CN108120709A

CN108120709A - 一种用于表面增强拉曼光谱的毛细管微液滴金属球检测方法

Info

Publication number: CN108120709A
Application number: CN201711425106.6A
Authority: CN
Inventors: 刘洪林; 苏梦可; 田丽; 于烦烦
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2037-12-25
Also published as: CN108120709B

Abstract

本发明提供一种用于表面增强拉曼光谱的毛细管微液滴金属球检测方法，将贵金属纳米溶胶与密度大于水的有机溶剂相混合，然后加入待测物提取液进行剧烈震荡；贵金属纳米材料在油水界面进行快速组装，形成纳米材料间隙可调的微液滴金属球；利用毛细作用将微液滴金属球吸入毛细管内部；置于拉曼光谱仪下进行检测，即可得到待测物的SERS特征指纹信号；使用有机溶剂的特征峰作为内标对待测物的拉曼光谱信号进行校正。本发明可用于水溶性/油溶性待测物的单相或双相、单组分或多组分检测，打破了复杂样品中不同溶解性待测物检测的瓶颈，并利用组装体系中的有机相作为内标与方形毛细管的巧妙结合实现定量化检测，且制作简单、操作方便。

Description

一种用于表面增强拉曼光谱的毛细管微液滴金属球检测方法

技术领域

本发明属于灵敏检测分析领域，具体的说是涉及一种高重现性、超稳定性的用于表面增强拉曼光谱的毛细管微液滴金属球检测方法。

背景技术

表面增强拉曼光谱（SERS）是一种高灵敏的分析检测技术，由于其具备独特的振动指纹以及光谱窄线宽的特性，这种检测技术已经成功应用于复杂体系中多个分析物的检测，甚至单分子水平的检测。然而，传统的固体SERS基底存在一些局限性，使得SERS测量面临挑战，如（1）SERS信号的非均匀性：因为SERS本质上是一种近场现象，只有位于热点处的分子才能被检测到，此外热点处的场增强与分子的敏感的局部结构及其之间的耦合作用有关，这种耦合作用可以产生几个数量级的变化。因此，即使分子能均匀分布在金属表面，分子在热点中的分布仍然影响SERS信号的均匀性。（2）SERS信号的可重复性：常用检测是在纳米溶胶中加入无机盐使溶液中的纳米粒子发生团聚，产生更多的热点。但是，该团聚行为具有不可控性和随机性，导致产生的SERS信号的相对不稳定和不可重复性。解决这个问题的方法之一是使用吡啶和烷基硫醇类分子作为内部标准（IS），用于表面增强拉曼光谱的定量或半定量分析。然而，该方法也存在一些缺点，如果分子在体系中是不均匀的，它们将争夺表面的吸附位置。文献(Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 7308 –7312)中合成了一种含有活性分子的核壳结构的纳米粒子，纳米粒子中有一个中间分子层位于核心和贵金属壳之间。这个分子层作为表面增强拉曼光谱的IS起着重要作用。它可以解决上述问题，但这种核壳结构的合成过程中需要精细的专业操作，限制了其广泛应用。

目前，液液界面与表面增强拉曼光谱相结合的检测体系有望克服上述问题。这主要是因为液体体系本质上具有无损性、机械灵活性、自愈性等特性，使其具有发展成为一个快速、原位的SERS检测手段的潜力。近年来在油水界面纳米颗粒的自组装已有不少文献的相关报道，文献（Nat. Mater. 2013,12,165–171）报道了用金纳米颗粒在油水界面组装成油包水的膜，然后将油包水的膜转移在基板上进行拉曼光谱的采集。该方法操作步骤比较繁琐，不能保证膜的连续性、规整性，在激光照射下，有机溶剂易挥发，存在激光聚焦焦点易变，信号不稳定等缺点。文献（Anal. Chem. 2013, 85, 6783−6789）报道了在油水界面银纳米颗粒组装成水包油的膜，并通过1cm×1cm×4cm的比色皿进行测量。该方法并未控制在界面纳米颗粒之间的间距变化来优化电磁场增强强度，并且存在在比色皿采集信号需要的体系体积比较大，激光不容易聚焦等缺点。然而一个能够应用于现场检测的良好的SERS基底需要具备以下特征：制作简单，便于携带；操作方便；检测效果好，可定量分析；重现性、稳定性好。本发明完全符合上述要求，为现场检测开辟了新的思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有取样方便、简单，便于携带可用于现场检测的具有拉曼增强效应的检测方法。

一种用于表面增强拉曼光谱的毛细管微液滴金属球检测方法，步骤如下：

（1）将贵金属纳米溶胶与密度大于水的有机溶剂相混合，然后加入待测物提取液进行剧烈震荡；

（2）贵金属纳米溶胶中的贵金属纳米材料在油水界面进行快速组装，形成纳米材料间隙可调的微液滴金属球；

（3）利用毛细作用将微液滴金属球吸入毛细管内部；

（4）将上述吸附有微液滴金属球的毛细管置于拉曼光谱仪下进行检测，即可得到待测物的SERS特征指纹信号；

（5）使用有机溶剂的特征峰作为内标对待测物的拉曼光谱信号进行校正。

进一步方案，所述贵金属纳米溶胶是指经柠檬酸根稳定的贵金属纳米材料水溶液。

进一步方案，所述微液滴金属球中相邻贵金属纳米材料之间的间距为1-10nm。

可以通过控制有机溶剂体积、纳米颗粒数量，动态调控微液滴金属球表面的颗粒密度，从而可以将纳米颗粒间隙在1-10纳米之间定量化调控，因此可以获得最好的SERS增强效果。

进一步方案，所述有机溶剂与贵金属纳米溶胶的体积比小于1。

进一步方案，所述毛细管是指具有至少一面为平整界面的石英毛细管，且将该平整界面垂直于激发光方向放置。

进一步方案，所述贵金属纳米材料为贵金属的纳米球、纳米棒、纳米立方体、纳米片、纳米线或纳米花。

进一步方案，所述有机溶剂为邻二氯乙烷、二氯甲烷或氯仿。

进一步方案，所述有机溶剂的特征峰是指邻二氯乙烷652 cm^-1、氯仿662 cm^-1处的特征峰信号。

进一步方案，用于制备微液滴金属球的容器和毛细管需先进行亲水处理，即把容器和毛细管浸入12 M的NaOH水溶液中浸泡至少8小时，然后用水清洗至少10次，再用乙醇清洗3次，最后烘干备用。

所述微液滴金属球，是指贵金属纳米材料完全包裹住油水两相形成的水包油型、且具有金属光泽的液体金属球。这种微液滴金属球可以通过控制有机溶剂的添加量来控制其体积大小，以满足不同孔径毛细管的要求。溶剂可随存放容器形状的不同改变自身形状。

通过建立一组贵金属纳米材料的添加数量和SERS强度关系的曲线来选择合适的贵金属纳米溶胶添加量，使微液滴金属球中相邻贵金属纳米材料之间的间距动态调控在1-10纳米，并获得最大的SERS增强和最好的SERS稳定性。

本发明通过贵金属纳米材料在油水界面自组装的方法不仅有效地避免了纳米颗粒的聚集，降低背景信号的影响；而且剧烈震荡可以加速捕获和富集待测分子，实现目标分子在复杂的实际样品中的快速检测。另外，微液滴金属球具有自愈性和机械灵活性，便于携带和保存。

在贵金属纳米材料自组装过程中，微液滴金属球表面吸附的纳米材料的数量的多少会产生不同的SERS效果。这主要是因为热点的产生需要纳米材料之间的间距在一个适合的范围，当界面上纳米材料较少或者较多的时候，SERS强度都比较低。因此我们需要通过建立一组数量和SERS增强强度的关系图来获得合适的添加量。通过控制加入体系中纳米材料的数量来调节微液滴金属球表面的SERS增强效果，同时保证液态检测信号的重复性和稳定性。

利用毛细作用，将微液滴金属球吸入毛细管中，通过调节焦距于毛细管中SERS活性的位置，然后检测待测物的信号。此方法中使用的毛细管有两个优点，一是相对于先前的检测手段，所需样品量较少；二是方便调节焦距，易于检测；三是石英平面结构，使得采集的光谱杂峰少，背景干净。与现有检测技术相比，本发明的结合装置操作简单，耗时低，方法快速，无需专人培训，可实现待测物的实时定量检测，具有实际意义。

在微液滴金属球自组装过程中，油相的有机溶剂分子均匀、一致地分散在界面组装的贵金属纳米颗粒阵列间隙内，可直接作为内标进行定量化检测。在待测物分子结构与外界环境波动影响下校正拉曼信号从而实现定量化检测。

所以本发明利用油水界面不相溶的原理，将待测物溶于油相、水相或者两相之后，与贵金属溶胶剧烈振荡将贵金属纳米材料吸附于油水界面，并且通过乳浊液之间的并聚，使纳米颗粒完全覆盖在界面表面，30秒左右形成微液滴金属球。测量时利用毛细作用将微液滴金属球吸入毛细管中，并且完全不需要其他工具的辅助操作，所需样品量少，从而实现现场快速检测。由于微液滴金属球的独特特性，可用于水溶性/油溶性待测物的单相或双相、单组分或多组分检测，打破了复杂样品中不同溶解性待测物检测的瓶颈，并利用组装体系中的油相作为内标与方形毛细管的巧妙结合实现定量化检测，制作简单，操作方便，为复杂体系中分析物的准确检测开辟了新的途径。

本发明毛细管微液滴金属球检测方法可以对农药残留、环境污染物和非法添加剂等有毒有害物质进行现场快速检测。例如农药残留涕必灵和非法添加剂孔雀石绿。

本发明的科学原理分析：

1、微液滴金属球形成的依据：

纳米颗粒在液液界面的吸附行为主要受到三个因素的影响：（1）是纳米颗粒的润湿性。我们可以通过以下方式：硅烷偶联剂处用钛酸酯等偶联剂处理；物理处理，如：冷冻干燥、超声和等离子体；合成两亲性的“Janus”颗粒或复合颗粒；用表面活性剂修饰处等改变纳米颗粒的润湿性来促进纳米颗粒在界面的吸附。（2）是纳米颗粒的表面的电性质。通过无机盐的加入，屏蔽纳米颗粒表面的电荷，或者在有机相加入与纳米颗粒相反电荷的油溶性物质都可以促进纳米颗粒在界面的吸附。（3）是外力的影响。通过电场，振荡等方式可以促进纳米颗粒在界面的吸附。除此之外，纳米颗粒的大小，反应容器的浸润性等都会影响纳米颗粒在液液界面的组装。通过控制以上一个或多个条件，可以实现微液滴金属球的组装。

2、优化SERS检测结果的依据：

当纳米颗粒之间的间距较大时，不会产生SERS热点；当纳米颗粒之间的间距较近时，会产生电子隧穿效应，将会降低SERS热点的数量。因此通过控制微液滴金属球表面的纳米颗粒的数量从而控制纳米颗粒之间的间距，获得最好的SERS增强效果。

3、转移至毛细管测量装置的依据：

一是毛细管具有毛细效应，二是微型液态金属球具有机械灵活性。这样，微液滴金属球可以很方便转移至毛细管进行SERS光谱的采集。

4、定量化检测的依据：

本发明中作为油相的有机溶剂分子与待测物均匀分散在纳米颗粒周围，不会与待测物竞争与纳米颗粒结合位点，实现定量化的检测，极大程度上减小了检测误差，提高了检测效率。

附图说明

通过以下参照附图而提供的具体实施方式部分，本发明的特征和优点将会变得更加易懂，在附图中：

图1为微液滴金属球的组装示意图；

图2为在组装体系中纳米颗粒的数量和SERS强度以及效果关系图；

图3为实施例2中孔雀石绿的浓度与SERS强度的关系图及使用内标前后的线性关系；

图4为实施例3中鱼样中孔雀石绿的浓度与SERS强度的关系图及使用内标前后的线性关系；

图5是实施例4中涕必灵的浓度与SERS强度的关系图及使用内标前后的线性关系。

具体实施方式

以下结合附图和实施例详述本发明，但本发明不局限于下述实施例。

本发明中贵金属纳米溶胶是指经柠檬酸离子溶液分散的水溶液，具体的如柠檬酸钠还原银纳米颗粒的合成方法如下：90 mg的AgNO₃溶解在500 mL的蒸馏水中，沸腾后，加入10 mL质量分数为1%的柠檬酸三钠作为还原剂和稳定剂，并持续沸腾1 h后冷却至室温。

盐酸羟胺种子生长法制得柠檬酸稳定的直径为80 nm金纳米颗粒：向洗净的锥形瓶中加入1.0 mL直径为20 nm的金种子、37.4mL超纯水、0.40 mL浓度为1%的柠檬酸三钠溶液、0.40 mL浓度为100 mM/L现配盐酸羟胺溶液，并搅拌5分钟（600-800 rpm/min）。然后加入0.8 mL浓度为1%的氯金酸溶液，1小时后停止反应。通过紫外光谱和相关公式获得金纳米颗粒溶液的浓度。

柠檬酸根稳定的纳米棒的获得：将CTAB稳定的金纳米棒在质量分数为0.15 %的聚苯乙烯磺酸钠溶液中离心、重新分散并循环三次，获得聚苯乙烯磺酸钠稳定的金纳米棒。然后将2 mM的柠檬酸钠溶液加入苯乙烯磺酸钠稳定的金纳米棒溶液离心、重新分散并循环三次获得柠檬酸根稳定的金纳米棒溶胶。

用于制备微液滴金属球的容器和毛细管需先进行亲水处理，即把容器和毛细管浸入12 M的NaOH水溶液中浸泡至少8小时，然后用水清洗至少10次，再用乙醇清洗3次，最后烘干备用。

在经亲水处理后的容器中添加上述制备的贵金属纳米溶胶与有机溶剂相混合，然后加入待测物提取液进行震荡30秒之后，使贵金属纳米材料在油水界面进行快速组装，从而形成微液滴金属球；在振荡器上剧烈振荡，实现贵金属纳米材料在油水界面的快速组装，从而形成具有机械灵活性的微液滴金属球。

根据贵金属纳米颗粒的添加量优化SERS效果：在三个小瓶中分别加入30μL含有10^-6mM的结晶紫、罗丹明、孔雀石绿的邻二氯乙烷溶液、以及不同数量80nm 的金纳米颗粒。剧烈振荡后形成微液滴金属球，然后分别转移至毛细管中进行检测。选取结晶紫的拉曼特征峰1613 cm^-1、罗丹明的拉曼特征峰1636 cm^-1、孔雀石绿的拉曼特征峰1174 cm^-1作为分析依据。如图2的所示：当液液界面纳米颗粒的密度为95.2个/每平方微米，即纳米颗粒之间的间距为2-3nm时，SERS强度最高，信号最稳定。拉曼参数有：激发波长785 nm，检测波长400-1600 cm^-1，激光功率8 mW，积分时间5 s，累积次数1次。

实施例1：

如图1所示为放大示意图，金纳米颗粒和待测物分子在油水界面进行快速组装，形成纳米材料间隙可调的微液滴金属球；

（3）利用毛细作用将微液滴金属球吸入毛细管内部；

实施例2：

在亲水处理过的容器小瓶中加入30μL 含有孔雀石绿的邻二氯乙烷、0.9mL直径为80nm的金颗粒（此时SERS的增强效果最好），剧烈震荡组装成微液滴金属球。然后转移至毛细管中进行拉曼检测，孔雀石绿的浓度分别为1×10^-6 M、5×10^-7 M、1×10^-7 M、5×10^-8 M、1×10^-8M、5×10^-9 M 、1×10^-9 M和0 M，如图3所示。孔雀石绿的拉曼特征峰有：436 cm^-1、 788cm^-1、896 cm^-1、1174 cm^-1、1367 cm^-1 和 1616 cm^-1。选取1174 cm^-1处的拉曼峰作为定量依据，656 cm^-1处的邻二氯乙烷峰作为内标，结果得出未加内标时R² = 0.87753，内标处理后R²= 0.98154。拉曼参数有：显微镜物镜×20，激发波长785 nm，检测波长400-1600 cm^-1，激光功率8 mW，积分时间5 s，累积次数1次。

实施例3：

将鲫鱼鱼肉打碎并匀浆，然后加入经邻二氯乙烷溶解的孔雀石绿（MG），制成孔雀石绿浓度分别为 0 M 、2.0×10^-8 M 、5.0×10^-8 M 、1.0×10^-7 M 和2.0×10^-7 M样品。最后制备含孔雀石绿提取液，其制备过程如下：（1）取4.00±0.04g样品与1000μL的9.5g/L羟胺溶液混合以防止MG降解，提取前室温条件下反应15分钟；（2）将2.0±0.2g无水硫酸镁加入到匀浆中，剧烈涡旋1分钟；（3）将4.0±0.1g氧化铝加入到匀浆中并剧烈涡旋30秒以除去样品中的脂质；（4）取上层清液与离心管中，在15000rpm离心速率下离心10分钟。离心后将上清液转移到在50℃的氮气下干燥过的20mL试管中，加入2.0±0.1g氧化铝，涡旋30秒，然后将其悬浮液将其转移到离心管中，15000rpm下离心5分钟，取上清液。在SERS分析之前上清液通过0.45微米 PVDF过滤器过滤得提取液。

在亲水处理过的小瓶中加入30μL 上述提取液、0.9mL直径为80nm的金颗粒（此时SERS的增强效果最好），剧烈震荡组装成微液滴金属球后转移至毛细管中进行拉曼检测。如图4所示，孔雀石绿的拉曼特征峰有： 442 cm^-1、793 cm^-1、1164 cm^-1、1375 cm^-1和1612 cm^-1，选取1164 cm^-1处的拉曼峰作为定量依据，652 cm^-1处的邻二氯乙烷峰作为内标，结果得出未加内标时R² = 0.83606，内标处理后R²= 0.92902。拉曼参数有：显微镜物镜×20，激发波长785 nm，检测波长400-1600 cm^-1，激光功率8 mW，积分时间5 s，累积次数1次。

实施例4：

在经亲水处理过的容器小瓶中加入30μL 含有涕必灵（TBZ）的氯仿、1mL的金纳米棒（此时SERS的增强效果最好），剧烈震荡组装成微液滴金属球。然后转移至毛细管中进行拉曼检测，涕必灵的浓度分别为10^-3 M、10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M、10^-7M、5×10^-8 M和0 M，如图5所示。涕必灵的拉曼特征峰有：780 cm^-1、1006 cm^-1、1272 cm^-1、1540 cm^-1和1571 cm^-1。选取780cm^-1处的拉曼峰作为定量依据，662 cm^-1处的氯仿峰作为内标，结果得出未加内标时R² =0.92682，内标处理后R²= 0.99726。拉曼参数有：显微镜物镜×20，激发波长785 nm，检测波长400-1600 cm^-1，激光功率8 mW，积分时间5 s，累积次数1次。

上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。

Claims

1.一种用于表面增强拉曼光谱的毛细管微液滴金属球检测方法，其特征在于：步骤如下：

（3）利用毛细作用将微液滴金属球吸入毛细管内部；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述贵金属纳米溶胶是指经柠檬酸根稳定的贵金属纳米材料水溶液。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述微液滴金属球中相邻贵金属纳米材料之间的间距为1-10nm。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述有机溶剂与贵金属纳米溶胶的体积比小于1。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述毛细管是指具有至少一面为平整界面的石英毛细管，且将该平整界面垂直于激发光方向放置。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述贵金属纳米材料为贵金属的纳米球、纳米棒、纳米立方体、纳米片、纳米线或纳米花。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述有机溶剂为邻二氯乙烷、二氯甲烷或氯仿。

8.根据权利要求1 所述的检测方法，其特征在于：所述有机溶剂的特征峰是指邻二氯乙烷652 cm^-1、氯仿662 cm^-1处的特征峰信号。

9.根据权利要求1 所述的检测方法，其特征在于：用于制备微液滴金属球的容器和毛细管需先进行亲水处理，即把容器和毛细管浸入12 M的NaOH水溶液中浸泡至少8小时，然后用水清洗至少10次，再用乙醇清洗3次，最后烘干备用。