CN112853510B - 一种基于微流控技术的内凹槽微丝的可控制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微流控技术的内凹槽微丝的可控制备方法。该方法包括微流控芯片的加工、水凝胶材料的选择、水凝胶微丝的合成及表征等。本发明利用通道出口共轴多层堆叠微流控芯片，采用共轴流出的方式，由于中心占位通道出口形貌不同，从而形成不同形貌的空腔微纤维。通过改变占位溶液芯片通道的出口形貌等，可以调节凹槽的数量、宽度和深度等。本发明可简单便捷的方式一步制备具有内凹槽的水凝胶微丝，既可包裹保护细胞又可诱导其定向排布促进分化。该方法制备的微丝在体外神经细胞、肌肉细胞等的定向诱导培养中具有很大的应用价值。

Description

一种基于微流控技术的内凹槽微丝的可控制备方法
技术领域
本发明属于微流控技术领域，具体涉及一种基于微流控技术的内凹槽微丝的简易可控制备方法。
背景技术
肌肉细胞是人体中最丰富的细胞类型。骨骼肌占整个人体体重的35％至40％，健康的骨骼肌可以完全从日常活动造成的小伤口和撕裂中再生，但是肌肉组织的大量丧失和肌肉消耗疾病不可自然修复。由此推动了肌肉组织工程的出现和发展。肌肉组织工程即从病患或供体收集肌肉细胞，通过体外培养或组织工程支架培养构建能植入病患体内的功能性肌肉组织，修复和替代缺损或病变组织，促进功能恢复的一项技术。其中水凝胶支架作为主要的生物支架材料应用于肌肉组织工程。由于人体内肌肉组织是由极性排列的肌管组成，细胞高效特异性排列。因此需要在生物支架上具有一定的凹槽结构实现对细胞的定向诱导并作为支架材料完成构建体外组织后的体内移植。
然而传统制备凹槽状微丝的方法需要用到静电纺丝或者高分子溶液溶剂快速挥发的制备方法，这些方法所能使用的高分子材料不具备水凝胶的生物相容性、保水性和营养物质良好透过的性质，具有其局限性。利用微流控湿法纺丝的方式则可以成功制备水凝胶微丝。但是，其所制备的水凝胶表面具有凹槽，细胞接种在表面，不能对细胞进行完好的保护；或者是将细胞负载在水凝胶内进行细胞培养，这不利于细胞的定向排列及细胞分化；或者负载细胞之后再次进行修饰保护细胞，这些都不利于肌肉组织的构建。本发明以简单便捷的方式一步法制备具有内凹槽的水凝胶微丝，既可包裹保护细胞又可诱导其定向排布促进分化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简易的基于微流控技术的内凹槽丝合成新方法。通过对流速和浓度等参数的简单调节，可以控制凹槽的深度和宽度等参数，从而可以用于纤维状细胞的定向诱导培养或移植。该方法包括微流控芯片的加工、水凝胶材料的选择、水凝胶微丝的合成及表征等。本发明利用通道出口共轴多层堆叠微流控芯片，采用共轴流出的方式，由于中心占位通道出口形貌不同，从而形成不同形貌的空腔微纤维。通过改变占位溶液芯片通道的出口形貌等，可以调节凹槽的数量、宽度和深度等。本发明可简单便捷的方式一步制备具有内凹槽的水凝胶微丝，既可包裹保护细胞又可诱导其定向排布促进分化。该方法制备的微丝在体外神经细胞、肌肉细胞等的定向诱导培养中具有很大的应用价值。
本发明一种基于微流控技术的内凹槽微丝的简易可控制备方法，包括下列步骤：
(1)多层微流控芯片的加工：利用常规软光刻的方法，制得多个出口形成同轴共流的多层PDMS芯片，该芯片主要由三层芯片构成；第一层鞘流入口、鞘流通道、鞘流出口；第二层：水凝胶预聚体入口、水凝胶预聚体通道、水凝胶预聚体出口；第三层：空心占位液体入口、空心占位液体通道、空心占位液体出口。
其中空心占位液体出口9，水凝胶预聚体出口6，鞘流出口3截面均为圆形或者不规则圆形，且三个通道处于共轴，直径由内而外依次增大。空心占位液体出口形状为锯齿形的圆形通道。微丝出口接入与鞘流液体相同的液体收集池中，用以进一步交联水凝胶，形成稳定的微丝。
(2)水凝胶材料的选择：本方法需要可以进行快速交联的水凝胶材料，原位固化将流体的形状保留下来。因此选用了可以用二价离子快速鳌合交联的海藻酸钠和果胶作为制备材料。选用的海藻酸钠粘度范围55-1000cps，优选240cps、浓度范围0.5-6％，优选2％；甲基纤维素浓度0.5-4％，优选1％；
(3)将配制好的海藻酸钠经过0.45μm滤膜过滤后，用注射泵通过水凝胶预聚体入口注入水凝胶预聚体通道中，将配制好的甲基纤维素经过0.45μm滤膜过滤后，用注射泵通过空心占位液体入口注入空心占位液体通道中；将氯化钙溶液通过鞘流入口注入鞘流通道；三个液体分别在空心占位液体出口9，水凝胶预聚体出口6，鞘流出口3流出，同时进行交联固化，用以制备空心微丝。在形成液体稳定层层鞘流后，快速将流体脱水固化得到水凝胶微丝；通过调节所用水凝胶预聚体的浓度及其流速，控制凹槽丝的形貌参数；
芯片空心占位液体出口9的圆形出口半径为0.5mm，通道高100μm；水凝胶预聚体出口6圆形出口半径为0.7mm，通道高100μm；鞘流出口3圆形出口半径为0.9mm，高度100μm；三层芯片出口共轴堆叠使用，如图1和图2所示；三个PDMS芯片需要将中心重叠层层组装，用氧等离子封接到一起使用。
PDMS芯片需要预先经过疏水硅烷化试剂的修饰。
内凹槽微丝其表面形貌和机械性能都将具有局部的差异，无需外界刺激可全方位包裹细胞。
所制备的内凹槽微丝可实现细胞的包裹保护及定向诱导排列促进分化，因此可以用于体外肌肉细胞等的定向诱导培养或者体内移植。
本发明有益效果：
本发明利用多层堆叠微流控芯片，通过控制预聚物溶液流出口方向直接形成了流动的截面形状，而鞘层流动又间接地控制了流动的截面形状，从而实现形貌特殊的内凹槽水凝胶微丝用于生物支架材料的构建。通过改变不同入口水凝胶预聚体的浓度和流速等，可以调节凹槽的深度和宽度等。此外，通过制备具有不同出口结构的芯片，可以对微丝的凹槽数量进行调控。该方法制备的微丝在体外肌肉细胞等的定向诱导培养中具有很大的应用价值。
附图说明
图1是多层堆叠芯片结构示意图；
其中：1代表鞘流入口；2代表鞘流通道；3代表鞘流出口；4代表水凝胶预聚体入口，5代表水凝胶预聚体通道；6代表水凝胶预聚体出口；7代表空心占位液体入口；8代表空心占位液体通道；9代表空心占位液体出口。
图2是具有不同出口形状的芯片示意图，其中：a中心占位通道为圆形的芯片设计图；b中心占位通道为花瓣形芯片设计图；c中心占位通道为锯齿形芯片设计图。
图3是实施例1中空心微丝形貌表征，其中：a明场表征图(标尺：400μm)；b SEM表征图。
图4是实施例2中内凹槽微丝形貌表征，其中：a明场表征图(标尺：400μm)；b凹槽丝截面SEM表征。
具体实施方式
在多层芯片中分别通入甲基纤维素溶液、海藻酸钠溶液及氯化钙溶液，出口浸于盛满氯化钙的收集池中，进一步进行固化，得到表面带有凹槽状结构的微丝，用于后续细胞定向诱导培养。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种基于微流控技术的空心微丝的简易可控制备方法，包括下列步骤：
(1)多层微流控芯片的加工：利用常规软光刻的方法，制得多个出口形成同轴共流的多层PDMS芯片，该芯片主要由三层芯片构成；第一层鞘流入口、鞘流通道、鞘流出口；第二层：水凝胶预聚体入口、水凝胶预聚体通道、水凝胶预聚体出口；第三层：空心占位液体入口、空心占位液体通道、空心占位液体出口。如图1所示，其中其中空心占位液体出口9，水凝胶预聚体出口6，鞘流出口3截面均为圆形或者不规则圆形，且三个通道处于共轴，由内而外依次增大。空心占位液体出口形状为锯齿形的圆形通道。微丝出口接入与鞘流液体相同的液体收集池中，用以进一步交联水凝胶，形成稳定的微丝。其中出口形貌特征为：圆形，如图2中a所示。
(2)水凝胶材料的选择：本方法需要可以进行快速交联的水凝胶材料，原位固化将流体的形状保留下来。因此选用了可以用二价离子快速鳌合交联的海藻酸钠和果胶作为制备材料。选用的海藻酸钠粘度240mPa·s，浓度2％。
(3)用注射泵通过水凝胶预聚体入口注入水凝胶预聚体通道中，将配制好的甲基纤维素经过0.45μm滤膜过滤后，用注射泵通过空心占位液体入口注入空心占位液体通道中；将氯化钙溶液通过鞘流入口注入鞘流通道；三个液体分别在空心占位液体出口9，水凝胶预聚体出口6，鞘流出口3流出，同时进行交联固化，芯片出口浸没于收集池中对微丝进行收集和进一步固化。其中流速：空心占位液体通道中的甲基纤维素流速为30μl/min；水凝胶预聚体通道中的海藻酸钠流速为100μl/min，鞘流通道中鞘流流速为1000μl/min；
(4)表征：对制备的微丝进行表面形貌表征，如图3所示。
实施例2
一种基于微流控技术的内凹槽微丝的简易可控制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1)多层微流控芯片的加工：利用常规软光刻的方法，制得多个出口形成同轴共流的多层PDMS芯片，该芯片主要由三层芯片构成；第一层鞘流入口、鞘流通道、鞘流出口；第二层：水凝胶预聚体入口、水凝胶预聚体通道、水凝胶预聚体出口；第三层：空心占位液体入口、空心占位液体通道、空心占位液体出口。其中空心占位液体出口9，水凝胶预聚体出口6，鞘流出口3截面均为圆形或者不规则圆形，且三个通道处于共轴，由内而外依次增大。空心占位液体出口形状为锯齿形的圆形通道。微丝出口接入与鞘流液体相同的液体收集池中，用以进一步交联水凝胶，形成稳定的微丝。其中出口形貌特征为：锯齿形圆环，如图2中b所示。
(2)水凝胶材料的选择：本方法需要可以进行快速交联的水凝胶材料，原位固化将流体的形状保留下来。因此选用了可以用二价离子快速鳌合交联的海藻酸钠和果胶作为制备材料。选用的海藻酸钠粘度240mPa·s，浓度2％。
(3)用注射泵通过水凝胶预聚体入口注入水凝胶预聚体通道中，将配制好的甲基纤维素经过0.45μm滤膜过滤后，用注射泵通过空心占位液体入口注入空心占位液体通道中；将氯化钙溶液通过鞘流入口注入鞘流通道；三个液体分别在空心占位液体出口9，水凝胶预聚体出口6，鞘流出口3流出，同时进行交联固化，芯片出口浸没于收集池中对微丝进行收集和进一步固化。其中流速：空心占位液体通道中的甲基纤维素流速为30μl/min；水凝胶预聚体通道中的海藻酸钠流速范围100μl/min，鞘流通道中鞘流流速范围1000μl/min；
(4)表征：对制备的微丝进行表面形貌表征，如图4所示。

Claims (5)

1.一种基于微流控技术的内凹槽微丝的可控制备方法，其特征在于：该方法利用多层微流控芯片，共轴流出的方式，通过控制中心占位通道出口的形貌从而形成不同形貌的空腔微纤维，制备出形貌特殊的水凝胶内凹槽微丝；通过改变不同入口水凝胶预聚体的浓度和流速，可以调节凹槽的深度和宽度；
多层微流控芯片具体如下：
利用常规软光刻的方法，制得多个出口形成同轴共流的多层PDMS芯片，该芯片主要由三层芯片构成；第一层芯片包括鞘流入口（1）、鞘流通道（2）和鞘流出口（3）；第二层芯片包括水凝胶预聚体入口（4）、水凝胶预聚体通道（5）和水凝胶预聚体出口（6）；第三层芯片包括空心占位液体入口（7）、空心占位液体通道（8）和空心占位液体出口（9）；
其中空心占位液体出口（9）、水凝胶预聚体出口（6）和鞘流出口（3）截面为圆形或不规则圆形，且三个通道处于共轴，由内而外依次增大；空心占位液体出口（9）形状为锯齿形的圆形通道;
水凝胶为粘度55-1000cps、浓度0.5-6%的海藻酸钠、浓度0.5-4%的甲基纤维素、浓度2%的氯化钙溶液；
水凝胶内凹槽微丝的可控制备具体如下：
将配制好的海藻酸钠经过0.45μm滤膜过滤后，用注射泵通过水凝胶预聚体入口（4）注入水凝胶预聚体通道（5）中，将配制好的甲基纤维素经过0.45μm滤膜过滤后，用注射泵通过空心占位液体入口（7）注入空心占位液体通道（8）中；将氯化钙溶液通过鞘流入口（1）注入鞘流通道（2）；三个液体分别在空心占位液体出口（9），水凝胶预聚体出口（6），鞘流出口（3）流出，同时进行交联固化，用以制备空心微丝；空心占位液体通道（8）中的甲基纤维素流速范围30μl/min；水凝胶预聚体通道（5）中的海藻酸钠流速为100μl/min，鞘流通道（2）中鞘流流速为1000μl/min；在形成液体稳定层鞘流后，快速将流体脱水固化得到水凝胶微丝；通过调节所用水凝胶预聚体的浓度及其流速，控制凹槽丝的形貌参数，得到水凝胶内凹槽微丝。
2.根据权利要求1所述基于微流控技术的内凹槽微丝的可控制备方法，其特征在于：芯片空心占位液体出口（9）的圆形出口半径为 0.5 mm，通道高100 μm；水凝胶预聚体出口（6）圆形出口半径为 0.7 mm，通道高 100 μm；鞘流出口（3）圆形出口半径为 0.9 mm，高度100μm；三层芯片出口共轴堆叠使用。
3.根据权利要求1所述基于微流控技术的内凹槽微丝的可控制备方法，其特征在于：PDMS芯片需要预先经过疏水硅烷化试剂的修饰。
4.如权利要求1-3任一项所述方法得到的内凹槽微丝，其特征在于：内凹槽微丝其表面形貌和机械性能都将具有局部的差异，无需外界刺激可全方位包裹细胞。
5.一种如权利要求4所述的内凹槽微丝的应用，其特征在于：用于体外肌肉细胞的定向诱导培养或者体内移植。
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