CN108085275A - 一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌及其应用 - Google Patents

一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌及其应用，具体涉及一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigii B424，该菌株的保藏编号为CGMCC No.14915。本发明还公开了上述菌株的分子生物学特性和培养方法，验证了其具有抑制家蚕白僵病病原真菌的活性，并验证了其对家蚕白僵病的防治效果。

Description

一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生防菌株技术领域，特别是涉及一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌及其应用。
背景技术
家蚕是我国重要的经济昆虫，我国蚕桑业发展具有悠久的历史，每年蚕桑业都为我国带来巨大的而经济效益。2015年，全国桑园面积1232万亩；桑蚕茧产量63万吨；蚕农实现收入199亿元人民币；桑蚕丝产量16.9万吨；真丝绸商品出口额31亿美元[1]。
家蚕养殖过程中，白僵病是常见真菌病害，这一病害每年都会给蚕桑业生产造成巨大的经济损失，极大地限制了蚕桑业的发展。该病的病原为球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。目前对于这一真菌病害，主要的防治措施是以预防为主，在养殖前期做好消毒工作，在养殖过程中注意隔离受感染的僵虫，在此期间大量使用抗生素以及化学农药，常用药物主要有“克红素”、“克氯素”、“多菌灵”及“防僵一号”等,虽然使用化学农药减少了家蚕白僵病的发生，但是长期使用这些农药不仅会造成病原菌的抗性上升，而且会造成生态环境污染等问题，除此之外，有些化学农药对人体毒性很高。为克服现有家蚕使用药物存在的诸多问题，亟待挖掘新微生物资源，筛选微生物农药用于防治家蚕白僵病。
发明内容
本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌及其应用。路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigii B424，该菌株的保藏编号为CGMCC No.14915。本发明还公开了上述菌株的分子生物学特性和培养方法，并验证了其具有抑制多种家蚕白僵病病原真菌的活性。
本发明的一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌及其应用技术方案为，本发明采用的细菌为一株路德维希肠杆菌，分类命名为Enterobacter ludwigii，经过16SrDNA序列分析。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2017年11月16日，保藏号：CGMCCNo.14915，参据的生物材料(株)：B424。
所述的路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigii B424，其16S rDNA序列全长为1444bp，全序列如下：
GGGCCTGGGCGGCAGACTACACATGCAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGAACTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTACCACTTTGAATCAGG。
所述的路德维希肠杆菌在制备防治家蚕白僵病的生防菌剂中的应用。本发明的菌株Enterobacter ludwigii B424或其发酵液可以作为生物防治剂使用，用于预防球孢白僵菌引起的家蚕白僵病。
将路德维希肠杆菌发酵制备生防菌剂，使用培养基为LB培养基，成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000mL，121℃灭菌15min备用；液体培养基LB方成分与固体培养基相似，只是不加入琼脂。
所述家蚕白僵病由球孢白僵菌引起。
本发明的菌株Enterobacter ludwigii B424对家蚕白僵病病原球孢白僵菌具有抑制作用。
一种防治家蚕白僵病的生防菌剂，包括路德维希肠杆菌或路德维希肠杆菌发酵液。
本发明的有益效果为：本发明的抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌克服了现有采用化学农药造成的病原菌的抗性上升、生态环境污染等问题，提供了一种新的微生物资源，对于进一步研发治疗家蚕白僵病的生物制剂具有重大意义。
附图说明
图1为路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigii B424的16S rDNA PCR产物电泳图；
图2为路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigii B424对球孢白僵菌的拮抗效果图。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigii B424的分离培养和筛选纯化
样品为山东省泰安市范镇蒜田大蒜根际土壤，将采集的土壤放入封口袋并记录。
土壤样品带回实验室后，取0.1g土样加入到5mL PBS缓冲液中，充分震荡混匀后，2000g离心取上清，10倍梯度稀释至10-8，然后取10-4至10-7稀释液涂布于LB平板，28℃培养箱培养36h后，挑取单菌落划线于新的LB平板，挑取划线后的单菌落保存在LBA平板。
将获得的纯菌株使用LB培养12h后，取1mL加入到10mL LBA中后充分混匀，冷却后在平板中央接种球孢白僵菌菌饼，对照使用1mL液体LB代替菌液，每个细菌菌株设置3个平行对照，于26℃黑暗条件下培养15天后，观察球孢白僵菌的生长直径。挑选对白僵菌生长有明显抑制作用的菌株进行鉴定。
所用固体基为LBA养基，具体成分为蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂10g，pH调整至7.0-7.2，加水定容至1000mL，121℃灭菌15min备用；液体培养基LB方成分与固体培养基相似，只是不加入琼脂。
菌株鉴定
将所得菌株使用LB培养12h后，取1mL菌液2000g离心10min收集菌体，使用DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。采用细菌16S rDNA通用引物1492R(5’-GGCTCGAGCGGCCGCCCGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)和8F(5’-GCGGATCCGCGGCCGCTGCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)以基因组DNA为模板对细菌16S rDNA序列进行扩增，扩增后PCR产物送上海生工生物有限公司测序，并将序列上传至GenBank数据库，所得序列号为MF084966，使用细菌模式种数据库EzBioCloud进行鉴定时，菌株B108序列与Enterobacter ludwigii EN-119(T)相似性为99.17％，鉴定该菌株B424为Enterobacterludwigii。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2017年11月16日，保藏号：CGMCCNo.14915。
实施例2
生防菌Enterobacter ludwigii B424对家蚕白僵病病原球孢白僵菌的抑制效果
取1mL过夜培养的Enterobacter ludwigii B424培养液(LB液体培养基培养)加入到冷却至40℃左右的10mL LBA后充分混匀，制备平板作为处理组，对照组使用1mL LB液体代替菌液。然后带平板凝固后在每个平板中央接种球孢白僵菌菌饼，每个处理重复7次。培养皿封口后置于26℃培养15天，测定球孢白僵菌在两种平板上的生长速率。结果表明，生防菌Enterobacter ludwigii B424能够完全抑制球孢白僵菌的生长。因此，该菌株对家蚕白僵病病原菌球孢白僵菌具有较好的抑菌效果。
实施例3
生防菌Enterobacter ludwigii B424发酵液预防家蚕白僵病实验室模拟
取过夜培养的Enterobacter ludwigii B424培养液(LB液体培养基培养)，OD600约为0.8，将上述发酵液使用喷壶均匀喷洒至2-3龄家蚕体表两组各100头，至家蚕体表刚湿透为止，对照组使用无菌水喷雾。待虫体晾干后，再次使用球孢白僵菌孢子悬浮液(109CFU/mL)对家蚕虫体进行喷雾，至家蚕体表刚湿透为止。待家蚕虫体晾干后，每10头一组放置于大培养皿内使用消毒后的桑树叶饲喂。每日检查家蚕存活率，连续检查10天。结果表明，10天后，对照组死亡率为78％，而使用菌株Enterobacter ludwigii B424培养液处理后的家蚕死亡率为10％。因此，该菌株对家蚕白僵病具有较好的预防效果。
实施例4
生防菌Enterobacter ludwigii B424发酵液防治家蚕白僵病实验室模拟
2-3龄家蚕体表两组各100头使用球孢白僵菌孢子悬浮液(109CFU/mL)对家蚕虫体进行喷雾，至家蚕体表刚湿透为止。然后，使用过夜培养的Enterobacter ludwigii B424培养液(LB液体培养基培养，OD600约为0.8)对上述家蚕再次喷雾，至家蚕体表刚湿透为止，对照组使用无菌水喷雾。待虫体晾干后，每10头一组放置于大培养皿内使用消毒后的桑树叶饲喂。每日检查家蚕存活率，连续检查10天。结果表明，10天后，对照组死亡率为83％，而使用菌株Enterobacter ludwigii B424培养液处理后的家蚕死亡率为30％。因此，该菌株对家蚕白僵病具有较好的防治效果。
以上所披露的仅为本发明的较佳实施例，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东省科学院生态研究所
<120> 一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1444
<212> DNA
<213> 路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)
<400> 1
gggcctgggc ggcagactac acatgcagtc gaacggtagc acagagagct tgctctcggg 60
tgacgagtgg cggacgggtg agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta 120
ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc 180
tcttgccatc agatgtgccc agatgggatt agctagtagg tggggtaacg gctcacctag 240
gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc 300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 360
catgccgcgt gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaggt 420
gttgtggtta ataaccgcag caattgacgt tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg 480
tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540
cgcacgcagg cggtctgtca agtcggatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca 600
ttcgaaactg gcaggctaga gtcttgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa 660
atgcgtagag atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca aagactgacg 720
ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780
acgatgtcga cttggaggtt gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaagt 840
cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tactcttgac 960
atccagagaa ctttccagag atggtttggt gccttcggga actctgagac aggtgctgca 1020
tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tatcctttgt tgccagcggt ccggccggga actcaaagga gactgccagt gataaactgg 1140
aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg agtagggcta cacacgtgct 1200
acaatggcgc atacaaagag aagcgaactc gcgagagcaa gcggacctca taaagtgcgt 1260
cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgta 1320
gatcagaatg ctacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1380
ggagtgggtt gcaaaagaag taggtagctt aaccttcggg agggcgctac cactttgaat 1440
cagg 1444
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 3
ggctcgagcg gccgcccggg ttaccttgtt acgactt 37
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成(artificially synthesized)
<400> 3
gcggatccgc ggccgctgca gagtttgatc ctggctcag 39

Claims (6)

1.一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌，其特征在于，所述的路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigii B424，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.14915，保藏日期为2017年11月16日。
2.根据权利要求1所述的一种抑制家蚕白僵病病原真菌的路德维希肠杆菌，其特征在于，其16S rDNA序列全长为1444bp，全序列如下：GGGCCTGGGCGGCAGACTACACATGCAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGAACTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTACCACTTTGAATCAGG。
3.如权利要求1所述的路德维希肠杆菌在制备防治家蚕白僵病的生防菌剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述家蚕白僵病由球孢白僵菌引起。
5.一种防治家蚕白僵病的生防菌剂，其特征在于，包括路德维希肠杆菌或路德维希肠杆菌发酵液。
6.一种防治家蚕白僵病的生防菌剂，其特征在于，所述的路德维希肠杆菌发酵液发酵所用培养基为LB培养基。
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