CN108070650B - 外泌体中microRNA在诊断缺血性脑卒中疾病的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测外泌体中microRNA的试剂在制备评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度的产品中的用途，并涉及用于早期区别受试者患有心源性缺血性卒中和非心源性缺血性卒中的方法。该方法采用高分子聚合物沉淀血清中的外泌体，实时荧光定量PCR技术，实验结果表明miR‑155‑5p和miR‑93‑5p特异性和灵敏度显著高于现有的蛋白标志物。同时和非心源性脑卒中患者相比，心源性脑卒中患者在疾病早期血清miR‑133a‑3p、miR‑208a‑3p没有显著变化的情况下，血清外泌体的miR‑133a‑3p、miR‑208a‑3p表达显著升高，因此可作为显著区分心源性与非心源性缺血性脑卒中的标志物。

Description

外泌体中microRNA在诊断缺血性脑卒中疾病的用途
技术领域
本发明涉及医疗诊断领域，具体涉及外泌体中microRNA在诊断缺血性脑卒中疾病的 用途，特别涉及microRNA在区分心源性缺血性脑卒中与非心源性缺血性脑卒中的应用。
背景技术
在缺血性心脏病后，脑卒中作为高收入国家中发病率极高的疾病，在世界卫生组织公 布的人类死亡原因中排序第二。在伤残调整生命年方面，脑卒中是冠心病的2倍。此外， 卒中后患者的远期死亡风险除了卒中复发外还包括心血管事件，且卒中后患者远期心血管 事件发生随时程增加而显著增加。脑卒中作为全球严重的公共健康问题，缺血性脑卒中占 其中的60％-80％。关于缺血性脑卒中的分类，1993年公布的类肝素药物治疗急性缺血性 脑卒中试验(TOSAT)亚型分类标准是目前国际上公认的缺血性脑卒中的病因学分类标准。 该标准来源于一个多中心、随机、双盲、对照的临床研究。TOAST亚型分类标准侧重于缺 血性脑卒中的病因学分类，根据这一分类方法提出的大、小血管病变学说在脑卒中的发病 机制研究中占有重要的地位。TOAST标准将中风的原因仔细分析成心源性脑栓塞、大动脉 粥样硬化性卒中、小动脉闭塞性卒中或腔隙性卒中、其他原因所致的缺血性卒中。
心源性脑卒中(CE)是指包括多种可以产生心源性栓子的心脏疾病所引起的脑栓塞， 约占全部脑栓塞的60％-75％，栓子在心内膜和瓣膜产生，脱落后随血流入脑阻塞相应的脑 血管后致病，常见原因如下：心房纤颤时左心房收缩性降低，血流缓慢甚至瘀滞，易导致 附壁血栓，心脏的不规律跳动又导致血栓易脱落而导致脑栓塞；心肌梗死后2-4周内发生 脑栓塞的比例约为2.5％，栓子多来源于左心室血栓；心瓣膜病，常见的有二尖瓣狭窄、反 流或脱垂等附有血栓形成等；当发生扩张性心肌病时，由于血流缓慢甚至瘀滞导致心室内 存在散在的小栓子，尤其在心尖部，当心律失常，尤其当心房纤颤时这些血栓容易脱落，导致脑栓塞；先天性心脏病以及心脏外科手术等原因引起的脑梗塞。
大动脉粥样硬化性卒中(LAA)患者通过颈动脉超声波检查发现颈动脉闭塞或狭窄(狭 窄≥动脉横断面的50％)。血管造影或MRA显示颈动脉、大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉、椎基底动脉狭窄程度≥50％。其发生是由于动脉粥样硬化所致。
小动脉闭塞性卒中或腔隙性卒中患者临床及影像学表现具有以下3项标准之一即可确 诊：有典型的腔隙性梗死的临床表现，影像学检查有与临床症状相对应的卒中病灶的最大 直径<1.5cm；临床上有非典型的腔隙梗死的症状，但影像学上未发现有相对应的病灶；临 床上具有非典型的腔隙性梗死的表现，而影像学检查后发现与临床症状相符的<1.5cm的 病灶。
以上三种卒中病因分类是临床上常见的类型，为了评估这些标准，需要颈动脉和经颅 超声及超声心动描记术和心电图。
传统来说，心脏肌钙蛋白是诊断急性心肌梗死的首选生物标志物。已经认可能够在几 种非急性慢性疾病状态，包括冠状动脉疾病、心力衰竭和慢性肾病中检测到升高的肌钙蛋 白水平。有报道已经显示了肌钙蛋白在来自一般群体的个体中可检出。但是肌钙蛋白检测 的前提是基于心肌细胞的受损，细胞破裂释放出肌钙蛋白，临床上房颤患者如果没有合并 心肌梗死，是不会出现肌钙蛋白增高。同时，卒中原因的早期评估是至关重要的，以充分 治疗患有卒中的受试者，特别是患有心源性卒中的受试者。此外，由于心源性栓塞所致的 卒中一般严重且易于早期复发。因此，需要一个能监控患者突发卒中的风险，且在未有心 肌出现损伤时判断出脑卒中血栓来源，能早期监控脑卒中发生且判断出是否为心源性的生 物学指标。
microRNA是一种内源性的22个核苷酸的小分子单链RNA，通过靶向mRNA的3’UTR降解mRNA，或抑制其翻译从而实现对基因表达的调节。最近研究发现，急性脑梗死患者 或脑缺血损伤动物模型血液中的microRNA表达显著变化，如脑缺血和动脉粥样硬化患者 血清中let-7e、miR-21和miR-145的水平增高，而miR-221和miR-210则显著降低，因此 认为它们可以作为脑梗死早期诊断的血液标志物。但它们缺乏组织特异性，miRNA-145是 主要分布在血管平滑肌细胞而miRNA-210则是氧敏感性microRNA。
外泌体是一种直径约30-100nm的双层膜性小囊泡，多种组织和细胞都可分泌形成， 存在于血液、脑脊液、唾液和尿液等体液中。它们含有来自宿主细胞的microRNA和蛋白质等多种成分，是细胞间重要的信息交流媒介，同时也是无创性疾病诊断标志物研究的理想对象。
在心肌损伤的临床疾病中，如在心肌受损的急性心肌梗死血浆中miR-208a高表达。 近来研究显示，血浆miR-208a可以作为非侵入性评价心肌损伤的标志物，miR-208a的水 平与损伤程度相关，可作为评估损伤程度和治疗效果的标志。但是，对于心肌损伤不严重， 未有心肌细胞坏死，如房颤发生，则很难通过检测血清中相应microRNA的表达来获取心 肌细胞的信息，并且微量心肌细胞释放的microRNA入血，再至循环血液中稀释，其含量几乎低至不可检测。miR-124-3p是脑中含量最丰富的miRNA之一，表达在几乎脑各个区 域。已有的临床和动物模型研究显示血浆中miR-124的水平较正常对照组显著增加。
Ji Q等(PloS one，2016，11(9)：e0163645.)分析了急性脑缺血卒中患者血液外泌体 中的miR-9-3p和miR-124-3p的水平变化，发现急性脑卒中患者血清外泌体miR-9-3p和miR-124-3p含量显著升高，可作为潜在的急性脑梗死诊断标志物的应用。
专利CN105648073A公开了miR-98在制备缺血性脑卒筛查试剂盒中的应用，其揭示miR-98通过靶向负性调节PAFR的表达，进而影响PAFR及其下游炎症相关的信号转导过 程而在脑卒中发生中发挥作用。
专利CN105543389B公开了miR-4330在诊治脑卒中的用途，通过生物信息学方法对已发表的脑卒中的miRNA高通量转录组数据进行整合分析，选取后备miRNA进行分子生 物学验证，RT-PCR结果显示，miR-4330和脑卒中密切相关，可用于临床诊断及预防检测。
由此可见，已有的诊断技术不能对脑卒中原因进行早期、可靠的评估，个人化的治疗 方案不能以足够的精确性测定，许多患者会接受不充分的或者可能具有副作用的治疗方案。 因此，找到一种用于可靠区别脑卒中原因的手段和方法具有重要意义。
发明内容
本发明一个目的是提供了能够评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度的标志物和方法。
本发明还一个目的是提供了诊断受试者脑卒中疾病，特别是显著区分心源性缺血性脑 卒中与非心源性缺血性脑卒中的标志物和方法。
因此，本发明的一方面提供了microRNA作为评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度的 标志物的应用，所述的microRNA选自miR-155-5p、miR-93-5p、miR-133a-3p和miR-208a-3p 中的一种或几种。
在本发明的一个实施方案中，所述的microRNA为miR-155-5p和/或miR-93-5p。
在本发明的一个实施方案中，所述的microRNA为miR-133a-3p和/或miR-208a-3p。
优选的，本发明所述的miR-155-5p的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示：
UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU(SEQ.ID.NO.1)。
优选的，本发明所述的miR-93-5p的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示：
CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(SEQ.ID.NO.2)。
优选的，本发明所述的miR-133a-3p的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示：
UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG(SEQ.ID.NO.3)。
优选的，本发明所述的miR-208a-3p的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示：
AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU(SEQ.ID.NO.4)。
优选的，所述的microRNA为受试者外周血的外泌体中microRNA；更优选的，所述的microRNA为受试者血清的外泌体中的microRNA。
所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度包括诊断目的或非诊断目的。
优选的，所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度为诊断受试者脑卒中疾病。
优选的，所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度为区分心源性缺血性脑卒中与非 心源性缺血性脑卒中。
本发明的第二方面提供了一种检测外泌体中microRNA的试剂在制备评判脑缺血性损 伤存在和/或损伤程度的产品中的用途，其中所述的microRNA选自miR-155-5p、miR-93-5p、 miR-133a-3p和miR-208a-3p中的一种或几种。
优选的，所述的外泌体中microRNA为受试者外周血的外泌体中microRNA；更优选的，所述的受试者外周血为受试者血清。
在本发明的一个实施方案中，所述的microRNA为miR-155-5p和/或miR-93-5p。
在本发明的一个实施方案中，所述的microRNA为miR-133a-3p和/或miR-208a-3p。
优选的，所述的检测外泌体中microRNA的试剂为检测microRNA的存在或水平的试剂。
在本发明的一个实施例中，所述的检测外泌体中microRNA的试剂包括血清外泌体分 离试剂；所述的血清外泌体分离试剂选自超速离心法血清外泌体分离试剂和Exoquick法血 清外泌体分离试剂；更优选的，所述的血清外泌体分离试剂选自通过高分子聚合物沉淀溶 液中Exoquick法提取外泌体的试剂，例如Exoquick试剂盒。
在本发明的一个实施例中，所述的检测外泌体中microRNA的试剂包括外泌体RNA抽提试剂，例如mirVana试剂盒。
在本发明的一个实施例中，所述的检测外泌体中microRNA的试剂包括通过PCR法检 测microRNA的试剂；优选的，所述的检测外泌体中microRNA的试剂包括实时定量PCR 法测定microRNA水平的试剂，例如miDETECTA TrackTM miRNA qRT-PCR试剂盒。
在本发明的一个实施例中，所述的检测外泌体中microRNA的试剂包括RT引物和/或 荧光定量PCR引物序列。
所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度包括诊断目的和非诊断目的。
优选的，所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度为诊断受试者脑卒中疾病。
优选的，所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度为区分心源性缺血性脑卒中与非 心源性缺血性脑卒中。
优选的，所述的外泌体为大致呈圆形、部分有凹陷。
优选的，所述的外泌体粒径并不均一，主要分布在100nm附近，例如是100nm±20nm。
优选的，所述的外泌体为表达选自标志蛋白CD9，HSG101和HSP70中一种或几种的外泌体。
本发明的第三方面提供了一种评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度的方法，所述的方 法包括检测外泌体中microRNA，所述的microRNA选自miR-155-5p、miR-93-5p、miR-133a-3p和miR-208a-3p中的一种或几种。
所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度的方法包括诊断目的和非诊断目的。
优选的，所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度为诊断受试者脑卒中疾病。
优选的，所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度为区分心源性缺血性脑卒中与非 心源性缺血性脑卒中。
优选的，所述的检测外泌体中microRNA为检测microRNA的存在或水平。
在本发明的一个实施方式中，所述的检测外泌体中microRNA包括：(1)血清外泌体的分离；(2)外泌体RNA抽提；(3)PCR法检测microRNA存在或水平。
优选的，所述的步骤(1)血清外泌体的分离选自超速离心法剂和Exoquick法；更优选的，所述的血清外泌体分离选自高分子聚合物沉淀溶液中的Exoquick法。
优选的，所述的PCR法检测microRNA存在或水平为实时定量PCR法检测microRNA存在或水平。
优选的，所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度的方法还包括比对外泌体中 microRNA水平的步骤；所述的比对外泌体中microRNA水平可以为将检测得到外泌体中microRNA水平相互比对，也可以是将检测得到外泌体中microRNA水平与已有的外泌体 中microRNA水平比对；在本发明的具体实施方式中，所述的比对外泌体中microRNA水 平包括将检测得到受试者外泌体中microRNA水平与健康受试者外泌体中microRNA水平 比对。
心源性缺血性脑卒中患者脑组织内的miR-155-5p和miR-93-5p以外泌体形式进入外周血，其水平较对照组显著增加，且表达量与脑损伤的程度呈正相关，因此可作为一种评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度的标志物；由于分泌到外周血的外泌体microRNA由双膜结构包裹，不容易受到外界影响，因此外泌体microRNA较血清microRNA可以更为准确地反映脑缺血损伤的程度；同时miR-155-5p和miR-93-5p的特异性和灵敏度显著高于现有的蛋白标志物如S100β，CRP。相比非心源性缺血性脑卒中，心源性缺血性脑卒中患者心脏组织特异性的miR-133a-3p以外泌体的形式进入外周血，其水平较对照组显著增加，同时血浆外泌体中miR-208a-3p的水平较对照组显著增加，且其表达量与IL-6的含量呈正相关。对外周血中循环的miR-133a-3p、miR-208a-3p的表达进行检测发现，相比外周血中游离的miRNA含量较少，来源于外周血外泌体的miR-133a-3p、miR-208a-3p的表达更显著，且在疾病早期外周血miR-133a-3p、miR-208a-3p没有显著变化的情况下，外周血外泌体的miR-133a-3p、miR-208a-3p表达显著升高，因此本发明所述的miR-133a-3p、miR-208a-3p可作为显著区分心源性与非心源性缺血性脑卒中的标志物。
附图说明
图1为本发明的血清外泌体的分离和鉴定。A.透射电镜观察分离的外泌体大小和形态 (Bar＝200nm)；B.Western印迹法检测外泌体标志蛋白CD9(右侧)，TSG101(中间)和HSP70(左侧)在对照组和研究组血清外泌体中的表达。
图2为疾病组(非心源性和心源性)与健康对照组血清外泌体中miR-155-5p(右侧)和miR-93-5p(左侧)的表达(*P＜0.001)。
图3为心源性缺血性脑卒中与非心源性缺血性脑卒中患者血清外泌体中microRNA的 表达水平。A.心源性缺血性脑卒中与非心源性缺血性脑卒中患者血清外泌体miR-155-5p (右侧)和miR-93-5p(左侧)的表达水平；B.心源性缺血性脑卒中与非心源性缺血性脑卒中患者血清外泌体miR-133a-3p(左侧)和miR-208a-3p(右侧)的表达水平。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本 领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明 保护的范围。
本发明术语“受试者”包括哺乳动物，优选为灵长类动物，特别优选为人类。
本发明术语“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者 是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。
本发明术语“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。
本发明术语“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质 上影响的其他指定成分或步骤。
本发明术语“PCR”是指聚合酶链式反应，RNA或DNA序列的指数扩增的方法。
本发明术语“实时定量PCR”是指实时定量聚合酶链式反应，基于PCR技术，用于 扩增且同时定量RNA或DNA分子。
本发明术语“检测microRNA存在”是指在本领域通常允许的误差范围内检测样品中 microRNA的有无。
本发明术语“检测microRNA水平”是指本领域通常允许的误差范围内检测样品中microRNA的含量或浓度。
本发明的术语“microRNA”包括pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、dsmiRNA 及其片段或变体中的一种或几种，例如“miR-155-5p、miR-93-5p、miR-133a-3p和 miR-208a-3p”包括各自的pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、dsmiRNA及其片段或 变体中的一种或几种。
实施例1研究对象及血清收集
选取2017年1月至2017年5月深圳市第二人民医院神经内科急性脑卒中患者40例设为研究组(男女各20例)。其中心源性脑卒中20例，非心源性脑卒中20例。年龄39～ 73岁，平均(56.4±13.3)岁。均经头颅CT或MRI检查证实，符合第四届全国脑血管病学 术会议修订的脑卒中诊断标准。发病时间48-72小时，NIHSS评分的中位数(四分位数间距) 为8(8-12)。除恶性肿瘤、心衰、血液、内分泌、代谢或消化系统疾病，营养不良，严重肺 部感染、肝肾功能不全者，及神经系统的其他疾患。将同期医院体检中心确诊的健康志愿 者30例设为对照组，其中男15例、女15例，年龄26～71岁，平均(50.3±6.0)岁。
健康志愿者于体检中心空腹采血，脑卒中患者于入院次日空腹采静脉血10mL，分离 血清，-80℃冻存。ELISA法检测血液中cTnT和NT-proBNP的含量。
结果表明疾病组(心源性脑卒中和非心源性脑卒中患者)和正常对照组在性别、年龄间无 统计学差异(P＞0.05)；疾病组血清中cTnT和NT-proBNP的表达较正常对照组增高，差异 有统计学意义(P＜0.05)。
实施例2血清外泌体的分离
(1)采用SBI公司的Exoquick试剂盒(System Biosciences Inc.，Mountain View，CA， USA)分离血清中的外泌体。将保存于-80℃的血清在冰上融化，3000g离心15min。将上清转移至新的EP管中，加入适量的ExoQuick溶液轻轻颠倒混匀，4℃反应30min(优选 250μL血清中加入63μL exoquick试剂)，1500g离心30min(外泌体沉于管下)；吸出上 清，1500g离心5min吸出所有上清(不能震动离心管)；用250μL PBS溶解全部沉淀，-80℃ 保存备用。
(2)分析外泌体的粒径和浓度：采用Nanoparticle-tracking analysis(NTA)分析颗粒的 数量和粒径分布。将上述沉淀用30μL无颗粒PBS重悬，测试前再稀释1000倍。
(3)透射电镜观察外泌体的形态：根据Thery等(John Wiley&Sons,Inc.，2006，Chapter 3(Chapter 3)：Unit 3.22)所描述的方法准备电镜观察样本。用30μL PBS重悬沉淀，加入 等体积的4％w/v多聚甲醛固定。将10μL固定后的外泌体溶液滴到Formvar/carbon-coated 镍网上，空气干燥20min。PBS洗涤数次后，用1％w/v的戊二醛固定5min，纯水清洗数 次后用4％w/v醋酸铀染色5min，醋酸铀和甲基纤维素混合液体包埋，用滤纸吸去多余液 体并空气干燥备用。透射电镜(JEM-2100JEOL,Tokyo,Japan)观察外泌体的形态和大小。
(4)Westen blot检测外泌体标志物：采用RIPA(Pierce,USA)裂解液提取外泌体蛋白， BCA(Pierce,美国)测定蛋白浓度。12％SDS-PAGE分离蛋白，每道上样量为40μg总蛋白。湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入TSG101(Abcam， USA),CD9(Abcam，USA)和HSC70(Abcam，USA)抗体(1:1000)，4℃封闭过夜，TBST洗3 次，加入HRP标记的2抗(1:1000)，室温孵育1h，增强化学发光法显色(ECL)(Pierce,USA)， 胶片记录。
由于外泌体粒径极小，传统的超速离心法费时、费力且分离效率较低，遂采用通过高 分子聚合物沉淀溶液中外泌体的Exoquick法。本实验通过该方法获得的血清外泌体大致呈 圆形、部分有凹陷，粒径在100nm以下(图1A)，表达CD9，TSG101和HSP70等外泌体 的标志分子，且研究组和对照组间无明显差异(图1B)。进一步的NTA分析显示，分离到 的外泌体粒径并不均一，主要分布在100nm附近，说明成功分离了人血清外泌体。
实施例3外泌体RNA抽提和实时定量PCR法测定microRNA
采用mirVana(Ambion，TX，USA)试剂盒抽提血清外泌体的总RNA。Bioanalyzer2100(Agilent，CA)检测所提取RNA的质量和浓度。采用和CFX96PCR仪(Biorad)检测各组 外泌体miRNA，各样本重复检测3次。
(1)反转录获得cDNA：
1)提取上述样品的外泌体中的RNA，作为模板，在去RNase的PCR管中加入模板(50-150ng)、RT引物(15-20pmol)和RNA free H2O至总体积12μl。
2)将上述溶液混匀，65℃孵育5min，以打开RNA二级结构，随后立即置于冰上，防止RNA复性恢复二级结构。
3)反转录：
反转录过程中，筛选出的miR-155-5p、miR-93-5p、miR-133a-3p和miR-208a-3p的特 异性反转录RT引物序列如表1所示：
表1特异性反转录RT引物序列
Figure GDA0002763217730000101
4)向上述反应液中依次加入以下试剂：
Figure GDA0002763217730000102
Figure GDA0002763217730000111
5)混匀后简短离心，42℃孵育60min。
6)70℃灭活5min，即可获得cDNA。
(2)荧光定量PCR
荧光定量PCR中，筛出的miR-155-5p、miR-93-5p、miR-133a-3p和miR-208a-3p的荧光定量PCR引物序列如表2。
表2荧光定量PCR引物序列
Figure GDA0002763217730000112
1)按以下反应体系对miR-155-5p、miR-93-5p、miR-133a-3p和miR-208a-3p分别进行 荧光定量PCR：
Figure GDA0002763217730000113
Figure GDA0002763217730000121
2)荧光定量PCR反应条件：
94℃30s；94℃5s，60℃34s读板40循环；溶解曲线分析：温度60℃-95℃。
实施例4：
研究脑卒中患者与健康对照组血清外泌体中miR-155-5p和miR-93-5p的表达：上述操 作步骤检测血清外泌体中miR-155-5p和miR-93-5p，其相对表达水平以如图2所示：对照 组的miR-155-5p和miR-93-5p的表达接近于本底水平，而研究组患者miR-155-5p和miR-93-5p的表达显著增高(P＜0.001)。血清外泌体中的miR-155-5p和miR-93-5p表达量与血液中IL-6的水平间的关系：为探讨血清外泌体中miR-155-5p和miR-93-5p的水平与脑 损伤程度之间的关系，对miR-155-5p和miR-93-5p的水平与血液中促炎症因子IL-6的水 平进行线性回归分析显示两者间明显相关(P＜0.001)。miR-155-5p和miR-93-5p的AUC(areaunder curve)值分别为0.8689(95％CI:0.7779–0.9600)和0.7083(95％CI:0.5866–0.8301)，因此 miR-155-5p和miR-93-5p可作为一种评判脑卒中缺血性损伤和程度的标志物。
本组脑卒中病例中仅有15例S100β表达量增高，而miR-155-5p和miR-93-5p在所有病例中均显著增高，同时与脑缺血损伤的相关性也要高于CRP，脑组织特异性miR-155-5p和miR-93-5p以外泌体形式进入外周血，其水平较对照组显著增加，且表达量与脑损伤的程度呈正相关，可作为一种评判脑卒中缺血性损伤和程度的标志物。
进一步，上述操作步骤研究疾病组(心源性脑卒中患者和非心源性脑卒中患者)血清外泌体中miR-155-5p和miR-93-5p以及miR-133a-3p和miR-208a-3p的表达，其相对表 达水平以如图3所示：相比非心源性脑卒中患者，心源性脑卒中患者血清外泌体miR-155-5p和miR-93-5p水平较对照组无显著性差异(P>0.05；图3A)；而miR-133a-3p和miR-208a-3p水平较对照组显著增加(P＜0.001；图3B)；因此miR-133a-3p和miR-208a-3p可作为显著区分心源性缺血性脑卒中与非心源性缺血性脑卒中的标志物。
进一步，为了说明相比检测外周血游离的miR-133a-3p和miR-208a-3p，外泌体内的 miR-133a-3p和miR-208a-3p的变化更为灵敏，同样采用实时定量PCR对外周血游离miR-133a-3p和miR-208a-3p的表达进行检测，结果表明，相比非心源性脑卒中，心源性脑卒中患者外周血游离miR-133a-3p和miR-208a-3p水平较对照组的表达没有显著差异 (P>0.05)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳承启生物科技有限公司
<120> 外泌体中microRNA在诊断缺血性脑卒中疾病的用途
<130> 1
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人（human）
<400> 1
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人（human）
<400> 2
caaagugcug uucgugcagg uag 23
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人（human）
<400> 3
uuuggucccc uucaaccagc ug 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人（human）
<400> 4
auaagacgag caaaaagcuu gu 22
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacccct 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctacct 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccagctg 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacaagc 50
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acactccagc tgggttaatg ctaatcgtga t 31
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagtgcaggg tccgaggtat 20
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acactccagc tgggcaaagt gctgttcgtg c 31
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagtgcaggg tccgaggtat 20
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acactccagc tgggaaagga ccccaacaac 30
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagtgcaggg tccgaggtat 20
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acactccagc tgggataaga cgagcaaaaa 30
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagtgcaggg tccgaggtat 20

Claims (5)

1.一种检测外泌体中microRNA的试剂在制备评判脑缺血性损伤存在和损伤程度的产品中的用途，其中所述的microRNA包括miR-155-5p、miR-93-5p、miR-133a-3p和miR-208a-3p；
其中，所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度为区分心源性缺血性脑卒中与非心源性缺血性脑卒中；
其中，所述的外泌体为表达选自标志蛋白CD9，TSG101和HSP70中一种或几种的外泌体；
其中，所述的外泌体中microRNA为受试者血清的外泌体中microRNA。
2.权利要求1所述的用途，所述的检测外泌体中microRNA的试剂为检测microRNA的存在或水平的试剂。
3.权利要求1所述的用途，所述的评判脑缺血性损伤存在和/或损伤程度为诊断受试者缺血性脑卒中疾病。
4.权利要求1所述的用途，所述的检测外泌体中microRNA的试剂包括通过高分子聚合物沉淀溶液中Exoquick法提取外泌体的试剂。
5.权利要求1所述的用途，所述的检测外泌体中microRNA的试剂包括通过实时定量PCR法测定microRNA水平的试剂。
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