氷冷下、オキシ塩化リン２g
(１５eq.)を滴下した。室温で３時間撹拌した。溶媒を
留去し、炭酸水素ナトリウム水、酢酸エチル混合溶媒中
で一晩撹拌した。水層Ａmberlite(登録商標)をＸＡＤ−
２カラム、Ｓephadex(登録商標)ＬＨ−２０カラム(溶出
溶媒:水)で精製した。メタノール，ジエチルエーテルを
用いて結晶化した。 収量：８２mg(６４％).Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)δ(ppm):１.
３２(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),１.３７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１
Ｈz),４.３５(２Ｈ,q,Ｊ＝７.１Ｈz),４.４２(２Ｈ,q,
Ｊ＝７.１Ｈz),７.４０(２Ｈ,d,Ｊ＝８.４Ｈz),７.５１
(２Ｈ,d,Ｊ＝８.４Ｈz).13Ｃ−ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)δ(ppm):
１６.００(２Ｃ),６６.１７,６６.５６,１１９.３,１２
３.７１(２Ｃ,Ｊccop＝４.３Ｈz,δ７.４０の1Ｈと相
関),１２９.９４,１３１.６２,１３２.４３(２Ｃ),１３
４.８０,１４４.８２,１５２.９４,１５８.１３(Ｊcop
＝５.５Ｈz),１６８.３３,１７０.８１ ＩＲ(Ｋbr.)ν:１７４０,１６００,１４２０,１３１０,
１２４０,１１２０,９９０cm-1.
【０１３２】実施例１５ ８−アミノ−５−クロロ−７−(４−ヒドロキシフェニ
ル)ピリド[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジ
オンＯ−リン酸ナトリウム塩(Ｌ−０３６) ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−(４−ヒドロキシフェニル)ピリジンＯ−リン酸
ナトリウム塩１２５mgにヒドラジン−水和物２mlに溶か
し室温で４５分間撹拌した。溶媒を留去し、炭酸水素ナ
トリウム２２.５mg(１.０eq.)を加え、Ｓephadex(登録
商標)ＬＨ−２０(溶出溶媒:水)カラムで精製した。エタ
ノールを用いてろ取した。 収量:１１mg(１０％).ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)δ(ppm):７.３７
(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈz),７.５６(２Ｈ,d,Ｊ＝８.８Ｈ
z).ＩＲ(ＫＢr)ν:１６４０,１５８０,１５００cm-1.元
素分析:計算値(Ｃ13Ｈ9Ｎ4Ｏ6ＣlＮaＰ・２Ｈ2Ｏ)Ｃ:３
５.２７;Ｈ:２.９６;Ｎ:１２.６６;Ｐ:７.００.測定値
Ｃ:３５.１９;Ｈ:２.９３;Ｎ:１２.８６;Ｐ:６.６９.
【０１３３】参考例５５ ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン 参考例１８で得た２−クロロ−３,４−ジエトキシカル
ボニル−５−ニトロ−６−フェニルピリジン４７０mgを
エタノール１５mlに溶かし、８.７％アンモニア・エタ
ノール溶液計６mlを加え、室温で４日間撹拌した。溶媒
を留去し、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を
水、飽和食塩水で洗浄後乾燥、溶媒を留去した。析出し
た結晶をヘキサンを用いてろ取した。 収量:４０５mg(９１％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.
３７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),１.３９(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２
Ｈz),４.３８(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.４０(２Ｈ,q,
Ｊ＝７.２Ｈz),７.４８(５Ｈ,m).
【０１３４】参考例５６ ３,４−ジエトキシカルボニル−２−フルオロ−５−ニ
トロ−６−フェニルピリジン ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン１００mgを酢酸２mlに溶か
し、４２％ほうフッ化水素酸１.５mlを加えた。−５℃
に冷却し、水０.５mlに溶かした亜硝酸ナトリウム２１m
g(１.１eq)を滴下した。３０分後、室温に戻し、炭酸水
素ナトリウム水で中和後、酢酸エチルで抽出した。有機
層を水、飽和食塩水で洗浄後、乾燥、溶媒を留去した。
析出した結晶(２−ピリドン体)をヘキサンを用いてろ
取、洗浄し、ろ液を得た。ろ液の溶媒を留去し、油状物
質を得た。 収量:５２mg(５２％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３
７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz),１.４１(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈ
z),４.４３(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.４５(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.０Ｈz),７.５１(５Ｈ,m).
【０１３５】参考例５７ ３−アミノ−６−フルオロ−４,５−ジエトキシカルボ
ニル−２−フェニルピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−２−フルオロ−５−ニ
トロ−６−フェニルピリジン１６０mgをエタノール５ml
に溶かし、還元鉄１２０mg(５eq.)を加え、酢酸０.５ml
(２０eq.)を加え、３０分間還流した。溶媒を留去、炭
酸水素ナトリウム水で中和、酢酸エチルで抽出した。沈
澱物をろ去後、有機層を得、水、飽和食塩水で洗浄後乾
燥、溶媒を留去した。 収量:１４２mg(９６％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.
３８(３Ｈ,t,Ｊ＝６.８Ｈz),１.４１(３Ｈ,t,Ｊ＝６.６
Ｈz),４.３８(２Ｈ,q,Ｊ＝６.８Ｈz),４.４２(２Ｈ,q,
Ｊ＝６.６Ｈz),５.５４(２Ｈ,br.),７.５０(３Ｈ,m),
７.６４(２Ｈ,m).
【０１３６】実施例１６ ８−アミノ−５−フルオロ−７−フェニルピリド[３,４
−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０３７) ３−アミノ−６−フルオロ−４,５−ジエトキシカルボ
ニル−２−フェニルピリジン９０mgをエタノール１mlに
溶かし、ヒドラジン−水和物２mlを加え、室温で４時間
撹拌した。溶媒を留去し、析出した結晶をエタノールを
用いてろ取した。結晶に水を加え、１Ｎ塩酸で中和しろ
取した。メタノールに溶かしシリカゲルにまぶし、シリ
カゲルカラム(溶出:酢酸エチル→酢酸エチル−メタノー
ル１:１)で精製後、水を用いてろ取した。 収量:３３mg(４８％).ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):
７.１０(２Ｈ,br.),７.５３(３Ｈ,m),７.７２(２Ｈ,m).
ＩＲ(ＫＢr)ν:１６６０,１５０５,１３４５,１３２５c
m-1.
【０１３７】参考例５８ ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−(３−
ニトロフェニル)−２−ピリドン 参考例１７で得た３,４−ジエトキシカルボニル−５−
ニトロ−６−フェニル−２−ピリドン０.７２gを濃硫酸
４.５mlに溶かし、氷冷撹拌下、発煙硝酸０.０６mlを添
加した。添加後室温で４５分撹拌した後、氷水(約１０
０ml)に注ぎ、析出沈澱物を濾取、水洗、乾燥して３,４
−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−(３−ニト
ロフェニル)−２−ピリドンの０.７４gを淡黄色粉末と
して得た。 mp １８８−１９０℃.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.４
１(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz),１.４２(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈ
z),４.４４(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),４.５０(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.０Ｈz),７.６３(１Ｈ,t,Ｊ＝８.０Ｈz),７.８５
(１Ｈ,dt,Ｊ＝１.５,8.０Ｈz),８.３９(１Ｈ,m),８.５
０(１Ｈ,t,Ｊ＝１.５Ｈz).ＩＲ(ＫＢr)ν:１７５５,１
６６０,１５３５,１３５０,１２９０,１２７５,１２１
０,１１０５,１０３５,８５０,６８５cm-1.元素分析:計
算値(Ｃ17Ｈ15Ｎ3Ｏ9)Ｃ:５０.３８;Ｈ:３.７３;Ｎ:１
０.３７.測定値Ｃ:５０.１４;Ｈ:３.７４;Ｎ:１０.４
３.
【０１３８】参考例５９ ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−(３−ニトロフェニル)ピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−(３−
ニトロフェニル)−２−ピリドン０.７０gをオキシ塩化
リン２mlに懸濁し、氷冷下にＤＭＦ０.３mlを加えた
後、１００℃で１時間かき混ぜた。反応液を氷水(１０
０ml)にあけ、３０分間かき混ぜたのち酢酸エチルで抽
出、抽出液を重曹水、次いで食塩水で洗浄し乾燥(ＭgＳ
Ｏ4)した。溶媒を濃縮乾固後、残留物をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー(展開溶媒:n−ヘキサン／酢酸エ
チル４:１)に付し、固形化する無色の残留物をエタノー
ルから再結晶すると２−クロロ−３,４−ジエトキシカ
ルボニル−５−ニトロ−６−(３−ニトロ−フェニル)ピ
リジンの０.５１gが無色プリズム晶として得られた。 mp ９０−９１℃.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３６
(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz),１.４４(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈ
z),４.４２(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),４.４９(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.０Ｈz),７.７１(１Ｈ,t,Ｊ＝８.０Ｈz),７.８９
(１Ｈ,dt,Ｊ＝１.５,８.０Ｈz),８.４０(１Ｈ,m),８.５
３(１Ｈ,t,Ｊ＝１.５Ｈz).ＩＲ(ＫＢr)ν:１７５０,１
７４０,１５５０,１５３５,１３５０,１２６０,１２３
５,１０２０,７００cm-1.
【０１３９】参考例６０ ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−(３−アミノフェニル)ピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−(３−ニトロフェニル)ピリジン０.３７gおよび
還元鉄０.４５gをエタノール８mlに懸濁し６０℃に加温
した。これに濃塩酸１.９mlを加え、還流下に３０分間
加熱した。反応液を濃縮後、酢酸エチルで抽出し、重曹
水、食塩水の順に洗浄し乾燥(ＭgＳＯ4)した。減圧下に
濃縮後、残留部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
(展開溶媒:クロロホルム／メタノール４０:１)に付し３
−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニル
−２−(３−アミノフェニル)ピリジンの０.２９gを黄橙
色粘稠油状物として得た。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３６(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈ
z),１.４２(３Ｈt,Ｊ＝７.０Ｈz),３.８１(２Ｈ,br.s),
４.３６(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),４.４３(２Ｈ,q,Ｊ＝
７.０Ｈz),５.９８(２Ｈ,br.s),６.７２(１Ｈ,ddd,Ｊ＝
１.５,２.０,７.５Ｈz),６.８３(１Ｈ,dd,Ｊ＝１.５,
２.０Ｈz),６.９４(１Ｈ,dd,Ｊ＝１.５,７.５Ｈz),７.
２４(１Ｈ,t,Ｊ＝７.５Ｈz).
【０１４０】実施例１７ ８−アミノ−５−クロロ−７−(３−アミノフェニル)ピ
リド[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン
(Ｌ−０３８) ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−(３−アミノフェニル)ピリジン０.３５gにヒド
ラジン一水和物７.５mlを加え、９０℃で３０分間かき
混ぜた。反応液を氷水(約１００ml)にあけ、酢酸を加え
てpＨ６に調製し、析出する沈澱物を濾取水洗した。こ
れをＤＭＳＯ−Ｈ2Ｏから再沈澱して８−アミノ−５−
クロロ−７−(３−アミノフェニル)ピリド[３,４−d]ピ
リダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)−ジオンの０.２３gを橙色
粉末として得た。 mp ２９８℃(dec.).ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):５.
３２(２Ｈ,br.s),６.６５(１Ｈ,dd,Ｊ＝１.５,７.５Ｈ
z),６.８０(１Ｈ,d,Ｊ＝７.５Ｈz),６.８５(１Ｈ,s),
７.１７(１Ｈ,t,Ｊ＝７.５Ｈz),７.２９(２Ｈ,br.s),１
０.２０−１１.６０(２Ｈ,br.).ＩＲ(ＫＢr)ν:１６５
０,１５８５,１４１０,１３２５,１１２５,１０７５,８
７０,８１０cm-1.元素分析:計算値(Ｃ13Ｈ10Ｎ5Ｏ2Ｃl)
Ｃ:５１.４１;Ｈ:３.３２;Ｎ:２３.０６.測定値 Ｃ:５
１.０６;Ｈ:３.４７;Ｎ:２３.１７.
【０１４１】参考例６１ ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−ピリドン ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−フェ
ニルピリジン ヒドロクロリド(参考例１５)２１gを酢酸
１５０mlに溶解し、室温下でかき混ぜながら発煙硝酸(d
＝１.５８)１８mlを滴下した。ついで１００℃で２時間
かき混ぜた。反応液を室温まで冷却し、３００mlの水を
加えたのち３０分間氷冷した。析出結晶を濾取水洗後乾
燥すると１５gの３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニ
トロ−６−フェニル−２−ピリドンが得られた。本化合
物の物理定数は別途合成法(参考例１７)で得られたもの
と一致した。
【０１４２】参考例６２ ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−ピリドン２.５gをオキシ塩化リン６.５mlに
溶解し、ＤＭＦ１mlを加え１００℃で３０分間加熱し
た。反応液を減圧下に濃縮後、残留部に炭素水素ナトリ
ウム水を加えて中和し酢酸エチルで抽出した。有機層を
水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し
た。溶媒を留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー(展開溶媒:酢酸エチル／n−ヘキサン１:２)に
付し、２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５
−ニトロ−フェニルピリジンの１.９gを黄色針状晶とし
て得た。 mp ６５−６６℃.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３５
(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),１.４２(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈ
z),４.４４(４Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),７.５２(５Ｈ,m). ＩＲ(ＫＢr)ν:２９９０,１７５０,１５８０,１５５０c
m-1.
【０１４３】参考例６３ ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−６−(イミ
ダゾール−１−イル)−２−フェニルピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン０.３７９g、イミダゾール
０.２１g、クロロホルム１５mlの混合物を８時間加熱還
流した。反応液を濃縮後、酢酸エチルで抽出し有機層を
水、飽和食塩水で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥した。溶
媒を留去したのち残留部に酢酸５mlおよび還元鉄０.５g
を加えて、室温で４時間かき混ぜた。反応液に炭酸水素
ナトリウム水を加えて中和後、酢酸エチルで抽出した。
容器装置を水、飽和食塩水で洗浄し硫酸ナトリウムで乾
燥後、少量のシリカゲルを用いて濾過した。濾液を減圧
下に濃縮すると３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボ
ニル−６−(イミダゾール−１−イル)−２−フェニルピ
リジンの０.３４２gが黄色油状物として得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.１８(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈ
z),１.３７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),４.２０(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.２Ｈz),４.３９(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),６.０２
(２Ｈ,br.s),７.１２(１Ｈ,s),７.２４(１Ｈ,s),７.４
０−７.７５(５Ｈ,m),７.８０(１Ｈ,s).
【０１４４】実施例１８ ８−アミノ−５−(イミダゾール−１−イル)−７−フェ
ニルピリド[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジ
オン(Ｌ−０３９) ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−６−(イミ
ダゾール−１−イル)−２−フェニルピリジン０.３４２
gをエタノール１０mlに溶解し、ヒドラジン一水和物０.
５mlを加え７時間加熱還流した。反応液を濃縮後、残留
部を酢酸酸性とし、析出沈澱物を濾取、水洗した。これ
をＤＭＦ−Ｈ2Ｏから再沈澱すると８−アミノ−５−(イ
ミダゾール−１−イル)−７−フェニルピリド[３,４−
d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)−ジオンの０.２gが黄
色粉末として得られた。 mp ３２０℃(dec.).ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):６.
９３(１Ｈ＜s),７.３８(１Ｈ,s),７.４０−７.８０(５
Ｈ,m),７.８１(１Ｈ,s),１１.２０(１Ｈ,br.s),１１.９
５(１Ｈ,br.s).ＩＲ(ＫＢr)ν:１６４５,１５８０,１５
４０,１０９０cm-1.元素分析:計算値(Ｃ16Ｈ12Ｎ6Ｏ2・
０.２Ｈ2Ｏ)Ｃ:５９.３３;Ｈ:３.８６;Ｎ:２５.９５.測
定値Ｃ:５９.２８;Ｈ:３.８４;Ｎ:２５.９２.
【０１４５】参考例６４ ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−(１,２,４−トリアゾール−１−イル)ピリジ
ン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン０.３７９g,１Ｈ−１,２,４
−トリアゾール０.２g,ピリジン０.２ml,１,２−ジクロ
ルエタン１５mlの混合物を８０℃で１８時間反応させ
た。反応液を濃縮後、酢酸エチルで抽出し、水、飽和食
塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去
後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開
溶媒:ジクロロメタン／酢酸エチル４:１)に付し３,４−
ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェニル−２
−(１,２,４−トリアゾール−１−イル)ピリジンの０.
１９gを黄色結晶として得た。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３３(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈ
z),１.３７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),４.４２(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.２Ｈz),４.４４(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),７.４４−
７.７０(５Ｈ,m),８.１２(１Ｈ,s),９.１２(１Ｈ,s).
【０１４６】参考例６５ ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニル−６−(１,２,４−トリアゾール−１−イル)ピリジ
ン ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−(１,２,４−トリアゾール−１−イル)ピリジ
ン０.３５gを酢酸エチル２５mlに溶解し、１０％Ｐd−
Ｃ(５０％ wet)０.２gを加えた。この混合物を水素気流
下室温で２.５時間撹拌した。触媒を濾去後、濾液を濃
縮、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付
し、クロロホルム／酢酸エチル(４:１)で展開すると、
３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニル−６−(１,２,４−トリアゾール−１−イル)ピリジ
ンの０.２１５gが得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.２８(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈ
z),１.３８(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),４.３３(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.２Ｈz),４.４０(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),５.８９
(２Ｈ,br.s),７.４０−７.７０(５Ｈ,m),８.０１(１Ｈ,
s),８.７７(１Ｈ,s).
【０１４７】実施例１９ ８−アミノ−７−フェニル−５−(１,２,４−トリアゾ
ール−１−イル)ピリド[３,４−d]ピリダジン−１,４
(２Ｈ,３Ｈ)−ジオン(Ｌ−０４０) ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニル−６−(１,２,４−トリアゾール−１−イル)ピリジ
ン０.２１５gをエタノール１５mlに溶解、ヒドラジン一
水和物１mlを加え７時間加熱還流した。冷後、析出する
黄色結晶を濾取、エタノールで洗浄した。この結晶を２
０mlの水に懸濁、酢酸１mlを加えて酸性としたのち、結
晶を濾取水洗、乾燥すると８−アミノ−７−フェニル−
５−(１,２,４−トリアゾール−１−イル)ピリド[３,４
−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオンの０.１１gが
黄色結晶として得られた。 mp ２９０−２９２℃(dec.).ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ
(ppm):７.４０−８.１０(７Ｈ,m),８.０８(１Ｈ,s),８.
７４(１Ｈ,s),１０.８０−１２.２０(２Ｈ,br.).ＩＲ
(ＫＢr)ν:１６５０,１６６０,１５９０,１５１０,１３
１０,１２９０,１１３０cm-1.元素分析:計算値(Ｃ15Ｈ
11Ｎ7Ｏ2)Ｃ:５５.５２;Ｈ:３.５４;Ｎ:３１.０８.測定
値Ｃ:５５.４８;Ｈ:３.４５;Ｎ:３１.２８.
【０１４８】参考例６６ ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−(テトラゾール−１−イル)ピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン１.５２g,１Ｈ−テトラゾー
ル０.８４g,ジイソプロピルエチルアミン０.８４mlおよ
び１,２−ジクロルエタン５０mlの混合物を９０℃で２
４時間反応させた。反応液に希塩酸を加えpＨ２とした
のち、有機層を水、飽和食塩水の順に洗浄し硫酸ナトリ
ウムで乾燥した。濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーに付し、クロロホルムで溶出すると３,
４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェニル
−２−(テトラゾール−１−イル)ピリジンの０.３６gが
黄色結晶としてえられた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３１(３Ｈ,t,Ｊ＝７.４Ｈ
z),１.３８(３Ｈ,t,Ｊ＝７.４Ｈz),４.４３(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.４Ｈz),４.４７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.４Ｈz),７.４５−
７,８５(５Ｈ,m),９.４３(１Ｈ，ｓ）．
【０１４９】参考例６７ ３−アミノ−４，５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニル−６−(テトラゾール−１−イル)ピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−(テトラゾール−１−イル)ピリジン０.３６
g,１０％Ｐd−Ｃ(５０％ wet)０.３g,酢酸エチル３０ml
の混合物を、水素気流中室温で２時間かき混ぜた。触媒
を濾去後濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィーに付し、クロロホルムで溶出すると３−アミノ−
４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェニル−６−(テ
トラゾール−１−イル)ピリジンの０.１７２gが得られ
た。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.２７(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈ
z),１.３９(３Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈz),４.３３(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.１Ｈz),４.４１(２Ｈ,q,Ｊ＝７.１Ｈz),６.１２
(２Ｈ,br.s),７.５０−７.７０(５Ｈ,m),９.１４(１Ｈ,
s).
【０１５０】実施例２０ ８−アミノ−７−フェニル−５−(テトラゾール−１−
イル)ピリド[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)
ジオン(Ｌ−０４１) ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニル−６−(テトラゾール−１−イル)ピリジン０.７１
２gをエタノール２mlに溶解し、ヒドラジン−水和物１m
lを加え９０℃で２時間反応させた。エタノール１５ml
を加えて冷却、沈澱物を濾取しエタノールで洗浄した。
これを２０mlの温水に溶解し酢酸０.７mlを加えて冷
却、析出沈澱物を濾取、水洗、乾燥すると８−アミノ−
７−フェニル−５−(テトラゾール−１−イル)ピリド
[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオンの０.
１１gが黄色結晶として得られた。 mp １９０℃(dec.).ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):７.
４０−７.８０(５Ｈ,m),７.３０−８.３０(２Ｈ,br.),
９.７１(１Ｈ,s),１０.８０−１２.４０(２Ｈ,br.).Ｉ
Ｒ(ＫＢr)ν:１６５０,１５９０,１５６０,１５１０,１
３００,１０９０cm-1.元素分析:計算値(Ｃ14Ｈ10Ｎ8Ｏ2
・０.８Ｈ2Ｏ)Ｃ:４９.９４;Ｈ:３.４７;Ｎ:３３.２８.
測定値 Ｃ:５０.０７;Ｈ:３.２３;Ｎ:３３.２７．
【０１５１】参考例６８ ３，４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−(p−トリルスルホニル)ピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン０.３７９g、p−トルエンス
ルフィン酸ナトリウム・４水和物０.５gおよびエタノー
ル１５mlの混合物を３時間加熱還流した。濃縮後、酢酸
エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで
乾燥した。溶媒を留去したのちシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーに付し、n−ヘキサン／酢酸エチル(４:１)
で展開した。溶出液を濃縮後えられる結晶を同溶媒から
再結晶すると３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニル−２−(p−トリルスルホニル)ピリジ
ンの０.２８９gが無色針状晶として得られた。 mp １１５−１１７℃.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３
４(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),１.４８(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈ
z),２.４６(３Ｈ,s),４.４０(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),
４.５６(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),７.３０−７.６０(５
Ｈ,m),７.３４(２Ｈ,d,Ｊ＝８.２Ｈz),７.９８(２Ｈ,d,
Ｊ＝８.２Ｈz).ＩＲ(ＫＢr)ν:１７４０,１７３０,１５
８０,１５５０,１３３０,１３００,１２７０,１２３０,
１１６０,１１００,１０１０cm-1.元素分析:計算値(Ｃ
24Ｈ22Ｎ2Ｏ8Ｓ)Ｃ:５７.８３;Ｈ:４.４５;Ｎ:５.６２.
測定値Ｃ:５７.７７;Ｈ:４.３１;Ｎ:５.４２.
【０１５２】参考例６９ ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニル−６−(p−トリルスルホニル)ピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−(p−トリルスルホニル)ピリジン０.３５gを
エタノール１０mlに懸濁し、酢酸２ml、還元鉄０.１５g
を加え８０℃で４.５時間かき混ぜた。エタノールを留
去したのち、炭酸水素ナトリウム水で中和し酢酸エチル
で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し硫酸ナトリウ
ムで乾燥後、減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルのフ
ラッシュクロマトグラフィーに付し、クロロホルム／酢
酸エチル(４:１)で展開すると、３−アミノ−４,５−ジ
エトキシカルボニル−２−フェニル−６−(p−トリルス
ルホニル)ピリジンの０.１４４gが得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３９(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈ
z),１.４８(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz),２.４０(３Ｈ,s),
４.３７(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz),４.５３(２Ｈ,q,Ｊ＝
７.２Ｈz),６.５０(２Ｈ,s),７.２６(２Ｈ,d,Ｊ＝８.２
Ｈz),７.４９(５Ｈ,m),７.９４(２Ｈ,q,Ｊ＝８.２Ｈz).
【０１５３】実施例２１ ８−アミノ−７−フェニル−５−(p−トリルスルホニ
ル)ピリド[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジ
オン(Ｌ−０４２) ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニル−６−(p−トリルスルホニル)ピリジン０.２５１g
にヒドラジン−水和物２mlおよびエタノール２mlを加え
９０℃で２時間かき混ぜた。エタノールを加えて冷却
後、析出沈澱物を濾取しエタノールで洗浄した。これを
３０mlの水に懸濁し、酢酸２mlを加えて加温後、冷却し
て沈澱物を濾取、水洗、乾燥すると８−アミノ−７−フ
ェニル−５−(p−トリルスルホニル)ピリド[３,４−d]
ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオンの０.１５gが得ら
れた。 mp ３１０−３１４℃(dec.)ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(p
pm):２.４７(３Ｈ,s),７.１０−７.５０(５Ｈ,m),７.４
２(２Ｈ,d,Ｊ＝８.４Ｈz),７.７０(２Ｈ,d,Ｊ＝８.４Ｈ
z),１２.００(２Ｈ,br.).ＩＲ(ＫＢr)ν:１６５０,１５
８０,１３１５,１１４０cm-1.元素分析:計算値(Ｃ20Ｈ
16Ｎ4Ｏ4Ｓ)Ｃ:５８.８１;Ｈ:３.９５;Ｎ:１３.７２.測
定値Ｃ:５８.６７;Ｈ:４.０８;Ｎ:１３.６２
【０１５４】参考例７０ ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−(４−ニトロフェニル)ピリジン ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−６−フェ
ニルピリジン(参考例１５で得られる塩酸塩を中和した
もの)２.０gを濃硫酸１２mlに溶解し、氷冷撹拌下に発
煙硝酸０.５８mlを加えた。室温で１時間かき混ぜた
後、氷水(３００ｍｌ）にあけ析出する沈澱を濾取水洗
した。濾過残渣を酢酸エチルに溶解し、重曹水、食塩水
の順に洗浄し乾燥（ＭgＳo4)した。減圧下に濃縮後、残
留部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:
n−ヘキサン／酢酸エチル３:１)に付し２−アミノ−３,
４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−(４−ニ
トロフェニル)ピリジンの０.９５gを黄色結晶として得
た。 mp １４８−１５０℃.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３
８(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz),１.３９(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈ
z),４.４０(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),４.４１(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.０Ｈz),７.６２(１Ｈ,s,),６.５０−７.５０(２
Ｈ,br.),７.６５(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈz),８.２９(２Ｈ,
d,Ｊ＝９.０Ｈz).ＩＲ(ＫＢr)ν:１７５０,１７１０,１
６００,１５６５,１５２５,１４４０,１３５０,１３３
０,１３００,１２６５,１２３５,１１１０,１０２０,７
０５cm-1.元素分析:計算値(Ｃ17Ｈ16Ｎ4Ｏ8)Ｃ:５０.５
０;Ｈ:３.９９;Ｎ:１３,８６.測定値Ｃ:５０.２９;Ｈ:
３.７６;Ｎ:１３.８２.
【０１５５】参考例７１ ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−(４−ニトロフェニル)ピリジン ２−アミノ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−(４−ニトロフェニル)ピリジン３.１gを酢酸２
０mlに懸濁し、氷冷撹拌下に発煙硝酸３mlを加えたの
ち、１１０℃で３時間反応させた。反応液を氷水(３０
０ml)にあけ、析出物を濾取水洗後酢酸エチルに溶解
し、重曹水、食塩水で洗浄、乾燥(ＭgＳＯ4)した。溶媒
を減圧下に留去し３,４−ジエトキシカルボニル−５−
ニトロ−６−(４−ニトロフェニル)−２−ピリドンの
２.９４gを黄橙色粉末として得た。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３０−１.５０(６Ｈ,m),
４.３０−４.５０(４Ｈ,m),７.５０−７.６０(２Ｈ,b
r.)８.１５−８.２５(２Ｈ,br.). 上記で得た粗生成物２.９０gをオキシ塩化リン９mlに懸
濁し、ＤＭＦ１.２mlを加え１００℃で１時間かき混ぜ
た。反応物を２００mlの氷水にあけ、３０分かき混ぜた
のち酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を重曹水、食
塩水の順に洗浄し乾燥(ＭgＳＯ4)後、減圧下に濃縮し
た。残留部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展
開溶媒:n−ヘキサン／酢酸エチル６:１)に付し２−クロ
ロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−
(４−ニトロフェニル)ピリジンの０.９５gを無色粘稠油
状物として得た。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３５(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈ
z),１.４３(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz),４.４２(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.０Ｈz),４.４９(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),７.７８
(２Ｈd,Ｊ＝９.０Ｈz),８.３５(２Ｈ,d,Ｊ＝９.０Ｈz).
ＩＲ(neat)ν:２９８０,１７４０,１５８０,１５５０,
１５３０,１３５０,１３００,１２６０,１２３０,１１
３０,１０９５,１０１５,８６０,８３０,７３５,７００
cm-1.
【０１５６】参考例７２ ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−(４−アミノフェニル)ピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−(４−ニトロフェニル)ピリジン０.９１gおよび
還元鉄１.１１gをエタノール２０mlに懸濁し６０℃に加
温、濃塩酸４.７mlを加えたのち２０分間加熱還流し
た。反応液を濃縮後酢酸エチルで抽出、重曹水、食塩水
の順に洗浄し硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、残
留部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:
クロロホルム／メタノール４０:１)に付し３−アミノ−
６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−(４−
アミノフェニル)ピリジンの０.５８gを黄色プリズム晶
として得た。 mp １３７℃.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３７(３Ｈ,
t,Ｊ＝７.０Ｈz),１.４２(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz),３.８
４(２Ｈ,br.s),４.３６(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),４.４２
(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),５.９５(２Ｈ,s),６.７７(２
Ｈ,d,Ｊ＝８.５Ｈz),７.４４(２Ｈ,d,Ｊ＝８.５Ｈz).Ｉ
Ｒ(ＫＢr)ν:１７３５,１７００,１６１０,１５２０,１
４０５,１３０５,１２３５,１１８０,１１０５,１０６
５,１０２５,８３５cm-1.
【０１５７】実施例２２ ８−アミノ−５−クロロ−７−(４−アミノフェニル)ピ
リド[３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン
(Ｌ−０４３) ３−アミノ−６−クロロ−４,５−ジエトキシカルボニ
ル−２−(４−アミノフェニル)ピリジン０.３０gにヒド
ラジン一水和物６mlを加え、９０℃で３０分間加熱し
た。反応液を氷水(１５０ml)にあけ、酢酸でpＨ６に調
整し、析出沈澱物を濾取水洗した。これをＤＭＳＯ−Ｈ
2Ｏから再沈澱し８−アミノ−５−クロロ−７−(４−ア
ミノフェニル)ピリド[３,４−d]ピリジン−１,４(２Ｈ,
３Ｈ)ジオンの０.２１gを橙色粉末として得た。 mp ３００℃以上.ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):５.５
３(２Ｈ,br.s),６.６８(２Ｈ,d,Ｊ＝８.５Ｈz),７.２９
(２Ｈ,br.s),７.４４(２Ｈ,d,Ｊ＝８.５Ｈz),１１.３０
−１１.９０(２Ｈ,br.).ＩＲ(ＫＢr)ν:１６２５,１６
０５,１５８０,１４００,１２９０,１１８０,１１２０,
１０７０,８７０,８３５cm-1.元素分析:計算値(Ｃ13Ｈ
10Ｎ5Ｏ2Ｃl・１／４Ｈ2Ｏ)Ｃ:５０.６６;Ｈ:３.４３;
Ｎ:２２.７２.測定値Ｃ:５０.７０;Ｈ:３.５１;Ｎ:２
２.８５.
【０１５８】参考例７３ ３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニトロ−６−フェ
ニル−２−スルホピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン０.７０g、エタノール７mlの
溶液に、亜硫酸ナトリウム０.２８g／水７ml溶液を加
え、２０分間加熱還流した。反応液を濃縮後、１Ｎ Ｈ
Ｃlで酸性とし酢酸エチルで抽出、食塩水で洗浄、乾燥
(ＭgＳＯ4)した。減圧下に濃縮乾固し、残渣をクロロホ
ルム／エーテルから再結して、０.４７gの白色結晶を得
た。mp １８７−１９０℃.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
１.１６(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz),１.２７(３Ｈ,t,Ｊ＝
７.０Ｈz),４.２５(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),４.３２(２
Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),７.２３(３Ｈ,br.s),７.３５(２
Ｈ,br.s).
【０１５９】参考例７４ ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニル−６−スルホピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−３−ニトロ−２−フェ
ニル−６−sulfoピリジン０.３４g、還元鉄０.４１g、
エタノール７mlの混合物を６０℃に加温し、濃塩酸０.
５mlを加えたのち２０分間加熱還流した。反応液を濃縮
乾固後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
(展開溶媒:クロロホルム／メタノール５:１)に付し０.
２４gの淡黄色粉末を得た。 mp ２２０℃(dec).ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):１.
２６(６Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz),４.１６(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０
Ｈz),５.９４(２Ｈ,s),７.４５−７.６０(５Ｈ,m).ＩＲ
(ＫＢr)ν:１７２０,１６００,１４２０,１３８５,１３
２０,１２５０,１２００,１０８５,１０４５,６６５,６
０５cm-1.
【０１６０】実施例２３ ８−アミノ−５−スルホ−７−フェニルピリド[３,４−
d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０４４) ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−２−フェ
ニル−６−スルホピリジン０.１８４gにヒドラジン一水
和物９mlを加え、９０℃で３０分間反応させた。反応液
を減圧下に濃縮後、エタノールを加え析出する沈澱を濾
取、これをＳephadexＬＨ−２０カラムクロマトグラフ
ィー(展開溶媒:水)に付し、目的画分を凍結乾燥して０.
０５９gの黄色粉末を得た。 mp １７５−１８０℃(dc.).ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(p
pm):２.８０−５.２０(ca.１０Ｈ,br.),７.４０−７.６
０(３Ｈ,m),７.６５−７.７５(２Ｈ,m).ＩＲ(ＫＢr)ν:
１６５０,１５８５,１３２５,１２２５,１１７０,１０
７５,１０３０,６３５,５８０cm-1.
【０１６１】参考例７５ ３,４−ジエトキシカルボニル−２−メルカプト−５−
ニトロ−６−フェニルピリジン ２−クロロ−３,４−ジエトキシカルボニル−５−ニト
ロ−６−フェニルピリジン０.２７gをメタノール１０ml
に溶解し、水流化ナトリウムn−水和物０.１４７gを加
え室温で３０分間掻き混ぜた。反応液を濃縮乾固し、１
Ｎ ＨＣlで酸性としたのち酢酸エチルで抽出、有機層
を食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮
乾固すると０.３１gの橙色結晶が得られた。 mp １２９−１３２℃.ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３
６(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz),１.４１(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈ
z),４.３９(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),４.４４(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.０Ｈz),７.４０−７.６０(５Ｈ,m).ＩＲ(ＫＢr)
ν:１７４０,１５７０,１５２５,１３４５,１２７０,１
２３５,１２１５,１１２５,１０２０,７０５cm-1.
【０１６２】参考例７６ ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−６−メル
カプト−２−フェニルピリジン ３,４−ジエトキシカルボニル−２−メルカプト−５−
ニトロ−６−フェニルピリジン０.３０g、還元鉄０.４
１g、エタノール７mlの混合物を６０℃に加温、ついで
濃塩酸１.７mlを加えた後３０分間加熱還流した。反応
液を濃縮後、酢酸エチルで抽出し食塩水で洗浄、硫酸マ
グネシウムで乾燥した。濃縮物をシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーに付しクロロホルムで展開すると０.２
１gの黄橙色粘稠油状物が得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.３３(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈ
z),１.３４(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz),４.３１(２Ｈ,q,Ｊ
＝７.０Ｈz),４.３２(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz),５.８４
(２Ｈ,s),７.３５−７.４０(３Ｈ,m),７.４０−７.５０
(２Ｈ,m).ＩＲ(ＫＢr)ν:１７２５,１５９０,１４０５,
１３０５,１２３５,１１１０,１０７０,１０３０,７１
０cm-1.
【０１６３】実施例２４ ８−アミノ−５−メルカプト−７−フェニルピリド[３,
４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０４
５) ３−アミノ−４,５−ジエトキシカルボニル−６−メル
カプト−２−フェニルピリジン０.２１gにヒドラジン一
水和物６mlを加え、９０℃で１５分間加熱した。反応液
を氷水にあけ酢酸酸性とし、析出沈澱物を濾取して褐色
粉末５３mgを得た。濾液をＳephadex(登録商標)ＬＨ−
２０カラムクロマトグラフィーに付し、水で溶出すると
さらに褐色粉末の３４mgが得られた。両者を合わせシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホル
ム／メタノール５:１)に付し８−アミノ−５−メルカプ
ト−７−フェニルピリド[３,４−d]ピリダジン−１,４
(２Ｈ,３Ｈ)ジオンの４７mgを得た。 mp ２４５−２４８℃(dec.).ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ
(ppm):４.９０(２Ｈ,br.s),５.７７(１Ｈ,s),７.５５−
７.６０(３Ｈ,m),７.６０−７.７０(２Ｈ,m).ＩＲ(ＫＢ
r)ν:１７０５,１６２０,１５８０,１５２０,１４１５,
１２６０cm-1.元素分析:計算値(Ｃ13Ｈ10Ｎ4Ｏ2Ｓ・１
／２Ｈ2Ｏ)Ｃ:５２.８７;Ｈ:３.７５;Ｎ:１８.９７.測
定値Ｃ:５２.９６;Ｈ:３.２５;Ｎ:１８.４３.
【０１６４】参考例７７ ３,４−ジメトキシカルボニル−２−メトキシ−６−メ
チル−５−ニトロピリジン 参考例３４で得られた２−クロロ−３,４−ジエトキシ
カルボニル−６−メチル−５−ニトロピリジン０.５gを
メタノール５mlに溶かし、２８％ナトリウムメトキシド
メタノール溶液０.３７ml(１.２eq.)を加え、室温で１.
５時間撹拌した。溶媒を留去し、水を加え、酢酸エチル
で抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後乾燥、溶
媒を留去し、結晶を得た。 収量 ０.３６g(７９.７％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
２.６６(３Ｈ,s),３.９０(６Ｈ,s),４.０７(３Ｈ,s).
【０１６５】参考例７８ ３−アミノ−４,５−ジメトキシカルボニル−６−メト
キシ−２−メチルピリジン ３,４−ジメトキシカルボニル−２−メトキシ−６−メ
チル−５−ニトロピリジン３５０mgを酢酸エチル５mlに
溶かし、１０％Ｐd−Ｃ(５０％ wet)３００mgを加え、
４.５時間接触還元した。硫酸マグネシウムを用いて乾
燥後、ろ過し溶媒を留去し油状生成物を得た。 収量:２８０mg(８９.４％).ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):
２.４０(３Ｈ,s),３.８６(３Ｈ,s),３.８８(３Ｈ,s),
３.９０(３Ｈ,s),４.９３(２Ｈ,br.).
【０１６６】実施例２５ ８−アミノ−５−メトキシ−７−メチルピリド[３,４−
d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−１８) ３−アミノ−４,５−ジメトキシカルボニル−６−メト
キシ−２−メチルピリジン(１８:Ｒ＝ＣＨ3,Ｒ'＝ＣＨ3
Ｏ)２８０mgをメタノール８mlに溶かし、ヒドラジン一
水和物０.５４ml(１０eq.)を加え３時間還流した。析出
した結晶をろ取し、メタノールで洗浄した。結晶を水に
懸濁し、塩酸酸性として、ろ取し、水洗した。 収量:４６mg(１８.８％).mp ２８５−２８７℃(dec.).
ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):２.３７(３Ｈ,s),３.８
７(３Ｈ,s),６.５９(２Ｈ,br.).ＩＲ(ＫＢr)ν:３４６
０,３３４０,１６５０,１６３０cm-1.元素分析：計算値
（Ｃ9Ｈ18Ｎ4Ｏ3）Ｃ:４８.６５;Ｈ:４.５４;Ｎ:２５.
２１.測定値Ｃ:４８.７０;Ｈ:４.５３;Ｎ:２４.９５.
【０１６７】実施例２６ ８−アミノ−５−ヒドロキシ−７−フェニルピリド[３,
４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ,)ジオン(Ｌ−７) 参考例２９で得られた３−アミノ−４,５−ジエトキシ
カルボニル−６−ヒドロキシ−２−フェニルピリジン５
０mgにヒドラジン一水和物１mlを加え１００℃、１時
間、窒素気流下加熱した。氷冷下、反応液に水を加え、
塩酸で中和、pＨ５とし、生じた黄色粉末状結晶をろ取
した。 収量：３７mg(９０.５％).mp ３００℃以上.ＮＭＲ(Ｄ
ＭＳＯ−d6)δ(ppm):５.９７(２Ｈ,br.),７.５３(５Ｈ,
m).ＩＲ(ＫＢr)ν:３４８０,３３５０,２９７０−２９
００,１６７０,１６４０,１５７５,１５６５,１２５５,
８００cm-1.元素分析：計算値（Ｃ13Ｈ10Ｎ4Ｏ3・０.４
Ｈ2Ｏ）Ｃ,５６.２８;Ｈ,３.７８;Ｎ,２０.１９.測定
値:Ｃ,５６.４３;Ｈ,３.５８;Ｎ,２０.３３．
【０１６８】実施例２７ ８−アミノ−５−ジメチルアミノ−７−フェニルピリド
［３,４−d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−
１９) 参考例３１で得られた３−アミノ−４,５−ジエトキシ
カルボニル−６−ジメチルアミノ−２−フェニルピリジ
ン２５０mgに、ヒドラジン一水和物５mlを加え、１００
−１１０℃で１.５時間加熱した。溶媒を留去し、水を
加え、pＨ３とし、ろ取した。１Ｎ水酸化ナトリウムを
用いてナトリウム塩とし、ろ取した。 収量:１０６mg(４７.５％).mp ３００℃以上.ＮＭＲ
(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):２.７９(６Ｈ,s),７.０３(２
Ｈ,br.),７.４２(３Ｈ,m),７.８４(２Ｈ,d,Ｊ＝８.４Ｈ
z).ＩＲ(ＫＢr)ν:３０３０,１６５５,１５８５cm-1.元
素分析：計算値（Ｃ15Ｈ14Ｎ5Ｏ2Ｎa）Ｃ,５６.４３;
Ｈ,４.４２;Ｎ,２１.９３.測定値Ｃ,５６.２５;Ｈ,４.
４９;Ｎ,２１.７２.
【０１６９】実施例２８ ８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド[３,４−
d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン ナトリウム塩
(Ｌ−０１２ ナトリウム塩) ８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド[３,４−
d]ピリダジン−１,４(２Ｈ,３Ｈ)ジオン(Ｌ−０１２)の
１.５０gを、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液の５０mlにか
きまぜながら加えた。一旦溶解したのち折出する淡黄色
結晶を瀘取し、少量の１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、つ
いでエタノールで洗浄、乾燥すると１.４８gの目的化合
物が得られた。 mp >300℃ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):７.３５〜７.５５(３Ｈ,
ｍ),７.６５〜７.７０(２Ｈ,ｍ),７.４０〜８.２０(２
Ｈ,br.),１０.５(１Ｈ,br.s). ＩＲ(ＫＢr)υ:１６５０,１５５０,１４５５,８７０ｃ
ｍ-1. 元素分析:計算値(Ｃ13Ｈ8Ｎ4Ｏ2ＣｌＮａ:Ｃ:５０.２
６;Ｈ:２.６０;Ｎ:１８.０３.測定値:Ｃ:４９.９１;Ｈ:
２.３５;Ｎ:１７.６３．
【０１７０】実施例２９ 化学発光検出法を用いるサンドイッチ酵素免疫測定法
（ＩＩ） ＥＩＡ用イムノプレートを用いてヒト血清中bＦＧＦの
測定を行った。 １．抗体感作プレートの調製 ＭＡb５２とＭＡb９８の等量混合物を０.１Ｍ炭酸緩衝
液(pＨ９.６)にて５０μg／mlとなるように希釈し、Ｅ
ＩＡ用イムノプレート(Ｍicro Ｆluor“Ｗ"プレート;
ダイナテック社製)の各ウエルに１００μlずつ注入して
４℃で一夜放置して感作させた。０.１５Ｍ ＮaＣlを
含む０.０１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)にて洗浄した
後、２５％ブロックエース(大日本製薬)および０.１５
Ｍ ＮaＣlを含む０.０１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)を
各ウエルに注入して用時まで冷所保存した。
【０１７１】２．ヒト血清中bＦＧＦの測定 (a)試薬 (１)実施例９で得られた酵素標識抗体(３Ｈ３−ＨＲＰ) (２)１で得た抗体感作マイクロプレート (３)リコンビナントヒトbＦＧＦ(rhbＦＧＦ) (４)緩衝液Ａ(０.１５Ｍ ＮaＣlを含むpＨ７.０の０.
０２Ｍリン酸緩衝液)、緩衝液Ｂ(２５％ブロックエース
(大日本製薬)、０.１５Ｍ ＮaＣl、１００μg／mlヘパ
リンを含むpＨ７.０の０.０２Ｍリン酸緩衝液)、緩衝液
Ｃ(１０μg／mlマウスＩgＧを含む緩衝液Ｂ) (５)発光用Ｌ−０１２溶液(１００μＭ Ｌ−０１２,５
０μＭ ４−(４−ハイドロキシフェニル)チアゾール、
２５μＭ ＥＤＴＡ、５％ＤＭＳＯを含むpＨ７.５のト
リス塩酸緩衝液) (６)bＦＧＦゼロ血清(ヒトプール血清をＭＡb９８を固
定化したアフィニティーカラムにかけ、bＦＧＦを除い
たもの) (７)不活化ＨＲＰ(ＨＲＰを１２１℃、３０分間オート
クレーブ処理したもの）
【０１７２】（ｂ）測定 ゼロ血清または被検血清８０μl、標準rhbＦＧＦ含有緩
衝液Ｂまたは緩衝液Ｂのみ８０μl,３０μg／mlマウス
ＩgＧ,１.５Ｍ ＮaＣl,６０μg／ml不活化ＨＲＰ含有
緩衝液Ｂ８０μlを混合して調製したサンプルの１００
μlを(１)で得られた抗体感作プレートの各ウエルに注
入し、４℃、２４時間反応させた。各ウエルを緩衝液Ａ
で洗浄後、緩衝液Ｃで３００倍に希釈した酵素標識抗体
溶液１００μlを加えて４℃でさらに４時間反応させ
た。各ウエルを緩衝液Ａで洗浄し、発光用Ｌ−０１２溶
液５０μl,続いて６００μＭ過酸化水素溶液５０μlを
添加し、化学発光反応を生ぜしめた。ルミネッセンスリ
ーダー(ＭＬ−１０００,ダイナテック社製)を用いて各
ウエルの発光量を測定した。標準曲線を第３図に示す。
この方法により血清中hbＦＧＦが約２pg／mlまで測定で
きる。またＬ−０１２のナトリウム塩を発光基質として
用いた場合も、Ｌ−０１２と同様の感度で血清中hbＦＧ
Ｆの測定が可能であった。 (c)正常人における血清中hbＦＧＦ量 健常人(n＝２５)における血清中hbＦＧＦ量を本測定法
により測定した結果を第４図に示す。この結果、健常人
のhbＦＧＦ量は平均５.９pg／mlであった。 (d)各種がん患者血清の測定 本測定法を用いて各種がん患者血清中のhbＦＧＦ量を測
定した。結果を第４図に示す。カットオフ値を健常者平
均＋標準偏差×３(２２pg／ml)とすると、陽性率は肺が
ん７９.２％、腎がん６７.７％、肝がん８.７％、胃が
ん０％であり、肺がん及び腎がんで極めて高い陽性率を
示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例２の化合物(Ｌ−０１１)で標識された
抗インタフェロンγ抗体量と発光カウントの関係を示す
グラフである。
【図２】 ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子のサンドイッ
チ酵素免疫測定機において検出に実施例３(Ｌ−０１２)
の化合物を用いて化学発光させた実験における標準曲線
である。
【図３】 標準rhbＦＧＦを用いて作成された標準曲線
を示す。
【図４】 正常人及び各種がん患者血清における測定結
果を示す。図中の各レーンにおける横線はそれぞれの平
均値を示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭51−34195（ＪＰ，Ａ) 特公 昭45−18458（ＪＰ，Ｂ１) 辻 章夫等、「蛋白質 核酸 酵 素」、別冊第31巻（1988）、第252−263 頁 Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．, Ｖｏｌ．24，Ｎｏ．11（1976），ｐ. 2699−2710 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07D 471/04 C07D 491/048 G01N 33/532 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 【化１】 〔式中、Ｒ1は式 【化１６】 〔式中、Ｒ4は−ＣＮ、−hal、−ＯＰＯ3Ｍ2、−ＯＳＯ
    3Ｍ、−ＣＯ2Ｒ5、−ＳＲ6、−ＯＲ6、−ＮＨＲ6であ
    り、Ａは硫黄、酸素、窒素原子を、ｎは１〜４の整数
    を、Ｍはアルカリ金属または水素原子を、halはハロゲ
    ン原子を、Ｒ5は水素原子、低級アルキル基、マレイミ
    ド基、スクシンイミド基または５−ノルボルネン−２，
    ３−カルボキシイミド基を、Ｒ6は水素原子または式 【化１７】 〔式中、Ｒ7はマレイミド基、スクシンイミド基または
    ５−ノルボルネン−２，３−カルボキシイミド基を示
    す。〕で表わされる基を示す。〕で表わされる基で置換
    されていてもよいフェニル基を示し、 Ｒ2は(1)水酸基、(2)チオール基、(3)アミノ基または
    (4)直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６の低級アルキ
    ル基、炭素数２〜３のアルケニル基、炭素数２〜３のア
    ルキニル基、炭素数７〜１２のアラルキル基および炭素
    数６〜１０のアリール基から選ばれる置換基でモノ置換
    されたアミノ基を示し、 Ｒ3は(1)水素原子、(2)直鎖状または分枝鎖状の炭素数
    １〜６の低級アルキル基、炭素数６〜１０のアリール基
    および炭素数７〜１２のアラルキル基から選ばれる置換
    基で置換されていてもよい水酸基、(3)直鎖状または分
    枝鎖状の炭素数１〜６の低級アルキル基、炭素数３〜６
    のシクロアルキル基、炭素数２〜３のアルケニル基、炭
    素数２〜３のアルキニル基、炭素数７〜１２のアラルキ
    ル基および炭素数６〜１０のアリール基から選ばれる置
    換基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基、
    (4)直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６の低級アルキ
    ル基、炭素数６〜１０のアリール基および炭素数７〜１
    ２のアラルキル基から選ばれる置換基で置換されていて
    もよいチオール基、(5)ハロゲン原子、(6)窒素原子、硫
    黄原子および酸素原子から選ばれる１〜４個のヘテロ原
    子を含む不飽和または飽和された５ないし６員のヘテロ
    環基、(7)ニトロ基、(8)シアノ基、(9)エステル化また
    はアミド化されていてもよいカルボキシル基、(10)アジ
    ド基、(11)スルホ基または(12)有機スルホニル基を示
    し、 Ｘは酸素原子または硫黄原子を示す。〕で表わされるピ
    リドピリジン誘導体またはその塩の化学発光を利用する
    ことを特徴とするアッセイ法。
  2. 【請求項２】 式 【化２】 〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＸはそれぞれ請求項１記
    載と同意義を示し、ただし、Ｒ3が水素原子の場合、Ｒ1
    は式 【化１８】 〔式中、各記号は請求項１記載と同意義を示す。〕で表
    わされる基で置換されたフェニル基を示す。〕で表わさ
    れるピリドピリジン誘導体またはその塩。
  3. 【請求項３】 ８−アミノ−５−クロロ−７−フェニル
    ピリド〔３，４−ｄ〕ピリダジン−１，４（２Ｈ，３
    Ｈ）ジオンまたはその塩である請求項２記載の化合物。
  4. 【請求項４】 式 【化３】 〔式中、Ｒは低級アルキル基を、他の記号は請求項２記
    載と同意義を示す。〕で表わされる化合物とヒドラジン
    とを反応させることを特徴とする一般式 【化４】 〔式中、Ｘは酸素原子を示し、他の記号は請求項２記載
    と同意義を示す。〕で表わされるピリドピリダジン誘導
    体またはその塩の製造法。
  5. 【請求項５】 式 【化５】 〔式中、Ｗは酸素原子またはＲ'が水素原子、低級アル
    キル基またはフェニル基である−ＮＲ'基を示す。〕で
    表わされる化合物とヒドラジンとを反応させることを特
    徴とする一般式 【化６】 〔式中、Ｘは酸素原子を示し、他の記号は請求項２記載
    と同意義を示す。〕で表わされるピリドピリダジン誘導
    体またはその塩の製造法。
  6. 【請求項６】 アミド結合を介して、請求項１記載の一
    般式（Ｉ）で表わされるピリドピリダジン誘導体または
    その塩と反応性物質とを化学結合させてなることを特徴
    とする化学発光性標識複合体。
  7. 【請求項７】 請求項６記載の化学発光性標識複合体を
    用いて液体サンプル中の微量物質を測定することを特徴
    とするアッセイ方法。
  8. 【請求項８】 過酸化水素を発生できる系を含む測定シ
    ステムにおいて、請求項１記載の一般式（Ｉ）で表わさ
    れるピリドピリダジン誘導体またはその塩と、要すれば
    触媒を加えて化学発光反応を生じさせ、液体サンプル中
    の微量物質を測定することを特徴とするアッセイ方法。
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