CN108064160B - 一种含有牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物或其级分作为活性成分的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于治疗和预防神经退行性疾病的药物组合物，其包含选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的两种或多种的混合物的提取物或其级分作为活性成分。特别地，本发明的混合物的提取物显示出对线粒体功能损伤的恢复作用、对内质网应激的缓解作用，并且同时显示出对炎症反应的抑制作用，与体外单一提取物所显示的效果相比具有显著的改善，并且在帕金森氏病动物模型中，所述混合物的提取物显著地显示出对运动协调的改善作用和对多巴胺能神经元的保护作用，因此本发明所述的混合物的提取物或其级分可用作治疗和预防神经退行性疾病的药物组合物的活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于治疗和预防神经退行性疾病的药物组合物，其包含选自牡丹根皮(Moutan Radicis Cortex)、白芷根(Angelicae Dahuricae Radix)和柴胡根(Bupleuri Radix)中的两种或多种的混合物的提取物或其级分作为活性成分。
背景技术
在过去的二十年里，世界上患有神经退行性疾病的患者迅速增加。在治疗神经退行性疾病中，最重要的步骤是预防。然而，这种疾病的病因尚未被清楚地了解，因而仍然需要研究治疗方法。神经退行性疾病的常见病理现象是中枢神经系统细胞的死亡。不同于其他的器官细胞，中枢神经系统细胞几乎不可能在细胞死亡后再生，导致功能的永久丧失。迄今为止开发的用于这种脑疾病治疗的方法主要集中于分析神经细胞自身的死亡机制和基于该分析预防死亡。根据最近对阿尔茨海默病和帕金森氏病的基础和临床研究的结果，脑中的炎症反应是神经元死亡的主要原因。实际上，已经证实在脑疾病患者的脑脊液中炎症介质和反应性氧会增加。此外，在脑损伤的区域中观察到许多活性小胶质细胞，表明脑炎症是帕金森氏病的主要原因。此外，在脑损伤的区域中观察到活性小胶质细胞的数量，表明脑炎症是帕金森氏病的主要原因。因此，通过神经胶质细胞抑制脑炎症已经变成治疗神经退行性疾病的靶点。然而，迄今为止开发的治疗剂仅在调节疾病的症状方面有效，但在治疗神经退行性疾病本身方面并无效。在现代社会中不断暴露的许多环境污染物和由污染物产生的基因突变会引起退神经退行性疾病。因此，需要开发基于与常规概念完全不同的概念的用于神经退行性疾病的预防和治疗剂。
神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森氏病、中风、亨廷顿病和脊髓损伤等。在这些疾病中，帕金森氏病是第二大最常见的神经退行性疾病，影响了1～2％的60岁以上的韩国人和4～5％的85岁以上韩国人。最近在韩国40～50岁的中年人中，帕金森氏病急剧增加。在以前的报告中，帕金森氏病似乎是由多巴胺缺乏诱导的，多巴胺缺乏是由中脑黑质和纹状体中多巴胺能神经元的死亡引起的。多巴胺能神经元的选择性死亡的原因尚未得到解释。因而，有效的治疗剂和诊断试剂也尚未开发出来。帕金森氏病显示出面无表情、僵硬、震颤、弯曲姿态和运动迟缓的症状。
最近已经提出线粒体功能障碍可能是各种神经退行性疾病(包括帕金森氏病)的诱因。作为家族性帕金森氏病(家族性PD)的致病基因，涉及活性氧(ROS)和蛋白水解产生的基因如PARK1/4(α-突触核蛋白)、PARK2(帕金蛋白)、PARK6(PTEN诱导的假定激酶1，PINK1)、PARK7(DJ-1)和PARK8(富含亮氨酸的重复激酶2，LRRK2)和存在于线粒体内膜中的PARK13(HTRA2/0MI)已被确定。(Nat.Clin.Pract.Neurol 2，136-146，2006).PINKI、帕金蛋白和DJ-1参与线粒体动力学中的这种作用，如裂变和融合以支持线粒体的网络结构(PLoSBioI.6，e1000298，2010)。
散发性帕金森氏病(散发性PD)占所有帕金森氏病的95％，也以线粒体活动性损伤为特征。已知杀虫剂/除草剂如百草枯和鱼藤酮是通过抑制线粒体的电子传递系统来破坏线粒体活性的引发物质。用于建立帕金森氏病动物模型的MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)及其代谢物MPP+被称为线粒体电子传递系统复合物1的选择性抑制剂。该实例表明，由于线粒体功能障碍引起的多巴胺能神经元的选择性死亡可能是帕金森氏病的病因，同时线粒体活性的恢复可能是治疗帕金森氏病的重要靶点。
内质网(细胞内细胞器)分为具有附着的核糖体的粗糙内质网(粗ER，RER)和平滑内质网(平滑ER，SER)。粗糙内质网的主要功能是合成蛋白质。约1/3的细胞内蛋白质在粗糙内质网中合成。同时，各种脂质和类固醇激素在平滑内质网中合成。平滑ER也在调节细胞内钙浓度中起重要作用。然而，由于各种原因，蛋白质的异常折叠导致内质网的功能性损伤，这被称为内质网应激。当内质网应激继续时，通过各种信号转导增加细胞凋亡和大量活性氧簇(ROS)形成，导致细胞损伤。也有报道称，内质网应激也是神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、中风、亨廷顿病和伴随代谢综合征的脊髓损伤、糖尿病、肥胖和由线粒体损伤介导的血脂异常的病因(Lindholm等人，2006；Penas等人，2007；Yoshida，2007；Zhang等人，2006)。
牡丹根皮(牡丹皮)是牡丹的根皮，它是含有芍药醇、芍药甙、羟基芍药苷和没食子酸或芍药甙元酮的草药。在东方医学中，已知牡丹根皮在松弛、止痛、抗炎和治疗炎症疾病方面是有效的。已知牡丹根皮具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗衰老活性，最近报道了其作为各种混合物的组分治疗脑疾病的功效。
白芷根是白芷(Angelica dahurica Bentham et Hooker f.)或杭白芷(Angelicadahurica Bentham et Hooker f.var.formosana Shan et Yuan)的干根，白芷是一种原产于韩国、中国和日本的2～3年生草本植物。白芷根的主要生物活性化合物是欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素、珊瑚菜内酯和白当归脑。在东方医学中，已经知晓白芷根的各种功效。尤其已知其能有效地减轻发汗、镇静、疼痛、感冒、头痛或牙痛。然而，没有关于白芷根参与改善线粒体功能和缓解内质网应激以提高神经元疾病治疗效果的报告。
柴胡根是一种药用植物，是指柴胡(膜缘柴胡，Bupleurum falcatum Linne)或其变种(伞形科(Umbelliferae))的根。
柴胡根的主要药理活性有例如解热、舒缓、镇痛、抗菌、抗病毒和抗炎活性。柴胡根的主要药理活性是解热、舒缓、镇痛、抗菌、抗病毒和抗炎活性。
本发明人尝试从可食用草药开发一种用于神经退行性疾病的治疗剂。结果，本发明人发现，选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的两种或多种类型的混合物的提取物具有恢复线粒体功能损伤、缓解内质网应激并同时抑制炎症反应的活性，这明显高于各自单一提取物所显示的活性。上述混合物的提取物显著改善运动协调性，并在帕金森氏病模型中显示出对体内多巴胺能神经元的保护作用，因此本申请发明人证实，牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物或级分可用作治疗和预防神经退行性疾病的药物组合物的活性成分，从而完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，其包含选自牡丹根皮(Moutan Radicis Cortex)、白芷根(Angelicae Dahuricae Radix)和柴胡根(Bupleuri Radix)中的两种或多种的混合物的提取物或其级分作为活性成分，以及一种用于改善或预防神经退行性疾病的包含上述组合物的保健功能性食品。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，其包含选自牡丹根皮(Moutan Radicis Cortex)、白芷根(Angelicae DahuricaeRadix)和柴胡根(Bupleuri Radix)中的两种或多种的混合物的提取物作为活性成分。
本发明还提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，其包含上述混合物的提取物的有机溶剂级分作为活性成分。
本发明还提供一种用于改善或预防神经退行性疾病的保健功能性食品，其包含选自牡丹根皮、白芷根和当归根中的两种或多种的混合物的提取物作为活性成分。
本发明还提供一种用于改善或预防神经退行性疾病的健康功能食品，其包含上述混合物的提取物的有机溶剂级分作为活性成分。
本发明还提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的方法，其包括向患者施用药学有效剂量的选自牡丹根皮(Moutan Radicis Cortex)、白芷根(Angelicae DahuricaeRadix)和柴胡根(Bupleurum radix)中的两种或多种的混合物的提取物的步骤。
本发明还提供一种用在治疗或预防神经退行性疾病中的药物组合物，其包括选自牡丹根皮(Moutan Radicis Cortex)、白芷根(Angelicae Dahuricae Radix)和柴胡根(Bupleurum radix)中的两种或多种的混合物的提取物。
本发明还提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的方法，其包括向患者施用药学有效剂量的选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的两种或多种的混合物的提取物的有机溶剂级分的步骤。
本发明还提供一种用在治疗或预防神经退行性疾病中的药物组合物，其包括选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的两种或多种的混合物的提取物的有机溶剂级分。
有益效果
选自牡丹根皮(Moutan Radicis Cortex)、白芷根(Angelicae Dahuricae Radix)和柴胡根(Bupleuri Radix)中的两种或多种混合物的提取物可以增加细胞内ATP水平，恢复受损线粒体膜电位；并且当在帕金森氏病模型中线粒体功能损伤、内质网应激和炎症反应被同时诱导时以单一提取物1.5倍的强度抑制ROS产生。本发明的混合物的提取物在帕金森氏病动物模型中也被证实在改善运动协调性和保护多巴胺能神经元方面是显著有效的，因此本发明混合物的提取物或其级分能够有效地用作用于预防和治疗神经退行性疾病的药物组合物的活性成分。
附图的简要说明
参考附图可以更好地理解本发明的优选实施例的应用，其中：
图1是说明通过1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)给药构建帕金森氏病动物模型的方法的示意图。特别地，将由牡丹根皮、白芷根和柴胡根以1∶1∶1的比例组成的混合物的冷冻干燥的90％乙醇提取物溶解在3％HPMC中，将其施用(口服，p.o.)于测试小鼠(1、3或10mg/kg)，每天一次，持续14天。从实验的第8天开始，以3小时30mg/kg的剂量向小鼠施用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)(腹膜内，i.p.)，口服给药5天后，构建成帕金森氏病动物模型。将制备的小鼠模型用于行为测试。处死动物并进行细胞分析和蛋白质免疫印迹(western blotting)。
图2是说明通过6-OHDA(6-羟基多巴胺)给药构建帕金森氏病动物模型的方法的示意图。特别地，将16μg的6-OHDA(6-羟基多巴胺)在2μL的0.1％抗坏血酸中稀释，通过立体定位手术将其注射给测试动物一次，即构建成帕金森氏病动物模型。手术后一周，将由牡丹根皮、白芷根和柴胡根以1∶1∶1的比例组成的混合物的冷冻干燥的90％乙醇提取物溶解在水中，将其以3mg/kg的剂量施用(口服，p.o.)于小鼠，每天一次，持续7天。将制备的小鼠模型用于行为测试。处死动物并进行细胞分析和蛋白质免疫印迹。
图3是说明通过鱼藤酮给药构建帕金森氏病动物模型的方法的示意图。特别地，将由牡丹根皮、白芷根和柴胡根以1∶1∶1的比例组成的混合物的冷冻干燥的90％乙醇提取物溶解在水中，将其以10mg/kg的剂量施用(口服，p.o.)于大鼠，每天一次，持续6周。口服给药后1周，以2.5mg/kg的剂量将鱼藤酮注射(腹膜内，i.p.)至大鼠，每天一次，持续5周，构建成帕金森氏病动物模型。将制备的大鼠模型用于行为测试。处死动物并进行细胞分析和蛋白质免疫印迹。
图4是说明通过LPS(脂多糖)给药构建帕金森氏病动物模型的方法的示意图。特别地，将由牡丹根皮、白芷根和柴胡根以1∶1∶1的比例组成的混合物的冷冻干燥的90％乙醇提取物溶解在水中，将其以10或30mg/kg的剂量施用(口服，p.o.)于小鼠，每天一次，持续3天。最后一次给药后，以5mg/kg的剂量向小鼠施用LPS(脂多糖)(腹膜内，i.p.)一次，构建成帕金森氏病动物模型。将制备的小鼠模型用于抗脑炎症测试。
具体实施方式
本发明将在下文中进行详细描述。
本发明提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，其包含选自牡丹根皮(Moutan Radicis Cortex)、白芷根(Angelicae Dahuricae Radix)和柴胡根(Bupleuri Radix)中的两种或多种的混合物的提取物作为活性成分。
本发明还提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的药物组合物，其包括选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的两种或多种的混合物的提取物的有机溶剂级分作为活性成分。
优选以1∶0.2～5∶0.2～5(w∶w∶w)的重量比混合牡丹根皮、白芷根和柴胡根。更优选以1∶0.5～2∶0.5～2(w∶w∶w)的比例，最优选以1∶1∶1(w∶w∶w)的比例混合牡丹根皮、白芷根和柴胡根，但并不总是限于此。
两种选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的物质优选以1∶0.2～5(w∶w)的重量比，更优选以1∶0.5～2(w∶w)的重量比，最优选以1∶1(w∶w)重量比混合，但并不总是限于此。
上述混合物的提取物优选通过使用水、C1-C4低级醇或其混合物作为溶剂提取，此时该低级醇优选为乙醇、甲醇或丁醇。
混合物的提取物优选从选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种物料组成的混合物中提取，但是能够从各牡丹根皮、白芷根和柴胡根提取物中的至少两种提取物组成的混合物中提取。
上述混合物的提取物优选通过包括以下步骤的方法制备，但不总是限于此：
1)向选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种物质组成的混合物中加入提取溶剂，然后提取；
2)过滤步骤1)的提取物；和
3)在减压下浓缩步骤2)中获得的滤液，然后将其干燥。
在上述方法中，步骤1)的牡丹根皮、白芷根和柴胡根被购买或栽培所得。
在上述方法中，提取提取物的方法是任意常规方法，例如过滤、热水提取、脂吸法、回流提取和超声波提取。
在该方法中，步骤3)中减压下的浓缩优选通过使用真空浓缩器或真空旋转蒸发器进行，但不总限于此。本文的干燥优选通过减压干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥或冷冻干燥进行，但不总限于此。
所述级分优选通过加入有机溶剂由提取物制备。本文的有机溶剂优选为选自由己烷、氯仿、乙酸乙酯和丁醇中的一种或多种溶剂，更优选为丁醇，但不限于此。
所述提取物优选含有选自由式1表示的芍药醇(2′-羟基-4′-甲氧基苯乙酮)、由式2表示的芍药甙、由式3表示的芍药甙元酮([(2s，3as，5s，7ar，8s)-3a-羟基-7a-甲基-6-氧代六氢-2，5-甲桥-1，3-苯并二氧杂环戊烯-8-基]甲基苯甲酸酯)、由式4表示的欧前胡素(9-[(3-甲基-2-丁烯-1-基)氧基]-7H-呋喃并[3，2-g][1]苯并吡喃-7-酮)、由式5表示的柴胡皂苷A((3β，4α，16β)-13，28-环氧-16，23-二羟基齐墩果-11-烯-3-基-6-脱氧-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)、由式6表示的柴胡皂苷B2((3b，4a，16a)-16，23，28-三羟基齐墩果-11，13(18)-二烯-3-基-6-脱氧-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)、由式7表示的柴胡皂苷B4((3β，11α，16α)-16，23，28-三羟基-11-甲氧基齐墩果-12-烯-3-基-6-脱氧-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)和由式8表示的柴胡皂苷D((3b，4a，16a)-13，28-环氧-16，23-二羟基齐墩果-11-烯-3-基-6-脱氧-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)中的一种或多种化合物，但不总限于此：
[式1]
[式2]
[式3]
[式4]
[式5]
[式6]
[式7]
[式8]
上述提取物优选抑制线粒体功能损伤、内质网应激或炎症反应，但不总限于此。
本文的神经退行性疾病优选选自痴呆、亨廷顿病、帕金森氏病、阿尔茨海默病、中风、卢伽雷氏病(肌萎缩侧索硬化症)和脊髓损伤，但不总限于此。
在本发明的优选实施方案中，本发明人研究了具有诱导功能损伤的神经元细胞的恢复，以证实牡丹根皮、白芷根或柴胡根的单一提取物的效果。
结果证实，牡丹根皮的单一提取物对线粒体的功能损伤具有恢复作用(见表2～7)，而白芷根的单一提取物对内质网应激具有恢复作用(见表8～13)。还证实了柴胡根单一提取物具有对炎症的恢复作用(参见表14～20)。
由根据本发明的选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根的至少两种物质组成的混合物的提取物显示ATP水平恢复作用，且会抑制帕金森氏病细胞模型中活性氧簇的产生。特别地，牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物显示对线粒体的功能损伤有显著的恢复作用(参见表21～24)。
本发明人还研究了牡丹根皮、白芷根和柴胡根混合物的提取物根据混合比例对帕金森氏病细胞模型中细胞功能的恢复作用。结果显示，当这些草药材料以1∶1∶1(w∶w∶w)的比例混合时，细胞功能恢复作用最有效(参见表24～26)。本发明人还研究了牡丹根皮、白芷根和柴胡根混合乙醇提取物根据乙醇浓度对帕金森氏病细胞模型中细胞功能的恢复作用。结果显示，当混合物的提取物通过使用90％的乙醇提取处理时，组合细胞功能恢复作用的提升最为显著(参见表28～30)。与水提取物、甲醇提取物和丁醇提取物相比，乙醇提取物可以最显著地提升恢复效果(参见表31～33)。
为了确认由比例为1∶1∶1(w∶w∶w)的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物制备得到的混合的90％乙醇提取物的效果，在以细胞功能损伤诱导的神经元细胞系中研究恢复作用。结果证实，混合物的提取物对线粒体的功能损伤、内质网应激和炎症显示出恢复作用(参见表34～38)。
此外，使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)、6-羟基多巴胺(6-OHDA)、鱼藤酮和LPS(脂多糖)构建的帕金森氏病动物模型，以确认牡丹根皮、白芷根和柴胡根混合物的提取物在体内对帕金森氏病的治疗效果。将混合物的提取物施用于经MPTP处理构建的帕金森氏病小鼠模型，然后进行行为试验。结果显示，与未以本发明的混合物的提取物处理的动物模型相比，在帕金森氏病模型中运动协调性得到改善。本发明的混合物的提取物也被证实对多巴胺能神经元具有保护作用，且对纹状体(ST)、黑质(SN)和小脑中的信号转导系统损伤具有恢复作用(参见表39～47)。还对经6-OHDA处理构建的帕金森氏病小鼠模型进行了行为测试。结果证实，本发明的混合物的提取物对运动协调性具有改善作用，并且对纹状体和黑质中的多巴胺能神经元具有保护作用(参见表48～52)。还对经鱼藤酮处理构建的帕金森氏病小鼠模型进行了行为测试。结果显示，被鱼藤酮抑制的运动功能得到改善，并且在黑质中，α-突触核蛋白低聚物的积累、帕金森氏病的主要致病因子减少(参见表53～54)。同时，在经应用LPS构建的神经炎症小鼠模型中，在黑质和海马体中诱导的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活被牡丹根皮、白芷根和柴胡根混合物的提取物抑制，表明其显示了抗炎效果(参见表55～58)。
本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物显示了对线粒体功能损伤的恢复作用、对内质网应激的缓解作用，并且同时显示了其对炎症反应的抑制作用，与在体外单一提取物所显示的效果相比具有显著的改善，并且在帕金森氏病动物模型中，混合物的提取物显著地显示出对运动协调性的改善作用和对多巴胺能神经元的保护作用，因此本发明的混合物的提取物或其级分可用作治疗和预防神经退行性疾病的药物组合物的活性成分。
本发明的组合物能够口服或肠胃外给药，并以药物制剂的一般形式使用。也就是说，本发明的组合物可以通过与通常使用的稀释剂或赋形剂如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂混合来制备以用于口服或肠胃外给药。
用于口服给药的固体制剂为片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊剂。这些固体制剂通过将所述甜菜碱与一种或多种合适的赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等混合而制备。除了简单的赋形剂之外，也可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。用于口服给药的液体制剂为悬浮液、溶液、乳液和糖浆，并且除了通常使用的简单稀释剂如水和液体石蜡之外，上述制剂可以含有各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。
用于肠胃外给药的制剂为灭菌水溶液、水不溶性赋形剂、悬浮液、乳液、冻干制剂和栓剂。水不溶性赋形剂和混悬液除了含有活性化合物外，还可以含有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射的酯如油酸乙酯等。栓剂除活性化合物外还可以含有witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂油、甘油、明胶等。
本发明的组合物可以口服或胃肠外给药，胃肠外给药的优选示例为皮肤外用、腹膜内注射、直肠内注射、静脉内注射、肌内注射、皮下注射、子宫内注射和脑室内注射。其中，更优选皮肤外用。
本发明的组合物优选以药学有效剂量施用。本文的术语“药学有效剂量”表示足以治疗疾病的适当的、合理的或有风险的浓度的量。该剂量可以通过考虑许多因素来确定，例如疾病类型、疾病严重性、药物活性、对药物的敏感性、给药频率和途径、排泄物、治疗期限、共治疗药物及在药物领域中被认为相关的其它因素。本发明的组合物可以单独给药或与其它药物一起给药。如果需要联合治疗，可以分步或同时进行给药。组合物可以单次或多次施用。重要的是，考虑以上所有的因素，并且施用在没有副作用的情况下最小量就能够获得最大效果的用量，这样的用量可以由本领域技术人员容易地确定。
本发明化合物的有效剂量可根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法、排泄物和疾病的严重程度来确定。剂量为每天0.01～1000mg/kg，优选每天30～500mg/kg，更优选每天50～300mg/kg，给药频率优选为每天1～6次。然而，有效剂量可以根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重和患者年龄等增加或减少，因此，上述有效剂量在任何方面都不能限制本发明。
本发明的组合物可以单独施用或与外科手术、激素治疗、化学治疗和生物调节剂一起施用。
本发明还提供一种用于改善或预防神经退行性疾病的保健功能性食品，其包含选自牡丹根皮、白芷根和当归根中的两种或多种的混合物的提取物作为活性成分。
本发明还提供一种用于改善或预防神经退行性疾病的保健功能性食品，其包括选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的两种或多种的混合物的提取物的有机溶剂级分作为活性成分。
优选以1∶0.2～5∶0.2～5(w∶w∶w)的重量比混合牡丹根皮、白芷根和柴胡根。更优选以1∶0.5～2∶0.5～2(w∶w∶w)的比率，最优选以1∶1∶1(w∶w∶w)的比率混合牡丹根皮、白芷根和柴胡根，但并不总是限于此。
两种选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的物质优选以1∶0.2～5(w∶w)的重量比，更优选以1∶0.5～2(w∶w)的重量比，最优选以1∶1(w∶w)重量比混合，但并不总是限于此。
上述混合物的提取物优选通过使用水、C1-C4低级醇或其混合物作为溶剂提取，此时所述低级醇优选为乙醇、甲醇或丁醇。
混合物的提取物优选从选自牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种物质组成的混合物中提取，但是可以从各牡丹根皮提取物、白芷根提取物和柴胡根提取物中的至少两种提取物组成的混合物中提取。
所述提取物优选含有选自由式1表示的芍药醇、由式2表示的芍药甙、由式3表示的芍药甙元酮、由式4表示的欧前胡素、由式5表示的柴胡皂苷A、由式6表示的柴胡皂苷B2、由式7表示的柴胡皂苷B4和由式8表示的柴胡皂苷D中的一种或多种化合物，但不总限于此。
上述混合物的提取物优选抑制线粒体功能损伤、内质网应激和炎症反应.但不总限于此。
本文的神经退行性疾病优选选自：痴呆、亨廷顿病、帕金森氏病、阿尔茨海默病、中风、卢伽雷氏病(肌萎缩侧索硬化症)和脊髓损伤，更优选为帕金森氏病，但不总限于此。
本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物显示了对线粒体功能损伤的恢复作用、对内质网应激的缓解作用，并且同时显示了其对炎症反应的抑制作用，与在体外单一提取物所显示的效果相比具有显著的改善，并且在帕金森氏病动物模型中，混合物的提取物显著地显示出对运动协调性的改善作用和对多巴胺能神经元的保护作用，因此本发明的混合物的提取物或其级分可用作改善和预防神经退行性疾病的保健功能性食品的活性成分。
本发明还提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的方法，其包括向患者施用药学有效剂量的选自牡丹根皮(Moutan Radicis Cortex)、白芷(Angelicae DahuricaeRadix)和柴胡根(Bupleurum radix)中的两种或多种的混合物的提取物的步骤。
本发明还提供一种用在治疗或预防神经退行性疾病中的药物组合物，其包括选自牡丹根皮(Moutan Radicis Cortex)、白芷(Angelicae Dahuricae Radix)和柴胡根(Bupleurum radix)中的两种或多种的混合物的提取物。
本发明还提供一种用于治疗或预防神经退行性疾病的方法，其包括向患者施用药学有效剂量的选自牡丹根皮、白芷和柴胡根中的两种或多种的混合物的提取物的有机溶剂级分的步骤。
此外，本发明提供一种用在治疗或预防神经退行性疾病中的药物组合物，其包括选自牡丹根皮、白芷和柴胡根中的两种或多种的混合物的提取物的有机溶剂级分。
本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物显示了对线粒体功能损伤的恢复作用、对内质网应激的缓解作用，并且同时显示了其对炎症反应的抑制作用，与在体外单一提取物所显示的效果相比具有显著的改善，并且在帕金森氏病动物模型中，混合物的提取物显著地显示出对运动协调性的改善作用，对多巴胺能神经元的保护作用和抗炎症作用，因此本发明的混合物的提取物或其级分可用作治疗和预防神经退行性疾病的药物组合物的活性成分。
本发明实际的和目前优选的实施方案被在如以下所示的实施例中进行了阐述。
然而，应当理解，本领域技术人员在考虑本公开的情况下可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1：牡丹根皮、白芷根和柴胡根各自的单一提取物的制备
<1-1>牡丹根皮乙醇提取物的制备
将90％乙醇加入到牡丹根皮(Moutan Radicis Cortex；Jeungdo中草药公司，韩国)中，然后在室温下提取110分钟。通过过滤提取物制备乙醇提取物。将所得提取物冷冻干燥并保存。在使用时，将提取物溶解在缓冲液中。芍药醇作为提取物的指标成分用于确认纯度。
<1-2>白芷根乙醇提取物的制备
将90％乙醇加入到白芷根(Angelicae Dahuricae Radix；Jeungdo中草药公司，韩国)中。通过与实施例<1-1>中所述相同的方式制备白芷根的乙醇提取物。欧前胡素作为白芷根提取物的指标成分用于确认纯度。
<1-3>柴胡根乙醇提取物的制备
将90％乙醇加入到柴胡根(Bupleuri Radix；Jeungdo中草药公司，韩国)中。通过与实施例<1-1>中所述相同的方式制备柴胡根的乙醇提取物。柴胡皂苷A作为柴胡根提取物的指标成分用于确认纯度。
实施例2：牡丹根皮和白芷根的混合物的提取物的制备
将牡丹根皮和白芷根以1∶5、1∶1或1∶0.2(w∶w)的比例混合，向其中加入90％乙醇，然后在室温下提取110分钟。通过过滤提取物制备牡丹根皮和白芷根的混合乙醇提取物。将所得的混合乙醇提取物冷冻干燥并保存。在使用时，将提取物溶解在水或缓冲液中。芍药醇和欧前胡素作为该混合提取物的指标成分用于确认纯度。
实施例3：牡丹根皮和柴胡根的混合物的提取物的制备
将牡丹根皮和柴胡根以1∶5、1∶1或1∶0.2(w∶w)的比例混合，向其中加入90％乙醇，然后在室温下提取110分钟。通过过滤提取物制备牡丹根皮和柴胡根的混合乙醇提取物。将所得的混合乙醇提取物冷冻干燥并保存。在使用时，将提取物溶解在缓冲液中。芍药醇和柴胡皂苷A作为混合提取物的指标成分用于确认纯度。
实施例4：白芷根和柴胡根的混合物的提取物的制备
将白芷根和柴胡根以1∶5、1∶1或1∶0.2(w∶w)的比例混合，向其中加入90％乙醇，然后在室温下提取110分钟。通过过滤提取物制备白芷根和柴胡根的混合乙醇提取物。将所得的混合乙醇提取物冷冻干燥并保存。在使用时，将提取物溶解在缓冲液中。欧前胡素和柴胡皂苷A作为混合提取物的指标成分用于确认纯度。
实施例5：牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的制备
<5-1>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合乙醇提取物的制备
将牡丹根皮、白芷根和柴胡根以如下方表1所示的比例混合，向其中加入10％、30％、50％、70％或90％乙醇，然后在室温下提取110分钟。通过过滤提取物制备牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合乙醇提取物。将所得的混合乙醇提取物冷冻干燥并保存。在使用时，将提取物溶解在缓冲液中。芍药醇、柴胡皂苷A和欧前胡素作为混合提取物的指标成分用于确认纯度。
【表1】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合比例
<5-2>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合水提取物的制备
牡丹根皮、白芷根和柴胡根以1∶1∶1(w∶w∶w)的比例混合，向其中加入水。通过与实施例<5-1>中所述相同的方式制备牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合水提取物。
<5-3>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合甲醇提取物的制备
牡丹根皮、白芷根和柴胡根以1∶1∶1(w∶w∶w)的比例混合，向其中加入90％甲醇。通过与实施例<5-1>中所述相同的方式制备牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合甲醇提取物。
<5-4>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合丁醇提取物的制备
牡丹根皮、白芷根和柴胡根以1∶1∶1(w∶w∶w)的比例混合，向其中加入90％丁醇。通过与实施例<5-1>中所述相同的方式制备牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合丁醇提取物。
实验例1：牡丹根皮提取物及其活性成分的细胞内功效评价
<1-1>牡丹根皮提取物及其活性成分对细胞存活率的影响
为了评价本发明牡丹根皮提取物及其活性成分的细胞内功效，研究了其在人神经母细胞瘤细胞中的细胞毒性。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(Dulbeco′s Modified Eagle′s Medium&Ham’s F12；Gibco，USA)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以2.5×104个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。用实施例<1-1>中制备的浓度为1.0μg/ml的牡丹根皮提取物或其活性组分芍药醇、芍药甙或芍药甙元处理细胞4小时。收集细胞并通过使用钙黄绿素测量细胞存活率。计算与未用上述提取物或其活性组分处理而用DMSO处理的正常对照细胞相比增加或减少的细胞的存活率，并以百分比(％)表示。
结果如下表2所示，牡丹根皮提取物及其活性成分在正常细胞中未显示出细胞毒性(表2)。
【表2】
牡丹根皮提取物及其活性成分对细胞存活率的影响
<1-2>牡丹根皮提取物及其活性成分对线粒体损伤诱导的细胞死亡的抑制作用
为了研究牡丹根皮提取物及其活性成分对线粒体功能损伤恢复的影响，进行了MTT检验以证实对细胞中线粒体复合物1损伤的恢复作用。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1，Dulbeco′s Modified Eagle′s Medium&Ham’s F12；Gibco，USA)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。用实施例<1-1>中制备的浓度为1.0μg/ml的牡丹根皮90％乙醇提取物或其活性组分芍药醇、芍药甙或芍药甙元处理细胞，然后培养4小时。然后用50μg/ml的莠去津(2-氯-4-(乙胺)-6-(异丙胺)-s-三嗪，ATZ)处理细胞，随后培养24小时以诱导线粒体功能障碍。用0.2μg/ml的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物，MTT；Sigma，USA)处理具有功能障碍线粒体的细胞，然后培养4个小时。然后，将由存活的细胞形成的MTT甲臜沉淀溶在100μl的0.04N HCl/异丙醇中。使用ELISA酶标仪(MolecularDevices，USA)测量OD540。确认线粒体复合物1的损伤以查看其与用DMSO而非提取物或其活性成分处理的正常对照组相比，损伤水平是如何增加或减少的。同时，阴性对照组单独用50μg/ml的莠去津处理以诱导线粒体损伤，并且不再用提取物或其活性成分处理。然后，通过与上述相同的方式进行MTT检验。
结果如下表3所示，经牡丹根皮90％乙醇提取物、芍药醇、芍药甙或芍药甙元酮处理，莠去津诱导的线粒体损伤恢复到正常水平(表3)。
【表3】
牡丹根皮提取物及其活性成分对线粒体复合物1损伤的恢复作用
<1-3>牡丹根皮提取物及其活性成分对线粒体损伤引起的ATP损失的恢复作用
为了研究牡丹根皮提取物及其活性成分对线粒体功能损伤恢复的影响，进行了ATP测定以证实对细胞中ATP损失的恢复作用。
具体地，通过与实验例<1-2>中所述相同的方式培养SH-SY5Y细胞，用50μg/kg的莠去津处理细胞以诱导线粒体功能障碍。然后，通过使用ATP生物发光体细胞测定试剂盒(Sigma，USA)将100μL从具有功能障碍的线粒体的细胞获得的细胞裂解物与100μL荧光素-荧光素酶混合，随后在20℃下培养10分钟。得到上清液。通过使用LB 9501 Lumat光度计(Berthold，德国)测量荧光信号。将含有无细胞培养基的对照孔的荧光用作背景。测量值通过减去该背景来计算，并且ATP的量归一化为蛋白质浓度。正常对照不用本发明的提取物或其活性成分处理，而是单独用DMSO处理。所有结果通过正常对照表示为％，以呈现细胞内的ATP水平。阴性对照单独用50μg/ml的莠去津处理以诱导线粒体损伤，并且不再用提取物或其活性成分处理。通过与上述相同的方式测定细胞内ATP水平。
结果如下表4所示，经牡丹根皮90％乙醇提取物、芍药醇、芍药甙或芍药甙元酮处理，莠去津诱导的线粒体损伤恢复到正常水平(表4)。
【表4】
牡丹根皮提取物及其活性成分对细胞内ATP损失的恢复作用
<1-4>根据牡丹根皮提取物和其活性成分参与帕金森氏病或线粒体的基因的表达
为了研究本发明的牡丹根皮提取物及其活性成分对损伤的线粒体功能恢复的影响，通过实时PCR(RT-PCR)测量由线粒体基因和家族性帕金森氏病的致病基因之一的Park7(DJ-1)合成的细胞色素c氧化酶亚基III(COX III)基因的表达水平。
具体地，通过与实验例<1-2>中所述相同的方式培养SH-SY5Y细胞，并诱导线粒体功能障碍。然后，将具有功能障碍的线粒体的细胞悬浮于TRIzol(Invitrogen，USA)中，并根据制造商的方案从其中提取总RNA。用1μg的提取的RNA合成总cDNA。在要求的最佳条件下，通过使用合成的cDNA作为模板，在下表5所列的正向和反向引物的存在下，用GeneAmp PCR系统9700(美国应用生物系统公司，USA)进行PCR，导致COX III和Park7(DJ-1)基因的扩增。将扩增的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳。通过在UV下使用图像密度计(AlphaEase FC软件；Alpha Innotech，USA)测量相对浓度。通过与18S rRNA的水平比较来标准化mRNA的水平。正常对照不用本发明的提取物或其活性成分处理，而是单独用DMSO处理。阴性对照单独用50μg/ml的莠去津处理以诱导线粒体损伤，并且不再用提取物或其活性成分处理。通过与上述相同的方式测定基因表达水平。
【表5】
本发明使用的引物的序列
结果如表6和表7所示，由线粒体基因和家族性帕金森氏病的致病基因之一的Park7(DJ-1)合成的降低表达的COX III恢复至正常水平(表6和7)。
【表6】
根据牡丹根皮提取物及其活性成分的COX III的表达
【表7】
根据牡丹根皮提取物及其活性成分的Park7(DJ-1)的表达
实验例2：白芷根提取物及其活性成分的细胞内功效评价
<2-1>白芷根提取物及其活性成分对细胞存活率的影响
为了评价本发明白芷根提取物及其活性成分的细胞内功效，研究了其在人神经母细胞瘤细胞中的细胞毒性。
具体地，通过与实验例<1-1>中所述相同的方式培养SH-SY5Y细胞。将培养的细胞以2.5×104个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。用1.0μg/ml在实施例<1-2>中制备的白芷根提取物或0.5μg/ml或1.0μg/ml其的活性成分欧前胡素处理细胞4小时。收集细胞并通过使用钙黄绿素测量细胞存活率。计算与未用上述提取物或其活性成分处理而用DMSO处理的正常对照组相比增加或减少的细胞的存活率，并以百分比(％)表示。
结果如表8所示，白芷根提取物和欧前胡素在0.5μg/ml的浓度下在正常细胞中不会引发细胞毒性。然而，欧前胡素在1μg/ml的浓度下会引发低水平的毒性(表8)。
【表8】
根据白芷根提取物及其活性成分的细胞存活率
<2-2>白芷根提取物及其活性成分对由内质网应激诱导的细胞死亡的抑制作用
为了研究本发明的白芷根提取物及其活性成分能否诱导内质网应激的恢复，对具有经衣霉素(Tuni)处理(已知衣霉素(Tuni)通过抑制N-糖基化诱发内质网应激)或经毒胡萝卜素(Thap)处理(已知毒胡萝卜素(Thap)通过破坏钙稳态诱发内质网应激)诱发的内质网应激的细胞进行MTT测定以确认线粒体复合物1损伤在活细胞中的恢复。
具体地，通过与实验例<1-2>中所述相同的方式培养SH-SY5Y细胞。用1.0μg/ml在实施例<1-2>中制备的白芷根提取物或0.5μg/ml或1.0μg/ml其的活性成分欧前胡素处理细胞，然后培养4小时。用0.5μg/ml的毒胡萝卜素(Thap)或1μg/ml的衣霉素(Tuni)处理细胞，接着培养24小时以诱导内质网应激。然后，通过与实验例<1-2>中所述相同的方式进行MTT测定。与未用提取物或其活性成分处理但用DMSO处理的正常对照细胞相比，研究了线粒体复合物1在细胞中损伤的增加或减少。阴性对照经0.5μg/ml的毒胡萝卜素或1μg/ml的衣霉素处理以引起内质网应激，而未经提取物或其活性成分处理，然后通过与上述相同的方式进行MTT测定。
结果如表9和表10所示，经白芷根90％乙醇提取物和欧前胡素处理，由毒胡萝卜素或衣霉素引起的内质网应激所诱发的线粒体功能损伤和细胞死亡恢复至正常水平(表9和10)。
【表9】
白芷根提取物及其活性成分对由毒胡萝卜素诱导的内质网应激介导的线粒体复合物1损伤的恢复效果
【表10】
白芷根提取物及其活性成分对由衣霉素诱导的内质网应激介导的线粒体复合物1损伤的恢复效果
<2-3>白芷根提取物及其活性成分对内质网应激引起的ATP损失的恢复作用
为了研究白芷根提取物及其活性成分对内质网应激恢复的影响，进行了ATP测定以证实其对细胞内ATP损失的恢复作用。
具体地，通过与实验例<2-2>中所述相同的方式培养SH-SY5Y细胞，并诱导内质网应激。然后，通过与实验例<1-3>中所述相同的方式测定细胞内ATP水平。正常对照不用本发明的提取物或其活性成分处理，而是单独用DMSO处理。所有结果通过正常对照表示为％，以呈现细胞内的ATP水平。阴性对照不用提取物或活性成分处理，而是单独用0.5μg/ml的毒胡萝卜素或1.0μg/ml的衣霉素处理以诱导内质网应激。然后，通过与上述相同的方式测定细胞内ATP水平。
结果如表11所示，经白芷根90％乙醇提取物和欧前胡素处理，由毒胡萝卜素或衣霉素引起的内质网应激所诱发的人神经母细胞瘤细胞的线粒体功能损伤和细胞死亡恢复至正常水平(表11)。
【表11】
白芷根提取物及其活性成分对细胞内ATP损失的恢复作用
<2-4>根据白芷根提取物和其活性成分的内质网应激标记基因的表达
为了研究本发明的白芷根提取物及其活性成分对内质网应激的恢复的影响，测量了内质网应激标记基因GRP78和XBP1p的表达水平。
具体地，通过与实验例<2-2>中所述相同的方式培养SH-SY5Y细胞，并诱导内质网应激。然后，通过与实验例<1-4>中所述相同的方式，对具有内质网应激的细胞进行RT-PCR，随后进行电泳以研究在UV下1.5％琼脂糖凝胶上GRP78和XBP1p基因的表达水平。正常对照不用本发明的提取物或其活性成分处理，而是单独用DMSO处理。阴性对照不用提取物或活性成分处理，而是单独用0.5μg/ml的毒胡萝卜素处理以诱导内质网应激。然后，通过与上述相同的方式证实内质网应激标记基因的表达。
结果如表12和表13所示，经白芷根90％乙醇提取物和欧前胡素处理，在具有此处诱导所致的内质网应激的细胞中的内质网应激标记基因GRP78和XBP1p的表达水平恢复至正常水平(表12和13)。
【表12】
根据白芷根提取物和其活性成分，在具有由毒胡萝卜素诱导的内质网应激的细胞中的GRP78 mRNA的表达
【表13】
根据白芷根提取物和其活性成分，在具有由毒胡萝卜素诱导的内质网应激的细胞中的XBP1p mRNA的表达
实验例3：柴胡根提取物及其活性成分的细胞内功效评价
<3-1>柴胡根提取物及其活性成分对细胞存活率的影响
为了评价本发明柴胡根提取物及其活性成分的细胞内功效，研究了其在鼠小胶质细胞中的细胞毒性。
具体地，将鼠小胶质细胞系BV2接种在补充有10％FBS的1∶1DMEM(Dulbeco′sModified Eagle’s Medium；Gibco，USA)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以2.5×104个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。用浓度为1.0μg/ml的实施例<1-3>中制备的柴胡根90％乙醇提取物、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷B4或柴胡皂苷D处理细胞4小时。收集细胞并通过使用钙黄绿素测量细胞存活率。计算与未用上述提取物或其活性组分处理而用DMSO处理的正常对照细胞相比增加或减少的细胞的存活率，并以百分比(％)表示。
结果如下表14所示，柴胡根提取物及其活性成分在正常细胞中未显示出细胞毒性(表14)。
【表14】
柴胡根提取物及其活性成分对细胞存活率的影响
<3-2>柴胡根提取物及其活性成分对炎症反应诱导的细胞死亡的抑制作用
为了研究本发明的柴胡根提取物及其活性成分对炎症反应的抑制作用，对具有由脂多糖(LPS)诱导的炎症反应的细胞进行MTT测定，以证实对活细胞中线粒体复合物1的损伤的恢复作用。
具体地，通过与实验例<3-1>中所述相同的方式培养BV2细胞。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。用浓度为1.0μg/ml的实施例<1-3>中制备的柴胡根90％乙醇提取物、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷B4或柴胡皂苷D处理细胞，然后培养4小时。然后用100ng/ml的脂多糖(LPS)处理细胞，随后培养20小时以诱导炎症反应。通过与实验例<1-2>中所述相同的方式对由炎症反应诱导的细胞进行MTT测定。确认线粒体复合物1的损伤以查看其与用DMSO而非提取物或其活性成分处理的正常对照组相比，损伤水平是如何增加或减少的。同时，阴性对照组单独用100ng/ml的LPS处理以诱导炎症反应，并且不再用提取物或其活性成分处理。然后，通过与上述相同的方式进行MTT测定。
结果如下表15所示，经柴胡根90％乙醇提取物、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷B4或柴胡皂苷D处理，通过LPS诱导的炎症反应恢复到正常水平(表15)。
【表15】
柴胡根提取物及其活性成分对线粒体复合物1损伤的恢复作用
<3-3>通过柴胡根提取物及其活性成分处理炎症反应依赖型一氧化氮(NO)的减少
为了研究本发明的柴胡根提取物及其活性组分对炎症反应的恢复作用，使用行Griess法测量细胞培养基中亚硝酸盐/硝酸盐(NOx)的浓度。
具体地，通过与实验例<3-1>中所述相同的方式培养BV2细胞，并诱导炎症反应。然后，获得100μL细胞培养基，向其中加入100μL包含含有5％磺胺和2％萘基乙二胺的盐酸的Griess试剂，随后在暗室中反应30分钟。反应完成后，用EISA酶标仪(Versamax，USA)测量OD540。使用亚硝酸钠的标准校准曲线计算培养基中一氧化氮的浓度。正常对照不用提取物或其活性成分处理，而是用DMSO处理。阴性对照单独用100ng/ml的LPS处理以诱导炎症反应，而不用提取物或活性成分处理。然后，通过与上述相同的方式研究一氧化氮浓度的减少效果。
结果如表16所示，确认柴胡根90％乙醇提取物、柴科皂甙A、柴科皂甙B2、柴科皂甙B4和柴科皂甙D具有抑制LPS介导的NO产生的效果(表16)。
【表16】
柴胡根提取物及其活性成分对一氧化氮(NO)浓度减少的影响
<3-4>根据柴胡根提取物和其活性成分的炎症反应标记基因的表达
为了研究本发明的柴胡根提取物及其活性成分对炎症反应的恢复的影响，测量了炎症反应标记基因可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素-6(IL-6)和NF-kB p65/ReIA的表达水平。
具体地，通过与实验例<3-1>中所述相同的方式培养BV2细胞，并诱导炎症反应。然后，通过与实验例<1-4>中所述相同的方式对细胞进行RT-PCR，随后定量分析iNOS、IL-6和NF-kB p65/ReIA基因的表达水平。正常对照不用本发明的提取物或其活性成分处理，而是单独用DMSO处理。阴性对照不用提取物或活性成分处理，而是单独用100ng/ml的LPS处理以诱导炎症反应。然后，通过与上述相同的方式证实炎症反应标记基因的表达。
结果如表17至表19所示，经柴胡根90％乙醇提取物、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷B4和柴胡皂苷D处理，在具有此处诱导所致的炎症反应的细胞中的炎症反应标记基因iNOS、IL-6和NF-kB p65/ReIA的表达水平恢复至正常水平(表17至19)。
【表17】
根据柴胡根提取物和其活性成分的iNOS mRNA的表达
【表18】
根据柴胡根提取物和其活性成分的IL-6 mRNA的表达
【表19】
根据柴胡根提取物和其活性成分的p65/ReIA mRNA mRNA的表达
<3-5>受柴胡根提取物和其活性成分影响的活性氧簇(ROS)产生的减少
为了研究本发明的柴胡根提取物及其活性成分对炎症反应的恢复作用，通过使用2′，7′-二氯荧光素二乙酸盐(DCF-DA)测定细胞内ROS的浓度。
具体地，通过与实验例<3-1>中所述相同的方式培养BV2细胞，并诱导炎症反应。然后，用1μM DCF-DA和0.05μM双苯甲酰亚胺(Hoechst 33342)处理炎症反应诱导的细胞，随后在37℃下染色1小时。染色后，在485nm/535nm处测量DCF-DA的荧光强度，并在335nm/460nm处测量双苯甲酰亚胺的荧光强度。基于DCF-DA/双苯甲酰亚胺的比例，定量ROS。将增加或减少的ROS的量与未用提取物或其活性成分处理但用DMSO处理的正常对照的量进行比较，结果以％表示。阴性对照单独用100ng/ml的LPS处理以诱导炎症反应，而不用提取物或其活性成分处理。然后，通过与上述相同的方式研究ROS的产生。
结果如表20所示，确认本发明的柴胡根90％乙醇提取物、柴科皂甙A、柴科皂甙B2、柴科皂甙B4和柴科皂甙D具有降低DCF-DA介导的由炎症反应和应激引起的ROS产生的效果(表20)。
【表20】
柴胡根提取物和其活性成分对活性氧簇(ROS)产生的降低作用
实验例4：对包含牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种的混合提取物的细胞内
功效的评价
<4-1>包含牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种的混合提取物对帕金森氏病
细胞模型中线粒体活性的恢复效果
为了研究包含牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种的混合提取物对帕金森氏病细胞模型中线粒体活性的恢复作用，在帕金森氏病细胞模型中检查了线粒体活性指数。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。用浓度为1μg/ml的实施例2中制备的牡丹根皮和白芷根的混合的90％乙醇提取物、实施例3中制备的牡丹根皮和柴胡根的混合的90％乙醇提取物、实施例4中制备的白芷根和柴胡根的混合的90％乙醇提取物或者实施例<5-1>中制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％乙醇提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，用浓度为1mM的1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP+)处理细胞，然后培养24小时。结果，构建了帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<1-1>中所述相同的方式使用钙黄绿素测定细胞存活率。计算与未用上述提取物或其活性组分处理而用DMSO处理的正常对照细胞相比增加或减少的细胞的存活率，并以百分比(％)表示。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后，与正常对照相比较，通过与上述相同的方式测量细胞存活率的增加或减少。
结果如表21所示，经混合的提取物处理，准确来说是经包含以各种混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的乙醇提取物处理，根据由MPP+引起的线粒体活性减少的帕金森氏病细胞模型的细胞存活率恢复了65～70％。同时，经牡丹根皮和柴胡根的混合物的提取物、牡丹根皮和白芷根的混合物的提取物，以及白芷根和柴胡根的混合物的提取物处理，恢复效果提高并达到77～81％。特别地，当使用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物处理时，恢复效果最高，为92.84％(表21)。
【表21】
包含牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种的混合物提取物对细胞存活率的影响
<4-2>包含牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种的混合物提取物对帕金森氏
病细胞模型中ATP的损失的恢复作用
为了研究包含牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种的混合物的提取物对帕金森氏病细胞模型中线粒体功能损伤的恢复作用，进行了ATP测定以证实对细胞中ATP损失的恢复作用。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。用浓度为1μg/ml的实施例2中制备的牡丹根皮和白芷根的混合的90％乙醇提取物、实施例3中制备的牡丹根皮和柴胡根的混合的90％乙醇提取物、实施例4中制备的白芷根和柴胡根的混合的90％乙醇提取物或者实施例<5-1>中制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％乙醇提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<1-3>中所述相同的方式测定细胞内ATP水平。通过与未用提取物或活性组分处理但单独用DMSO处理的正常对照比较来计算细胞内ATP水平的增加或降低。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，但不用提取物或活性成分处理，然后通过与上述相同的方式研究ATP水平恢复。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后，通过与上述相同的方式研究细胞内ATP水平的恢复效果。
结果如表22所示，经牡丹根皮、白芷根或柴胡根的90％乙醇单一提取物处理，基于由1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP+)引起的线粒体活性降低的细胞内ATP的损失恢复高达正常组的68～69％。同时，经牡丹根皮和柴胡根的混合物的提取物、牡丹根皮和白芷根的混合物的提取物，以及白芷根和柴胡根的混合物的提取物处理，恢复率提高并达到78～83％。特别地，当使用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物处理时，恢复率最高，达到95.82％(表22)。
【表22】
包含牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种的混合物的提取物对细胞内ATP损失的恢复作用
<4-3>通过包含牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种的混合物的提取物来减
少帕金森氏病细胞模型中的活性氧簇(ROS)
为了研究牡丹根皮和柴胡根的混合物的提取物、牡丹根皮和白芷根的混合物的提取物，白芷根和柴胡根的混合物的提取物，以及牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病细胞模型中线粒体功能损伤引起的ROS产生的减少作用，使用2’，7’-二氯荧光素二乙酸盐(DCF-DA)测定了细胞内ROS的浓度。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。用浓度为1μg/ml的实施例2中制备的牡丹根皮和白芷根的混合的90％乙醇提取物、实施例3中制备的牡丹根皮和柴胡根的混合的90％乙醇提取物、实施例4中制备的白芷根和柴胡根的混合的90％乙醇提取物或者实施例<5-1>中制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％乙醇提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<3-5>中所述相同的方式，基于DCF-DA/双苯甲酰亚胺的比例来定量ROS。将增加或减少的ROS水平与未用提取物或其活性成分处理但用DMSO处理的正常对照的水平进行比较，结果表示为％正常对照。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后，通过与上述相同的方式研究ROS的产生的减少效果。
结果如表23所示，由1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP+)引发降低的线粒体活性所导致的ROS的产生在经牡丹根皮、白芷根或柴胡根的90％乙醇单一提取物处理后恢复至正常水平的144～146％；而经牡丹根皮和柴胡根的混合物的提取物、牡丹根皮和白芷根的混合物的提取物，以及白芷根和柴胡根的混合物的提取物处理后，ROS的产生恢复至正常水平的120～132％。特别是，经牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物处理后，ROS的产生几乎恢复到正常水平，为108.20％，表明上述混合物的提取物具有最高的恢复效果(表23)。
【表23】
包含牡丹根皮、白芷根和柴胡根中的至少两种的混合物提取物对细活性氧簇(ROS)的产生的减少作用。
实验例5：不同混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的细胞内
功效评价
<5-1>不同混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏
病细胞模型中线粒体活性的恢复作用
为了研究不同混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病细胞模型中线粒体活性的恢复作用，首先确认了线粒体活性指数以比较恢复作用。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。以1μg/ml的浓度，用实施例5中制备的具有不同混合比例的牡丹根皮和白芷根的各种混合的90％的乙醇提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过使用钙黄绿素以与实验例<1-1>中所述相同的方式测量细胞存活率。计算与未经上述提取物或其活性组分处理但用DMSO处理的正常对照组相比增加或减少的细胞存活率，并以百分比(％)表示。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后通过与上述相同的方式，计算与正常对照组相比增加或减少的细胞存活率，并以百分比(％)表示。
结果如表24所示，用牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合物的提取物处理，由1-甲基-4-苯基吡啶鎓引起的线粒体活性降低恢复多达正常对照的93.22％，这是最高的(表24)。
【表24】
不同混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对细胞存活率的影响
*所述混合物的提取物的混合比是牡丹根皮∶白芷根∶柴胡根的重量比(w∶w∶w)
<5-2>不同混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏
病细胞模型中细胞内ATP损失的恢复作用
为了研究不同混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病细胞模型中线粒体功能损伤的恢复作用，进行了ATP测定以确认对细胞内ATP的损失的恢复作用。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。以1μg/ml的浓度，用实施例5中制备的具有不同混合比例的牡丹根皮和白芷根的各种混合的90％的乙醇提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<1-3>中所述相同的方式测定细胞内ATP水平。计算与未经所述提取物或其活性组分处理但用DMSO处理的正常对照组相比增加或减少的细胞内ATP水平，并以百分比(％)表示。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后通过与上述相同的方式，确认所述细胞内ATP损失的恢复作用。
结果如表25所示，用牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合物的提取物处理后，由1-甲基-4-苯基吡啶鎓引起的细胞内ATP损失恢复多达正常对照的94.10％，这是最高的(表25)。
【表25】
不同混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对细胞内ATP损失的恢复作用
*所述混合物的提取物的混合比是牡丹根皮∶白芷根∶柴胡根的重量比(w∶w∶w)
<5-3>不同混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏
病细胞模型中活性氧簇(ROS)的产生的减少作用
为了研究不同混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物在帕金森氏病细胞模型中的所述恢复作用，用2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)测量了细胞内ROS的浓度。
具体地，将小鼠小胶质细胞系BV2接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。以1μg/ml的浓度，用实施例5中制备的具有不同混合比例的牡丹根皮和白芷根的各种混合的90％的乙醇提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<3-5>中所述相同的方式，基于DCF-DA/双苯甲酰亚胺的比例定量ROS。将增加或减少的ROS的水平与未用提取物或其活性成分处理但用DMSO处理的正常对照的水平进行比较，结果表示为％正常对照。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后，通过与上述相同的方式研究ROS的产生的减少作用。
结果如表26所示，用牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合物的提取物处理后，由1-甲基-4-苯基吡啶鎓引起的线粒体活性降低所致的ROS产生恢复多达正常对照的106.23％，这是最高的(表26)。
【表26】
不同混合比例的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对活性氧簇(ROS)的产生的减少作用
*所述混合物的提取物的混合比是牡丹根皮∶白芷根∶柴胡根的重量比(w∶w∶w)
实验例6：牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1，w∶w∶w)的混合物的提取物基于乙醇
浓度变化的细胞内功效评价
<6-1>牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1，w∶w∶w)的混合物的提取物基于乙醇浓度
变化的活性成分变化
研究了牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1，w∶w∶w)的混合物的提取物基于乙醇浓度变化的活性成分变化。
具体地，以10％、30％、50％、70％和90％的不同浓度向牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物(1∶1∶1，w∶w∶w)中添加提取溶剂乙醇，然后通过与实施例<5-1>中所述相同的方式进行提取。随后用HPLC对所获取的混合物的提取物进行定量分析。
结果如表27所示，牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合的90％的乙醇提取物表现出最高含量的芍药醇、芍药甙、柴胡皂苷A和欧前胡素(表27)。
【表27】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1，w∶w∶w)的混合物的提取物基于乙醇浓度变化的活性成分变化
<6-2>牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1，w∶w∶w)的混合物的提取物基于乙醇浓度
变化对帕金森氏病细胞模型中线粒体活性的恢复作用
为了研究牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合物的提取物基于乙醇浓度变化对帕金森氏病细胞模型中线粒体活性的恢复作用，在帕金森氏病细胞模型中检测了线粒体活性指标。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。以1μg/ml的浓度，用实施例<5-1>中通过不同浓度的乙醇制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合的乙醇提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<1-1>中所述相同的方式使用钙黄绿素测定细胞存活率。计算与未用上述提取物或其活性组分处理而用DMSO处理的正常对照细胞相比增加或减少的细胞的存活率，并以百分比(％)表示。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后，通过与上述相同的方式，测量与正常对照相比较细胞存活率的增加或减少。
结果如表28所示，用牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合的90％的乙醇提取物处理后，由1-甲基-4-苯基吡啶鎓引起的线粒体活性降低恢复多达正常对照的95.02％，这是最高的(表28)。
【表28】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1，w∶w∶w)的混合物的提取物基于乙醇浓度变化对细胞存活率的影响
<6-3>牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1，w∶w∶w)的混合物的提取物基于乙醇浓度
变化对帕金森氏病细胞模型中ATP损失的恢复作用
为了研究牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1，w∶w∶w)的混合物的提取物基于乙醇浓度变化对帕金森氏病细胞模型中线粒体功能损伤的恢复作用，进行了ATP测定以确认对细胞内ATP的损失的恢复作用。
特别地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。以1μg/ml的浓度，用实施例<5-1>中通过不同浓度的乙醇制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合的乙醇提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<1-3>中所述相同的方式测定细胞内ATP水平。通过与未经所述提取物或其活性组分处理但用DMSO单独处理的正常对照组相比较来计算细胞内ATP水平的增加或减少。计算与未经所述提取物或其活性组分处理但用DMSO处理的正常对照组相比增加或减少的细胞内ATP水平，并以百分比(％)表示。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后通过与上述相同的方式，确认所述细胞内ATP水平的恢复作用。
结果如表29所示，用所述混合的90％的乙醇提取物处理后，由1-甲基-4-苯基吡啶鎓引起的线粒体活性降低恢复多达正常对照的96.45％，这是最高的(表29)。
【表29】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1，w∶w∶w)的混合物的提取物基于乙醇浓度变化对细胞内ATP损失的恢复作用
<6-4>牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合乙醇提取物基于乙醇浓度变化对
帕金森氏病细胞模型中活性氧簇(ROS)的产生的减少作用
为了研究牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合乙醇提取物基于乙醇浓度变化在帕金森氏病细胞模型中对由线粒体功能损伤引起的ROS的产生的减少作用，用2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)测量了细胞内ROS的浓度。
具体地，将小鼠小胶质细胞系BV2接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。以1μg/ml的浓度，用实施例5中通过不同浓度的乙醇制备的具有不同混合比例的牡丹根皮和白芷根的各种混合的乙醇提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<3-5>中所述相同的方式，基于DCF-DA/双苯甲酰亚胺的比例定量ROS。将增加或减少的ROS的水平与未用提取物或其活性成分处理但用DMSO处理的正常对照的水平进行比较，结果表示为％正常对照。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后，通过与上述相同的方式研究ROS的产生的减少作用。
结果如表30所示，用牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合的90％的乙醇提取物处理后，由1-甲基-4-苯基吡啶鎓引起的线粒体活性降低恢复多达正常对照的106.06％，这是最高的(表30)。
【表30】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1，w∶w∶w)的混合物的提取物基于乙醇浓度变化对活性氧簇(ROS)的产生的减少作用
实验例7：牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物基于提取溶剂类型变化的
细胞内功效评价
<7-1>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物基于提取溶剂类型变化对帕
金森氏病细胞模型中线粒体活性的恢复作用
为了研究牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物基于提取溶剂类型变化对帕金森氏病细胞模型中线粒体活性的恢复作用，在帕金森氏病细胞模型中检测了线粒体活性指标。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。以1μg/ml的浓度，用实施例<5-1>中通过不同浓度的乙醇制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合的乙醇提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<1-1>中所述相同的方式使用钙黄绿素测定细胞存活率。计算与未用上述提取物或其活性组分处理而用DMSO处理的正常对照细胞相比增加或减少的细胞的存活率，并以百分比(％)表示。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后，通过与上述相同的方式与正常对照相比较，测量细胞存活率的增加或减少。
结果如表31所示，用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇提取物处理后，由1-甲基-4-苯基吡啶鎓引起的线粒体活性降低恢复多达正常对照的93.09％，这是最高的(表31)。
【表31】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物基于提取溶剂类型变化对细胞存活率的影响
<7-2>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物基于提取溶剂类型的变化对
帕金森氏病细胞模型中细胞内ATP损失的恢复作用
为了研究牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物基于提取溶剂类型的变化对帕金森氏病细胞模型中线粒体功能损伤的恢复作用，进行了ATP测定以确认对细胞内ATP的损失的恢复作用。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。以1μg/ml的浓度，用实施例5中通过不同的提取溶剂制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合物的提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<1-3>中所述相同的方式测定细胞内ATP水平。计算与未经所述提取物或其活性组分处理但用DMSO处理的正常对照组相比增加或减少的细胞内ATP水平，并以百分比(％)表示。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后通过与上述相同的方式，确认所述细胞内ATP水平的恢复作用。
结果如表32所示，用混合的90％的乙醇提取物处理后，由1-甲基-4-苯基吡啶鎓引起的线粒体活性降低恢复多达正常对照的95.90％，这是最高的(表32)。
【表32】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物基于提取溶剂类型变化对细胞内ATP损失的恢复作用
<7-3>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物基于提取溶剂类型变化对帕
金森氏病细胞模型中活性氧簇(ROS)的产生的减少作用
为了研究牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物基于提取溶剂类型变化在帕金森氏病细胞模型中对由线粒体功能损伤引起的ROS的产生的减少作用，用2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)测量了细胞内ROS的浓度。
特别地，将小鼠小胶质细胞系BV2接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。以1μg/ml的浓度，用实施例5中通过不同的提取溶剂制备的牡丹根皮和白芷根的混合物的提取物处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，通过与实验例<3-5>中所述相同的方式，基于DCF-DA/双苯甲酰亚胺的比例定量ROS。将增加或减少的ROS的水平与未用提取物或其活性成分处理但用DMSO处理的正常对照的水平进行比较，结果表示为％正常对照。阴性对照单独用1mM的MPP+处理，构建出未用提取物或其活性成分处理的帕金森氏病细胞模型。然后，通过与上述相同的方式研究ROS的产生的减少作用。
结果如表33所示，用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇提取物处理后，由1-甲基-4-苯基吡啶鎓引起的线粒体活性降低恢复多达正常对照的106.82％，这是最高的(表33)。
【表33】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物基于提取溶剂类型的变化对活性氧簇(ROS)的产生的减少作用
实验例8：牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的细胞内功效评价
<8-1>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对线粒体活性的改善
为了评价本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的细胞内功效，通过免疫印迹法测量了人神经母细胞瘤细胞中线粒体生物发生的代表性标记物TFAM和H2AX的表达水平。
具体地，将人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y接种在补充有10％FBS的DMEM/F12(1∶1)中，然后在37℃、5％CO2/95％空气(O2)的培养箱中培养。然后，将培养的细胞以1×105个细胞/孔的密度转移到无血清培养基中。以1。0μg/ml的浓度，用实施例<5-1>中制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根(1∶1∶1)的混合的90％的乙醇的提取物的冻干剂处理细胞，然后培养4小时。培养完成后，通过与实验例<4-1>中所述相同的方式构建帕金森氏病细胞模型。然后，用0.5mM的MPP+处理预处理的细胞，然后培养24小时以引起线粒体失效。从细胞中获得胞内蛋白，然后通过免疫印迹法研究STAT蛋白(S727和Y705)的磷酸化作用、AKT蛋白(T308和S473)的磷酸化作用以及TH、TFAM和H2AX蛋白的表达水平。用β-肌动蛋白作为对照蛋白来比较其表达。正常对照未用本发明所述的提取物处理但用DMSO处理。阴性对照单独用0.5mM的MPP+处理但此时未用本发明所述的提取物处理。
结果如表34所示，当以1μg/ml的浓度用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇的提取物处理细胞时，所述STAT蛋白(Y705)的磷酸化作用、AKT蛋白(T308和S473)的磷酸化作用以及TH、TFAM和H2AX蛋白的表达水平几乎恢复到正常水平(表34)。
【表34】
基于牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的线粒体活性相关基因的蛋白质表达水平
<8-2>基于牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的内质网应激标记基因
的表达
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对内质网应激的恢复作用，测量了内质网应激标记基因GRP78和XBP1p的表达水平。
具体地，通过与实验例<2-2>中所述相同的方式培养SH-SY5Y细胞，并诱导内质网应激。然后，通过与实验例<1-4>中所述相同的方式，对具有内质网应激的细胞进行RT-PCR，随后进行电泳以研究GRP78和XBP1p基因在UV下1.5％琼脂糖凝胶上的表达水平。正常对照未用本发明的提取物处理而是单独用DMSO处理。阴性对照未用所述提取物或活性成分处理，而用0.5μg/ml的毒胡萝卜素单独处理以诱导内质网应激。然后，通过与上述相同的方式证实内质网应激标记基因的表达。
结果如表35和表36所示，在以1.0μg/ml的浓度用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇的提取物处理而诱导内质网应激的细胞中，所述内质网应激标记基因GRP78和XBP1p的表达水平恢复到了正常水平(表35和36)。
【表35】
基于牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的由毒胡萝卜素诱导内质网应激的细胞中的GRP78 mRNA的表达
【表36】
基于牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的由毒胡萝卜素诱导内质网应激的细胞中的XBP1p mRNA的表达
<8-3>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的抗炎作用和抗氧化作用
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对炎症反应的恢复作用，通过Griess方法用2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)测量了细胞培养基中亚硝酸盐/硝酸盐(NOx)的浓度以及细胞内ROS的浓度。
具体地，通过与实验例<3-1>中所述相同的方式培养BV2细胞，并诱导炎症反应。然后，向获得的100μL细胞培养基中加入100μL包含含有5％磺胺和2％萘基乙二胺的盐酸的Griess试剂，随后在暗室中反应30分钟。反应完成后，用EISA酶标仪(Versamax，USA)测量OD540。使用亚硝酸钠的标准校准曲线计算培养基中一氧化氮的浓度。为测量ROS浓度，用1μM的DCF-DA和0.05μM的双苯酰亚胺(赫斯特公司33342)处理细胞，随后在37℃下染色1小时。染色后，在485nm/535nm处测量DCF-DA的荧光强度，并在335nm/460nm处测量双苯甲酰亚胺的荧光强度。基于DCF-DA/双苯甲酰亚胺的比例，定量ROS。将ROS增加或减少的量与未经所述提取物处理但用DMSO处理的正常对照进行比较，结果表示为％。阴性对照单独用100ng/ml的LPS处理以诱导炎症反应，而不用提取物或其活性成分处理。然后，通过与上述相同的方式研究一氧化氮浓度的降低作用和ROS浓度的降低作用。
结果如表37所示，本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物被证实具有减少LPS介导的NO的产生的作用(表37)以及减少DCF-DA介导的ROS的产生(由炎症反应和应激引起)的作用(表38)。
【表37】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对一氧化氮(NO)的浓度降低作用
【表38】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对活性氧簇(ROS)的产生的减少作用
实验例9：牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗
作用
<9-1>帕金森氏病动物模型的构建：MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型
如图1所示，构建了帕金森氏病的动物模型以研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用(图1)。
具体地，分配5周龄的C57BL/6雄性小鼠(体重：约19～22g)，随后，在东亚ST研究部的动物实验室中适应至少1周。此时，调节室内温度在22±2℃，控制湿度在53±3％。光暗循环设置为12小时/12小时。自由提供水和饲料。适应后，将小鼠分成5组，每组分配6只小鼠。将实施例<5-1>中制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％乙醇提取物的冷冻干燥物(1∶1∶1)溶解在3％HPMC中，以1、3和10mg/kg的剂量向所述小鼠口服给药(口服，p.o.)，每天一次，持续14天。然后，在从实验的第8天起口服给药5天后3小时，以30mg/kg的剂量向小鼠施用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)(腹膜内给药，i.p.)，构建帕金森氏病动物模型。向正常对照组以5ml/kg的剂量施用不含所述混合物的提取物的3％的HPMC，随后腹膜内施用不含MPTP的PBS。
<9-2>MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型中牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的
提取物对运动协调性的改善作用
为了研究研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，在施用上述混合物的提取物之后，用MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型进行了行为测试(爬杆试验、旋转试验)。
具体地，在实验例<9-1>中构建了帕金森氏病小鼠模型。构建后14天，将所述动物模型放置在具有粗糙表面(直径：8mm，高度：55cm)的杆的顶部。每30秒测量小鼠完全下移的时间，并定义为转向时间(T-转)，同时测量小鼠到达地板的时间，定义为运动活动时间(T-LA)。将动物放置在可调节rpm的轮上。测量动物跌落的时间(跌落潜伏期(latency tofall))。正常对照用3％HPMC的载体处理。阴性对照用MPTP以30mg/kg的剂量腹膜内(i.p.)施用5天，但是之后不用所述混合物的提取物处理。然后，用对照进行爬杆试验以测量T-转和T-LA，并通过与上述相同的方式进行旋转试验以测量跌落潜伏期。
结果如表39和表40所示，与用所述载体处理的正常对照组相比，用MPTP单独处理的阴性对照组中的T-转和T-LA显著增大。同时，用所述牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇提取物处理的帕金森氏病小鼠模型中的T-转和T-LA减小(表39和表40)。如表41所示，从所述旋转试验可以确认用MPTP单独处理的阴性对照组中的的跌落潜伏期显著减小，而用所述牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇提取物处理的帕金森氏病小鼠模型中的跌落潜伏期增大。因此，可以确认，用所述牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇提取物处理的帕金森氏病小鼠模型中的运动协调性得到了恢复(表39～41)。
【表39】
MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型中由牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物所致的T-转的下降
*所述剂量代表用在每千克动物模型小鼠体重的混合物的提取物的质量(mg)
【表40】
MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型中由牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物所致的T-LA的下降
*所述剂量代表用在每千克动物模型小鼠体重的混合物的提取物的质量(mg)
【表41】
MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型中由牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物所致的跌落潜伏期的下降
*所述剂量代表用在每千克动物模型小鼠体重的混合物的提取物的质量(mg)
<9-3>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对多巴胺能神经元的体内保
护作用
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，用获得的经本发明的混合物的提取物处理的MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型的脑组织证实了对纹状体(ST)和黑质(SN)中的多巴胺能神经元的保护作用。
具体地，将完成实验例<9-2>中的行为试验的小鼠模型通过肌内注射施以舒泰(50mg/kg)用于麻醉。将含有4％的多聚甲醛的PBS注入心脏，然后提取脑。将提取的脑再次在4％的多聚甲醛中固定，然后在4℃下浸入30％蔗糖溶液中，直到脑下沉，然后冷冻。通过使用恒冷箱切片机(产品名称：CM3000，Leica，德国)将冷冻的脑组织切成30μm的冠状切片，并将切片在4℃下储存在包含甘油，乙二醇和PBS的储备溶液中。将所述切片置于盖玻片上，用PBS洗涤，然后用含有1％H2O2的PBS处理15分钟以从所述组织中消除过氧化物酶活性。然后，将抗酪氨酸羟化酶抗体(抗TH；1∶2000，兔来源的；Millipore，美国)作为第一抗体处理，随后反应过夜。将生物素化的抗兔IgG抗体作为第二抗体处理，然后在室温下反应90分钟。反应完成后，用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories，USA)中包含的抗生物素蛋白-生物素复合物溶液处理所述组织，随后反应1小时。用二氨基联苯胺诱导显色。为了研究多巴胺细胞的保护作用，测量了纹状体(ST)的光密度，然后计数黑质(SN)中的酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞。正常对照组用溶剂处理，阴性对照用MPTP以30mg/kg的剂量腹膜内(i.p.)给药5天，但其后不用所述混合物提取物处理。
结果如表42所示，施用了牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物的帕金森氏病动物模型的纹状体(ST)中染色的TH的光密度剂量依赖性地增加，表明所述提取物对多巴胺能神经元具有保护作用。如表43所示，黑质(SN)中的TH阳性细胞也因施用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物剂量而表现为剂量依赖性增加(表42和43)
【表42】
由牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物所致的MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型的纹状体(ST)中的TH的光密度的增加
*所述剂量代表用在每千克动物模型小鼠体重的混合物的提取物的质量(mg)
【表43】
由牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物所致的MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型的黑质(SN)的TH阳性细胞的增加
*所述剂量代表用在每千克动物模型小鼠体重的混合物的提取物的质量(mg)
<9-4>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对体内多巴胺量的影响
为了研究本发明所述的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，获得了经本发明的混合物的提取物处理的MPTP诱发的帕金森氏病小鼠模型的脑组织并测量其中的多巴胺水平。
具体地，从完成实验例<9-2>中的行为试验的小鼠模型中提取脑。从提取的脑中分离ST，然后匀浆。向其中加入高氯酸(Sigma)，然后培养。将培养的ST过滤并加压/浓缩。将浓缩的提取物进行色谱分析以测量多巴胺的水平。正常对照组用溶剂处理，阴性对照用MPTP以30mg/kg的剂量腹膜内(i.p.)给药5天，但其后不用混合物提取物处理。
结果如表44所示，在未经牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物处理的帕金森氏病动物模型中，多巴胺的水平显著降低，而当向所述动物施以牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物时，多巴胺的水平显著增加(表44)。
【表44】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型中多巴胺量的影响
*所述剂量代表用在每千克动物模型小鼠体重的混合物的提取物的质量(mg)
<9-5>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对体内TH、线粒体和胰岛素信
号传导系统损伤的恢复作用
为了研究本发明所述的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，获得了经本发明的混合物的提取物处理的MPTP诱发的帕金森氏病小鼠模型的脑组织并测量了TH和ND9的表达水平、线粒体标记物，以及Akt1的磷酸化水平和胰岛素信号传导系统标记物。
具体地，通过与实验例<8-3>所述相同的方式获得黑质(SN)、纹状体(ST)和小脑切片，并从中获得脑组织蛋白。对所述蛋白进行免疫印迹处理以测量TH和ND9的表达水平以及Akt1(S473和T308)的磷酸化水平。此时，将β-肌动蛋白用作对照蛋白用于比较所述表达。正常对照组用溶剂处理，阴性对照用MPTP以30mg/kg的剂量腹膜内(i.p.)给药5天，但其后不用混合物提取物处理。
结果如表45～47所示，以10mg/kg的剂量施用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇的提取物的动物模型的SN、ST和小脑中TH和ND9的表达水平几乎恢复到与所述正常对照一样高的正常水平，Akt1蛋白的磷酸化水平也恢复到正常水平(表45～47)
【表45】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型的SN中的TH、线粒体和胰岛素信号传导系统损伤的恢复作用
【表46】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型的ST中的TH、线粒体和胰岛素信号传导系统损伤的恢复作用
【表47】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对MPTP诱导的帕金森氏病小鼠模型的小脑中的TH、线粒体和胰岛素信号传导系统损伤的恢复作用
实验例10：牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治
疗作用
<10-1>帕金森氏病动物模型的构建：6-OHDA(6-羟多巴胺)诱导的帕金森氏病小鼠
模型
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，如图2所示，构建了帕金森氏病的动物模型(图2)。
具体地，分配8周龄的ICR雄性小鼠(体重：约19～22g)，随后，在庆熙大学药学院的动物实验室中适应至少1周。此时，调节室内温度在22±2℃，控制湿度在53±3％。光暗循环设置为12小时/12小时。自由提供水和饲料。适应后，将小鼠分成3组，每组分配6只小鼠。在2μl的0.1％的抗坏血酸中稀释16μg6-OHDA(6-羟多巴胺)，并通过立体定位手术将其注射给每只小鼠，构建帕金森氏病的动物模型。将实施例<5-1>中制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％乙醇提取物的冷冻干燥物(1∶1∶1)溶解在水中，以3mg/kg的剂量向小鼠口服施用(口服，p.o.)，每天一次，持续7天。正常对照组用溶剂处理，阴性对照组通过立体定位手术注射含6-OHDA的0.1％的抗坏血酸。
<10-2>6-OHDA诱导的帕金森氏病小鼠模型中牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物
的提取物对运动协调性的改善
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，在施用上述混合物的提取物之后，用6-OHDA诱导的帕金森氏病小鼠模型进行了行为测试(爬杆试验、旋转试验)。
具体地，在实验例<10-1>中构建了帕金森氏病小鼠模型。构建后7天，将所述动物模型放置在具有粗糙表面(直径：8mm，高度：55cm)的杆的顶部。每30秒测量小鼠完全下移的时间，并定义为转向时间(T-转)，并且测量小鼠到达地板的时间，定义为运动活动时间(T-LA)。将动物放置在可调节rpm的轮上。测量动物跌落的时间(跌落潜伏期)。正常对照用溶剂处理，阴性对照通过立体定位手术注射含6-OHDA的0.1％的抗坏血酸。然后，用对照进行爬杆试验以测量T-转和T-LA，并通过与上述相同的方式进行旋转试验以测量跌落潜伏期。
结果如表48和表49所示，与用溶剂处理的正常对照组相比，用6-OHDA单独处理的阴性对照组中的T-转和T-LA显著增大。同时，用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇提取物处理的帕金森氏病小鼠模型中的T-转和T-LA减小(表48和表49)。如表50所示，从旋转试验可以确认用6-OHDA单独处理的阴性对照组中的的跌落潜伏期显著减小，而用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇提取物处理的帕金森氏病小鼠模型中的跌落潜伏期增大。因此，可以确认，用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇提取物处理的帕金森氏病小鼠模型中的运动协调性得到了恢复(表48～50)。
【表48】
6-OHDA诱导的帕金森氏病小鼠模型中牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物产生的T-转的减小
【表49】
6-OHDA诱导的帕金森氏病小鼠模型中牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物产生的T-LA的减小
【表50】
6-OHDA诱导的帕金森氏病小鼠模型中牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物产生的跌落潜伏期的下降
<10-3>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对多巴胺能神经元的体内保护作用
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，获得了经本发明的混合物的提取物处理的6-OHDA诱导的帕金森氏病小鼠模型的脑组织，以其证实了对纹状体(ST)和黑质(SN)中的多巴胺能神经元的保护作用。
具体地，将完成实验例<10-2>中的行为试验的小鼠模型通过肌内注射施以舒泰(50mg/kg)用于麻醉。将含有4％的多聚甲醛的PBS注入心脏，然后提取脑。将提取的脑再次在4％的多聚甲醛中固定，然后在4℃下浸入30％蔗糖溶液中，直到脑下沉，然后冷冻。通过使用恒冷箱切片机(产品名称：CM3000，Leica，德国)将冷冻的脑组织切成30μm的冠状切片，并将切片在4℃下储存在包含甘油，乙二醇和PBS的储备溶液中。将所述切片置于盖玻片上，用PBS洗涤，然后用含有1％H2O2的PBS处理15分钟以从所述组织中消除过氧化物酶活性。然后，将抗酪氨酸羟化酶抗体(抗TH；1∶2000，兔来源的；Millipore，美国)作为第一抗体处理，随后反应过夜。将生物素化的抗兔IgG抗体作为第二抗体处理，然后在室温下反应90分钟。反应完成后，用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories，USA)中包含的抗生物素蛋白-生物素复合物溶液处理所述组织，随后反应1小时。用二氨基联苯胺诱导显色。为了研究多巴胺细胞的保护作用，测量了纹状体(ST)的光密度，然后计数黑质(SN)中的酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞。正常对照组用溶剂处理，阴性对照组通过立体定位手术注射含6-OHDA的0.1％的抗坏血酸。
结果如表51和表52所示，施用了牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物的帕金森氏病动物模型的纹状体(ST)的染色TH的光密度剂量依赖性增加，表明所述提取物对多巴胺能神经元具有保护作用。黑质(SN)中的TH阳性细胞也因施用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物剂量而表现为剂量依赖性增加(表51和52)
【表51】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物产生的6-OHDA诱导的帕金森氏病小鼠模型的纹状体(ST)中的TH的光密度的增加
【表52】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物产生的6-OHDA诱导的帕金森氏病小鼠模型的黑质(SN)中的TH阳性细胞的增加
实验例11：牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治
疗作用
<11-1>帕金森氏病动物模型的构建：鱼藤酮诱导的帕金森氏病大鼠模型
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，如图3所示，构建了帕金森氏病的动物模型(图3)。
具体地，分配7周龄的SD雄性大鼠(体重：200～220g)，随后，在东亚ST研究部的动物实验室中适应至少1周。此时，调节室内温度在22±2℃，控制湿度在53±3％。光暗循环设置为12小时/12小时。自由提供水和饲料。适应后，将大鼠分成3组，每组分配6只大鼠。将实施例<5-1>中制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％乙醇提取物的冷冻干燥物(1∶1∶1)溶解在水中，以10mg/kg的剂量向所述小鼠口服施用(口服，p.o.)，每天一次，持续6周。然后，在每日一次口服给药5周后，以2.5mg/kg的剂量向小鼠施用鱼藤酮(腹膜内给药，i.p.)1周，构建得到帕金森氏病动物模型。正常对照组用溶剂处理，阴性对照组以2.5mg/kg的剂量施用鱼藤酮(腹膜内给药，i.p.)，每天一次，持续5周。
<11-2>鱼藤酮诱导的帕金森氏病大鼠模型中牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物
的提取物对运动协调性的改善
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，在施用上述混合物的提取物之后，用所述鱼藤酮诱导的帕金森氏病大鼠模型进行了行为测试(圆柱体试验)。
具体地，用实验例<11-1>中构建的帕金森氏病大鼠模型进行圆柱体试验。将大鼠置于圆柱体中(高：30cm，直径：20cm)。统计5分钟内大鼠起身将爪子靠在墙上的次数。正常对照组用溶剂处理，阴性对照组以2.5mg/kg的剂量腹膜内给药鱼藤酮，每天一次，持续5周。同样地，统计5分钟内对照组的大鼠起身将爪子靠在墙上的次数。
结果如表53所示，与用溶剂单独处理的正常对照组相比，用鱼藤酮单独处理的阴性对照组中的站立的次数显著减少，而施用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％的乙醇提取物时，次数增加(表53)。
【表53】
鱼藤酮诱导的帕金森氏病大鼠模型中牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对5分钟内爪子置于墙上的次数的影响
<11-3>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物产生的α-突触核蛋白积累的减少
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，从经本发明的混合物的提取物处理的鱼藤酮诱发的帕金森氏病大鼠模型获得脑组织。研究了所述脑组织的黑质(SN)中的α-突触核蛋白积累模式。
具体地，将完成实验例<11-2>中的行为试验的大鼠模型通过肌内注射施以舒泰(50mg/kg)用于麻醉。将含有4％的多聚甲醛的PBS注入心脏，然后提取脑。将提取的脑再次在4％的多聚甲醛中固定，然后在4℃下浸入30％蔗糖溶液中，直到脑下沉，然后冷冻。通过使用恒冷箱切片机(产品名称：CM3000，Leica，德国)将冷冻的脑组织切成30μm的冠状切片，并将切片在4℃下储存在甘油，乙二醇和PBS中。将所述切片置于盖玻片上，用PBS洗涤，然后用含有1％H2O2的PBS处理15分钟以从所述组织中消除过氧化物酶活性。然后，将抗α-突触核蛋白抗体(1∶2000，鼠来源的；abcam，英格兰)作为第一抗体处理，随后反应过夜。将生物素化的抗鼠IgG抗体作为第二抗体处理，然后在室温下反应90分钟。反应完成后，用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories，USA)中包含的抗生物素蛋白-生物素复合物溶液处理所述组织，随后反应1小时。用二氨基联苯胺诱导显色。通过计数所述α-突触核蛋白的阳性细胞来测量所述α-突触核蛋白的积累。正常对照组用溶剂处理，阴性对照组以2.5mg/kg的剂量腹膜内施用鱼藤酮，每天一次，持续5周。
结果如表54所示，施用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的帕金森氏病动物模型的黑质(SN)中的α-突触核蛋白的阳性细胞的数量减少(表54)。
【表54】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物产生的帕金森氏病动物模型的黑质(SN)中的α-突触核蛋白的阳性细胞的减少
实验例12：牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病(脑部炎
症)的体内治疗作用
<12-1>神经炎症动物模型的构建：LPS诱导的帕金森氏病小鼠模型
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，如图4所示，构建了帕金森氏病的动物模型(图4)。
具体地，分配8周龄的C57BL/6雄性小鼠(体重：约19～22g)，随后，在庆熙大学药学院的动物实验室中适应至少1周。此时，调节室内温度在22±2℃，控制湿度在53±3％。光暗循环设置为12小时/12小时。自由提供水和饲料。适应后，将小鼠分成4组，每组分配6只小鼠。将实施例<5-1>中制备的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的90％乙醇提取物的冷冻干燥物(1∶1∶1)溶解在水中，以10或30mg/kg的剂量向所述小鼠口服施用(口服，p.o.)，每天一次，持续7天。然后在口服施药后以5mg/kg的剂量向所述小鼠施以(腹膜内给药，i.p.)LPS(脂多糖)，构建得到帕金森氏病动物模型。正常对照组用溶剂处理，阴性对照以5mg/kg的剂量施用LPS，但其后不用混合物的提取物处理。
<12-2>牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物的抗脑部炎症作用
为了研究本发明的牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物对帕金森氏病的体内治疗作用，从经本发明的混合物的提取物处理的帕金森氏病大鼠模型获得脑组织。通过研究上述获得的脑组织的黑体(SN)和海马体中的星形胶质细胞和小神经胶质细胞的活性来确认所述混合物的提取物的抗脑部炎症作用。
具体地，将实验例<12-1>中构建的神经炎症动物模型通过肌内注射施以舒泰(50mg/kg)用于麻醉。将含有4％的多聚甲醛的PBS注入心脏，然后提取脑。将提取的脑再次在4％的多聚甲醛中固定，然后在4℃下浸入30％蔗糖溶液中，直到脑下沉，然后冷冻。通过使用恒冷箱切片机(产品名称：CM3000，Leica，德国)将冷冻的脑组织切成30μm的冠状切片，并将切片在4℃下储存在甘油，乙二醇和PBS中。将所述切片置于盖玻片上，用PBS洗涤，然后用含有1％H2O2的PBS处理15分钟以从所述组织中消除过氧化物酶活性。然后，将抗-GFAP抗体(1∶5000，兔来源的；Neuromics，美国)或抗-Iba-1抗体(1∶1000，兔来源的；Dako，日本)作为第一抗体处理，随后反应过夜。将生物素化的抗兔IgG抗体作为第二抗体处理，然后在室温下反应90分钟。反应完成后，用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories，USA)中包含的抗生物素蛋白-生物素复合物溶液处理所述组织，随后反应1小时。用二氨基联苯胺诱导显色。通过计数GFAP和Iba-1阳性细胞来测量黑体(SN)和海马体中活化的星形胶质细胞和小神经胶质细胞的水平。正常对照组用溶剂处理，阴性对照以5mg/kg的剂量施用LPS，但其后不用混合物的提取物处理。
结果如表55和表56所示，帕金森氏病小鼠模型的黑质(SN)中由LPS增加的GFAP和Iba-1，通过施用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物而出现剂量依赖性减小。上述结果表明，星形胶质细胞和小神经胶质细胞的活化作用降低了，也就是脑部炎症减少了(表55和表56)。如表57和表58所示，帕金森氏病小鼠模型的海马体中由LPS增加的GFAP和Iba-1阳性细胞，通过施用牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合的乙醇提取物而出现剂量依赖性减小。同样地，星形胶质细胞和小神经胶质细胞的活化作用降低了，表明脑部炎症减少了(表57和表58)。
【表55】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物产生的LPS-诱导的帕金森氏病小鼠模型的黑质(SN)中的GFAP-阳性细胞(星形胶质细胞)的减少
【表56】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物产生的LPS-诱导的帕金森氏病小鼠模型的黑质(SN)中的Iba-1阳性细胞的减少
【表57】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物产生的LPS-诱导的帕金森氏病小鼠模型的海马体中的GFAP-阳性细胞的减少
【表58】
牡丹根皮、白芷根和柴胡根的混合物的提取物产生的LPS-诱导的帕金森氏病小鼠模型的海马体中的Iba-1阳性细胞的减少
生产实施例1：药物制剂的制备
<1-1>粉剂的制备
本发明的混合物的提取物或其级分 0.1g
乳糖 1.5g
滑石粉 0.5g
按照制备粉剂的常规方法通过混合上述所有组分并装入密封包装中来制备粉剂。
<1-2>片剂的制备
混合上述所有组分，通过常规的直接压片法来制备片剂。
<1-3>胶囊剂的制备
本发明的混合物的提取物或其级分 0.1g
玉米淀粉 5g
羧基纤维素 4.9g
按照制备胶囊剂的常规方法通过混合上述所有组分并装入硬胶囊中来制备胶囊剂。
<1-4>注射液的制备
本发明的混合物的提取物或其级分 0.1g
无菌蒸馏水 适量
pH调节剂 适量
按照制备注射液的常规方法通过混合上述所有组分，将所述混合物放入2ml安瓿中并进行无菌处理来制备注射液。
<1-5>液体制剂的制备
将上述所有组分溶解在纯净水中。加入柠檬香精后，通过添加纯净水调整总量为100ml。按照制备液体制剂的常规方法，通过将所述混合物放入棕色瓶中并进行无菌处理来制备液体制剂。
生产实施例2：保健功能性食品的制备
<2-1>面制食品的制备
向面粉中添加0.5～5.0重量份的本发明的混合物的提取物或其级分。按照常规方法，用所述面粉混合物制备提高健康的食品，诸如面包、蛋糕、饼干、薄脆饼干和面条。
<2-2>汤类和肉汁的制备
向汤和肉汁中添加0.5～5.0重量份的本发明的混合物的提取物或其级分。按照常规方法，用该混合物制备提高健康的肉类产品、汤类和肉汁。
<2-3>碎牛肉的制备
将10重量份的本发明的混合物的提取物或其级分与碎牛肉混合，按照常规方法制备提高健康的碎牛肉。
<2-4>碎牛肉的制备
向牛奶中添加5～10重量份的本发明的混合物的提取物或其级分，按照常规方法，用所述牛奶混合物制备提高健康的奶制品，诸如黄油和冰淇淋。
<2-5>Sun-Sik的制备
按照常规方法将糙米、大麦、糯米和薏苡(Yulmu，job’s tears)凝胶化，干燥、粉碎，得到60目的粉末。
按照常规方法，将黑豆、黑芝麻和野生芝麻蒸熟、干燥，并粉碎，得到60目的粉末。
将本发明的混合物的提取物在减压下浓缩、喷雾干燥并粉碎，得到60目的干燥粉末。
按照以下比例将谷物、种子和本发明的混合物的提取物或其级分的干燥粉末混合来制备Sun-Sik。
谷物(糙米：30重量份，薏苡：15重量份，大麦：20重量份)，
种子(野生芝麻：7重量份，黑豆：8重量份，黑芝麻：7重量份)，
本发明的混合物的提取物或其级分(3重量份)，
灵芝(Ganoderma lucidum)(0.5重量份)
地黄(Rehmannia glutinosa)(0.5重量份)
<2-6>健康补充食物的制备
按照健康食物的优选组合比例混合维生素和矿物质。不过，所述组合比例可以调整。按照制备健康食物的常规方法将各成分混合，然后按照常规方法制备健康食物的组合物。
生产实施例3：健康饮品的制备
按照制备健康饮品的常规方法混合上述成分。在85℃下加热并搅拌一小时，然后过滤。将所述滤液装在1L的无菌容器中，密封并再次灭菌，储藏在冰箱中直至其用于制备健康饮品的组合物。
按照优选的混合比例混合适于喜爱的饮品的成分，但所述组合比例可以根据地区和国家的偏好等进行调整。
本领域技术人员将理解，在前面的描述中公开的概念和具体实施例可以容易地用作修改或设计用于实现本发明的相同目的的其他实施例的基础。本领域技术人员还将理解，这样的等同实施例不背离如所附权利要求中阐述的本发明的精神和范围。
序列表
<110> 庆熙大学校产学协力团
东亚ST株式会社
金永美
吴明淑
洪善杓
孙美苑
郑轸锡
姜海花
金恩辰
刘子荣
曹泳雄
杜晓菲
崔祥珍
金玎洙
金炳文
<120> 用于治疗和预防神经退行性疾病的含有牡丹根皮、白芷根和柴胡根的组合提取物及其级分的药物组合物
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<160> 16
<170> PatentIn version 3.2
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<400> 16
ggcatcgttt atggtcggaa 20
Claims (3)
1.药物组合物在用于制备治疗或改善帕金森氏病的药物中的用途，
其中，所述药物组合物由牡丹根皮、白芷根和膜缘柴胡的混合物的提取物组成，而且
其中，所述提取物通过使用水、甲醇、乙醇、丁醇或其混合物作为溶剂来提取。
2.根据权利要求1所述的用途，
其中，所述提取物包含一种或多种选自以下的化合物：
由式1表示的芍药醇(2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮)
由式2表示的芍药甙，
由式3表示的芍药甙元酮([(2s,3as,5s,7ar,8s)-3a-羟基-7a-甲基-6-氧代六氢-2,5-甲桥-1,3-苯并二氧杂环戊烯-8-基]甲基苯甲酸酯) ，
由式4表示的欧前胡素(9-[(3-甲基-2-丁烯-1-基)氧基]-7H-呋喃并[3,2-g][1]苯并吡喃-7-酮)，
由式5表示的柴胡皂苷A((3β,4α,16β)-13,28-环氧基-16,23-二羟基齐墩果-11-烯-3-基-6-脱氧-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)
由式6表示的柴胡皂苷B2((3b,4a,16a)-16,23,28-三羟基齐墩果-11,13(18)-二烯-3-基-6-脱氧-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)
由式7表示的柴胡皂苷B4((3β,11α,16α)-16,23,28-三羟基-11-甲氧基齐墩果-12-烯-3-基-6-脱氧-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)，和
由式8表示的柴胡皂苷D((3b,4a,16a)-13,28-环氧-16,23-二羟基齐墩果-11-烯-3-基-6-脱氧-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)：
[式1]
[式2]
[式3]
[式4]
[式5]
[式6]
[式7]
[式8]
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述提取物抑制线粒体功能损伤、内质网应激或炎症反应。
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