CN108126244A - 一种组织工程支架及其制备方法以及一种可直接生物矿化的3d打印墨水 - Google Patents

一种组织工程支架及其制备方法以及一种可直接生物矿化的3d打印墨水 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种组织工程支架及其制备方法以及一种可直接生物矿化的3D打印墨水。该组织工程支架，具有高分子空心管状结构，且支架的表面均匀覆盖一层厚度可控的纳米羟基磷灰石层。该组织工程支架可广泛应用于骨组织填充和修复。并且该组织工程支架的制备方法利用了壳核共轴喷头3D打印在生物安全的条件下进行的。能够高效的制备出由空心管堆积的三维支架。该支架既具有开放的大孔结构，又具有可控的空心管结构。相比于现有的用模板法制备的直通孔的支架，本发明的组织工程支架同时具有两类孔结构，且管状取向可控。并且高分子空心管支架表面快速的矿化一层分布均匀、厚度可控的纳米羟基磷灰石层。能显著的提高细胞的粘附和增殖以及成骨分化。

Description

一种组织工程支架及其制备方法以及一种可直接生物矿化的 3D打印墨水
技术领域
本发明涉及组织工程的技术领域，具体地说，涉及一种组织工程支架及其制备方法以及一种可直接生物矿化的3D打印墨水。
背景技术
组织工程和再生医学是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。三维多孔组织修复支架，是指具有大量的一定尺寸孔隙结构和较高比表面积的多功能支架，它在组织工程中起着至关重要的作用，是目前再生医学领域的一个研究热点。
目前，组织工程多孔支架的制备方法包括：模板法、溶液浇铸/粒子沥滤法、热致相分离/冷冻干燥法、静电纺丝法、超临界流体制备法，以及新兴的3D打印技术等。但是目前大块支架对大尺寸缺损的组织修复效果依然不佳。
总之，现有的组织工程多孔支架由于工艺条件的限制、原料限制，导致所生产的组织工程多孔支架不具有较好的生物融合性，使用现有技术所制备的组织工程多孔支架的在应用中存在一定的局限性。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种可直接生物矿化的3D打印墨水，包括水凝胶；
所述水凝胶包括海藻酸钠复合物和含磷源的浓缩海藻酸钠；
所述磷源的浓度范围为0.1mol/L～1.5mol/L；
所述水凝胶中海藻酸钠的质量分数为10％～20％；
所述水凝胶中海藻酸钠复合物的质量分数为5％～20％。
在某些实施方式中，还负载有生长因子。
在某些实施方式中，所述生长因子包括骨形态发生蛋白、内皮细胞生长因子、转化生长因子、神经生长因子和成纤维细胞生长因子中的任意一种或任意几种的组合。
在某些实施方式中，所述海藻酸钠复合物包括明胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖中的任意一种或任意几种，以及海藻酸钠。
在某些实施方式中，所述海藻酸钠复合物中海藻酸钠质量百分比为20％～95％。
在某些实施方式中，所述海藻酸钠复合物包括聚乙烯醇或者明胶时，先将聚乙烯醇或者明胶于37℃～60℃溶解于磷源溶液，然后再加入海藻酸钠。
在某些实施方式中，所述磷源包括磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二氨中的任意一种或任意几种的组合。
本发明还提供了一种组织工程支架及其制备方法。
该组织工程支架的制备方法，包括将3D打印墨水利用壳核共轴打印喷头，按照预定的设计参数，进行打印，得到既有连通大孔又有开放空心管状结构的未交联的组织工程支架的过程。
在某些实施方式中，所述壳核共轴3D打印喷头为微米级打印喷头，并且该3D打印喷头的组合方式有50和100，100和200，200和400，400和600，500和800，600和1000，600和1200，800和1200，800和1500，1000和1600，1500和2200，2000和3000。
本发明提供的组织工程支架相对于现有技术而言，有益效果是：经发明人研究发现目前大块支架对大尺寸缺损的组织修复效果依然不佳，这其中最主要的原因是支架内部的血管化不足以及支架表面细胞的黏附和分化不够理想。因此，通过改进组织工程支架的内部孔结构和仿生改性支架的表面结构显得尤为重要。制备一种具有仿生的管状结构利于血管化和表面微纳米仿生结构利于细胞的黏附和分化是非常有必要的。本发明提供了一种组织工程支架，该组织工程支架具有空心管状结构；优选的，表面均匀布设有纳米羟基磷灰石层。
另外，目前对高分子组织工程支架的表面纳米羟基磷灰石改性方法主要是浸泡模拟体液。但是该方法所需的时间较长(一般几天都几周)，而且该方法得到的纳米羟基磷灰石分布不均匀且厚度很难控制。
为此，本发明中可直接生物矿化的3D打印墨水利用壳核共轴打印喷头，按照预定的设计参数，进行打印，得到既有连通大孔又有开放空心管状结构的未交联的组织工程支架。然后将该支架浸泡在钙源溶液中，得到表面覆盖一层均匀的纳米羟基磷灰石层的交联的空心管复合支架。
需要理解的是，本发明中钙源的pH值在偏碱性，浓度范围为0.05-2.5mol/L。所述钙源为氯化钙、硝酸钙、溴化钙、葡萄糖酸钙等。矿化的纳米羟基磷灰石的厚度由钙源的浓度控制。厚度的范围在50nm-30μm。
可以理解的是，该组织工程支架是一种3D打印组织修复支架，以克服现有技术的组织修复支架中血管化和细胞黏附效果不佳的问题。可广泛应用于组织工程进行骨修复或牙齿修复。
可以理解的是，该组织工程支架由本发明提供了一种可原位矿化的3D打印墨水制成。该3D打印墨水材料包括水凝胶；水凝胶包括含磷源的浓缩海藻酸钠及海藻酸钠复合物；其中，所述磷源的浓度在0.1～1.5mol/L；所述含海藻酸钠的水凝胶中海藻酸钠的质量分数为10～20％，海藻酸钠复合物的质量分数为5～20％。可以理解的是，该3D打印墨水材料配方简单、不含其他有毒辅料，成分安全。该3D打印墨水分散均匀、粘度合适，适合连续挤出成型，适用于制备具有高生物相容性的组织工程支架。
基于该结构，优选的，本发明的3D打印墨水能够非常高效的在水凝胶(海藻酸钠及海藻酸钠复合物)表面制备一层非常均匀的纳米羟基磷灰石材料，时间约为0.1h。相比于现有的浸泡模拟体液(SBF)则一般需要几天甚至几周的浸泡时间。而且浸泡SBF的方法也很难得到非常均匀的纳米羟基磷灰石的表面涂层结构。水凝胶支架的表面的一层均匀的纳米羟基磷灰石的材料有助于提高骨髓基质干细胞的粘附、增殖和成骨分化。
并且，本发明采用自制的壳核共轴打印喷头，能够直接的制备出有空心管堆积的三维支架，该支架既具有可控的大孔结构(空心管之间的空间)，又具有开放的空心管结构(形貌、大小尺寸可控)。相比于现有的用模板法制备的直通孔的支架来说，本发明的支架同时具有两类孔结构，而且管状取向可控。含有空心管结构的支架能显著的提高细胞的粘附和增殖(相比非空心管支架，最高增殖速度提高4倍)。而且新骨组织还能沿着空心管生长。
再者，本发明提供的组织工程支架的制备方法是在生物安全的条件下进行的。因此，其加载的生物因子的活性不会受到影响，通过调控海藻酸钠、以及表面矿化的纳米羟基磷灰石的厚度可以调控缓释速率，使支架可以起到长效、持久的组织修复功能。与现有技术中先制成多孔支架基体后，再滴加或浸泡载药微球的溶液相比，采用本发明的3D打印墨水所制成的组织修复支架中，加载的生物因子在支架中的负载效率较高，且负载量精确可控。
总之，本发明3D打印墨水中水凝胶支架表面的一层非常均匀的纳米羟基磷灰石(或者其他的矿物质)材料；利用壳核共轴喷头，3D打印直接快速的制备空心管结构，该支架同时具有可控大孔和空心管的结构。同时，可以非常高效(20分钟)制备出一个10×10×10mm大小的表面含有非常均匀的纳米羟基磷灰石材料、空心管状的海藻酸钠支架。需要注意的是，整个的制备过程非常温和，适合添加生物因子，利用表面纳米磷酸钙材料的厚度和水凝胶的浓度来调控生物因子的释放。
综上所述，本发明提供的组织工程支架的结构及操作方法其具有上述诸多的优点及价值，并在同类产品中未见有类似的方法公开发表或使用而确属创新，产生了好用且实用的效果，较现有的技术具有增进的多项功效，从而较为适于实用，并具有广泛的产业价值。
配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1骨髓基质干细胞在多种组织工程支架上的增殖吸光度检测情况，其中，NHM：表面有纳米羟基磷灰石层的非空心管支架；HPA：表面没有纳米羟基磷灰石层的空心管支架；HMA：表面有纳米羟基磷灰石层的空心管支架(本发明某个实施方式中公开的组织工程支架)；
图2为图1中HMA黏附和促进细胞增殖时的电镜图；
图3为本发明某一实施方式公开的组织工程支架的X射线能谱分析；
图4为本发明某一实施方式公开的组织工程支架的扫描电子显微镜照片；
图5为图4的放大图；
图6为图5的放大图。
附图标号说明：
名称 标号
开放的大孔 1
可控空心管 2
纳米羟基磷灰石层 3
高分子海藻酸钠及复合物 4
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合具体实施例及图对本发明的权利要求做进一步的详细说明，可以理解的是，以下仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
一种可直接生物矿化的3D打印墨水，包括水凝胶；
所述水凝胶包括海藻酸钠复合物和含磷源的浓缩海藻酸钠；
所述磷源的浓度范围为0.1mol/L～1.5mol/L；
所述水凝胶中海藻酸钠的质量分数为10％～20％；
所述水凝胶中海藻酸钠复合物的质量分数为5％～20％。
在本发明某些实施例中，还负载有生长因子。
上述，该组织工程支架由本发明提供了一种可原位矿化的3D打印墨水制成。该3D打印墨水材料包括水凝胶；水凝胶包括含磷源的浓缩海藻酸钠及海藻酸钠复合物；其中，所述磷源的浓度在0.1mol/L～1.5mol/L；所述含海藻酸钠的水凝胶中海藻酸钠的质量分数为10％～20％，海藻酸钠复合物的质量分数为5％～20％。可以理解的是，该3D打印墨水材料配方简单、不含其他有毒辅料，成分安全。该3D打印墨水分散均匀、粘度合适，适合连续挤出成型，适用于制备具有高生物相容性的组织工程支架。
基于该结构，优选的，本发明的3D打印墨水能够非常高效的在水凝胶(海藻酸钠及海藻酸钠复合物)表面制备一层非常均匀的纳米羟基磷灰石材料，时间约为0.1h。相比于现有的浸泡模拟体液(SBF)则一般需要几天甚至几周的浸泡时间。而且浸泡SBF的方法也很难得到非常均匀的纳米羟基磷灰石的表面涂层结构。水凝胶支架的表面的一层均匀的纳米羟基磷灰石的材料有助于提高骨髓基质干细胞的粘附、增殖和成骨分化。
在本发明某些实施例中，所述生长因子包括骨形态发生蛋白、内皮细胞生长因子、转化生长因子、神经生长因子和成纤维细胞生长因子中的任意一种或任意几种的组合。
上述，再者，本发明提供的组织工程支架的制备方法是在生物安全的条件下进行的。因此，其加载的生物因子的活性不会受到影响，通过调控海藻酸钠、以及表面矿化的纳米羟基磷灰石的厚度可以调控缓释速率，使支架可以起到长效、持久的组织修复功能。与现有技术中先制成多孔支架基体后，再滴加或浸泡载药微球的溶液相比，采用本发明的3D打印墨水所制成的组织修复支架中，载药微球在支架中的负载效率较高，几乎不存在药物突释问题。
在本发明某些实施例中，所述海藻酸钠复合物包括明胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖中的任意一种或任意几种，以及海藻酸钠。
在本发明某些实施例中，所述海藻酸钠复合物中海藻酸钠质量百分比为20％～95％。
在本发明某些实施例中，所述海藻酸钠复合物包括聚乙烯醇或者明胶时，先将聚乙烯醇或者明胶于37℃～60℃溶解于磷源溶液，然后再加入海藻酸钠。
在本发明某些实施例中，所述磷源包括磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二氨中的任意一种或任意几种的组合。。
参见图1至图7，本发明还提供了一种组织工程支架。
该种组织工程支架的制备方法包括将3D打印墨水利用壳核共轴打印喷头，按照预定的设计参数，进行打印，得到既有连通大孔又有开放空心管状结构的未交联的组织工程支架的过程。
上述，优选的，将所述3D打印浆料装入打印管除泡后，利用壳核共轴打印喷头，按照预定的设计参数，进行打印，得到既有连通大孔又有开放空心管状结构的未交联的组织工程支架的过程。
优选的，将制得的连通大孔又有开放空心管状结构的未交联的组织工程支架浸泡在钙离子溶液中，反应0.1h～5h以进行固化成型。经洗涤、冷冻干燥后得到具有缓释活性物质的组织工程支架。
优选的，壳核共轴为自制的壳核共轴。该壳核共轴3D打印喷头的形状，可以是圆形/圆形组合，也可以是方形和圆形组合，多边形和圆形组合，或者齿轮行和圆形，齿轮形和多边形组合，其中多边形包括五边形、六边形和八边形。
优选的，连通大孔又有开放空心管状结构的未交联的组织工程支架浸泡在钙离子溶液中交联后，继续进行化学交联。
可以理解的是，继续进行化学交联的方式包括将支架浸泡在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺溶液中，或者利用紫外光进行交联，提高支架的力学强度。
在本发明某些实施例中，所述壳核共轴3D打印喷头的组合方式有50和100，100和200，200和400，400和600，500和800，600和1000，600和1200，800和1200，800和1500，1000和1600，1500和2200，2000和3000。
可以理解的是，优选的，壳核共轴3D打印喷头为微米级。
可以理解的是，经发明人研究发现目前大块支架对大尺寸缺损的组织修复效果依然不佳，这其中最主要的原因是支架内部的血管化不足以及支架表面细胞的黏附和分化不够理想。因此，通过改进组织工程支架的内部孔结构和仿生改性支架的表面结构显得尤为重要。制备一种具有仿生的管状结构利于血管化和表面微纳米仿生结构利于细胞的黏附和分化是非常有必要的。本发明提供了一种组织工程支架，该组织工程支架具有空心管状结构；优选的，表面均匀布设有纳米羟基磷灰石层。
可以理解的是，该组织工程支架是一种可直接生物矿化的3D打印组织修复支架，以克服现有技术的组织修复支架中血管化和细胞黏附效果不佳的问题。可广泛应用于组织工程进行骨修复或牙齿修复。
并且，本发明采用自制的壳核共轴打印喷头，能够直接的制备出有空心管堆积的三维支架，该支架既具有可控的大孔结构(空心管之间的空间)，又具有开放的空心管结构(形貌、大小尺寸可控)。相比于现有的用模板法制备的直通孔的支架来说，本发明的支架同时具有两类孔结构，而且管状取向可控。含有空心管结构的支架能显著的提高细胞的粘附和增殖(相比非空心管支架，最高增殖速度提高4倍)。而且新骨组织还能沿着空心管生长。
总之，本发明可直接生物矿化的3D打印墨水中水凝胶支架表面的一层非常均匀的纳米羟基磷灰石(或者其他的矿物质)材料；利用壳核共轴喷头，3D打印直接快速的制备空心管结构，该支架同时具有可控大孔和空心管的结构。同时，可以非常高效(20分钟)制备出一个10×10×10mm大小的表面含有非常均匀的纳米羟基磷灰石材料、空心管状的海藻酸钠支架。需要注意的是，整个的制备过程非常温和，适合添加生物因子，利用表面纳米磷酸钙材料的厚度和水凝胶的浓度来调控生物因子的释放。
综上所述，本发明提供的组织工程支架的结构及操作方法其具有上述诸多的优点及价值，并在同类产品中未见有类似的方法公开发表或使用而确属创新，产生了好用且实用的效果，较现有的技术具有增进的多项功效，从而较为适于实用，并具有广泛的产业价值。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
发明人声明，本发明通过上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程。并且即不意味着本发明应依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种可直接生物矿化的3D打印墨水，其特征在于，包括水凝胶；
所述水凝胶包括含磷源的浓缩海藻酸钠和海藻酸钠复合物；
所述磷源的浓度范围为0.1mol/L～1.5mol/L；
所述水凝胶中海藻酸钠的质量分数为10％～20％；
所述水凝胶中海藻酸钠复合物的质量分数为5％～20％。
2.如权利要求1所述可直接生物矿化的3D打印墨水，其特征在于，还负载有生长因子。
3.如权利要求2所述可直接生物矿化的3D打印墨水，其特征在于，所述生长因子包括骨形态发生蛋白、内皮细胞生长因子、转化生长因子、神经生长因子和成纤维细胞生长因子中的任意一种或任意几种的组合。
4.如权利要求1所述可直接生物矿化的3D打印墨水，其特征在于，所述海藻酸钠复合物包括明胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖中的任意一种或任意几种，以及海藻酸钠。
5.如权利要求4所述可直接生物矿化的3D打印墨水，其特征在于，所述海藻酸钠复合物中海藻酸钠质量百分比为20％～95％。
6.如权利要求1所述可直接生物矿化的3D打印墨水，其特征在于，所述海藻酸钠复合物包括聚乙烯醇或者明胶时，先将聚乙烯醇或者明胶于37℃～60℃溶解于磷源溶液，然后再加入海藻酸钠。
7.如权利要求1所述可直接生物矿化的3D打印墨水，其特征在于，所述磷源包括磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二氨中的任意一种或任意几种的组合。
8.一种组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括将可直接生物矿化的3D打印墨水利用壳核共轴打印喷头，按照预定的设计参数，进行打印，得到既有连通大孔又有开放空心管状结构的未交联的组织工程支架的过程。
9.如权利要求1所述组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述壳核共轴3D打印喷头为微米级的打印喷头，并且该3D打印喷头的组合方式有50和100，100和200，200和400，400和600，500和800，600和1000，600和1200，800和1200，800和1500，1000和1600，1500和2200，2000和3000的组合方式。
10.一种组织工程支架，其特征在于，由权利要求8或9所述的方法制成。
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