CN108130307A - 一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法。首先将已分离提取的胰岛培养6～48小时后，离心弃上清后用培养液重悬，过滤重悬液，滤渣即为富集的胰岛细胞；再将富集的胰岛组织注射入“U”形管，利用连通器原理使胰岛组织聚集于“U”形管。利用该方法富集小鼠胰岛，可显著提高操作成功率和产率，并保持胰岛细胞活性，还可有效节约时间；该方法是一种更加简单快捷、廉价高效的小鼠胰岛细胞富集方法，在小鼠胰岛移植模型构建、新药实验、内分泌学基础研究等领域具有实际的应用价值，具有很好的推广应用前景。

Description

一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法。

背景技术

目前器官移植是治疗各类终末期疾病的最佳手段之一，但移植术后的排斥反应仍是影响患者术后长期生存的最重要原因，针对该领域的仍需开展大量研究。在移植免疫的研究中，合适的动物模型是必不可少的；目前常用的用于移植免疫研究的动物模型包括皮肤移植、心脏移植、胰岛移植等，其中小鼠胰岛移植因其操作相对简单、价格低廉、观察指标确切等优点，而成为目前最广泛应用的移植免疫模型。

小鼠胰岛移植方法包括原位移植和异位移植，其中以异位移植多见。异位移植又包括皮下、血液、肝脏和肾包膜下，其中以后两者为多。目前小鼠胰岛移植的手术操作已基本成熟，移植手术本身成功率已有保证。但是，传统的小鼠胰岛移植技术中仍存在一些亟待解决的问题，包括：1.胰岛分离难度较大，穿刺失败率高，得率较低；2.胰岛提纯操作繁琐，提取纯度低；3，胰岛分散且不均一，富集困难；4.胰岛活力及功能不一致，移植操作难以保证实验操作的一致性，易出现统计学误差等。其中问题1.及问题2.已有一些解决方案报道（如专利201510886141.2），但其他问题，尤其是小鼠胰岛富集这一关键问题的解决方案则尚未见报道。在小鼠胰岛富集领域存在的问题极大的制约了小鼠胰岛移植技术的推广及应用，亟待解决。

同时，近年来除了移植免疫研究领域，在新药实验、内分泌学基础研究等领域中富集的小鼠胰岛细胞亦成为研究所需的必须品。对小鼠胰岛细胞的富集方法的改良研究亦可对这些领域产生重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有小鼠胰岛细胞富集方法的缺陷和不足，提供一种可有效节约时间、提高操作成功率和产率，并保持胰岛细胞活性的小鼠胰岛细胞改良富集方法。

本发明的目的是提供一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法，首先将已分离提取的胰岛培养6～48小时后，离心弃上清后用培养液重悬，过滤重悬液，滤渣即为富集的胰岛细胞；再将富集的胰岛组织注射入“U”形管，利用连通器原理使胰岛组织聚集于“U”形管。

优选地，所述改良的小鼠胰岛细胞富集方法包括如下步骤：

（1）胰岛细胞的富集：将已分离提取的胰岛使用含10～20%胎牛血清的RMPI1640在36℃～38℃培养6～48小时，离心弃上清，沉淀用RMPI1640重悬，以0.05～0.2mm网孔的过滤件过滤重悬液，滤渣即为富集的胰岛细胞；

（2）富集胰岛细胞的收集：用微量移液工具收集步骤（1）富集的包膜完整的胰岛组织，沿“U”形管一端以5～15μl/s的速度缓慢注射入“U”形管，利用连通器原理使胰岛组织聚集于“U”形管。

其中，优选地，步骤（1）中，还需将滤渣转移至装有RMPI1640的培养容器中，此时肉眼可见白色点状物聚集于培养容器，将培养容器沿顺时针方向、以20～100cm半径、5～30圈/每分钟的速度水平旋转培养容器使白色点状物富集，即得到富集的胰岛细胞。

优选地，步骤（1）中，已分离提取的胰岛使用含15%胎牛血清的RMPI1640在37℃培养24小时。

优选地，步骤（1）中离心的条件是600～1200rpm、4～25℃离心1～2min。

更优选地，步骤（1）中离心的条件是800rpm、4℃离心1min。

优选地，所述过滤件的网孔孔径为0.1mm。

优选地，步骤（1）中将培养容器沿顺时针方向以50cm半径、10圈/每分钟的速度水平旋转培养容器使白色点状物富集。

优选地，步骤（2）所述微量移液工具是非玻璃非金属材质（因为玻璃或者金属会贴壁难以分离）。如塑料的微量吸管、塑料头的注射器或具有塑料枪头的微量移液器。

优选地，步骤（2）需要在保持低温条件下操作。温度在4～20℃均可，优选4℃。具体操作时，如可在冰上操作。

优选地，步骤（2）中注射入“U”形管的速度为5～10μl/s。

更优选地，步骤（2）中注射入“U”形管的速度为10μl/s。

优选地，所述“U”形管的内直径为0.1～0.3mm。

更优选地，所述“U”形管的内直径为0.2mm。

优选地，所述“U”形管的内壁光滑。

优选地，所述“U”形管的材质为玻璃或塑料。

步骤（2）中每管收集约100～150个完整的胰岛组织，所收集的胰岛组织可以保存备用。

比如，需进行胰岛移植时：取25μl Hamilton注射器，注射器头端连接一长约15cm、直径约0.2mm透明软管，将长枪头尖端的胰岛组织吸至软管中，置于碎冰上备用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法，包括小鼠胰岛的富集及收集；与传统方法相比，采用本发明方法在富集和收集小鼠胰岛细胞时具有以下优点：

（1）传统方法在提取胰岛后立刻进行进一步实验操作，本发明方法将已提取的胰岛组织先于体外培养后行操作，有效提高胰岛包膜的完整性，显著增强胰岛活力；

（2）传统方法胰岛细胞富集困难，大小不一，本发明方法可有效富集胰岛且确保质量；

（3）传统方法胰岛细胞收集难度大产率低，离心等方法会严重影响胰岛细胞的活性，本发明方法对胰岛细胞活性影响小，可更加集中的收集已提纯的胰岛细胞，便于对胰岛细胞进行进一步观察与处理；

（4）利用本发明的方法富集小鼠胰岛，可有效节约时间，提高操作成功率和产率，并保持胰岛细胞活性；该方法是一种更加简单快捷、廉价高效的小鼠胰岛细胞富集方法，在小鼠胰岛移植模型构建、新药实验、内分泌学基础研究等领域具有实际的应用价值，具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1为实施例1步骤（1）中富集胰岛的形态及与传统方法的对比。

图2为实施例1步骤（2）中胰岛收集于“U”形移液枪头的形态。

图3为实施例2中已富集的胰岛移植物已移植于小鼠肾包膜下的形态。

图4为实施例2中已富集的胰岛移植物的病理切片。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所用实验用品如下：

（1）实验动物：胰岛细胞供体为BALB/c小鼠，已使用胆道逆行灌注法分离胰岛组织。实验动物均购自南京大学生物研究院，饲养于中山大学附属第一医院动物实验中心

（2）实验试剂：RMPI1640培养基（gibco公司），15%胎牛血清（gibco公司），戊巴比妥钠（湖北鸿运隆生物科技有限公司）

（3）实验仪器：体视显微镜（德国蔡司公司），细胞培养箱（Thermo公司），低俗离心机（Thermo公司），小动物手术台（自制）

（4）实验材料：0.1mm网孔漏斗（Scientific公司），1.5ml Eppendorph管（Scientific公司），细胞培养皿（Scientific公司），微量移液器（eppendorf公司），微量移液器枪头（eppendorf公司），25μl Hamilton注射器（瑞士哈美顿公司），血糖试纸及指尖血糖仪（辉瑞公司），玻璃分针（自制），显微手术器械（上海医疗器械有限公司）。

实施例1 小鼠胰岛细胞富集方法

1、一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法，包括小鼠胰岛的富集及收集，步骤如下：

（1）小鼠胰岛的富集：

将已分离提取的胰岛使用含15%胎牛血清的RMPI1640在37℃的普通培养箱中培养24小时，以800RPM、4℃、1min设置离心机参数后离心，弃上清，用5ml RMPI1640重悬，用0.1mm网孔漏斗过滤重悬液；反转漏斗倒扣至装有5ml RMPI1640的培养皿中，再用5ml RMPI1640冲洗滤网。此时肉眼可见白色点状物聚集于培养皿，将培养皿沿顺时针方向以约50cm的半径、10圈每分钟的速度在桌面水平旋转培养皿使白色点状物富集。使用10倍目镜4倍物镜的体视显微镜（如图1），用200μl微量移液器收集包膜完整的胰岛组织。

（2）富集小鼠胰岛细胞的收集：

取1.5ml Eppendorph管，将一个长约5cm的长型200μl微量移液器枪头弯曲后放入管中，使其呈头端低尾端高的“U”形（图2），将整个Eppendorph管置于碎冰上。将步骤（1）中使用微量移液器分选的胰岛沿长枪头尾端以10μl/s的速度缓慢注射入长枪头，利用连通器原理使胰岛组织聚集于长枪头。每管收集约100～150个完整的胰岛组织。

2、传统的小鼠胰岛细胞富集方法，步骤如下：

（1）传统小鼠胰岛的富集方法：

将已分离提取的胰岛立即置于冰上，以800RPM、4℃、2min设置离心机参数后离心，弃上清，用5ml RMPI1640重悬，吹打均匀，以800RPM、4℃、1min设置离心机参数后再次离心清洗。弃上清，沉渣即为已富集的小鼠胰岛细胞。

（2）传统富集小鼠胰岛细胞的收集：

将步骤（1）的沉渣使用1ml RMPI1640重悬，加入1.5ml Eppendorph管中，置于冰上静置10～15分钟，待其分层，用微量移液器或小吸管小心地吸走上层清澈液体，下层含沉渣的悬浊液即收集的小鼠胰岛细胞。

3、富集胰岛的形态如图1所示。

由图1和图2的结果可知，传统方法所分离的小鼠胰岛细胞大小不一，包膜完整性差，富集度低，存在较多杂质；而本法所分离的小鼠胰岛细胞则大小较均一，包膜完整，富集度高，杂质较少。且新法收集效果直观，方便直接进行后续操作。

实施例2 富集所得小鼠胰岛细胞的使用效果举例

1、取25μl Hamilton注射器，注射器头端连接一长约15cm、直径约0.2mm透明软管，将实施例1中长枪头的胰岛组织吸至软管中，置于碎冰上备用。

进行胰岛细胞肾包膜下移植术，可见移植的小鼠胰岛均匀富集在肾包膜下（图3）。

2、术后7天，手术取出小鼠肾脏，将胰岛移植物所在部位行组织学石蜡切片及免疫组化检测，结果如图4所示，可见包膜下小鼠胰岛细胞均匀分布，胰岛素和胰高血糖素的免疫组化检测提示胰岛移植物已发挥功能。

传统方法所分离的小鼠胰岛细胞多采用门静脉注射的方法定植于受体小鼠肝脏，难以进行肉眼观察及组织学检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法，其特征在于，首先将已分离提取的胰岛培养6～48小时后，离心弃上清后用培养液重悬，过滤重悬液，滤渣即为富集的胰岛细胞；再将富集的胰岛组织注射入“U”形管，利用连通器原理使胰岛组织聚集于“U”形管。

2.根据权利要求1所述的小鼠胰岛细胞富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）胰岛细胞的富集：将已分离提取的胰岛使用含10～20%胎牛血清的RMPI1640在36℃～38℃培养6～48小时，离心弃上清，沉淀用RMPI1640重悬，以0.05～0.2mm网孔的过滤件过滤重悬液，滤渣即为富集的胰岛细胞；

（2）富集胰岛细胞的收集：用微量移液工具收集步骤（1）富集的包膜完整的胰岛组织，沿“U”形管一端以5～15μl/s的速度缓慢注射入“U”形管，利用连通器原理使胰岛组织聚集于“U”形管。

3.根据权利要求1或2所述的小鼠胰岛细胞富集方法，其特征在于，滤渣转移至装有RMPI1640的培养容器中，此时肉眼可见白色点状物聚集于培养容器，将培养容器沿顺时针方向、以20～100cm半径、5～30圈/每分钟的速度水平旋转培养容器使白色点状物富集，即得到富集的胰岛细胞。

4.根据权利要求1或2所述的小鼠胰岛细胞富集方法，其特征在于，已分离提取的胰岛使用含15%胎牛血清的RMPI1640在37℃培养24小时。

5.根据权利要求1或2所述的小鼠胰岛细胞富集方法，其特征在于，所述离心的条件是600～1200rpm、4～25℃离心1～2min。

6.根据权利要求2所述的小鼠胰岛细胞富集方法，其特征在于，所述过滤件的网孔孔径为0.1mm。

7.根据权利要求3所述的小鼠胰岛细胞富集方法，其特征在于，将培养容器沿顺时针方向以50cm半径、10圈/每分钟的速度水平旋转培养容器使白色点状物富集。

8.根据权利要求2所述的小鼠胰岛细胞富集方法，其特征在于，步骤（2）需要在4～20℃条件下操作。

9.根据权利要求1或2所述的小鼠胰岛细胞富集方法，其特征在于，所述注射入“U”形管的速度为5～10μl/s。

10.根据权利要求1或2所述的小鼠胰岛细胞富集方法，其特征在于，所述“U”形管的内直径为0.1～0.3mm。