CN108064695B - 一种鸡爪槭红司组培快繁的方法 - Google Patents

一种鸡爪槭红司组培快繁的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鸡爪槭红司组培快繁的方法，包括：预处理：取鸡爪槭红司的当年生枝条，去除叶片，剪切成带芽茎段，进行灭菌及清洗处理，得到灭菌后的外植体；启动培养：将所述灭菌后的外植体接种于启动培养基进行启动培养，得到伸长的腋芽；增殖培养：将所述腋芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到无菌芽苗；生根培养：取所述无菌芽苗从基部切除愈伤组织后，接种于生根培养基进行生根培养，得到试管苗；所述组培快繁方法培养时间短，培养流程简便，提高了鸡爪槭红司繁殖的效率，诱导腋芽成活率98％以上，增殖系数5～7，生根率95％以上；能快速获得遗传性状一致的试管苗；能满足大规模的工厂化育苗及产业化发展需要。

Description

一种鸡爪槭红司组培快繁的方法
技术领域
本发明涉及组培快繁技术领域，具体涉及一种鸡爪槭红司组培快繁的方法。
背景技术
鸡爪槭红司(Acer palmatum‘beni-tsukasa’)为槭树科槭树属鸡爪槭(Acerpalmatum)的一个栽培品种，落叶灌木，树干直立，树冠圆顶形，生长于5-9区，成龄株高和冠幅3-3.6m，4月开花，花红色，全日照或部分遮荫，在中性或微酸性排水良好的肥沃沙壤土中生长良好。掌状叶，5-7裂，裂深至距叶基部1/2处，叶边缘有重锯齿。春天叶子由鲜亮的桃红色变为黄色和黄红色，春末则变为带有粉色和红色色调的绿色，夏天成熟叶子变为绿色和深绿色，微带花斑，秋天则呈红色和橙色。春天开花，花为红色。
因鸡爪槭红司生长季叶色变化的特点，其具有较高的观赏价值。鸡爪槭红司生长缓慢，枝条柔软，目前，繁殖方法以嫁接和种子繁殖为主的，种子繁殖植株变异性较大，优良性状无法很好的保持；嫁接繁殖因受季节和母本接穗的影响，无法快速高效地满足科研及大规模生产需要。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种鸡爪槭红司组培快繁的方法，所述组培快繁方法培养时间短，培养流程简便，提高了鸡爪槭红司繁殖的效率，诱导腋芽成活率98％以上，增殖系数5～7，生根率95％以上；能快速获得遗传性状一致的鸡爪槭红司试管苗；能满足大规模的工厂化育苗及产业化发展需要。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种鸡爪槭红司组培快繁的方法，包括：
预处理：取鸡爪槭红司的当年生枝条，去除叶片，剪切成带芽茎段，进行灭菌及清洗处理，得到灭菌后的外植体；
启动培养：将所述灭菌后的外植体接种于启动培养基进行启动培养，得到伸长的腋芽；所述启动培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.005～0.01mg/LTDZ，0.05～0.1mg/LNAA，0.1～0.4％PPM；
增殖培养：将所述腋芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到无菌芽苗；所述增殖培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.15～0.25mg/LCPPU，0.02～0.06mg/L2,4-D；
生根培养：取所述无菌芽苗从基部切除愈伤组织后，接种于生根培养基进行生根培养，得到试管苗；所述生根培养基包括：1/2WPM盐类和H有机，补充0.1～0.2mg/LNAA，0.4～0.6mg/LIBA。
本发明上述0.1～0.4％PPM为所述启动培养基中PPM含量为0.1～0.4％wt％。
优选的，所述预处理过程具体为：取鸡爪槭的当年生枝条，去除叶片，剪切成带1～2个芽的带芽茎段，酒精灭菌处理20～40s，无菌水清洗1～3次，升汞灭菌处理3～8min，无菌水清洗5～6次，得到灭菌后的外植体。
优选的，所述预处理过程具体为：取鸡爪槭红司的当年生枝条，去除叶片，剪切成带1～2个芽的带芽茎段，75Vol％酒精灭菌处理20～40s，无菌水清洗1～3次，0.1wt％升汞灭菌处理3～8min，无菌水清洗5～6次，得到灭菌后的外植体。
优选的，所述启动培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基均还包括：20～30g/L蔗糖、4～6g/L琼脂。
优选的，所述启动培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.005～0.01mg/L TDZ，0.05mg/L NAA，0.2％PPM。
本发明上述0.2％PPM为所述启动培养基中PPM含量为0.2％wt％。
优选的，所述增殖培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.15～0.25mg/L CPPU，0.04mg/L 2,4-D。
优选的，所述生根培养基包括：1/2WPM盐类和H有机，补充0.1～0.15mg/LNAA，0.4～0.6mg/L IBA。
优选的，所述启动培养基pH值为5.5～5.8；所述增殖培养基pH值为5.5～5.8；所述生根培养基pH值为5.8～6.2。
优选的，所述启动培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1500～2000Lx，光照时间为12～14h/d；所述增殖培养过程和所述生根培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1800～2200Lx，光照时间为12～14h/d。
优选的，所述启动培养过程得到的所述腋芽长度为1.0～1.5cm。
优选的，所述增殖培养过程得到的所述无菌芽苗株高1.0～2.0cm。
优选的，所述启动培养过程培养时间为21～28d；所述增殖培养过程培养时间为35～42d；所述生根培养过程培养时间为12～16d。
本发明上述WPM盐类包括：NH4N03 400mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 556mg/L，K2SO4990mg/L，CaCl2·2H2O 96mg/L，KH2PO4 170mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，MnSO4·H2O 22.4mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，Na2-EDTA 37.3mg/L；上述1/2WPM盐类包括：NH4N03 200mg/L，Ca(NO3)2.4H2O278mg/L，K2SO4 495mg/L，CaCl2·2H2O 48mg/L，KH2PO4 85mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，MnSO4·H2O 11.2mg/L，ZnSO4·7H2O 4.3mg/L，CuSO4·5H2O 0.125mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，Na2-EDTA 18.65mg/L；上述H有机包括：维生素B6 0.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L，叶酸0.5mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，生物素0.05mg/L。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
本申请技术方案提供了一种鸡爪槭红司的组培快繁方法，包括外植体的选取及灭菌、启动培养、增殖培养、生根培养的步骤，通过对启动初代培养基、增殖培养基、生根培养基的筛选，得到最佳的培养基组分和配比，配比形成的培养基，配方简单，培养基成本低，采用带芽茎段进行启动培养，通过添加TDZ和NAA进行调控，诱导腋芽萌发生长；通过在培养基中加入适宜浓度的植物组培抗菌剂PPM，有效抑制外植体的污染，以建立良好的无菌体系。再通过基本培养基中添加适当浓度的CPPU、2,4-D、NAA、IBA激素调节腋芽的继代增殖和生根，建立了稳定的组培繁殖体系。本申请组培快繁方法培养时间短，培养流程简便，提高了鸡爪槭红司繁殖的效率，诱导腋芽成活率98％以上，增殖系数5～7，生根率95％以上；能快速获得遗传性状一致的鸡爪槭红司试管苗。利用组培快繁技术，进行外植体培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响，能满足大规模的工厂化育苗及产业化发展需要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本发明实施例1中启动培养过程生长情况；
图2示出了本发明实施例1中增殖培养过程生长情况；
图3示出了本发明实施例1中生根培养过程生长情况。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
鸡爪槭红司组培快繁的方法，包括
预处理：取鸡爪槭红司的当年生枝条，去除叶片，剪切成带1～2个芽的带芽茎段，进行灭菌及清洗处理，得到灭菌后的外植体；
启动培养：将所述灭菌后的外植体接种于启动培养基进行启动培养，得到伸长的腋芽；所述启动培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.005～0.01mg/LTDZ，0.05～0.1mg/LNAA，0.1～0.4％PPM；
增殖培养：将所述腋芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到无菌芽苗；所述增殖培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.15～0.25mg/LCPPU，0.02～0.06mg/L2,4-D；
生根培养：取所述无菌芽苗从基部切除愈伤组织后，接种于生根培养基进行生根培养，得到试管苗；所述生根培养基包括：1/2WPM盐类和H有机，补充0.1～0.2mg/LNAA，0.4～0.6mg/LIBA。
本实施例中，所述无菌芽苗具有一定的木质化情况。所述启动培养基pH值为5.5～5.8；所述增殖培养基pH值为5.5～5.8；所述生根培养基pH值为5.8～6.2。所述启动培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1500～2000Lx，光照时间为12～14h/d。所述增殖培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1800～2200Lx，光照时间为12～14h/d。所述生根培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1800～2200Lx，光照时间为12～14h/d。
所述启动培养过程得到的所述腋芽长度为1.0～1.5cm。所述增殖培养过程得到的所述无菌芽苗株高1.0～2.0cm。0.1～0.4％PPM为所述启动培养基中PPM含量为0.1～0.4％wt％。
本实施例示出了本发明所述启动培养过程生长情况图1；所述增殖培养过程生长情况图2；所述生根培养过程生长情况图3。鸡爪槭红司增殖系数5～7。
实施例2
启动培养基中组分对腋芽启动培养的影响
预处理：取鸡爪槭红司的当年生枝条，去除叶片，剪切成带1～2个芽的带芽茎段，75Vol％酒精灭菌处理20～40s，无菌水清洗1～3次，0.1wt％升汞灭菌处理3～8min，无菌水清洗5～6次，得到灭菌后的外植体；
启动培养：将所述灭菌后的外植体接种于启动培养基进行启动培养，得到长度为1～1.5cm的伸长的腋芽；所述启动培养基包括：WPM盐类和H有机，补充TDZ，NAA，PPM，20～30g/L蔗糖、4～6g/L琼脂。所述启动培养基pH值为5.5～5.8；所述启动培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1500～2000Lx，光照时间为12～14h/d；
根据启动培养基中TDZ浓度，NAA浓度，PPM含量进行分组，观察并记录启动培养过程的培养情况，具体分组及培养结果见表1。
表1
Figure BDA0001545460310000061
从上表可以看出，本发明启动培养基包括：WPM盐类，补充0.005～0.01mg/LTDZ，0.05～0.1mg/L NAA，0.1～0.4％PPM，腋芽诱导成活率98％以上，培养时间21～28d；优选的，所述启动培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.005～0.01mg/L TDZ，0.05mg/L NAA，0.2％PPM；补充的TDZ，NAA，PPM三种组分共同作用，保证了本发明启动培养过程的进行。
实施例3
增殖培养基中生长激素浓度对腋芽增殖的影响
预处理：取鸡爪槭红司的当年生枝条，去除叶片，剪切成带1～2个芽的带芽茎段，75Vol％酒精灭菌处理20～40s，无菌水清洗1～3次，0.1wt％升汞灭菌处理3～8min，无菌水清洗5～6次，得到灭菌后的外植体；
启动培养：将所述灭菌后的外植体接种于启动培养基进行启动培养，得到长度为1.0～1.5cm的伸长的腋芽；所述启动培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.005～0.01mg/LTDZ，0.05mg/LNAA，0.2％PPM，20～30g/L蔗糖、4～6g/L琼脂；
增殖培养：将所述腋芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到株高1.0～2.0cm的无菌芽苗；所述增殖培养基包括：WPM盐类和H有机，补充CPPU，2,4-D，20～30g/L蔗糖、4～6g/L琼脂；
所述启动培养基pH值为5.5～5.8；所述增殖培养基pH值为5.5～5.8；所述启动培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1500～2000Lx，光照时间为12～14h/d；增殖培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1800～2200Lx，光照时间为12～14h/d；
根据增殖培养基中CPPU浓度，2,4-D浓度进行分组，观察并记录增殖培养过程的培养情况，具体分组及培养结果见表2。
表2
Figure BDA0001545460310000071
Figure BDA0001545460310000081
从上表可以看出，本发明增殖培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.15～0.25mg/LCPPU，0.02～0.06mg/L 2,4-D，增殖系数5～7，培养时间35～42d；优选的，增殖培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.15～0.25mg/L CPPU，0.04mg/L2,4-D。
实施例4
生根培养基中生长激素浓度对试管苗生根的影响
预处理：取鸡爪槭红司的当年生枝条，去除叶片，剪切成带1～2个芽的带芽茎段，75Vol％酒精灭菌处理20～40s，无菌水清洗1～3次，0.1wt％升汞灭菌处理3～8min，无菌水清洗5～6次，得到灭菌后的外植体；
启动培养：将所述灭菌后的外植体接种于启动培养基进行启动培养，得到长度为1.0～1.5cm的伸长的腋芽；所述启动培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.005～0.01mg/LTDZ，0.05mg/LNAA，0.2％PPM，20～30g/L蔗糖、4～6g/L琼脂；
增殖培养：将所述腋芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到株高1.0～2.0cm的无菌芽苗；所述增殖培养基包括：WPM盐类和H有机，补充0.20mg/LCPPU，0.04mg/L2,4-D，20～30g/L蔗糖、4～6g/L琼脂；
生根培养：取所述无菌芽苗从基部切除愈伤组织后，接种于生根培养基进行生根培养，得到试管苗；所述生根培养基包括：1/2WPM盐类和H有机，补充NAA，IBA，20～30g/L蔗糖、4～6g/L琼脂。
所述启动培养基pH值为5.5～5.8，所述生根培养基pH值为5.8～6.2；所述增殖培养基pH值为5.5～5.8；所述启动培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1500～2000Lx，光照时间为12～14h/d；所述增殖培养过程和所述生根培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1800～2200Lx，光照时间为12～14h/d；
根据生根培养NAA浓度，IBA浓度含量进行分组，观察并记录生根培养过程中的培养情况，具体分组及培养结果见表3。
表3
Figure BDA0001545460310000091
从上表可以看出，本发明生根培养基包括：1/2WPM盐类和H有机，补充0.1～0.2mg/L NAA，0.4～0.6mg/L IBA，生根率95％以上，培养时间12～16d；优选的，生根培养基包括：1/2WPM盐类和H有机，补充0.1～0.15mg/L NAA，0.4～0.6mg/LIBA。
本发明中，培养基成分解释：
TDZ：所述TDZ是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等，可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，可用作植物组织培养。
NAA：所述NAA为萘乙酸，是一种植物生长激素，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组培快繁，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
PPM：所述PPM(Plant Preservative Mixture)是一种广谱抗微生物剂，可以杀死细菌和真菌细胞，防止真菌孢子的萌发，并在较高浓度下能消除内源性污染的外植体。PPM活性成分可以渗透过真菌或细菌细胞壁，抑制柠檬酸循环和电子传递链等中心代谢循环中的关键酶的活性，并且可以抑制培养基中的单糖和氨基酸向真菌和细菌细胞的运输。PPM能有效地抑制植物细胞和植物组织培养中的通过空气、水、人传播的微生物污染及内源性污染，而不会影响体外种子发芽、愈伤组织增殖和愈伤组织的再生。
CPPU：所述CPPU为氯吡苯脲，作为植物生长调节剂可促进植物细胞分裂和增大。
2,4-D：所述2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，作为植物生长调节剂可促进植物生根，调节细胞生长。
IBA：所述IBA为吲哚丁酸，是一种植物生长激素，主要用于插条生根，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成。
WPM盐类：所述WPM盐类为WPM培养基(Wood Plant medium)的无机盐成分，WPM培养基为木本植物培养基，适用于多种木本植物的组培快繁，其无机成分见表4：
表4
Figure BDA0001545460310000101
Figure BDA0001545460310000111
1/2WPM盐类：所述1/2WPM盐类为1/2WPM培养基的无机盐成分，1/2WPM培养基为WPM培养基中无机成分含量减半，其余不变形成的培养基。
H有机：所述H有机为H培养基(Bourgin and Nitsch(1967)medium)的有机物成分，H培养基有机成分见表5：
表5
维生素B1 0.5mg/L
维生素B6 0.5mg/L
甘氨酸 2.0mg/L
叶酸 0.5mg/L
肌醇 100mg/L
烟酸 0.5mg/L
生物素 0.05mg/L
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种鸡爪槭红司组培快繁的方法，其特征在于，包括：
预处理：取鸡爪槭红司的当年生枝条，去除叶片，剪切成带芽茎段，进行灭菌及清洗处理，得到灭菌后的外植体；
启动培养：将所述灭菌后的外植体接种于启动培养基进行启动培养，得到伸长的腋芽；所述启动培养基为：WPM盐类和H有机，补充0.005～0.01mg/LTDZ，0.05～0.1mg/LNAA，0.1～0.4％PPM，20～30g/L蔗糖，4～6g/L琼脂；
增殖培养：将所述腋芽接种于增殖培养基进行增殖培养，得到无菌芽苗；所述增殖培养基为：WPM盐类和H有机，补充0.15～0.25mg/LCPPU，0.04mg/L2,4-D，20～30g/L蔗糖，4～6g/L琼脂；
生根培养：取所述无菌芽苗从基部切除愈伤组织后，接种于生根培养基进行生根培养，得到试管苗；所述生根培养基为：1/2WPM盐类和H有机，补充0.1～0.2mg/LNAA，0.4～0.6mg/LIBA，20～30g/L蔗糖，4～6g/L琼脂；
所述启动培养基pH值为5.5～5.8；所述增殖培养基pH值为5.5～5.8；所述生根培养基pH值为5.8～6.2。
2.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述预处理过程具体为：取鸡爪槭红司的当年生枝条，去除叶片，剪切成带1～2个芽的带芽茎段，酒精灭菌处理20～40s，无菌水清洗1～3次，升汞灭菌处理3～8min，无菌水清洗5～6次，得到灭菌后的外植体。
3.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述启动培养基为：WPM盐类和H有机，补充0.005～0.01mg/L TDZ，0.05mg/LNAA，0.2％PPM，20～30g/L蔗糖，4～6g/L琼脂。
4.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述生根培养基为：1/2WPM盐类和H有机，补充0.1～0.15mg/LNAA，0.4～0.6mg/LIBA，20～30g/L蔗糖，4～6g/L琼脂。
5.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述启动培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1500～2000Lx，光照时间为12～14h/d；所述增殖培养过程和所述生根培养过程培养温度为24～26℃，光照强度为1800～2200Lx，光照时间为12～14h/d。
6.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述启动培养过程得到的所述腋芽长度为1～1.5cm。
7.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述增殖培养过程得到的所述无菌芽苗株高1.0～2.0cm。
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