CN108085298A - 一种mdck-mdr1的药物吸收筛选体系及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种MDCK‑MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法，针对MDCK细胞中犬P‑gp基因设计出了sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体；将人源MDR1基因转染至MDCK‑KO细胞中，筛选扩大阳性单克隆；蛋白免疫印迹法检测p‑gp蛋白表达，成功表达者即表示MDCK‑MDR1的药物吸收筛选体系构建成功。本发明基于工程技术敲除MDCK细胞中犬P‑gp蛋白的基因，以背景完全“干净”的MDCK细胞作为宿主细胞构建稳定表达人源p‑gp蛋白的MDCK‑MDR1细胞系，从而完善MDCK‑MDR1作为血脑屏障药吸收、转运筛选模型的功能。

Description

一种MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种基因敲除MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法。
背景技术
转运体所介导的外源性化合物及其代谢产物的外排是一种非常重要的细胞保护机制，在各种屏障及排泄组织的功能中起到关键的作用。例如肠粘膜、血脑屏障、血睾丸屏障以及肾近端小管和肝脏。几种ATP依赖的(ATP-Binding Cassette,ABC)转运体超家族包括：多药耐药蛋白(MDR1/P-glycoprotein)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)及几种多药耐药联合蛋白家族(MRP)在这些屏障组织中都有高表达，它们在药物体内分布中的重要作用不容争议。
单层膜上皮细胞模型经常被用于研究ABC外排转运体在药物分布中的作用，其中一个常用的细胞系是MDCK。
MDCK细胞系为马丁达比犬肾上皮细胞发展的一种细胞间连接非常紧密的细胞系，低水平表达转运蛋白，低代谢活性。MDCK细胞是在遗传学方面及细胞的脂质、蛋白质组成方面最为理想的上皮细胞系。可用于肾小管上皮细胞的形态和功能的研究，同时其许多生理特性均与血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)相似，常用于体外药物透过BBB的筛选模型。在研究主动吸收药物的渗透性方面，Caco-2和MDCK之间有很好的相关性，因此用MDCK细胞代替Caco-2细胞作为肠道模型。早在1988年，Pastan等用人类的mdr1基因稳定转染MDCK细胞建立了一个能大量表达P-gp的细胞系。MDCK-MDR1细胞的优点就是培养周期短，可达到代与代间的均一性，获得人P-gp的高表达。细胞表达产生的P-gp主要是位于细胞膜的顶侧。因此，可利用MDCK-MDR1细胞作为肠道黏膜和BBB药物透过的快速筛选模型。
然而，利用MDCK-MDR1细胞作为BBB的模型时也存在一些不足，MDCK分泌较少的犬P-gp，也会影响实验的可靠性。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，包括以下步骤：
(1)、针对MDCK细胞中犬P-gp基因设计出了sgRNA，用于靶点基因敲除；
(2)、以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体；
(3)、在对数生长期的MDCK-WT细胞中，加入sgRNA表达载体和GenJet形成的转染复合物，37℃反应20min，加入新鲜培养基，48h后以1：3比例传孔，第二天加800ug/ml的G418进行筛选，大量细胞死亡，停止加药，待细胞进入对数生长期后铺单克隆，每3天换药一次，待细胞大量死亡，降低G418筛选浓度至200μg/ml或撤除G418，15天左右待细胞单克隆长至0.5cm左右进行挑取筛选阳性单克隆；
(4)、取阳性单克隆菌株，生长至对数生长期后，调整细胞浓度至1×105个/ml，加入到6孔板中，每孔2ml，24h后进行质粒转染，2μg人源MDR1质粒+5ul脂质体+700ul优化液加到MDCK-KO细胞表面，6h后弃去转染液，加入新鲜培养基孵育48h；加入含G418(800ug/ml)进行筛选，8-10天后，绝大部分细胞死亡，将存活的细胞消化后接种到96孔板中进行单克隆筛选，待单克隆形成后扩大培养；
(5)、蛋白免疫印迹法检测p-gp蛋白表达，成功表达者即表示MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系构建成功。
在其中一些实施例中，所述步骤(2)包括以下步骤：
A、将sgRNA靶点插入粘末端之中，合成Oligo，Oligo退火，得到质粒DNA；
B、将所述质粒DNA线性化；
C、连接及鉴定重组质粒。
在其中一些实施例中，所述退火的反应体系为：正义链10ul、反义链10μl、NEBbuffer 5ul、H2O 25μl、Total 50μl。
在其中一些实施例中，所述退火的反应程序为：98℃加热10min，自然冷却至室温。
在其中一些实施例中，所述质粒DNA线性化的反应体系为：质粒DNA5μl、BbsI 1μl、Buffer 3μl、H2O 21μl、Total 30μl；所述质粒线性化的反应程序为：37℃反应2hr，切胶回收线性化片段，即得。
在其中一些实施例中，所述连接反应的反应体系为：线性化质粒DNA 1μl、退火Oligo反应液4μl、Solution I 5μl、Total 10μl。
在其中一些实施例中，所述鉴定重组质粒是采用菌落PCR进行的，反应体系为：EXTaq Mix 10uL、Sp6引物0.8uL、正义链引物0.8uL、菌液1uL、H2O 7.4uL、Total 20uL。
在其中一些实施例中，所述反应程序为95℃5min→95℃30s，58℃30s，60℃30s，30cycles→72℃5min→16℃∞。
本发明还提供了上述构建方法构建得到的MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明基于工程技术敲除MDCK细胞中犬P-gp蛋白的基因，以背景完全“干净”的MDCK细胞作为宿主细胞构建稳定表达人源p-gp蛋白的MDCK-MDR1细胞系，从而完善MDCK-MDR1作为血脑屏障药吸收、转运筛选模型的功能。
附图说明
图1为本发明实施例1中p-gp蛋白的蛋白免疫印迹结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。
实施例1一种基因敲除MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法
包括以下步骤：
1、针对MDCK细胞中犬P-gp基因设计出了sgRNA，用于靶点基因敲除。
2、sgRNA表达载体的构建
以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体。
具体构建方法为：
A、20bp的sgRNA靶点插入粘末端之中，合成Oligo：
正义链(即与靶位点相同的序列)：5’-CACC-GN19-3’(SEQ ID No:1)
反义链：5’-AAAC-19NC-3’(SEQ ID No:2)
(反义链N19为正义链N19的反向互补序列)
B、Oligo退火
配制以下反应液：
98℃加热10min，自然冷却至室温，得到质粒DNA。
C、U6-sgRNA-BbsI质粒线性化
37℃反应2hr，切胶回收线性化片段，即得线性化质粒DNA。
D、连接及鉴定重组质粒
16℃反应1hr后，转化Top10或DH5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB平板生长，挑取单菌落于1mL LB液体培养基中(含卡那)，37℃培养2～3h，采用sp6引物和正义链引物进行菌落PCR。
反应程序为95℃5min→95℃30s，58℃30s，60℃30s，30cycles→72℃5min→16℃∞
菌落PCR为阳性的单克隆菌进行测序鉴定。测序引物为sp6。序列正确者进行扩大培养和质粒制备，即为打靶质粒。
3、MDCK细胞转染与单克隆筛选
取对数生长期的MDCK-WT接种于6孔板中，每孔约2×105个/孔细胞，加入打靶质粒2ug：GenJet 6ul形成的转染复合物悬浮MDCK细胞，37℃反应20min，加入新鲜培养基，48h后以1：3比例传3孔，第二天加G418(800ug/ml)进行筛选，大概7天后大量细胞死亡，停止加药，待细胞进入对数生长期后铺单克隆。每3天换药一次，待细胞大量死亡，可降低G418筛选浓度至200μg/ml或撤除G418。15天左右待细胞单克隆长至0.5cm左右，可进行挑取。
挑取细胞单克隆至48孔板培养，长满后取1/10细胞鉴定基因型，9/10的细胞传至24孔板培养。经鉴定打靶的阳性克隆视生长情况可传至12孔板培养，长满后冻存，24孔细胞可冻1-2管，12孔细胞可冻2-4管。冻存液为90％血清加10％DMSO。
取出的少量细胞经离心沉淀，去除上清，加10μl裂解液(含0.45％NP40和2mg/mlproteinase K)56℃1h；95℃10min。直接取样进行PCR。PCR须扩增打靶位点序列，由于模板较少，因此尽量选取较短片段扩增(小于500bp为好)，并且20bp打靶序列居中。
PCR产物测序鉴定基因型。测序峰图若为单峰，则比对序列，结果或为野生型，或为纯合等位基因打靶；测序峰图若为打靶位点后双峰或多峰，则为两种或多种基因型混合。将PCR产物连接T载体，每种至少挑取6个单克隆测序鉴定。确定所有的打靶基因型。
将筛选出的阳性菌株PCR产物进行测序，通过与MDR1和WT基因比对，发现基因型MDCK(MDCK-KO)在221-224出现碱基缺失，导致蛋白被删节，预示打靶成功。
4、稳定表达人源p-gp蛋白的MDCK-MDR1细胞系的构建
取步骤3中检测为阳性的菌株，生长至对数生长期后，调整细胞浓度至1×105个/ml，加入到6孔板中，每孔2ml，24h后进行质粒转染，2μg人源MDR1质粒+5ul脂质体+700ul优化液加到MDCK细胞表面，6h后弃去转染液，加入新鲜培养基孵育48h；加入含G418(800ug/ml)进行筛选，8-10天后，绝大部分细胞死亡，将存活的细胞消化后接种到96孔板中进行单克隆筛选，待单克隆形成后扩大培养。
5、蛋白免疫印迹法检测p-gp蛋白表达
取步骤3和4中检测为阳性的细胞菌株，MDCK-KO、MDCK-MDR1及MDCK-WT细胞，扩大培养后，收获对数生长期的细胞。
A、加入RIPA细胞裂解液(1ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask)，冰上操作；收集裂解液至离心管中；
B、在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min(4℃)，弃沉淀；
C、用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量；
D、超声10～15秒剪切DNA以减低样品粘性；
E、样品5minutes；
F、离心12000g,5min，取上清；
G、电泳分离：上样20μl至SDS-PAGE胶(10cm x 10cm)电泳。
H、转膜(湿转)。NC膜先在转膜Buffer中浸泡一下，防止贴合不紧密。最好在Buffer中操作，用玻璃棒轻轻按压，从左至右赶走气泡。转膜条件是80V，280mA，转移35min。(具体看蛋白分子量大小)转的时候正负极不要弄反，胶放在黑色(负极)一端，膜放在红色(正极)一端。
I、配制30mL 5％TBS牛奶，封闭2～4h。(看效果，如何不好可以延长封闭时间)留下5mL左右用于配制一抗稀释液。
J、用1mL TBS牛奶稀释2μL一抗(鼠抗人单抗，初始浓度为230μg/mL)稀释比例是1：500，将抗体稀释液加到转印的膜上，要覆盖有目标蛋白的位置。4℃过夜。
K、回收一抗，标记“正”做使用次数标记。
L、TBST洗5次，每次5min。
M、用5mL TBST稀释1μL二抗(山羊抗鼠多抗初始浓度为1mg/mL)稀释比例是1:10000。将膜放在二抗稀释液中孵育1-2h。
N、TBST洗5次，每次5min。
O、ECL曝光:在暗盒中放置好免疫完成的膜，加600μL两种底物的混合液A:B＝300:300，上面铺保鲜膜，放置2min。进入暗室，开红色灯泡，尽量调低调暗，准备好后关闭灯泡。将柯达底片覆盖在膜上，关闭暗盒。(若荧光很强，会在黑暗中看到荧光)曝光时间具体看荧光强度(可以把底片剪成几张，铺在膜上，这样就会得到从下往上依次曝光减弱的胶片，选取最好的一张)拿出底片在显影液中浸泡显影1min，然后在清水中洗1min，最后在定影液中浸泡定影1min。
P、室外观察并分析结果。
蛋白表达检测结果如图1所示，结果显示，MDCK-KO细胞中的犬p-gp蛋白已成功敲除；构建的MDCK-MDR1细胞成功高表达人源p-gp蛋白。
试验例1P-gp蛋白转运体功能检测
取实施例1步骤4的检测结果为阳性的细胞菌株和MDCK-WT细胞扩大培养后，在细胞对数生长期消化细胞，调整细胞浓度至1.0-1.2×105个/ml,细胞接种于Transwell培养皿中，隔天换液，培养7-10天，待形成细胞单层膜及跨膜电阻稳定后，进行P-gp蛋白转运实验。
以Digoxin作为阳性对照(positive control)，同时进行A→B和B→A转运实验。分别检测转运60min后接收侧及给药侧的浓度。计算60min后药物回收率，及表观通透系数(Papp)和表观通透系数的比率(Papp ratio＝Papp[B→A]/Papp[A→B])，据此来评判MDCK细胞中犬p-gp细胞基因是否已敲除成功。
如表1、表2和表3所示，60min时Digoxin在A→B方向给药和在B→A方向给药试验的Papp值、Papp ratio及回收率。
表1Digoxin在MDCK-WT细胞中转运实验结果
表2.Digoxin在MDCK-KO细胞中转运实验结果
表3.Digoxin在MDCK-MDR1细胞中转运实验结果
结果显示，在MDCK-WT细胞中犬p-gp对地高辛的转运有弱的外排作用；在MDCK-KO中没有出现地高辛的外排作用；在MDCK-MDR1细胞中，地高辛的表观通透系数比率(Pappratio)为10.58，与文献中其Papp ratio值在3.1～15.4之间相符，说明MDCK-MDR1细胞中的人源P-gp蛋白具有较高的活性。
综上实验结果显示，MDCK-WT细胞中的犬P-gp蛋白基因已经成功敲除。MDCK-MDR1细胞高表达的p-gp蛋白对地高辛有很强的外排作用，此细胞系可以用做高通量药物吸收体外筛选模型
利用该细胞作为宿主细胞筛选出稳定表达人P-gp蛋白的MDCK-MDR1细胞系，应用于药物候选物体外吸收、转运的筛选可靠性将会大大增加。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、针对MDCK细胞中犬P-gp基因设计出了sgRNA，用于靶点基因敲除；
(2)、以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体；
(3)、在对数生长期的野生型MDCK细胞中，加入sgRNA表达载体和GenJet形成的转染复合物，37℃反应20min，加入新鲜培养基，48h后以1：3比例传孔，第二天加800ug/ml的G418进行筛选，大量细胞死亡，停止加药，待细胞进入对数生长期后铺单克隆，每3天换药一次，待细胞大量死亡，降低G418筛选浓度至200μg/ml或撤除G418，15天左右待细胞单克隆长至0.5cm左右进行挑取筛选阳性单克隆；
(4)、取阳性单克隆菌株，生长至对数生长期后，调整细胞浓度至1×105个/ml，加入到6孔板中，每孔2ml，24h后进行质粒转染，2μg人源MDR1质粒+5ul脂质体+700ul优化液加到MDCK-KO细胞表面，6h后弃去转染液，加入新鲜培养基孵育48h；加入含G418(800ug/ml)进行筛选，8-10天后，绝大部分细胞死亡，将存活的细胞消化后接种到96孔板中进行单克隆筛选，待单克隆形成后扩大培养；
(5)、蛋白免疫印迹法检测p-gp蛋白表达，成功表达者即表示MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系构建成功。
2.根据权利要求1所述的MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)包括以下步骤：
A、将sgRNA靶点插入粘末端之中，合成Oligo，Oligo退火，得到质粒DNA；
B、将所述质粒DNA线性化；
C、连接及鉴定重组质粒。
3.根据权利要求2所述的MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，其特征在于，所述退火的反应体系为：正义链10ul、反义链10μl、NEB buffer 5ul、H2O 25μl、Total 50μl。
4.根据权利要求2所述的MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，其特征在于，所述退火的反应程序为：98℃加热10min，自然冷却至室温。
5.根据权利要求2所述的MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，其特征在于，所述质粒DNA线性化的反应体系为：质粒DNA5μl、BbsI 1μl、Buffer 3μl、H2O 21μl、Total 30μl；所述质粒线性化的反应程序为：37℃反应2hr，切胶回收线性化片段，即得。
6.根据权利要求2所述的MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，其特征在于，所述连接反应的反应体系为：线性化质粒DNA 1μl、退火Oligo反应液4μl、Solution I 5μl、Total 10μl。
7.根据权利要求2所述的MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，其特征在于，所述鉴定重组质粒是采用菌落PCR进行的，反应体系为：EX Taq Mix 10uL、Sp6引物0.8uL、正义链引物0.8uL、菌液1uL、H2O 7.4uL、Total 20uL。
8.根据权利要求2所述的MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，其特征在于，所述反应程序为95℃5min→95℃30s，58℃30s，60℃30s，30cycles→72℃5min→16℃∞。
9.权利要求1～8任一项所述的构建方法构建得到的MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系。
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