CN108130360B

CN108130360B - 一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法

Info

Publication number: CN108130360B
Application number: CN201711339934.8A
Authority: CN
Inventors: 孔云虹; 夏云; 念馨; 张旭祥; 赵亚南; 瞿越云; 殷根深
Original assignee: Kunming University
Current assignee: Kunming University
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: CN108130360A

Abstract

本发明涉及一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，包括如下步骤：步骤（1）、样品采集；步骤（2）、稀释样品；步骤（3）、洗脱细胞；步骤（4）、收集滤液；步骤（5）、收集沉淀物；步骤（6）、盲肠淀粉降解细菌的标定；步骤（7）、盲肠淀粉降解细菌的回位鉴定；步骤（8）、肉鸡盲肠淀粉降解细菌的菌丰度的确定及统计分析。本发明不仅可以快速获取肉鸡盲肠中的优势淀粉水解细菌组成的原位信息，还可以用来筛选优质的肉鸡饲料配方，为进一步调控盲肠淀粉发酵对肉鸡生产性能和健康的影响具有重要的意义。

Description

一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测淀粉降解细菌的方法，尤其是一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法。

背景技术

动物饲料效率是评估现代肉鸡营养和能量代谢功效的重要指标之一。提高饲料效率可以降低生产者的成本，为人类生产更多的食用资源，减少排泄物和温室气体的排放。饲料转化率和残留饲料摄取量是评估动物饲料效率的主要指标。饲料效率是一个复杂的特征，因为它不仅受宿主遗传学和生理状态的影响，而且还受到肠道微生物菌群的影响，因为肠道微生物菌群会影响宿主的营养消化和能量吸收。

大约70％的肉鸡生产成本和饲料成本联系在一起，对廉价饲料原料的追求是永无止境的。肉鸡拥有健康的肠道不仅可以提高饲料营养的消化吸收率，而且能够抵抗肠道致病菌的侵袭，减少因疾病死亡和并发症造成的经济损失，是肉鸡发挥良好生产性能的关键因素。谷物淀粉占饲粮的70％-80％，是肉鸡生长的主要能量来源，饲粮淀粉在肉鸡肠道中的消化率和淀粉颗粒的结构和组成、淀粉颗粒和蛋白质的相互作用以及饲料加工后颗粒的可用性相关。因为淀粉是肉鸡日粮中的主要能量成分，任何能够减少不消化淀粉的策略都会对肉鸡的生产能力有益。虽然总体上肉鸡肠道对淀粉的消化能力良好，饲粮谷物淀粉消化率相对较高，90％糖以及淀粉在肉鸡胃肠道(GIT)中消化，然而多种相互关联的因素都会降低肉鸡淀粉的全肠道和后肠消化率，主要的因素包括：淀粉的结构特点、淀粉的颗粒性状、饲粮中的可溶性纤维和不可溶纤维的浓度以及肉鸡的基因族源。

胃肠道是肉鸡淀粉消化和吸收的主要部位，肠道十二指肠对淀粉消化吸收至关重要，它具有比后肠更低的pH值，是吸收大部分葡萄糖和小肠内其他营养物质的区域。然而最近新一代DNA测序研究表明，除了胃肠道是肉鸡淀粉消化和吸收的主要部位之外,盲肠微生物菌群也参与了肉鸡淀粉的代谢。肉鸡盲肠由于位于肉鸡肠道后段而常常被忽视，流入盲肠的10％未消化饲粮淀粉在盲肠的发酵代谢也因此常常被忽略，大多数研究都集中在如何改善肉鸡肠道中淀粉的消化率，减少饲粮中未经消化淀粉流入盲肠的数量。近年来随着Omics技术的应用和发展，大量的研究通过宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质学确定了盲肠微生物群落的组成，预测了微生物群落的功能，了解和比较了盲肠微生物菌群的信息。由于充满了发酵微生物的盲肠在肉鸡预防病原体定殖，解毒有害物质，回收氮气和吸收额外的营养物质中起着重要作用，因此盲肠微生物菌群在肉鸡代谢疾病中的重要性受到越来越多的关注。

肉鸡肠道健康优化对于精准饲养和精准营养是非常重要的，微生物发酵的代谢产物对肠道健康有直接影响，肉鸡肠道微生物群落和宿主的养分和流体吸收、免疫调节、抵御感染、向大脑传送信号、维持体内的平衡和生长、繁殖有关。在饲料，微生物群落和宿主之间的三角关系中，处于最佳状态的肠道健康对于肉鸡的生产性能是最关键的因素。最新的研究结果表明盲肠是肉鸡胃肠道GIT发酵的主要部位，40％饲粮中未经消化的淀粉(包括植物颗粒和动物颗粒)流入盲肠，靠盲肠微生物菌群降解，转化为微生物需要的养分-短链脂肪酸(SCFA)和气体，为盲肠细菌的发育和生长提供能量，调整肠道健康环境，导致盲肠微生物向有益于改善肠道健康的方向发展，帮助宿主提高了免疫系统的发育，增强宿主肠道的结构和强度(Jamroz等，2002)。

盲肠微生物能够利用宿主消化系统中未能利用的饲粮成分，从而改善饲粮的总能量捕获。实验研究证明,切除盲肠的肉鸡的粗纤维代谢和其他营养物质的消化率比正常肉鸡低；另外，在盲肠中观察到较强的葡萄糖吸收能力，与空肠相比，盲肠在糖浓度较低的状况下，具有较高的吸收糖的能力。与肉鸡其他胃肠道部分相比，盲肠中短链脂肪酸(SCFA)的浓度最高。在最近肉鸡盲肠宏基因组的研究中，已经观察到许多寡糖和多糖降解酶编码基因和涉及短链脂肪酸(SCFAs) 产生的几种途径，SCFA主要通过盲肠微生物发酵产生，宿主可以通过粘膜吸收进行分解代谢产生能量，产生的SCFAs通过降低pH来抑制宿主肠道中的酸敏感病原体。短链脂肪酸不仅可以抑制宿主病原菌的生长，同时在吸收之后向宿主提供一些产生能量的底物。盲肠中的微生物菌群与宿主的相互作用导致了不同的饲料效率的差异。首先，宿主基因改变肠道生理环境，使它成为微生物的“底物”，而且“底物”的变化会影响肠道微生物组成；反过来肠道微生物菌群的代谢又影响“底物”的组成；最后盲肠微生物菌群与宿主的相互作用就通过宿主的饲料效率表现出来。近期研究表明，宿主的代谢免疫功能随着盲肠微生物菌群组成和丰度的变化而变化，揭示了盲肠微生物菌群在动物饲料效率方面的重要影响。饲粮中碳水化合物消化率的水平是确定进入后肠的碳水化合物的数量重要的因素，而这些碳水化合物是盲肠微生物发酵的底物，进入盲肠的未经消化的碳水化合物将引起微生物群落结构的瞬态变化。在观察商业肉鸡养殖场的饲料转化效率时，发现一旦肉鸡小肠中的消化和营养摄取出现障碍，未经消化的饲粮碳水化合物进入盲肠的量上升，导致基于简单底物的微生物菌群的活化，盲肠中乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度增加(

and Apajalahti，2013)。

一直以来，通过特定的肠道功能菌群来监控肉鸡肠道微生物菌群的变化，对维持肠道健康进而提高肉鸡生产性能是有效的策略，人们对将某些盲肠功能菌群与肉鸡的健康和生产性能联系起来一直很感兴趣。水解是淀粉分解发酵的第一步，到目前为止，关于肉鸡盲肠淀粉水解细菌的信息很少，只有很少的纯培养研究结果揭示了盲肠中的淀粉水解细菌包括乳酸菌属(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)，梭菌属(Clostridium spp.)；证明了这些细菌能分泌α-amlase并参与淀粉的降解。至今为止这些研究结果都没有在原位(in situ)(不需要通过纯培养分离菌株)状态下得到证实。由于盲肠中仅有20％的细菌能在培养基中生长，而且通过纯培养研究得到的微生物生理生化信息不一定能反映微生物在复杂的生态系统原位的作用和功能。

近期大量的研究通过Omics技术(宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学) 对肉鸡盲肠中的微生物群落进行了分析，发现盲肠微生物与饲料效率高度相关，研究结果表明了盲肠微生物菌群在肉鸡饲料效率方面的突出作用，特别是乳酸菌属(Lactobacillusspp.)在影响肉鸡饲料效率方面起主要作用，其他盲肠微生物发挥次要的作用。这些近期的研究结果为通过调节盲肠功能微生物来提高肉鸡饲料效率提供了一个有希望的前景，研究结果进一步指出应该更多地关注迄今为止尚未得到充分研究的盲肠微生物菌群，并且通过盲肠微生物菌群来改善肉鸡的健康和营养。

由于微生物纯培养技术的局限性，研究肉鸡盲肠微生物菌群的变化及探讨饲粮组成变化对盲肠微生物功能菌群的影响受到了限制。虽然现代分子生物学技术 -Omics技术(包括宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学)结合动物模型及生物信息学已经被广泛用于分析肉鸡盲肠功能菌群的组成和功能对肉鸡健康和生产性能的影响，但是由于Omics技术过程复杂，费用昂贵，需要专业技能较强的操作分析人员，至今为止，这项技术还没有广泛应用于鉴定和定量肉鸡盲肠淀粉水解细菌。

提高动物饲料效率是动物营养中的一个重要问题，因为需要减少饲养场的环境污染，降低生产成本。肉鸡的饲料效率和盲肠功能微生物菌群与宿主的相互作用密切相关。

到目前为止，还没有一种有效、简便、容易操作的方法可以用在原位状态(insitu)下，鉴定和定量肉鸡盲肠淀粉水解细菌的方法，也没有关于饲料配方与肉鸡盲肠淀粉水解细菌之间关系的研究，盲肠淀粉水解细菌的鉴定和定量的结果可以间接用来监控盲肠淀粉发酵的水平，以便推测盲肠淀粉发酵产物对肉鸡健康和生产性能的影响，探测饲粮中未经消化的淀粉在盲肠中的发酵产物对肉鸡健康和生产性能的影响，值得探索。

发明内容

为了克服了现有的方法的不足，本发明提供一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，采用荧光染酶和FISH(荧光原位杂交)回位的方法，不需要分离菌株，不需要应用专业技能较强的Omics技术，就可对在原位的状态下肉鸡盲肠淀粉水解细菌进行回位鉴定和回位定量。

本发明的具体方案如下：

一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，包括如下步骤：

步骤(1)、样品采集：随机抽取试验鸡，屠宰后剖开鸡腹截取盲肠，清洗，将清洗干净的盲肠放在灭菌锡纸上，剪开肠壁，刮取食糜样品并存于小烧杯中；

步骤(2)、稀释样品：称取大约10g步骤(1)的食糜样品，装入无菌过滤袋中，加入经预热的1×PBS缓冲液,混匀；

步骤(3)、洗脱细胞：将步骤(2)混匀的液体转入到BioRad匀浆袋中，在BioRad 匀浆器高速档匀浆，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；

步骤(4)、收集滤液：匀浆过程完成后,用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌离心管中，离心；

步骤(5)、收集沉淀物：去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于1×PBS缓冲液中, 得到细胞悬浮液，待用；

步骤(6)、盲肠淀粉降解细菌的标定

取上述细胞悬浮液转入到无菌离心管中，离心；去除上清液，加入1×Tris-HCl 缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光淀粉染液,立即将混合液体转入到无菌血清瓶中，随后加入灭菌后的电子传递链抑制剂，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动一段时间；将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取混合液涂布于用明胶涂层的载玻片上，避光风干；将上述风干的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光,记录每一个淀粉降解细菌的位置；

步骤(7)、盲肠淀粉降解细菌的回位鉴定

清洗、干燥载玻片，采用寡聚核苷酸探针，使用FISH，在原位条件下回位鉴定肉鸡盲肠淀粉降解细菌，其中，寡聚核苷酸探针的5’末端采用Cy3染料标记，得到淀粉降解菌的位置；

观察和拍照，根记录的淀粉降解细菌的位置回位到同一个视野下，通过Cy3 激发快观察FISH染色图像，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌，被绿色荧光淀粉染亮的细菌同时又被寡聚核苷酸探针染亮说明以上述寡聚核苷酸探针为靶标的细菌具有在肉鸡盲肠中具有水解淀粉的功能；

步骤(8)、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位定量

清洗、干燥载玻片，用取一定量的DAPI的染液覆盖于风干的载玻片上中央，将载玻片上的DAPI染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20-30min，将染液倒去，并用蒸馏水小心冲洗2-3遍，避光并在无菌操作箱中风干，即可在显微镜下镜检；

将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的蛋白质降解细菌的位置回到同一个视野下，通过DAPI 激发快观察DAPI染色图像，通过兰色荧光激发块观察所有细菌；

步骤(9)、盲肠淀粉降解细菌的丰度的确定及统计分析。

进一步地，步骤(1)之前还包括试验鸡的饲养，其中，饲养期包括前期和后期，饲养前期饲料配方如下：

饲料配方包括：玉米55-60％、玉米豆粕25-30％、玉米蛋白粉4-6％、鱼粉2-4％、大豆油1-3％、磷酸氢钙1-2％、细石粉1-2％、食盐0.1-0.5％、蛋氨酸0.1-0.2％、赖氨酸0.1-0.2％、预混料为0.8-1％；饲料营养水平如下：

ME 3000-3100％、CP 20-25％、Ca1-1.5％、P 0.5-1％、AP0.3-0.5％、NaCL 0.3-0.5％、Lys 1-1.5％、Met 0.3-0.5％、Thr 0.5-1％、Trp 0.2-0.4％、Arg 1-1.1％；

饲料还包括益生元，益生元为菊粉10-40g/Kg和/或溶菌酶40-200mg/Kg。

进一步地，饲养后期饲料配方如下：

饲料配方的范围包括：玉米60-65％、玉米豆粕20-25％、玉米蛋白粉6-8％、大豆油3-5％、磷酸氢钙1-2％、细石粉0.5-1％、粗石粉0.3-0.6％、食盐 0.1-0.5％、蛋氨酸0.01-0.1％、赖氨酸0.1-0.2％、预混料为0.8-1％；饲料营养水平如下：

ME 3100-3200％、CP 20-25％、Ca1-1.5％、P 0.7-1.2％、AP0.3-0.5％、NaCL 0.3-0.5％、Lys 1-1.5％、Met 0.3-0.5％、Thr 0.5-1％、Trp 0.2-0.4％、Arg 1-1.2％。

进一步地，步骤(6)中，电子传递链抑制剂为叠氮化钠3mM、氟乙酸钠 2mM和碘代乙酰胺钠4mM，按照总反应体积600μL计算。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明从肉鸡盲肠中回位鉴定(FISH-荧光原位杂交)和回位定量(DAPI染色)淀粉水解细菌的方法，此方法和以前的纯培养、Omics技术(宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学)方法比较，更快速，成本较低，操作简便，操作人员不需要特殊的培训，对检测的地点无特殊的要求，实验结果准确，能迅速提供给饲养人员相关的数据。不仅可以快速获取肉鸡盲肠中的优势淀粉水解细菌组成的原位信息，还可以用来筛选优质的肉鸡饲料配方，确定不同的饲料配方在特定的饲料条件下，肉鸡盲肠淀粉发酵产物对肉鸡生产性能和肠道健康的影响程度，为进一步调控盲肠淀粉发酵对肉鸡生产性能和健康的影响具有重要的意义。

附图说明

图1是本发明的快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法流程图；

图2A和图2B是在同一个视野下采用不同的荧光激发块拍摄的图片；图2A中箭头所指示的细菌是在FITC荧光激发块条件下拍摄的被BODIPY绿色荧光淀粉染液染亮的肉鸡盲肠淀粉降解细菌，图2B中箭头所指示的细菌和图2A中箭头所指示的细菌是在同一个视野下拍摄的，图2B中箭头所指示的细菌在Cy3荧光激发块条件下拍摄FISH图片；

图3为饲料中菊粉和溶菌酶的添加对肉鸡盲肠淀粉降解细菌相对丰度的影响。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、分析化学技术及相关领域的常规技术。

实施例1

1、实验试剂、仪器、设备

1.1实验试剂

1×PBS缓冲液(pH 7.0)、1×Tris-HCl缓冲液(10mM,pH 7.8)、BODIPY (boron-dipyrromethene)标记的绿色荧光淀粉染液、叠氮化钠100mM、氟乙酸钠100mM、碘代乙酰胺钠100mM、蒸馏水、超纯水、5mgDAPI、无水乙醇、明胶、十二水硫酸铬钾，洗洁精。

1.2实验仪器与设备

载玻片、载玻片架、载玻片盒、洗液瓶、试管架、移液枪、烧杯、匀质器、胶头滴管、煮锅、磁力震荡加热器，温度计、盒装铝箔、10ml的宽底血清瓶、50ml 离心管、2mL eppendof离心管、BioRad匀浆袋、药勺、保温瓶、无菌收集袋、玻棒、广口瓶、莱卡荧光显微镜、eppendof离心机、BioRad匀浆机、旋转摇床。

1.3实验药品配制

1.3.1：BODIPY(boron-dipyrromethene)标记的绿色荧光淀粉染液：配制的过程根据

Ultra Amylase Assay Kit[购自Thermo Fisher Scientific]中描述的方法进行；

1.3.2：寡聚核苷酸探针：

本次实验中所用到的所有的寡聚核苷酸探针的配制的浓度和过程都根据上海生工提供的数据和方法进行；如表1所示：

表1用于原位条件下回位鉴定肉鸡盲肠淀粉水解细菌的16S rRNA靶序列核苷酸探针及杂交液浓度

1.3.3：DAPI染液：

加5mgDAPI溶于1ml蒸馏水中:从5mg/ml的DAPI染液中取3ul加入到 2997ul超纯水中，配制成最终浓度为0.005mg/ml的DAPI染液，储藏于5ml离心管中，混匀冷藏，避光待用。

2、检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌

如图1所示，本实施例的快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法具体包括如下步骤：

2.1肉鸡的饲养

选取588羽1日龄狄高肉仔鸡随机分为七组，每组6个重复，每个重复14羽。各处理组之间鸡只平均始重(AIW)差异不显著(P>0.05)。试验采用封闭式鸡舍3层笼养，每笼7只鸡，室内温度按狄高肉鸡饲养标准控制。试验期42d，分前期(0～21d)和后期(22～42d)2个阶段饲养。试验1组是空白对照组饲喂基础日粮(表2)，试验2、3和4组是在基础日粮的基础上添加10、20、40g/kg菊粉；试验5、6和7组是在基础日粮的基础上添加40、100、200mg/kg溶菌酶；试验全程为42天。前期的饲料和后期饲料的成分及含量如表2所示：

表2狄高鸡的基础日粮组成及营养水平

2.2制作明胶涂片

在载玻片上覆上一层明胶的方法的目的是让样品均匀地分散和固定在载玻片上，使得肉鸡盲肠食糜样品在染色过程中不会从载玻片上脱落。取7个载玻片架，将载玻片填满于载玻片架中。用锅装3.5升蒸馏水，在水中加入4-5滴洗涤剂，放入载玻片架，煮沸约10分钟。10分钟后取出载玻片架，晾3分钟，然后用蒸馏水将洗涤剂冲洗干净，将载玻片保持直立状态晾干。在另外一口锅中加入 3.5升蒸馏水，在水中加入2.5g的十二水硫酸钾铬和0.44g的明胶，加热至70℃左右，待明胶基本溶解后放入载玻片架，煮大约10分钟，温度控制在70℃，10 分钟后取出载玻片架，将载玻片斜立于试管架边上，让它干燥，干燥后可以看到载玻片上均匀的覆上一层透明薄膜状的明胶。

2.3在无菌条件下收集肉鸡盲肠食糜中的总细菌

第一步、样品采集：试验分别进行至9d、16d、30d、42d，在各重复中随机抽取试验鸡各4羽，屠宰后用无菌的手术剪剖开鸡腹截取盲肠，将经37℃预热的0.9％Nacl溶液倒在一个500ml的无菌烧杯中，将鸡盲肠用无菌镊子夹住，在 0.9％Nacl溶液中轻轻涮洗2-3次，将附着在肠壁上的血渍清洗干净。将清洗干净的盲肠放在灭菌锡纸上，用无菌手术剪剪开肠壁，用无菌的药勺刮取食糜样品并存于小烧杯中；

第二步、稀释样品：称取大约10g新鲜食糜，装入无菌过滤袋中，加入40 毫升经37℃预热的1×PBS缓冲液(pH 7.0),混匀；

第三步、洗脱细胞：将混匀的液体转入到BioRad匀浆袋中，在BioRad匀浆器高速档匀浆8分钟，速度4，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；

第四步、收集滤液：匀浆过程完成后,用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌的50ml离心管中，离心10分钟(37℃、1000rpm)；

第五步、收集沉淀物(细菌细胞)：将上清液收集在10mL螺口离心管中，离心10分钟(37℃、8000rpm)，去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于5ml的 1×PBS缓冲液(pH7.0)中,待用。在等待下一步的实验过程中，可将细胞悬浮液储存于4度的冰箱中。

2.4肉鸡盲肠淀粉水解细菌的标定

第一步、取400μL上述细胞悬浮液转入到无菌的2mLeppendof离心管中，离心(4500g)10分钟；

第二步、去除上清液，加入400μL 1×Tris-HCl缓冲液(10mM,pH 7.8)(从

Ultra Amylase Assay Kit中获取)，再加入200μL BODIPY (boron-dipyrromethene)标记的绿色荧光淀粉染液(从

Ultra Amylase Assay Kit中获取)，立即将混合液体转入到无菌的10ml的宽底血清瓶中，随后加入灭菌后的3种电子传递链抑制剂，电子传递链抑制剂为叠氮化钠、氟乙酸钠和碘代乙酰胺钠，最终反应浓度分别为3mM、2mM和4mM，按照总反应体积 600μL计算，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；

第三步、将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动30分钟，速度保持在220r.p.m；

第四步、将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取10μL均匀涂布于用明胶涂层的载玻片上，并在黑暗的环境中风干20分钟，整个过程需要避光；

第五步、将干燥好的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光，记录每一个淀粉降解细菌的位置如图2A所示。

2.5肉鸡盲肠淀粉水解细菌的回位鉴定

第一步、将载玻片从荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡DFC500数字照相机)载物台移到桌面上，轻轻移走盖玻片，轻柔用70％的酒精冲洗载玻片3 分钟，将载玻片置于50％的酒精中浸泡4小时，将载玻片置于室温下干燥。

荧光原位杂交技术(FISH)的操作过程按照Amman(1995)描述的方法进行。我们在总结了现有的关于鉴定肉鸡盲肠淀粉降解细菌的纯培养研究的参考文献之后，我们搜集并采用了寡聚核苷酸探针，如表1所示，在原位条件下回位鉴定肉鸡盲肠淀粉水解细菌。

所有的寡聚核苷酸探针均购置于上海生工，如表1所示，并在5’末端采用 Cy3染料标记，所有寡聚核苷酸探针的甲胺浓度(％)均来自于Probe-Base网站 (http://131.130.66.201/probebase_old/search.asp)。

FISH的操作步骤简述如下：将上述处理好的载玻片依次放入浓度为50％、 80％、100％乙醇溶液中脱水3min，室温风干；按照表二中各个寡聚核苷酸探针的甲胺浓度分别配制杂化液和洗脱液，杂化液和洗脱液的配制过程也是根据 Amman(1995)描述的方法进行；将配制好的洗脱液放入温度为48度的水浴锅中预热。在处理好的载玻片上滴加32μL配制好的杂化液和4μL探针(对于混合探针每种探针加入4μL)，立即将载玻片转入预热到46℃的培养箱中杂交3h；将载玻片取出，立即放入预热至48℃的洗脱液中洗脱15min(不同的探针对应不同浓度的洗脱液)，后用蒸馏水清洗3次，避光晾干备检。

第二步、将干燥好的载玻片置于荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡 DFC500数字照相机)物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的淀粉降解细菌的位置回位到同一个视野下，FISH染色图像通过Cy3激发快观察，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌，如图2B所示。被绿色荧光淀粉染亮的细菌同时又通过FISH被表二中特殊的寡聚核苷酸探针染亮说明以这个特殊的寡聚核苷酸探针为靶标的细菌具有在肉鸡盲肠中具有水解淀粉的功能。

2.6肉鸡盲肠淀粉水解菌群的回位定量

第一步、将载玻片从荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡DFC500数字照相机)载物台移到桌面上，轻轻移走盖玻片，轻柔用70％的酒精冲洗载玻片3 分钟，将载玻片置于50％的酒精中浸泡4小时，将载玻片置于室温下干燥，用移液枪取80ul DAPI(0.005mg/ml)的染液覆盖于风干的载玻片上中央，用枪头将载玻片上的DAPI染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20-30min(由于DAPI的荧光会淬灭，因此染色时应避光),将染液倒去，并用蒸馏水小心冲洗 2-3遍(每次1分钟)，避光并在无菌操作箱中风干20分钟,即可在显微镜下镜检；

第二步、将干燥好的载玻片置于荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡 DFC500数字照相机)物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的被绿色荧光淀粉染液染亮的淀粉降解细菌的位置回到同一个视野下，DAPI 染色图像通过DAPI激发快观拍照图片，通过兰色荧光激发块观察和记录所有的细菌。

2.7肉鸡盲肠淀粉水解优势菌群丰度的确定

为了定量肉鸡盲肠淀粉水解细菌的丰度，每个样品至少采集30套(每套数据图片包括一张绿色荧光淀粉染色图片和一张DAPI染色图片)数据图片。肉鸡盲肠淀粉降解细菌的丰度采用图像分析软件ImageJ分别分析同一套数字图片中的绿色荧光淀粉染色阳性淀粉降解细菌的数量和DAPI染色阳性的细胞数(微生物总数)的数量来确定。绿色荧光淀粉染色细胞采用ImageJ中提供的手动计数法计数，DAPI染色细胞采用自动计数法计数。淀粉降解细菌的丰度为被绿色荧光淀粉染色的细胞数占细胞总数的百分比，即：

淀粉降解细菌的丰度＝绿色荧光淀粉染色的细胞数/细胞总数×100％。

2.8统计分析

t检验和方差分析均在excel中完成。

2.9结果与分析

如图2所示，图2(A)和图2(B)中箭头所指示的细菌是在同一个视野下采用不同的荧光激发块拍摄的图片，图2A中箭头所指示的细菌是在FITC荧光激发块条件下拍摄的被BODIPY绿色荧光淀粉染液染亮的肉鸡盲肠淀粉降解细菌，图2B中箭头所指示的细菌和图2A中箭头所指示的细菌是在同一个视野下拍摄的，图2B中箭头所指示的细菌在Cy3荧光激发块条件下拍摄FISH图片，即在 FISH过程中图2A中的被BODIPY绿色荧光淀粉染液染亮的盲肠淀粉降解细菌同样也通过FISH被寡聚核苷酸探针Bif228染亮。

通过FISH进行回位鉴定后，我们发现以双歧杆菌为靶标微生物的寡聚核苷酸探针Bif228，以大部分梭菌为靶标微生物的寡聚核苷酸探针Chis150，以台湾乳杆菌为靶标微生物的基因探针Lab9057_570，以大部分链球菌属为靶标微生物的寡聚核苷酸探针Strc493都染亮了绿色荧光淀粉标定的肉鸡盲肠淀粉水解细菌，确定了梭菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属和链球菌属的细菌都参与了肉鸡盲肠中淀粉降解的过程；图片计数的结果表明了以双歧杆菌为靶标微生物的基因探针 Bif228染亮了大部分绿色荧光淀粉标定的肉鸡盲肠淀粉水解细菌，而乳杆菌、梭菌和链球菌属只染亮了小部分绿色荧光淀粉标定的肉鸡盲肠淀粉水解细菌；因此双歧杆菌被鉴定为主要的狄高肉仔鸡盲肠淀粉水解过程中的主要功能菌群。

我们同时测定了对照组和六个不同的试验组的肉鸡盲肠淀粉水解细菌在42 天饲养周期中丰度的变化，如图3所示，结果显示：

对照组1组、添加菊粉的试验2、3和4组、添加溶菌酶的试验5、6和7 组的肉鸡，盲肠淀粉水解细菌的丰度都出现了增加的趋势。

对照组肉鸡的盲肠淀粉水解细菌的丰度增加量较小，从3.4％增加到7.7％；添加菊粉的试验2、3和4组是在基础日粮的基础上添加10、20、40g/kg菊粉，在添加的菊粉3个试验组，盲肠淀粉水解细菌的丰度均出现了较大幅度的增加，分别从3％增加到13％；从2.9％增加到16％；从3.5％增加到33％。添加溶菌酶的试验5、6和7组是在基础日粮的基础上添加40、100、200mg/kg溶菌酶，对比添加菊粉的3个试验组，添加溶菌酶的3个试验组增加幅度较小，和对照组增加的幅度相似，分别从从2.9％增加到5.2％；从3.5％增加到7.1％；从4.3％增加到8.5％。

我们的研究结果指出：添加不同种类的益生元(例如：溶菌酶和菊粉)导致了盲肠淀粉水解细菌的丰度增加的差异性；添加不同浓度的相同种类的益生元 (例如：菊粉)也导致了盲肠淀粉水解细菌的丰度增加的差异性，因此在肉鸡饲养过程中，在添加不同种类的益生元，或者添加相同种类的不同浓度的益生元的条件下，原位回位定量监控盲肠淀粉水解细菌丰度的变化具有重要的意义。

通过进一步分析对照组和6个试验组肉鸡盲肠淀粉水解细菌的组成，我们发现7个试验组的盲肠淀粉水解细菌的组成是一致的，说明益生元(菊粉和溶菌酶)的添加并没有改变肉鸡盲肠淀粉水解细菌的组成。

以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims

1.一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，用于提供给饲养人员肉鸡盲肠淀粉降解细菌的信息和数据，以确定肉鸡饲料配方，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1）、样品采集：随机抽取试验鸡，屠宰后剖开鸡腹截取盲肠，清洗，将清洗干净的盲肠放在灭菌锡纸上，剪开肠壁，刮取食糜样品并存于小烧杯中；

步骤（2）、稀释样品：称取大约10 g 步骤（1）的食糜样品，装入无菌过滤袋中，加入经预热的1×PBS缓冲液, 混匀；

步骤（3）、洗脱细胞：将步骤（2）混匀的液体转入到BioRad 匀浆袋中，在BioRad匀浆器高速档匀浆，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；

步骤（4）、收集滤液：匀浆过程完成后, 用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌离心管中，离心；

步骤（5）、收集沉淀物：去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于1×PBS缓冲液中,得到细胞悬浮液，待用；

步骤（6）、盲肠淀粉降解细菌的标定

取上述细胞悬浮液转入到无菌离心管中，离心；去除上清液，加入1×Tris-HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光淀粉染液, 立即将混合液体转入到无菌血清瓶中，随后加入灭菌后的电子传递链抑制剂，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动一段时间；将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取混合液涂布于用明胶涂层的载玻片上，避光风干；将上述风干的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光，记录每一个淀粉降解细菌的位置；

步骤（7）、盲肠淀粉降解细菌的回位鉴定

观察和拍照，根据记录的淀粉降解细菌的位置回位到同一个视野下，通过Cy3激发快观察FISH染色图像，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌，被绿色荧光淀粉染亮的细菌同时又被寡聚核苷酸探针染亮说明以上述寡聚核苷酸探针为靶标的细菌在肉鸡盲肠中具有降解淀粉的功能；

步骤（8）、肉鸡盲肠淀粉降解细菌的回位定量

清洗、干燥载玻片，用取一定量的DAPI的染液覆盖于风干的载玻片上中央，将载玻片上的DAPI 染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20-30min，将染液倒去，并用蒸馏水小心冲洗2-3遍，避光并在无菌操作箱中风干，即可在显微镜下镜检；

将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的淀粉降解细菌的位置回到同一个视野下，通过DAPI激发快观察DAPI染色图像，通过兰色荧光激发块观察所有细菌；

步骤（9）、盲肠淀粉降解细菌的丰度的确定及统计分析。

2.根据权利要求1所述的快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，其特征在于：步骤（1）之前还包括试验鸡的饲养，其中，饲养期包括前期和后期，饲养前期饲料配方如下：

饲料配方包括：玉米 55-60%、玉米豆粕 25-30%、玉米蛋白粉 4-6% 、鱼粉 2-4%、大豆油 1-3% 、磷酸氢钙 1-2% 、细石粉 1-2% 、食盐 0.1-0.5% 、蛋氨酸 0.1-0.2% 、赖氨酸0.1-0.2%、预混料为0.8-1%；饲料营养水平如下：

ME 3000-3100，其单位为KC/kg、CP 20-25%、Ca 1-1.5%、P 0.5-1%、AP 0.3-0.5%、NaCl0.3-0.5%、Lys 1-1.5%、Met 0.3-0.5%、Thr 0.5-1%、Trp 0.2-0.4%、Arg 1-1.1%；

3.根据权利要求2所述的快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，其特征在于：饲养后期饲料配方如下：

饲料配方的范围包括：玉米 60-65%、玉米豆粕 20-25%、玉米蛋白粉 6-8% 、大豆油 3-5% 、磷酸氢钙 1-2% 、细石粉0.5-1% 、粗石粉0.3-0.6%、食盐 0.1-0.5% 、蛋氨酸 0.01-0.1% 、赖氨酸 0.1-0.2%、预混料为0.8-1%；饲料营养水平如下：

ME 3100-3200，其单位为KC/kg、CP 20-25%、Ca 1-1.5%、P 0.7-1.2%、AP 0.3-0.5%、NaCl 0.3-0.5%、Lys 1-1.5%、Met 0.3-0.5%、Thr 0.5-1%、Trp 0.2-0.4%、Arg 1-1.2%；

4.根据权利要求1所述的快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，其特征在于：

步骤（6）中，电子传递链抑制剂为叠氮化钠3mM、氟乙酸钠2mM和碘代乙酰胺钠4mM，按照总反应体积600μL计算。