CN108096585A - 天青地白提取物作为基因治疗增敏剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了天青地白提取物在制备基因治疗增敏剂中的应用，本发明首次发现天青地白提取物可以上调肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26的表达水平，促进缝隙连接通讯的功能，从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用；本发明进一步通过构建人黑色素瘤自杀基因稳定细胞株验证了天青地白提取物对人黑色素瘤自杀基因治疗具有协同增效作用，可以作为基因治疗的增敏剂。而且，天青地白提取物本身具有一定的抗肿瘤作用，其与增强了的基因治疗作用相叠加，可以最大程度的发挥抗肿瘤作用。

Description

天青地白提取物作为基因治疗增敏剂的应用

技术领域

本发明涉及基因治疗技术领域，具体涉及天青地白提取物作为基因治疗增敏剂的应用。

背景技术

恶性肿瘤是目前导致人类死亡的主要原因之一，随着细胞生物学和分子生物学的发展，基因治疗在恶性肿瘤的临床治疗中发挥着越来越重要的作用，特别是肿瘤自杀基因治疗已成为继传统治疗手段(如手术治疗、化疗、放疗等)之后最具希望挑战治疗肿瘤的措施。

所谓自杀基因治疗，是指将自杀基因(某些病毒或细菌的基因)导入靶细胞中，通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，其表达的酶可以催化无毒的前体药物转化为细胞毒物质，从而导致携带该基因的细胞自动死亡。

自杀基因治疗不仅对导入自杀基因的肿瘤细胞具有直接杀伤作用，而且还具有旁杀伤效应。所谓旁杀伤效应是指导入了自杀基因与未导入自杀基因的肿瘤细胞按一定比例混合培养，加入前体药物后，不仅可以直接杀伤导入自杀基因的肿瘤细胞，还可以导致其邻近未导入自杀基因的肿瘤细胞也被杀死。

目前，自杀基因治疗已广泛应用于肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的临床治疗，其中，单纯疱疹病毒1型胸苷激酶/更昔洛韦(HSV1-tk/GCV)系统已经开展III期临床相关试验研究。但多年试验和临床研究结果表明，对恶性肿瘤的基因治疗效果并没有达到人们当初的期望，仍有许多技术难题尚待解决，如基因不够靶向性、基因转染效率低、基因缺乏转染后的表达调控、基因杀伤效应低等问题，还有部分肿瘤消退后出现复发；此外，病毒载体的使用具有毒副作用，难以保证安全性。因此，如何有效提高基因治疗的疗效、减少其毒副作用是目前亟待解决的问题。

天青地白(Gnaphalium japonicum Thunb.)是菊科鼠曲草属植物日本鼠曲草的全草，又名细叶鼠曲草、清明草等，性味甘、凉，无毒，归肺、肝、脾经。具有解表、清热、明目、利尿的功能，可用于治疗感冒、咳嗽、头痛、喉痛、目赤翳障、小便热闭、淋浊、白带、疔疮等。现代药理学研究表明，天青地白具有抗炎、治疗腹泻、痈肿等功效。有研究发现，将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因疗法联合，有可能会提高肿瘤自杀基因的疗效。但至今尚无天青地白及其提取物作为基因治疗增敏剂的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供天青地白提取物作为基因治疗增敏剂的应用。本发明首次研究发现，天青地白提取物可以上调肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26的表达水平，促进缝隙连接通讯的功能，从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用；而且，天青地白提取物本身具有一定的抗肿瘤作用，其与增强了的基因治疗作用相叠加，可以最大程度的发挥抗肿瘤作用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

天青地白提取物在制备基因治疗增敏剂中的应用。

上述应用中，所述的基因治疗是以慢病毒为载体的自杀基因治疗。优选的，以pLV-tk作为慢病毒载体。

上述应用中，所述的基因治疗是对黑色素瘤的自杀基因治疗。

上述应用中，所述天青地白提取物可以通过本领域技术人员熟知的方法提取得到，例如，取天青地白适量，以适宜的溶媒浸泡，以适宜的提取方法提取，过滤得到澄清液体，任选经过纯化步骤，制成优选含生药浓度1-500mg/ml，更优选为10-200mg/ml的溶液；也可挥干溶媒制成干粉形式。

作为优选的实施方式，所述适宜溶媒主要为水(包括蒸馏水、去离子水等)或有机溶剂(优选醇类和酯类溶剂，醇类溶剂包括乙醇和多元醇等，酯类溶剂包括乙酸乙酯等)；适宜的提取方法选自以下一种或几种：浸提、煎煮、回流和超临界；适宜的纯化方法选自以下一种或几种：醇沉、萃取、膜分离和柱层析。

生药浓度按照如下方法计算：

提取前粉碎的药物重量(干重)为Wg，加入适宜溶剂提取，得到最终提取液经体积定量为Kml，提取物的生药浓度为：W/K(g/ml)＝1000W/K(mg/ml)。

最优选的，所述天青地白提取物由如下方法制备而成：

将天青地白干燥、粉碎，加入8-12重量倍的水，加热至80-100℃，保温浸提2-4h，提取1-2次，过滤，弃去滤渣，合并滤液；滤液浓缩至相对密度为1.1-1.2(50℃测)，向浓缩后的滤液中加入95％乙醇，使乙醇终浓度为50-60％，静置过夜，过滤，滤液采用膜分离的方法分离出分子量在5000-15000之间的有效部位群，浓缩干燥，即得天青地白提取物。

本发明的有益效果：

目前，天青地白已报道的药理作用及功效主要为：解表、清热、明目、利尿，用于治疗感冒、咳嗽、头痛、喉痛、目赤翳障、小便热闭、淋浊、白带、疔疮等。但是，经本发明人研究意外的发现，天青地白提取物可以上调肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26的表达水平，促进缝隙连接通讯的功能，从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用；本发明进一步通过构建人黑色素瘤自杀基因稳定细胞株(A375-tk/GFP)，验证了天青地白提取物对人黑色素瘤自杀基因治疗具有协同增效作用，可以作为基因治疗的增敏剂。而且，天青地白提取物本身具有一定的抗肿瘤作用，其与增强了的基因治疗作用相叠加，可以最大程度的发挥抗肿瘤作用。

附图说明

图1：不同提取物对Cx43、Cx26表达情况的Western Blot检测结果；其中，1：天青地白提取物处理对Cx43、Cx26表达情况的影响；2：提取物A处理对Cx43、Cx26表达情况的影响；3：提取物B处理对Cx43、Cx26表达情况的影响；4：提取物C处理对Cx43、Cx26表达情况的影响；5：提取物D处理对Cx43、Cx26表达情况的影响。

图2：pLV-tk-GFP感染A375细胞后荧光显微镜观察结果。

图3：A375-tk/GFP活性检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明实施例和试验例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

术语说明：

有效部位，是指从单一植物、动物、矿物等物质中提取的一类或数类成份组成的有效部位，其含量应占提取物的50％以上。

实施例1：

将天青地白干燥、粉碎，加入10重量倍的水，加热至100℃，保温浸提3h，提取2次，过滤，弃去滤渣，合并滤液；滤液浓缩至相对密度为1.1-1.2(50℃测)，向浓缩后的滤液中加入95％乙醇，使乙醇终浓度为60％，静置过夜，过滤，滤液采用膜分离的方法分离出分子量在5000-15000之间的有效部位群，浓缩干燥，即得天青地白提取物。

对比例1：

将天青地白干燥、粉碎，加入10重量倍的水，加热至100℃，保温浸提3h，提取2次，过滤，弃去滤渣，合并滤液；滤液浓缩，干燥，得提取物A。

对比例2：

将天青地白干燥、粉碎，加入10重量倍的无水乙醇，回流提取3h，过滤，滤液浓缩，干燥，得提取物B。

对比例3：

将“天青地白”替换为同属植物“佛耳草(Gnaphalium offine)”，按实施例1的方法进行提取，得提取物C。

对比例4：

将“天青地白”替换为“紫花地丁”，按实施例1的方法进行提取，得提取物D。

试验例1：不同提取物对人皮肤黑色素瘤细胞株生长的影响

1.试验材料：

人皮肤黑色素瘤细胞株(A375)，实施例1制备的天青地白提取物，对比例1-4制备的提取物A-提取物D。

2.试验方法：

将A375按3×10³个/孔接种到96孔板，待细胞贴壁生长后，加入终浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μg/ml的提取物，作用72h后镜下观察细胞的变化；以未加入提取物作为对照。用MTT法检测各组细胞的吸光度(D值)，按如下公式计算各组细胞抑制率：抑制率(％)＝[1-(D_测定孔/D_对照)]×100％。

3.试验结果：

不同提取物对人皮肤黑色素瘤细胞株生长的影响结果见表1。

表1：不同提取物对人皮肤黑色素瘤细胞株生长的影响

试验例2：不同提取物对Cx43、Cx26表达的影响

1.试验材料：

人皮肤黑色素瘤细胞株(A375)，实施例1制备的天青地白提取物，对比例1-4制备的提取物A-提取物D。

2.试验方法：

采用Western Blot检测不同提取物对Cx43、Cx26表达的影响，将A375细胞按2×10⁶个/孔细胞接种于6孔板，加入终浓度为0.8μg/ml的提取物处理细胞48h后，裂解提取蛋白，经SDS-PAGE电泳分离后转印。将转印好的PVDF膜封闭后依次加入相应一抗和二抗，膜放发光液中孵育后用影响工作站对图像进行扫描和分析，具体操作如下：

(一)提取蛋白：

①吸弃上清，每孔加入4℃预冷PBS洗涤细胞2次，然后按每1×10⁴个细胞加入1μL含蛋白酶抑制剂(PMSF)的细胞裂解液(1000:1，即PMSF1μL+RAPI 1mL)，于冰上裂解20min。

②然后用干净的细胞刮刀刮落细胞，用移液器将裂解液及细胞碎片转移至1.5mLEP管中，4℃、12000r/min、离心10min。

③收集上清液，转移至1.5mL EP管中，-20℃保存，即为总蛋白提取液。

④测定所提蛋白含量(按蛋白定量试剂盒说明书操作)，计算上样体积。上样前，按每孔加入等质量蛋白样品，含1×上样缓冲液，将样品置于100℃沸水中煮5min使蛋白变性。(二)SDS-PAGE电泳：

①制胶与上样：将干净的玻璃板对齐用橡胶条密封后垂直卡在电泳槽上，向两玻璃板间加12％分离胶至一定的高度(红色线中间)，然后在胶上加一层去离子水液封，室温放置30min；弃上层水并用滤纸吸干；添加4％浓缩胶并插入梳子，胶凝30min；待到浓缩胶凝固后，拔出梳子，将其放入电泳槽中加足够的电泳液，赶走凝胶板下面的气泡后上样。

②电泳：设置恒压200V，电泳约45-60min，buffer电泳到凝胶底部时，停止电泳。

(三)转膜：

①电泳完毕后，剪裁与胶样相同大小的滤纸和PVDF膜，将PVDF膜标记后，浸泡于无水甲醇溶液中约1min。把凝胶、滤纸、纤维垫浸泡于转移缓冲液里。

②按从负极到正极的顺序将纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、纤维垫依次叠合，赶走每层间的气泡，固定于装有预冷转移缓冲液的转膜槽中，以100V恒压转膜60-90min。

③从装置上取下PVDF膜，进行封闭及免疫反应。

(四)免疫反应：

①加5％牛奶封闭液，室温下摇床上缓慢摇动，封闭1h，以TBST洗膜10min。

②分别加入用抗体稀释液1:500稀释的一抗(兔抗鼠Cx26多克隆抗体和兔抗鼠Cx43多克隆抗体，美国Abclonal公司)，4℃摇床上缓慢摇动孵育过夜。

③用TBST洗膜3次，每次10min。

④分别加入用抗体稀释液1:5000稀释的二抗(HRP标记的山羊抗兔二抗)，室温孵育1h。

⑤用TBST洗膜3次，每次10min。

(五)曝光：

提前5min取出发光液复温，暗室用7mL ECL配发光液(5mL A+27μL 3％H₂O₂)，剧烈混匀1min，把膜置于发光液(美国Millipore公司)中4min，用滤纸吸干放入影像工作站曝光盒内，根据目的蛋白信号强弱选择曝光时间，扫描图像。

3.试验结果：

Western Blot检测Cx43、Cx26表达的情况如图1所示，由图1可以看出，采用本发明实施例1制备的天青地白提取物处理A375细胞48h后，可以显著促进缝隙连接蛋白Cx43和Cx26的表达，从而促进缝隙连接通讯的功能。

试验例3：不同提取物对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用

1.人黑色素瘤自杀基因稳定细胞株(A375-tk/GFP)的构建

参照现有技术的方法(“木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究”，黄暨生)构建人黑色素瘤自杀基因稳定细胞株(A375-tk/GFP)，具体如下：

(1)重组慢病毒载体pLV-tk-GFP的构建：

1)根据人tk基因cDNA全序列(GenBank：JX392980.1)设计引物，以人胚肾细胞HEK293为模板，合成目的基因tk片段；

Primer1：5，-ATATCTTGTGGAAAGGACG-3，；

Primer2：5，-CTGCATTCTAGTTGTGGTT-3，。

PCR反应体系(25μL)如下：

10×buffer Tango 2.5μL，MgCl₂ 1.5μL，dNTP mixture 0.5μL，Primer1 0.5μL，Primer20.5μL，Taq DNA polymerase 1μL，Template 2μL，ddH₂O 16.5μL。

PCR反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸80s，共进行30个循环后，72℃再延伸10min。

扩增得到的基因片段两端含有BamH I和EcoR I的酶切位点。

2)双酶切空载体CD511B(质粒CD511B长度为7544bp，含人EF1启动子和GFP基因，带有氨苄原核抗性基因、嘌呤霉素筛选标记以及BamH I和EcoR I的酶切位点，为常规的市售质粒)和tkPCR扩增产物，30μL的酶切体系如下：

10×buffer Tango 3μL，BamHI 1μL，EcoRI 1μL，质粒(CD511B-1149bp)2.5μL，ddH₂O22.5μL。

37℃恒温酶切6h，酶切产物电泳，切胶回收。

将酶切后的目的基因tk片段与载体混合，加入T4DNA连接酶，16℃连接过夜。将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α。将转化后的大肠杆菌菌液50μL加入5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min振摇过夜，并进行质粒抽提。将抽提的质粒用BamHI或EcoR I酶切，观察所得的特异片段，筛选阳性克隆，即构建得到重组慢病毒载体pLV-tk-GFP。

(2)重组慢病毒的包装与感染

将HEK293T细胞用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液置于37℃、5％(体积分数)CO₂的培养箱中培养。转染前1h，更换4mL的opti-MEM培养基，参照Lipofectamine^TM2000转染试剂说明书，将构建好的重组慢病毒载体pLV-tk-GFP转染HEK293T细胞，转染6-8h后换10mL新鲜培养基，加入新鲜培养基，培养48h后收集病毒液，离心，取上清液，置于-80℃低温冰箱中保存。

(3)A375细胞感染及稳定表达株的筛选

将A375细胞用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液置于37℃、5％(体积分数)CO₂的培养箱中培养。当细胞达到80-90％的汇合率时，消化细胞并计数，将细胞悬液稀释为5×10⁵/mL，吸取1mL细胞悬液到EP管中，再加入2μL polybrene，混匀；加入1mL步骤(2)制备的病毒液上清，充分混匀后接种到培养皿。24h后更换含有0.5μg/mL嘌呤霉素筛选培养液(即在含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液中添加嘌呤霉素，使嘌呤霉素的浓度为0.5μg/mL)，48-72h后置于荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达。

pLV-tk-GFP感染A375细胞48h后，在荧光显微镜下能观察到绝大部分细胞能被激发出绿色荧光(图2)，说明转染率接近100％。GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强。用0.5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周，最终获得稳定表达株，即为A375-tk/GFP。

(4)A375-tk/GFP活性检测

将A375和A375-tk/GFP按3000个/孔细胞接种到96孔板，待细胞贴壁生长后加入GCV，换含终浓度分别为0、6.25、25、100μmol/L的GCV培养液，GCV作用72h后镜下观察细胞的变化。用MTT法检测各组细胞的吸光度(D值)，按公式：P细胞存活率(％)＝(D测定孔/D对照组)，计算各组细胞的存活率，比较A375细胞和A375-tk/GFP细胞对GCV的敏感性。

结果显示(图3)，A375-tk/GFP组对6.25μmol/L的GCV的敏感性已显著高于A375组；GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用，而对未感染重组慢病毒的A375细胞无明显的细胞毒作用。

2.不同提取物对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用

为考察不同提取物与tk/GCV系统联合作用的影响，选择了旁观者效应较低而且单独作用抑制率较低的5μmol/LGCV和20％A375-tk/GFP细胞混合比例，以及对肿瘤细胞杀伤程度较轻的提取物浓度(0.4μg/ml)进行试验，具体如下：

将A375-tk/GFP细胞和A375细胞按1:4比例混合，按3000个/孔细胞接种到96孔板。将混合细胞分为空白组、tk/GCV组、天青地白提取物组、提取物A组、提取物B组、提取物C组、提取物D组、天青地白提取物联合tk/GCV组、提取物A联合tk/GCV组、提取物B联合tk/GCV组、提取物C联合tk/GCV组和提取物D联合tk/GCV组，其中：

空白组：不向混合细胞中加入GCV和提取物；

tk/GCV组：向混合细胞中加入GCV，使GCV的终浓度为5μmol/L；

天青地白提取物组：向混合细胞中加入天青地白提取物，使天青地白提取物的终浓度为0.4μg/ml；

提取物A组：向混合细胞中加入提取物A(对比例1制备得到)，使提取物A的终浓度为0.4μg/ml；

提取物B组：向混合细胞中加入提取物B(对比例2制备得到)，使提取物B的终浓度为0.4μg/ml；

提取物C组：向混合细胞中加入提取物C(对比例3制备得到)，使提取物C的终浓度为0.4μg/ml；

提取物D组：向混合细胞中加入提取物D(对比例4制备得到)，使提取物D的终浓度为0.4μg/ml；

天青地白提取物联合tk/GCV组：向混合细胞中加入GCV和天青地白提取物，使GCV的终浓度为5μmol/L，天青地白提取物的终浓度为0.4μg/ml；

提取物A联合tk/GCV组：向混合细胞中加入GCV和提取物A，使GCV的终浓度为5μmol/L，提取物A的终浓度为0.4μg/ml；

提取物B联合tk/GCV组：向混合细胞中加入GCV和提取物B，使GCV的终浓度为5μmol/L，提取物B的终浓度为0.4μg/ml；

提取物C联合tk/GCV组：向混合细胞中加入GCV和提取物C，使GCV的终浓度为5μmol/L，提取物C的终浓度为0.4μg/ml；

提取物D联合tk/GCV组：向混合细胞中加入GCV和提取物D，使GCV的终浓度为5μmol/L，提取物D的终浓度为0.4μg/ml。

各组作用72h后镜下观察细胞的变化，用MTT法检测各组细胞的吸光度(D值)，按公式：抑制率(％)＝[1-(D_测定孔/D_对照)]×100％，计算各组细胞抑制率，并进行协同性分析比较各药物组旁杀效应的大小。

协同性分析采用金正均Q值法，公式如下(式中，分子代表实测联合药效，分母代表理论联合药效)：Q＝E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)；EA、EB为单独用药药效。

Q<0.85为拮抗作用；0.85≤Q≤1.15为相加作用；Q≥1.15为协同作用。

不同提取物与tk/GCV系统联合作用的影响结果见表2。

表2：不同提取物与tk/GCV系统联合作用的影响

由表2可以看出，天青地白提取物联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度的单药组(天青地白提取物组)和单纯tk/GCV组高，说明天青地白提取物联合tk/GCV系统能显著提高A375-tk/GFP和A375混合细胞对GVC的敏感性。

另外，天青地白提取物联合tk/GCV组的Q值达2.57，说明天青地白提取物具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。与提取物A联合tk/GCV组以及提取物B联合tk/GCV组相比，采用本发明提取方法制备的天青地白提取物的协同增效作用更为显著，说明不同提取方法制备的天青地白提取物其对tk/GCV系统杀伤效应的协同增效作用存在差异。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (5)

1.天青地白提取物在制备基因治疗增敏剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因治疗是以慢病毒为载体的自杀基因治疗。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，以pLV-tk作为慢病毒载体。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因治疗是对黑色素瘤的自杀基因治疗。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述天青地白提取物由如下方法制备而成：

将天青地白干燥、粉碎，加入8-12重量倍的水，加热至80-100℃，保温浸提2-4h，提取1-2次，过滤，弃去滤渣，合并滤液；滤液浓缩至相对密度为1.1-1.2(50℃测)，向浓缩后的滤液中加入95％乙醇，使乙醇终浓度为50-60％，静置过夜，过滤，滤液采用膜分离的方法分离出分子量在5000-15000之间的有效部位群，浓缩干燥，即得天青地白提取物。