CN108124770A - 一种澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法 - Google Patents

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CN108124770A CN201711487088.4A CN201711487088A CN108124770A CN 108124770 A CN108124770 A CN 108124770A CN 201711487088 A CN201711487088 A CN 201711487088A CN 108124770 A CN108124770 A CN 108124770A
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Abstract

本发明公开了一种澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法。本发明以澳洲鸽石斛当年新萌发生长的嫩芽为外植体，经过类原球茎诱导培养、类原球茎增殖培养、类原球茎分化培养、生根壮苗培养和出瓶移栽，实现澳洲鸽石斛优质种苗的快速繁殖。本发明的方法具有可定时、定质、定量提供规格划一整齐一致的优质澳洲鸽石斛试管苗满足市场需求，试管苗无病虫生长健壮，种苗具有品质好、抗性强、生长迅速、便于生产管理和降低生产成本等优势。可为国内发展澳洲鸽石斛产业提供大量优质标准的种苗，对促进澳洲鸽石斛产业在我国的发展，尽早形成规模化生产，抢先进入全国花卉市场，具有积极的推动作用。

Description

一种澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物繁殖技术领域，具体涉及一种澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法。
背景技术：
澳洲鸽石斛组(Section Dendrocryne)，是兰科石斛属(Dendrobium)41个组中的一个组，约有12个原种，主要原产于澳大利亚东部、豪勋爵岛(Howe Island)和新加勒多尼亚岛(New Caledonia Island)，常见原种有Den.fleckeri、Den.gracilicaule、Den.jonesii、D en.kingianum、Den.speciosum及其各变种、Den.tetragonum及其各变种与变型。本组中的原种大多具有开花性极佳、花图锦簇、香味浓厚、非常热闹特点。早在19世纪，人们就开始利用Dendrocryne开展了杂交育种，至今已选育出许多品种，仅利用Den.kingianum作母本就选育出了58个品种(英国皇家园艺学会中数据库)，作父本选育出了103个品种。在这些新选育的品种中部分品种开花期延长了许多，使Dendrocryne的观赏性进一步加强，这使得该组的很多种类具有极大的园林园艺开发潜力和商业价值。
澳洲鸽石斛花色彩绚丽、花开热闹、花香馥郁、栽培容易且生长快速，其正常的生长温度可低至1.7℃(最低不可低于-1.7℃)。华南地区的气候条件非常适宜澳洲鸽石斛的生产。澳洲鸽石斛传统繁殖方法是分株繁殖，繁殖速度慢，周期长且种苗大小不一致，难以满足市场需求。本发明通过组织培养保持种苗的品种性状，在较短时间内繁殖出大量的种苗，种苗标准一致，出苗时间可控制，满足生产要求，是提高澳洲石斛种苗繁育效率及种苗标准化的有效途径。经文献查询，国内还没有澳洲鸽石斛组培快繁技术研究的报道，本发明可填补国内空白，为国内发展澳洲鸽石斛产业提供大量优质标准的种苗，对促进澳洲鸽石斛产业在我国的发展，尽早形成规模化生产，抢先进入全国花卉市场，具有积极的推动作用。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法。
本发明的澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法，包括以下步骤：
a、外植体的消毒：选取澳洲鸽石斛优良单株当年新萌发生长的嫩芽为外植体，去除叶片并将其切成包含芽点的小段后进行消毒处理，剥去苞叶后再进行消毒处理，得到消毒后的嫩芽；
b、类原球茎诱导培养：切取消毒后的嫩芽上带节的茎段和顶芽，接种到类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，待茎段节位和顶芽基部节位有腋芽产生、外植体基部切口膨大形成颗粒突起时转接到新的类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，获得类原球茎；
所述的类原球茎诱导培养基SB1：每升含花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁50～100mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基嘌呤5.0～8.0mg、萘乙酸0.2～2mg、蔗糖15～30g和琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；
c、类原球茎增殖培养：将获得的类原球茎转接至增殖培养基SB2，培养温度为(25± 2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，增殖培养得到的类原球茎可用于类原球茎分化培养或者继续增殖培养；
所述的增殖培养基SB2：每升含花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、肌醇80～120mg、甘氨酸 1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基嘌呤2.0～5.0mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g和琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；
d、类原球茎分化培养：将获得的类原球茎转接至分化培养基SB3，培养温度为(27± 2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，类原球茎分化形成不定芽；
所述的分化培养基SB3：每升含花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、活性炭50～100mg、肌醇 80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸 0.4～0.8mg、6-苄基嘌呤3.0～6.0mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g和琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；
e、生根壮苗培养：当类原球茎分化培养的不定芽高3～5cm时，转接至生根壮苗培养基 SR4，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，获得试管苗；
所述的生根壮苗培养基SR4：每升含花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、硫酸亚铁20～40 mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、活性炭500～1000mg、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g和琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；
f、出瓶移栽：当生根壮苗培养得到的试管苗长至5～7cm高时在自然光下炼苗，取出试管苗，洗净附着的培养基后，对试管苗根部进行消毒处理，然后移栽至种植基质中，置于阴凉通风处栽培，浇水保湿，其他按常规条件培养，由此得到澳洲鸽石斛幼苗。
步骤a所述的去除叶片并将其切成包含芽点的小段后进行消毒处理，剥去苞叶后再进行消毒处理，得到消毒后的嫩芽具体为：将外植体用干燥棉花擦拭1次，然后用体积分数75％乙醇水溶液浸泡的棉花擦拭1次，去除叶片并将其切成包含芽点的小段，然后用体积分数 75％乙醇水溶液浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量分数0.1％氯化汞溶液浸泡5-6min，无菌水冲洗3次，去除表面水分后剥去苞叶，然后用质量分数0.1％氯化汞溶液浸泡1-2min，去除表面水分后得到消毒后的嫩芽。
步骤f所述的对试管苗根部进行消毒处理具体为：将试管苗根部用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min。
优选，步骤f所述的种植基质是由发酵树皮和发酵木屑按照体积比1:1混合而成。
所述的树皮优选为阔叶林树皮。
本发明以澳洲鸽石斛当年新萌发生长的嫩芽为外植体，经过类原球茎诱导培养、类原球茎增殖培养、类原球茎分化培养、生根壮苗培养和出瓶移栽，实现澳洲鸽石斛优质种苗的快速繁殖。本发明的方法具有可定时、定质、定量提供规格划一整齐一致的优质澳洲鸽石斛试管苗满足市场需求，试管苗无病虫生长健壮，种苗具有品质好、抗性强、生长迅速、便于生产管理和降低生产成本等优势。可为国内发展澳洲鸽石斛产业提供大量优质标准的种苗，对促进澳洲鸽石斛产业在我国的发展，尽早形成规模化生产，抢先进入全国花卉市场，具有积极的推动作用。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
1.材料：澳洲石斛(Dendrobium kingianum)。
2.优良单株筛选及其外植体消毒
于种植中国科学院华南植物园温室中澳洲鸽石斛种质圃中，选取生长健壮、萌芽率高、抗逆性、抗病虫害强的具明显特性观赏价值高健康株系，选取其当年新萌发生长的嫩芽为外植体。外植体消毒方法如下：将嫩芽用干燥棉花擦拭1次，然后用体积分数75％乙醇水溶液浸泡的棉花擦拭1次，去除叶片并将其切成小段，每段包含一个芽点，然后用体积分数75％乙醇水溶液充分浸泡30s，无菌水清洗3次，再用质量分数0.1％HgCl2溶液充分浸泡6min，无菌水冲洗3次，吹干表面水分后剥去苞叶，然后用质量分数0.1％HgCl2溶液充分浸泡2min，吹干表面水分后得到消毒后的嫩芽用于后续接种。
3.类原球茎诱导培养
于无菌条件下将消毒后的嫩芽切取高1～2厘米带节的茎段和顶芽，接种到类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，45天后，茎段节位和顶芽基部节位在培养基上有腋芽产生，外植体基部切口膨大形成颗粒突起，将外植体转接至新的类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，再经过45天培养就可形成大量类原球茎。类原球茎诱导培养基SB1：每升含花宝 1号1.5g、花宝2号1.5g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na) 37.3mg、蛋白胨2g、椰子汁100mL、肌醇100mg、甘氨酸2.0mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2 mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg、烟酸0.5mg、6-苄基嘌呤5.0mg、萘乙酸(NAA)0.5mg、蔗糖20g和琼脂6g，pH 5.4。
4.类原球茎增殖培养
将获得的类原球茎转接至增殖培养基SB2，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000 lx，光照时间12h/d，在该培养基上培养45d后，类原球茎增殖倍数可达到8倍以上；经过3 代类原球茎增殖培养可获得足够的繁殖材料进行类原球茎分化培养。增殖培养基SB2：每升含花宝1号1.5g、花宝2号1.5g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)37.3mg、蛋白胨2g、土豆泥40g、肌醇100mg、甘氨酸2.0mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg、烟酸0.5mg、6-苄基嘌呤2.0mg、萘乙酸(NAA) 0.5mg、蔗糖20g和琼脂6.0g，pH 5.4。
5.类原球茎分化培养
将获得的类原球茎转接至分化培养基SB3，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000 lx，光照时间12h/d，45天后，类原球茎在培养基上分化形成高3～5厘米不定芽。分化培养基SB3：每升含花宝1号1.5g、花宝2号1.5g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)37.3mg、蛋白胨2g、土豆泥80g、活性炭100mg、肌醇100mg、甘氨酸2.0mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg、烟酸0.5mg、6-苄基嘌呤4.0mg、萘乙酸(NAA)0.25mg、蔗糖30g和琼脂6.0g，pH 5.4。
6.生根壮苗培养
将高3～5厘米的不定芽，转到生根壮苗培养基SR4，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，培养60天时，获得的试管苗苗高可达到5～7厘米，根数3～5条，生根率为100％。生根壮苗培养基SR4：每升含花宝1号1.5g、花宝2号1.5g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)37.3mg、蛋白胨2g、土豆泥 80g、活性炭1000mg、肌醇100mg、甘氨酸2.0mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg、烟酸0.5mg、萘乙酸(NAA)0.5mg、蔗糖20g和琼脂6.0g，pH 5.6。
7.出瓶移栽
将生根培养60天的试管苗在自然光下炼苗7天后出瓶。移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，然后移栽至种植基质中，种植基质是由发酵阔叶林树皮和发酵木屑(购自佛山市顺德区纤脉农资材料有限公司)按照体积比1:1混合而成，置于阴凉通风处栽培，浇水保湿，其他按常规条件培养，由此得到澳洲鸽石斛幼苗，成活率可达95％以上。30d左右成活后的植株能产生新的根系，此时可移入大棚进行正常水、肥、药管理。
实施例2：
1.材料：大明石斛线艺矮种(Dendrobium speciosum)。
2.优良单株筛选及其外植体消毒
于种植中国科学院华南植物园温室中澳洲鸽石斛种质圃中，选取生长健壮、萌芽率高、抗逆性、抗病虫害强的具明显特性观赏价值高健康株系，选取其当年新萌发生长的嫩芽为外植体。外植体消毒方法如下：将嫩芽用干燥棉花擦拭1次，然后用体积分数75％乙醇水溶液浸泡的棉花擦拭1次，去除叶片并将其切成小段，每段包含一个芽点，然后用体积分数75％乙醇水溶液充分浸泡30s，无菌水清洗3次，再用质量分数0.1％HgCl2溶液充分浸泡5min，无菌水冲洗3次，吹干表面水分后剥去苞叶，然后用质量分数0.1％HgCl2溶液充分浸泡1min，吹干表面水分后得到消毒后的嫩芽用于后续接种。
3.类原球茎诱导培养
于无菌条件下将消毒后的嫩芽切取高1～2厘米带节的茎段和顶芽，接种到类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，45天后，茎段节位和顶芽基部节位在培养基上有腋芽产生，外植体基部切口膨大形成颗粒突起，将外植体转接至新的类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，再经过45天培养就可形成大量类原球茎。类原球茎诱导培养基SB1：每升含花宝 1号1.0g、花宝2号1.5g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na) 37.3mg、蛋白胨2g、椰子汁100mL、肌醇100mg、甘氨酸2.0mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2 mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg、烟酸0.5mg、6-苄基嘌呤6.0mg、萘乙酸(NAA)0.5mg、蔗糖20g和琼脂6g，pH 5.4。
4.类原球茎增殖培养
将获得的类原球茎转接至增殖培养基SB2，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000 lx，光照时间12h/d，在该培养基上培养45d后，类原球茎增殖倍数可达到8倍以上；经过3 代类原球茎增殖培养可获得足够的繁殖材料进行类原球茎分化培养。增殖培养基SB2：每升含花宝1号1.0g、花宝2号1.5g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)37.3mg、蛋白胨2g、土豆泥40g、肌醇100mg、甘氨酸2.0mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg、烟酸0.5mg、6-苄基嘌呤3.0mg、萘乙酸(NAA) 0.5mg、蔗糖20g和琼脂6.0g，pH 5.4。
5.类原球茎分化培养
将获得的类原球茎转接至分化培养基SB3，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000 lx，光照时间12h/d，45天后，类原球茎在培养基上分化形成高3～5厘米不定芽。分化培养基SB3：每升含花宝1号1.0g、花宝2号1.5g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)37.3mg、蛋白胨2g、土豆泥80g、活性炭100mg、肌醇100mg、甘氨酸2.0mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg、烟酸0.5mg、6-苄基嘌呤4.0mg、萘乙酸(NAA)0.25mg、蔗糖30g和琼脂6.0g，pH 5.4。
6.生根壮苗培养
将高3～5厘米的不定芽，转到生根壮苗培养基SR4，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，培养60天时，获得的试管苗苗高可达到5～7厘米，根数3～5条，生根率为100％。生根壮苗培养基SR4：每升含花宝1号1.5g、花宝2号1.0g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)37.3mg、蛋白胨2g、土豆泥 80g、活性炭1000mg、肌醇100mg、甘氨酸2.0mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg、烟酸0.5mg、萘乙酸(NAA)0.5mg、蔗糖20g和琼脂6.0g，pH 5.6。
7.出瓶移栽
将生根培养60天的试管苗在自然光下炼苗7天后出瓶。移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，然后移栽至种植基质中，种植基质是由发酵阔叶林树皮和发酵木屑(购自佛山市顺德区纤脉农资材料有限公司)按照体积比1:1混合而成，置于阴凉通风处栽培，浇水保湿，其他按常规条件培养，成活率可达 95％以上。30d左右成活后的植株能产生新的根系，此时可移入大棚进行正常水、肥、药管理。
实施例3：
1.材料：大明石斛线艺矮种(Dendrobium speciosum)。
2.优良单株筛选及其外植体消毒
于种植中国科学院华南植物园温室中澳洲鸽石斛种质圃中，选取生长健壮、萌芽率高、抗逆性、抗病虫害强的具明显特性观赏价值高健康株系，选取其当年新萌发生长的嫩芽为外植体。外植体消毒方法如下：将嫩芽用干燥棉花擦拭1次，然后用体积分数75％乙醇水溶液浸泡的棉花擦拭1次，去除叶片并将其切成小段，每段包含一个芽点，然后用体积分数75％乙醇水溶液充分浸泡30s，无菌水清洗3次，再用质量分数0.1％HgCl2溶液充分浸泡5min，无菌水冲洗3次，吹干表面水分后剥去苞叶，然后用质量分数0.1％HgCl2溶液充分浸泡1min，吹干表面水分后得到消毒后的嫩芽用于后续接种。
3.类原球茎诱导培养
于无菌条件下将消毒后的嫩芽切取高1～2厘米带节的茎段和顶芽，接种到类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，45天后，茎段节位和顶芽基部节位在培养基上有腋芽产生，外植体基部切口膨大形成颗粒突起，将外植体转接至新的类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，再经过45天培养就可形成大量类原球茎。类原球茎诱导培养基SB1：每升含花宝 1号2g、花宝2号1g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)20mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)40mg、蛋白胨0.5g、椰子汁100mL、肌醇80mg、甘氨酸2.5mg、盐酸硫胺素(VB1)0.05 mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg、烟酸0.4mg、6-苄基嘌呤8.0mg、萘乙酸(NAA)0.2mg、蔗糖30g和琼脂7g，pH 5.6。
4.类原球茎增殖培养
将获得的类原球茎转接至增殖培养基SB2，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000 lx，光照时间12h/d，在该培养基上培养45d后，类原球茎增殖倍数可达到8倍以上；经过3 代类原球茎增殖培养可获得足够的繁殖材料进行类原球茎分化培养。增殖培养基SB2：每升含花宝1号2g、花宝2号1g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)20mg、乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-2Na)40mg、蛋白胨0.5g、土豆泥80g、肌醇80mg、甘氨酸2.5mg、盐酸硫胺素 (VB1)0.05mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg、烟酸0.4mg、6-苄基嘌呤5.0mg、萘乙酸(NAA) 0.2mg、蔗糖30g和琼脂7.0g，pH 5.6。
5.类原球茎分化培养
将获得的类原球茎转接至分化培养基SB3，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000 lx，光照时间12h/d，45天后，类原球茎在培养基上分化形成高3～5厘米不定芽。分化培养基SB3：每升含花宝1号2g、花宝2号2g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)20mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)40mg、蛋白胨0.5g、土豆泥80g、活性炭50mg、肌醇120mg、甘氨酸 1.5mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg、烟酸0.8mg、6-苄基嘌呤 3.0mg、萘乙酸(NAA)0.5mg、蔗糖15g和琼脂7.0g，pH 5.6。
6.生根壮苗培养
将高3～5厘米的不定芽，转到生根壮苗培养基SR4，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，培养60天时，获得的试管苗苗高可达到5～7厘米，根数3～5条。生根壮苗培养基SR4：每升含花宝1号2g、花宝2号2g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)40 mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)20mg、蛋白胨0.5g、土豆泥40g、活性炭500mg、肌醇120mg、甘氨酸1.5mg、盐酸硫胺素(VB1)0.05mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg、烟酸0.8mg、萘乙酸(NAA)0.2mg、蔗糖30g和琼脂7.0g，pH 5.6。
7.出瓶移栽
将生根培养60天的试管苗在自然光下炼苗7天后出瓶。移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，然后移栽至种植基质中，种植基质是由发酵阔叶林树皮和发酵木屑(购自佛山市顺德区纤脉农资材料有限公司)按照体积比1:1混合而成，置于阴凉通风处栽培，浇水保湿，其他按常规条件培养，成活率为96％。30d左右成活后的植株能产生新的根系，此时可移入大棚进行正常水、肥、药管理。
实施例4：
1.材料：大明石斛线艺矮种(Dendrobium speciosum)。
2.优良单株筛选及其外植体消毒
于种植中国科学院华南植物园温室中澳洲鸽石斛种质圃中，选取生长健壮、萌芽率高、抗逆性、抗病虫害强的具明显特性观赏价值高健康株系，选取其当年新萌发生长的嫩芽为外植体。外植体消毒方法如下：将嫩芽用干燥棉花擦拭1次，然后用体积分数75％乙醇水溶液浸泡的棉花擦拭1次，去除叶片并将其切成小段，每段包含一个芽点，然后用体积分数75％乙醇水溶液充分浸泡30s，无菌水清洗3次，再用质量分数0.1％HgCl2溶液充分浸泡5min，无菌水冲洗3次，吹干表面水分后剥去苞叶，然后用质量分数0.1％HgCl2溶液充分浸泡1min，吹干表面水分后得到消毒后的嫩芽用于后续接种。
3.类原球茎诱导培养
于无菌条件下将消毒后的嫩芽切取高1～2厘米带节的茎段和顶芽，接种到类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，45天后，茎段节位和顶芽基部节位在培养基上有腋芽产生，外植体基部切口膨大形成颗粒突起，将外植体转接至新的类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，再经过45天培养就可形成大量类原球茎。类原球茎诱导培养基SB1：每升含花宝 1号1.0g、花宝2号2g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)40mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)20mg、蛋白胨2g、椰子汁50mL、肌醇120mg、甘氨酸1.5mg、盐酸硫胺素(VB1)0.2 mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg、烟酸0.8mg、6-苄基嘌呤5.0mg、萘乙酸(NAA)2mg、蔗糖15g和琼脂7g，pH 5.4。
4.类原球茎增殖培养
将获得的类原球茎转接至增殖培养基SB2，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000 lx，光照时间12h/d，在该培养基上培养45d后，类原球茎增殖倍数可达到8倍以上；经过3 代类原球茎增殖培养可获得足够的繁殖材料进行类原球茎分化培养。增殖培养基SB2：每升含花宝1号2g、花宝2号2g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)40mg、乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-2Na)20mg、蛋白胨2g、土豆泥40g、肌醇120mg、甘氨酸1.5mg、盐酸硫胺素 (VB1)0.2mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg、烟酸0.8mg、6-苄基嘌呤2.0mg、萘乙酸(NAA) 0.5mg、蔗糖15g和琼脂7.0g，pH 5.4。
5.类原球茎分化培养
将获得的类原球茎转接至分化培养基SB3，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000 lx，光照时间12h/d，45天后，类原球茎在培养基上分化形成高3～5厘米不定芽。分化培养基SB3：每升含花宝1号1.0g、花宝2号1.0g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)40mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)20mg、蛋白胨2g、土豆泥40g、活性炭100mg、肌醇80mg、甘氨酸2.5mg、盐酸硫胺素(VB1)0.05mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg、烟酸0.4mg、6-苄基嘌呤6.0mg、萘乙酸(NAA)0.2mg、蔗糖30g和琼脂6.0g，pH 5.6。
6.生根壮苗培养
将高3～5厘米的不定芽，转到生根壮苗培养基SR4，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，培养60天时，获得的试管苗苗高可达到5～7厘米，根数3～5条。生根壮苗培养基SR4：每升含花宝1号1g、花宝2号2g、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)20 mg、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)40mg、蛋白胨2g、土豆泥40g、活性炭1000mg、肌醇80mg、甘氨酸2.5mg、盐酸硫胺素(VB1)0.05mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg、烟酸 0.4mg、萘乙酸(NAA)0.5mg、蔗糖15g和琼脂7.0g，pH 5.4。
7.出瓶移栽
将生根培养60天的试管苗在自然光下炼苗7天后出瓶。移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，然后移栽至种植基质中，种植基质是由发酵阔叶林树皮和发酵木屑按照体积比1:1混合而成，置于阴凉通风处栽培，浇水保湿，其他按常规条件培养，成活率为96％。30d左右成活后的植株能产生新的根系，此时可移入大棚进行正常水、肥、药管理。

Claims (5)

1.一种澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、外植体的消毒：选取澳洲鸽石斛优良单株当年新萌发生长的嫩芽为外植体，去除叶片并将其切成包含芽点的小段后进行消毒处理，剥去苞叶后再进行消毒处理，得到消毒后的嫩芽；
b、类原球茎诱导培养：切取消毒后的嫩芽上带节的茎段和顶芽，接种到类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，待茎段节位和顶芽基部节位有腋芽产生、外植体基部切口膨大形成颗粒突起时转接到新的类原球茎诱导培养基SB1，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，获得类原球茎；
所述的类原球茎诱导培养基SB1：每升含花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁50～100mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基嘌呤5.0～8.0mg、萘乙酸0.2～2mg、蔗糖15～30g和琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；
c、类原球茎增殖培养：将获得的类原球茎转接至增殖培养基SB2，培养温度为(25±2)℃，光照度1500～2000lx，光照时间12h/d，增殖培养得到的类原球茎可用于类原球茎分化培养或者继续增殖培养；
所述的增殖培养基SB2：每升含花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基嘌呤2.0～5.0mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g和琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；
d、类原球茎分化培养：将获得的类原球茎转接至分化培养基SB3，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，类原球茎分化形成不定芽；
所述的分化培养基SB3：每升含花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、活性炭50～100mg、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基嘌呤3.0～6.0mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g和琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；
e、生根壮苗培养：当类原球茎分化培养的不定芽高3～5cm时，转接至生根壮苗培养基SR4，培养温度为(27±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，获得试管苗；
所述的生根壮苗培养基SR4：每升含花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、活性炭500～1000mg、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g和琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；
f、出瓶移栽：当生根壮苗培养得到的试管苗长至5～7cm高时在自然光下炼苗，取出试管苗，洗净附着的培养基后，对试管苗根部进行消毒处理，然后移栽至种植基质中，置于阴凉通风处栽培，浇水保湿，其他按常规条件培养，由此得到澳洲鸽石斛幼苗。
2.根据权利要求1所述的澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法，其特征在于，步骤a所述的去除叶片并将其切成包含芽点的小段后进行消毒处理，剥去苞叶后再进行消毒处理，得到消毒后的嫩芽具体为：将外植体用干燥棉花擦拭1次，然后用体积分数75％乙醇水溶液浸泡的棉花擦拭1次，去除叶片并将其切成包含芽点的小段，然后用体积分数75％乙醇水溶液浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量分数0.1％氯化汞溶液浸泡5-6min，无菌水冲洗3次，去除表面水分后剥去苞叶，然后用质量分数0.1％氯化汞溶液浸泡1-2min，去除表面水分后得到消毒后的嫩芽。
3.根据权利要求1所述的澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法，其特征在于，步骤f所述的对试管苗根部进行消毒处理具体为：将试管苗根部用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min。
4.根据权利要求1所述的澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法，其特征在于，步骤f所述的种植基质是由发酵树皮和发酵木屑按照体积比1:1混合而成。
5.根据权利要求4所述的澳洲鸽石斛优质种苗无性克隆快速繁殖方法，其特征在于，所述的树皮为阔叶林树皮。
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