CN108117557A - 一种马钱子碱的提取分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马钱子碱的提取分离纯化方法，属于药物技术领域。该方法包括但不限于：取马钱子破碎成粗粉，乙醇提取，合并提取液，过滤，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，得马钱子总碱提取浓缩液；将马钱子总碱提取浓缩液酸化，加有机溶剂萃取除杂，萃余液碱化，加有机溶剂萃取，得萃取液；萃取液上硅胶层析柱，洗脱，收集洗脱液马钱子碱段，合并，浓缩，干燥，通过重结晶法纯化即可得到纯度95%以上的马钱子碱。

Description

一种马钱子碱的提取分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种中药有效成分的提取方法，特别是涉及一种从中药马钱子中提取马钱子碱的方法，属于药物技术领域。

背景技术

马钱子又名番木鳖，始载于《本草纲目》，味苦，寒性，有大毒，归肝，脾经，功效为通络止痛，散结消肿。临床上用于风湿顽痹，麻木瘫痪，跌打损伤，痈疽肿痛，小儿麻痹后遗症，类风湿性关节炎等疾病；但具有剧毒的特性严重影响其在临床上的应用，所谓“毒药猛剂善起沉疴”。马钱子的治疗量为0.3-0.6g,过量易出现中毒，如何合理安全使用马钱子，成为近年的研究热点之一。

研究表明，总生物碱是马钱子中最主要的有效部位，包括马钱子碱、士的宁、番木鳖次碱、马钱子新碱、番木鳖甙、依卡精等，其中的主要生物碱成分中马钱子碱具有抗炎、镇痛作用，士的宁则是中枢神经兴奋剂，主要在临床上治疗面瘫，神经麻痹等，同时也是主要的毒性成分，基本无抗炎、镇痛作用；文献报道小鼠灌服士的宁、马钱子碱、马钱子仁的LD50分别为3.27 mg/kg、233 mg/kg和234.5 mg/kg；小鼠腹腔注射上述药物的LD50分别为1.53mg/kg、69.77 mg/kg和76 mg/kg，其口服中毒剂量成人为5～10mg,口服致死量为30 mg。表明士的宁是马钱子中的主要毒性成分。有文献报道，分别用士的宁和马钱子碱给小鼠灌胃，两者的LD₅₀分别为3.27mg/kg和233mg/kg，由此可以得知士的宁的安全性很低，如果能除去马钱子总生物碱中的部分士的宁，则既能降低其毒性，又能保留其原有的抗炎镇痛的药理活性，提高临床用药的安全性。因此，现代研究中需要一种能降低士的宁含量的马钱子总碱的提取方法。有文献报道，分别用士的宁和马钱子碱给小鼠灌胃，两者的LD₅₀分别为3.27mg/kg和233mg/kg，由此可以得知士的宁的安全性很低，如果能除去马钱子总碱中的部分士的宁，则既能降低其毒性，又能保留其原有的抗炎镇痛的药理活性，提高临床用药的安全性。因此，现代研究中需要一种提高马钱子碱纯度的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全性高、成本低、收率高的马钱子碱的提取分离纯化方法，主要是利用马钱子碱的特性及马钱子碱和士的宁的不同性质来提取分离纯化。

本发明是通过以下技术方案实现的：

（1）提取：取马钱子破碎成粗粉，加5-12倍量30-95%乙醇回流提取1-3次，每次0.5-2h，合并提取液，滤过，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，即得马钱子总碱提取浓缩液；

（2）萃取：取步骤（1）中得到的马钱子总碱提取浓缩液，调至浓度为0.1-5g药材量/ml，酸化（酸化所用酸为盐酸、硫酸、磷酸中的一种），酸化后的酸浓度为0.1-10%，加0.5-4倍量有机溶剂（有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、正丁醇中的一种）萃取1-4次，去除杂质，萃余液碱化（碱化所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙中的一种），碱化后pH值为9-13，加0.5-4倍量有机溶剂（有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、正丁醇中的一种）萃取1-4次，即得萃取液；

（3）纯化：取步骤（2）中得到的萃取液，上硅胶层析柱，洗脱（洗脱所用洗脱溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种或几种，洗脱溶剂含水量的体积百分率为0-10%，用量为5-40倍量的硅胶层析柱的柱体积），收集洗脱液马钱子碱段，合并洗脱液，减压浓缩至适量，干燥，通过重结晶法纯化即可得到马钱子碱。

该技术方案优选为：

（1）提取：取马钱子破碎成粗粉，加10倍量50%乙醇回流提取2次，每次1.5h，合并提取液，滤过，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，浓缩至适量，即得马钱子总碱提取浓缩液；

（2）萃取：取步骤（1）中得到的马钱子总碱提取浓缩液，调至浓度为0.5g药材量/ml，酸化，酸化后的酸浓度为1%，加1倍量有机溶剂萃取1次，去除杂质，萃余液碱化，碱化后pH值约为11，加1倍量有机溶剂萃取2次，即得萃取液；

（3）纯化：取步骤（2）中得到的萃取液，上硅胶层析柱，洗脱，收集洗脱液马钱子碱段，合并洗脱液，减压浓缩至适量，干燥，通过重结晶法纯化即可得到马钱子碱。

以上技术方案的重结晶法为酸水溶解-碱水析出法与有机溶剂结晶法两种方法重复交替使用。

其中，酸水溶解-碱水析出法的酸水为盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液、柠檬酸溶液中的一种；碱水为氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、稀氨水溶液中的一种；有机溶剂重结晶法的有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇中的一种。

通过以上方法制得马钱子总碱中的马钱子碱纯度≥95%。

本发明药物的活性成分可以加入药剂学上可接受的辅料按常规工艺制备成所需制剂。如可以制成常用的片剂（分散片、泡腾片、口腔崩解片、含片、咀嚼片、泡腾片）、胶囊剂（硬胶囊、软胶囊剂）、颗粒剂、丸剂（滴丸剂）、散剂等固体制剂形式的口服药物，也可以制成糖浆、口服液等液体制剂形式的口服药物；还可以制成膏剂、凝胶剂、软膏剂、巴布剂、贴膏剂、搽剂、洗剂、涂膜剂等外用制剂形式的外用药物。因此，该药物组合物中除有效成分外，还可以含有药学上可以接受的辅料。

这里所述的辅料，可以根据不同的制剂有所不同，如在片剂、胶囊剂、颗粒剂等固体制剂中常用的稀释剂、崩解剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、填充剂等；在糖浆、口服液等液体制剂形式中常用的表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂、助流剂等；在凝胶剂、软膏剂等外用制剂形式中常用的药用油性基质、水性基质、防腐剂、抗氧剂、保湿剂、透皮吸收促进剂、表面活性剂等。

其常用辅料如淀粉、乳糖、糊精、糖粉、微晶纤维素、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙、改良淀粉、山梨醇、聚乙烯吡咯酮、重质碳酸镁、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲淀粉钠、羟丙基纤维素、聚维酮K30、白陶土、预胶化淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、甜叶菊苷、甜菜碱、阿司帕坦、甘草甜素、糖精钠、枸橼酸、碳酸氢钠、碳酸钠、卡拉胶、琼脂、明胶、海藻酸钠、黄原胶、瓜耳豆胶、西黄耆胶、阿拉伯胶、槐豆胶、刺梧桐胶、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、聚丙烯酰胺、交联型聚丙烯酸钠、聚乙烯醇、卡波姆、山梨酸、山梨酸钾、羟苯乙酯、苯甲醇、尼泊金、硫柳汞、二甲基亚砜、氮酮、三乙醇胺、氢氧化钠、甘油、丙二醇、BHT、BHA、十二烷基硫酸钠、吐温类、司盘类等。

马钱子为马钱科植物马钱（Strychnos nux-vomica L.）的干燥成熟种子经炮制所得制马钱子，具有通络止痛、消肿散结的功效，临床用于治疗风湿顽痹、麻木瘫痪、跌打损伤和痈疽肿痛等疾病。马钱子主要活性成分为总生物碱，其中生物碱成分中马钱子碱具有较好的抗炎镇痛的药理活性，是马钱子的主要有效成分，而另一含量较高的士的宁是强毒性成分，同时为无效成分，所以在提取过程中需要提高马钱子碱的含量，降低士的宁的含量。

本发明与申请号为201110294731.8、201110300527.2、201110297528.6、201110408433.7的四个发明技术方案不同之处在于，通过优化萃取方法，制得高纯度的马钱子碱，且该纯化使用过的硅胶柱可以多次重复使用，大大降低了生产成本。本发明具体纯化方法是指在进行硅胶柱层析之前,采用先酸化后碱化的萃取工艺，去除马钱子总碱提取浓缩液中50-70%的杂质，降低纯化工艺中进入硅胶柱内的杂质，使纯化使用后的硅胶柱易于清洗，清洗后的硅胶柱可以多次重复使用。

为了全面考察影响萃取效果的因素，对萃取方法中影响萃取效果的主要因素进行了考察，优选萃取条件，确定萃取工艺的最佳条件。

实验例1：提取工艺研究

1.1乙醇浓度的考察

根据提取工艺的试验设计，对提取溶剂即不同浓度的乙醇进行优选。试验中设计了分别以30%、50%、70%、95%的乙醇作为提取溶液，以提取物中马钱子碱和士的宁的转移率为考察指标，对不同的提取溶剂进行考察。具体实验方法如下：

取马钱子破碎粉3份，每份10g，分别加入8倍量的不同的提取溶剂，对药材进行回流提取，每次1h，提取2次，将提取液分别滤过，滤液于60℃减压浓缩。然后放入干燥器中，冷却，准确称重，并测定马钱子碱和士的宁的含量，结果见表1：

表1 不同浓度乙醇提取马钱子总生物碱的实验结果

乙醇浓度（%）	马钱子碱提取率（%）	士的宁提取率（%）
			30	70.58	74.25
50	80.39	82.17
			70	80.76	82.28
95	81.07	82.68

由表1可知，采用50%以上乙醇溶液提取，均能得到较高含量和转移率的马钱子碱和士的宁，但综合考虑溶剂成本，优选用50%乙醇提取。

1.2提取方法的选择

优选以50%乙醇为提取溶剂，进行提取方式（渗漉法，回流法、搅拌法）的选择。以提取液中马钱子碱和士的宁的提取率为考察指标，对三种提取方法进行筛选。具体实验方法如下：

A、渗漉法：准确称取马钱子粉20.0g，用50%乙醇20ml充分湿润，浸泡24小时后，再用50%乙醇渗漉至流出液用碘化铋钾试液进行显色反应检测不出总碱为止，收集渗漉液，测定其中马钱子碱和士的宁的含量，结果见表2。

B、回流法：准确称取马钱子粉20.0g，用200ml 50%乙醇加热回流提取2次，每次1小时，合并药液过滤测定其中马钱子碱和士的宁的含量，结果见表2。

C、搅拌法：准确称取马钱子粉20.0g，用200ml 50%乙醇搅拌提取2次，每次1小时，合并药液过滤测定其中马钱子碱和士的宁的含量，结果见表2：

表2 不同提取方法的考察结果

方法	马钱子碱提取率（%）	士的宁提取率（%）
			渗漉法	65.37	74.51
回流法	81.47	85.48
			搅拌法	63.72	75.81

由表2可知，三种方法都能较好的提取出马钱子碱和士的宁，其中回流法提取率最高，提取方法优选回流提取法。

1.3提取时间的考察：

取马钱子粗粉4份，每份20g，分别加入8倍量的50%乙醇回流提取2次，分别提取0.5h、1h、1.5h、2h,将提取液分别滤过，取样稀释后进行测定，并将测定结果进行比较，结果见表3：

表3 提取时间考察

提取时间(h)	马钱子碱提取率（%）	士的宁提取率（%）
			0.5	58.72	66.58
1	80.58	85.83
			1.5	83.62	87.78
2	84.22	88.18

由表3可知，0.5-2h均能较大程度的提取得到马钱子碱和士的宁，综合考虑，优选提取时间为1.5h。

1.4提取次数的考察：

取马钱子粗粉3份，每份20g，分别加入8倍量的50%乙醇回流提取1.5h，分别提取1次，2次，3次，将提取液滤过，取样稀释后进行测定，并将测定结果进行比较，结果见表4：

表4 提取次数考察

提取次数	马钱子碱转移率（%）	士的宁转移率（%）
			1	58.23	57.31
2	83.10	87.43
			3	83.73	88.78

由表4可知，1-3次均能较大程度的提取得到马钱子碱和士的宁，综合考虑，优选提取次数为2次。

1.5提取溶剂用量考察：

实验方法：取马钱子粗粉4份，每份20g，分别加入5BV、8BV、10BV、12BV的50%乙醇回流提取2次，每次1.5h，将提取液分别滤过，取样稀释后进行测定，并将测定结果进行比较，结果见表5：

表5 提取体积考察

提取体积Bv	马钱子碱转移率（%）	士的宁转移率（%）
			5	71.67	77.31
8	83.77	85.24
			10	88.63	90.54
12	88.81	91.26

由表5可知，提取体积为5-12倍量均能较大程度的提取得到马钱子碱和士的宁，综合考虑，优选提取体积为10倍量50%乙醇提取。

实验例2：萃取工艺研究

2.1 酸化萃取除杂效果研究

取制马钱子粉16kg，加50%乙醇10倍量，回流提取三次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩为64L（浓度0.25g生药量/mL，相对密度1.07）。浓缩液测定含量后备用。

2.1.1浓缩程度不同的提取液对除杂效果的影响

取浓缩液5份，每份400mL，分别减压浓缩或稀释至浓度为0.1g生药量/mL，0.5g生药量/mL、1g生药量/mL、3g生药量/mL、5g生药量/mL，分别以盐酸调pH值至1～2的溶液，过滤，滤液分别加入等量的乙酸乙酯，萃取一次，取萃余水相，减压浓缩，干燥，称重，取样测定，结果见表6：

表6 浓缩程度不同的提取液对除杂效果的影响

由表6可知，不同浓度的制马钱子碱提取液的除杂效果不同，制马钱子提取液浓度为0.1g药材量/mL和0.5g药材量/mL时，除杂效果显著，综合考虑马钱子碱成分损失率及除杂效果，优选制马钱子提取液浓缩至0.5g生药量/mL时进行萃取除杂。

2.1.2萃取除杂有机溶剂的考察

取浓缩液6份，每份400mL，调至含酸量为1%，滤过，滤液分别加入等量不同的有机溶剂萃取1次，搅匀，静置分层，取萃取后水相，减压浓缩，干燥，称重，取样测定，结果见表7：

表7 不同有机溶剂萃取除杂考察结果

由表7可知，不同有机溶剂萃取除杂效果不同，其中正丁醇、甲苯、三氯甲烷、乙酸乙酯、二氯甲烷除杂效果均较好，综合考虑马钱子碱损失率及除杂效果，优选乙酸乙酯进行萃取除杂。

2.1.3萃取除杂加酸量考察

取浓缩液6份，每份400mL，加入盐酸调为不同浓度，滤过，滤液分别加入等量的乙酸乙酯萃取1次，搅匀，静置分层，取萃取后水相，减压浓缩，干燥，称重，取样测定，结果见表8：

表8 萃取除杂调酸浓度考察结果

由表8可知，不同酸浓度萃取除杂效果不同，酸浓度从0.1%到10%均可，考虑到酸浓度太高对提取设备的要求会提高，故优选1%的酸浓度。

2.1.4 萃取除杂的次数考察

取浓缩液4份，每份400mL，调至含酸量为1%，滤过，滤液分别加入等量的乙酸乙酯，分别萃取1次、2次、3次、4次。取萃取后水相，减压浓缩，干燥，称重，取样测定，结果见9：

表9 萃取除杂次数考察结果

由表9可知，使用乙酸乙酯进行萃取时，不同的萃取次数对水层中马钱子碱的量几乎无影响，考虑节省萃取时间因素，优选萃取次数为1次。

2.1.5 萃取除杂有机溶剂用量的考察

取浓缩液4份，每份400mL，调至含酸量为1%，滤过，滤液分别加入乙酸乙酯0.5倍量、1倍量、2倍量、4倍量。取萃取后水相，减压浓缩，干燥，称重，取样测定，结果见表10：

表10 萃取除杂有机溶剂用量考察结果

由表10可知，0.5-4倍量有机溶剂均有除杂效果，有机溶剂为1倍量、2倍量、3倍量时，除杂效果无显著差异，综合考虑到有机溶剂用量和除杂效果，优选为有机溶剂用量为1倍量进行除杂。

2.2碱化萃取除杂效果研究

经过酸化马钱子总碱提取液除杂，除去脂溶性成分后，再进一步去除提取液中的水溶性成分杂质。

利用马钱子碱及士的宁在碱性条件下变成游离态，易溶于有机溶剂，不溶于水的特性。将已经除去脂溶性杂质的酸性水相，调节pH至碱性，使马钱子生物碱由成盐状态转变成游离状态，再采用萃取法，使马钱子总碱与水溶性成分分离，除去杂质。我们对萃取工艺参数进行了优化。

2.2.1萃取除杂有机溶剂的考察

取浓缩液6份，每份400mL，按既定酸化除杂工艺处理后，将水层调至pH为9-13，滤过，滤液分别加入等量有机溶剂萃取3次，搅匀，静置分层，取萃取后有机相，减压浓缩，干燥，称重，取样测定，结果见表11：

表11 萃取溶剂种类考察结果

由表11可知，不同有机溶剂萃取除杂效果不同，其中乙酸乙酯的除杂效果显著，优选乙酸乙酯进行萃取除杂。

2.2.2萃取除杂加碱量的考察

取浓缩液6份，每份400mL，按既定酸化除杂工艺处理后，将水层调至pH为不同pH，滤过，滤液分别加入等量有机溶剂萃取3次，搅匀，静置分层，取萃取后有机相，减压浓缩，干燥，称重，取样测定，结果见表12：

表12 萃取调碱pH考察结果

由表12可知，不同pH萃取效果不同，其中pH为8时萃取效果不好，主要因为未达到碱化效果，导致生物碱转化不完全；在pH为11附近时萃出物含量最高，故优选pH为11。

2.2.3萃取除杂的次数考察

取浓缩液4份，每份400mL，按既定酸化除杂工艺处理后，将水层调至pH为9-13，滤过，滤液分别加入等量乙酸乙酯，分别萃取1次、2次、3次、4次，搅匀，静置分层，取萃取后有机相，减压浓缩，干燥，称重，取样测定，结果见表13：

表13 萃取次数考察结果

由表13可知，使用乙酸乙酯进行萃取时，不同的萃取次数对水层中马钱子碱萃取量无显著差别，考虑节省萃取时间因素，优选萃取次数为2次。

2.2.4 萃取除杂有机溶剂用量考察

取浓缩液4份，每份400mL，按既定酸化除杂工艺处理后，将水层调至pH为9-13，滤过，滤液分别加入等量有机溶剂萃取2次，搅匀，静置分层，取萃取后有机相，减压浓缩，干燥，称重，取样测定，结果见表14：

表14 萃取除杂溶剂用量考察结果

由表14可知，0.5-4倍量有机溶剂均有除杂效果，有机溶剂为0.5倍量和1倍量时，除杂效果显著，综合考虑马钱子碱损失率及除杂效果，优选为有机溶剂用量为1倍量进行除杂。

实验例3：纯化工艺研究

3.1洗脱溶剂及洗脱体积的考察

根据纯化工艺的试验设计，对洗脱溶剂进行优选。试验中设计了分别以甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇作为洗脱溶液，以洗脱物中马钱子碱量为考察指标，对不同的溶剂进行考察。具体实验方法如下：

取马钱子乙酸乙酯萃取液4份，每份折合生药20g，分别通过硅胶柱，每一个柱体积为一个流分，待检测到马钱子碱流出，开始收集洗脱液，至马钱子碱浓度基本稳定。浓缩收集液，干燥，测定马钱子碱含量。结果见表15：

表15 不同溶剂洗脱马钱子碱的实验结果

溶剂种类	马钱子碱含量（%）	马钱子碱出现点	洗脱体积
				甲醇	71.58	第3BV	5BV
乙醇	83.39	第7BV	20BV
				丙酮	77.43	第5BV	15BV
异丙醇	86.22	第15BV	40BV

表15表明，采用以上各溶剂均能提高马钱子碱含量，但综合洗脱体积和纯度，优选使用乙醇洗脱，洗脱体积为20BV。

3.2洗脱液含水量的考察

根据纯化工艺的试验设计，对洗脱液含水量进行优选。试验中设计了分别使用90%乙醇，乙醇（95%），无水乙醇洗脱，以洗脱物中马钱子碱的含量为考察指标，对不同的溶剂进行考察。具体实验方法如下：

取马钱子乙酸乙酯萃取液3份，每份折合生药20g，分别通过硅胶柱，每一个柱体积为一个流分，待检测到马钱子碱流出，开始收集洗脱液，至马钱子碱浓度基本稳定。浓缩收集液，干燥，测定马钱子碱含量。结果见表16：

表16 不同浓度乙醇洗脱马钱子碱的实验结果

溶剂浓度	马钱子碱含量（%）	马钱子碱出现点
			90%乙醇	80.58	第8BV
95%乙醇	84.19	第7BV
			无水乙醇	85.76	第6BV

表16表明，采用以上各不同浓度乙醇均能提高马钱子碱含量，但综合洗脱体积和纯度，优选使用乙醇（95%）洗脱。

实验例4：柱层析硅胶柱重复使用工艺研究

由于增加了调酸除杂工艺，使硅胶柱上样液杂质大大减少，从而可以保证硅胶柱可以重复使用，对硅胶柱重复使用效果进行了考察。结果见表17：

表17 柱层析硅胶柱使用次数考察

使用次数	马钱子碱含量（%）
		5	85.61%
10	84.83%
		15	83.96%
20	81.25%
		25	78.90%

由表17可知，柱层析硅胶柱重复使用次数为20次或20次以内时，得到的产物中马钱子碱含量在80%以上，重复使用超过20次时，马钱子碱含量下降，优选柱层析硅胶柱重复使用次数为20次。

以下对上述方法制得的马钱子碱进行鉴定和含量测定。

一、马钱子碱单体的结构鉴定

将本发明中制备的马钱子碱单体与法定的马钱子碱对照品进行对比鉴定，证明两者完全是相同的化合物即可：

1、样品及来源：

马钱子碱对照品：购于中国药品生物制品检定所；

马钱子碱供试品：由上述技术方案制备得到；

2、结构确证项目：

（1）采用熔点测定仪、热重（TGA）或差热分析(DSC)，确定本发明中马钱子碱的熔点及熔程；

（2）用红外吸收光谱（溴化钾压片法），分析其特征功能团，为确证结构提供依据；

（3）采用粉晶X-射线衍射谱确定其晶型；

（4）用高分辩率质谱，确定其分子量；

（5）采用核磁共振氢谱、碳谱(200MHz以上高分辨, 1H-NMR、13C-NMR、H-Hcosy、HMBC、HSQC等)，确定其C、H、O、N等原子数量及立体结构；

利用上述信息，综合解析，确定本品为马钱子碱。

二、马钱子碱单体的鉴别

1、薄层层析鉴别：参照《中国药典》马钱子项下，取马钱子碱供试品溶于氯仿制成2mg/ml供试液，另取马钱子碱对照品，制成同等浓度的对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液(4:5:0.6:0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2、红外光谱：马钱子碱供试品的红外光谱图与马钱子碱对照品一致。

三、马钱子碱的含量测定

1、测定方法

以中国药品生物制品检定所的马钱子碱为标准对照品，建立马钱子碱的HPLC-DAD检测方法，并采用LC-MS方法验证峰纯度，采用标准曲线法测量马钱子碱的含量。

2、测定结果

表18 马钱子碱的含量测定

由表18可知，通过不同的制备方法得到的马钱子碱的纯度均在95%以上，有的甚至达到马钱子碱纯度98%以上的单体。

由以上试验结果可见，本发明的技术方案可以显著提高产品的质量（收率和纯度），降低成本，提高安全性和生产可行性，达到了本发明的目的。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

取马钱子1000g，破碎成粗粉，加12倍量30%乙醇加热回流2次，每次0.5h，合并提取液，滤过，减压浓缩回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至浓度为0.4g药材量/ml，加盐酸调至含酸量2%，加3倍量乙酸乙酯萃取2次，取萃余液，加氢氧化钠溶液调pH至10，加2倍量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，上硅胶柱，乙醇洗脱，收集第7-30柱体积段，合并洗脱液，减压浓缩回收溶剂，减压干燥，粉碎，取粉末加6倍量1%盐酸溶解，过滤，滤液加碳酸氢钠溶液调pH至9.5，静置析晶后过滤，将晶体溶于3倍量乙醇中，冷藏12h，过滤，得到湿晶，减压干燥，即得马钱子碱。

经测定，所得马钱子碱纯度为97.6%。

实施例2

取马钱子1000g，破碎成粗粉，加10倍量50%乙醇加热回流2次，每次1.5h，合并提取液，滤过，减压浓缩回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至浓度为0.5g药材量/ml，加盐酸调至含酸量1%，加1倍量三氯甲烷萃取1次，取萃余液，加氢氧化钠溶液调pH至11，加1倍量三氯甲烷萃取2次，合并萃取液，上硅胶柱，甲醇洗脱，收集第5-20柱体积段，减压浓缩，回收溶剂，减压干燥，粉碎，取粉末加10倍量0.5%盐酸溶解，过滤，滤液加氢氧化钠溶液调pH至9.5，静置析晶后过滤，将晶体溶于5倍量三氯甲烷中，冷藏16h，过滤，得到湿晶，减压干燥，即得马钱子碱。

经测定，所得马钱子碱纯度为98.5%。

实施例3

取马钱子1000g，破碎成粗粉，加8倍量60%乙醇加热回流3次，每次2h，合并提取液，滤过，减压浓缩回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至浓度为1g药材量/ml，加硫酸调至含酸量0.5%，加4倍量三氯甲烷萃取3次，取萃余液，加氢氧化钾溶液调pH至9，加4倍量三氯甲烷萃取4次，合并萃取液，上硅胶柱，甲醇与丙酮（1:1）混合洗脱，收集第11-35柱体积段，减压浓缩，回收溶剂，减压干燥，粉碎，取粉末加20倍量0.3%硫酸溶解，过滤，滤液加氢氧化钾溶液调pH至10.6，静置析晶后过滤，将晶体溶于7倍量丙酮中，冷藏16h，过滤，得到湿晶，减压干燥，即得马钱子碱。

经测定，所得马钱子碱纯度为99.2%。

实施例4

取马钱子1000g，破碎成粗粉，加6倍量70%乙醇加热回流1次，每次1h，合并提取液，滤过，减压浓缩回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至浓度为5g药材量/ml，加硫酸调至含酸量0.1%，加2倍量正丁醇萃取4次，取萃余液，加氢氧化钾钙溶液调pH至12，加0.5倍量正丁醇萃取1次，合并萃取液，上硅胶柱，异丙醇洗脱，收集第15-30柱体积段，减压浓缩，回收溶剂，减压干燥，粉碎，取粉末加10倍量1.5%磷酸溶解，过滤，滤液加氢氧化钙溶液调pH至8.6，静置析晶后过滤，将晶体溶于10倍量乙酸乙酯中，冷藏16h，过滤，得到湿晶，减压干燥，即得马钱子碱。

经测定，所得马钱子碱纯度为97.4%。

实施例5

取马钱子1000g，破碎成粗粉，加5倍量80%乙醇加热回流2次，每次1.5h，合并提取液，滤过，减压浓缩回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至浓度为3g药材量/ml，加硫酸调至含酸量5%，加0.5倍量二氯甲烷萃取4次，取萃余液，加氢氧化钠溶液调pH至13，加3倍量二氯甲烷萃取2次，合并萃取液，上硅胶柱，丙酮洗脱，收集第7-19柱体积段，减压浓缩，回收溶剂，减压干燥，粉碎，取粉末加15倍量1.0%盐酸溶解，过滤，滤液加稀氨水溶液调pH至9，静置析晶后过滤，取将晶体溶于20倍量二氯甲烷中，冷藏16h，过滤，得到湿晶，减压干燥，即得马钱子碱。

经测定，所得马钱子碱纯度为99.2%。

实施例6

取马钱子1000g，破碎成粗粉，加11倍量90%乙醇加热回流3次，每次1h，合并提取液，滤过，减压浓缩回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至浓度为0.1g药材量/ml，加磷酸调至含酸量10%，加2倍量甲苯萃取2次，取萃余液，加氢氧化钠溶液调pH至10，加2倍量甲苯萃取3次，合并萃取液，上硅胶柱，甲醇洗脱，收集第9-21柱体积段，减压浓缩，回收溶剂，减压干燥，粉碎，取粉末加12倍量0.8%柠檬酸溶解，过滤，滤液加碳酸钠溶液调pH至9.8，静置析晶后过滤，将晶体溶于15倍量异丙醇中，冷藏16h，过滤，得到湿晶，减压干燥，即得马钱子碱。

经测定，所得马钱子碱纯度为99.0%。

实施例7

取马钱子1000g，破碎成粗粉，加9倍量95%乙醇加热回流2次，每次1.5h，合并提取液，滤过，减压浓缩回收乙醇至无醇味，滤液浓缩至浓度为02g药材量/ml，加盐酸调至含酸量7 %，加1倍量乙酸乙酯萃取1次，取萃余液，加氢氧化钾溶液调pH至11，加1倍量乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，上硅胶柱，乙醇洗脱，收集第9-21柱体积段，减压浓缩，回收溶剂，减压干燥，粉碎，取粉末加12倍量0.8%盐酸溶解，过滤，滤液加氢氧化钾溶液调pH至9.8，静置析晶后过滤，将晶体溶于15倍量甲醇中，冷藏16h，过滤，得到湿晶，减压干燥，即得马钱子碱。

经测定，所得马钱子碱纯度为98.9%。

实施例8

取实施例1制备得到的马钱子碱适量，加入凝胶基质、保湿剂、防腐剂，搅拌使溶解，放置，使充分溶胀，加溶剂调至全量，搅拌均匀，制成凝胶，即得凝胶剂。

实施例9

取马钱子碱适量，加入微晶纤维素、硬脂酸镁、微粉硅胶、阿司帕坦，混合均匀，制粒，压片，即得片剂。

实施例10

取马钱子碱适量，加入微晶纤维素、淀粉、甘露醇，以乙醇制粒，干燥，整粒，即得颗粒剂。

实施例11

取马钱子碱适量，与聚丙烯酸（NP-700）、氢氧化铝、氮酮加入甘油中搅拌均匀，再加入0.1%酒石酸水溶液，研磨均匀，涂于弹力布上，盖衬，分切，即得贴膏剂。

实施例12

取马钱子碱适量，与混悬剂、调味剂、防腐剂混匀，加水定容，滤过，分装，即得口服液体制剂。

实施例13

取马钱子碱适量，加入糊精，混匀，制粒，干燥，装胶囊，即得胶囊剂。

实施例14

取马钱子碱适量，加入辅料，混匀，制粒，干燥，制成丸剂。

Claims (11)

1.一种马钱子碱的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取：取马钱子破碎成粗粉，加5-12倍量30-95%乙醇回流提取1-3次，每次0.5-2h，合并提取液，滤过，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，即得马钱子总碱提取浓缩液；

（2）萃取：取步骤（1）中得到的马钱子总碱提取浓缩液，调至浓度为0.1-5g药材量/ml，酸化，酸化后的酸浓度为0.1-10%，加0.5-4倍量有机溶剂萃取1-4次，去除杂质，萃余液碱化，碱化后pH值为9-13，加0.5-4倍量有机溶剂萃取1-4次，即得萃取液；

（3）纯化：取步骤（2）中得到的萃取液，上硅胶层析柱，洗脱，收集洗脱液马钱子碱段，合并洗脱液，减压浓缩至适量，干燥，通过重结晶法纯化即可得到马钱子碱。

2.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取：取马钱子破碎成粗粉，加10倍量50%乙醇回流提取2次，每次1.5h，合并提取液，滤过，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，浓缩至适量，即得马钱子总碱提取浓缩液；

（2）萃取：取步骤（1）中得到的马钱子总碱提取浓缩液，调至浓度为0.5g药材量/ml，酸化，酸化后的酸浓度为1%，加1倍量有机溶剂萃取1次，去除杂质，萃余液碱化，碱化后pH值约为11，加1倍量有机溶剂萃取2次，即得萃取液；

（3）纯化：取步骤（2）中得到的萃取液，上硅胶层析柱，洗脱，收集洗脱液马钱子碱段，合并洗脱液，减压浓缩至适量，干燥，通过重结晶法纯化即可得到马钱子碱。

3.根据权利要求1或2所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤（2）中酸化所用酸为盐酸、硫酸、磷酸中的一种；碱化所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙中的一种；有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、正丁醇中的一种。

4.根据权利要求1或2所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）中洗脱所用洗脱溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的提取分离纯化方法，其特征在于，所述的洗脱溶剂含水量的体积百分率为0-10%。

6.根据权利要求4所述的提取分离纯化方法，其特征在于，所述的洗脱溶剂用量为5-40倍量的硅胶层析柱的柱体积。

7.根据权利要求1或2所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）中的硅胶层析柱可反复多次使用。

8.根据权利要求1或2所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）中的重结晶法为酸水溶解-碱水析出法与有机溶剂结晶法两种方法重复交替使用。

9.根据权利要求8所述的提取分离纯化方法，其特征在于，所述的酸水为盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液、柠檬酸溶液中的一种；所述的碱水为氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、稀氨水溶液中的一种；所述的有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇中的一种。

10.权利要求1或2所述的提取分离纯化方法，其特征在于，制得的马钱子碱纯度≥95%。

11.权利要求1或2所述的一种马钱子碱的提取分离纯化方法，其特征在于，将所制得的马钱子碱加入适量辅料按常规工艺制成药剂学上可接受的制剂。