CN108042554B - 麦冬皂苷d在制备治疗代谢综合征药物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了麦冬皂苷D在制备治疗代谢综合征药物上的应用。本发明首次发现了麦冬皂苷D可通过改变肠道菌群的组成进而改善由高脂进食诱导的小鼠代谢综合征，包括肥胖症、高血糖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、脂肪肝及腹部脂肪异常堆积。本发明开拓了麦冬皂苷D的药物用途，并为治疗肥胖相关代谢综合征提供了新的可能。

Description

麦冬皂苷D在制备治疗代谢综合征药物上的应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体地说涉及麦冬皂苷D在制备治疗代谢综合征药物上的应用。

背景技术

代谢综合征是指人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱的病理状态，是导致糖尿病、心脑血管疾病的危险因素。其中，肥胖症是一种典型的慢性代谢综合征，常常伴随着脂质和糖代谢紊乱的发生。肥胖症的诱发因素包括遗传因素、不健康的饮食习惯及缺乏锻炼等。肥胖的特征包括脂肪组织和其他器官中过量的脂肪堆积，血脂水平的明显升高，并常伴随着慢性低劣度炎症的发生。肥胖往往还会诱导许多疾病的发生，如2型糖尿病、心血管疾病、脂肪肝甚至癌症。流行病学调查发现，肥胖是一种全球流行性疾病。据估计，全球有接近21亿人超重或患有肥胖症。超重和肥胖已成为世界第五大致死因素，每年大约有340万人因此死亡。近年来，中国超重和肥胖人口数量也急剧增加，分别已达到9000万和2亿人口。因此，肥胖已成为危害人类健康的巨大隐患，给社会公共卫生系统带来沉重负担。

肥胖症由诸多病理因素造成，其中肠道菌群组成的优化被认为是重要原因之一。研究发现，在人体各器官中，肠道内微生物的密度最大(超过100万亿，总重量达1.5千克)，其中大多数都位于远端大肠。肠道菌群是寄生在人体肠道中的正常微生物，主要是一些细菌，这些细菌彼此间相互制约，相互依存，在质和量上形成一种生态平衡。人类的肠道微生物主要由厚壁菌(Firmicutes)和拟杆菌(Bacteroidetes)构成，同时包含少量的变形菌、疣微菌、梭菌、放线菌和蓝藻细菌。肠道菌群参与宿主的多项生理生化过程，包括葡萄糖的利用，胆酸的早期解离和脱氢化，维生素和必须氨基酸的生物合成等。作为人体的共生者，肠道菌群在调节人体营养吸收及体重方面发挥着重要作用。举列来说，与同窝瘦鼠相比，肥胖小鼠肠道中拟杆菌数量减少，而厚壁菌数量增多。临床研究也证明肥胖个体体内厚壁菌与拟杆菌的比例远高于正常个体。使用无菌受体动物的研究和粪菌移植技术表明肠道菌群功能和结构的紊乱会增加肥胖及其并发症的风险，这表明肠道菌群的改变优先于肥胖症的发生。相反地，肥胖又进一步加剧了肠道菌群的紊乱，从而形成一个恶性循环。因此，通过使用药物或营养干预策略来纠正肠道菌群紊乱已成为一种有希望的治疗肥胖症策略。

近期研究表明，麦冬皂苷D具有多种药理作用，包括抗心律不齐、抗氧化、抗静脉血栓、提高微循环等。例如，麦冬皂苷D可通过抑制DOX诱导的JNK和ERK1/2的激活，降低ROS的产生，从而保护心脏线粒体免受DOX毒性的影响除此之外；还有学者发现，麦冬皂苷D具有抗骨质疏松、抑制肿瘤转移等功能。

如中国专利“麦冬皂苷D作为组织因子途径抑制剂的医药用途”(公开号CN101327221A)公开了麦冬皂苷其作为组织因子(TF)途经抑制剂的用途，可用于治疗心脑血管疾病、凝血障碍、侵入性医疗程序、肿瘤转移等疾病。

又如中国专利“麦冬皂苷D在制备调控血管内皮细胞功能基因药物中的应用”(公开号CN101088506A)公开了麦冬皂苷D可下调因H₂O₂对血管内皮细胞具有损伤作用的基因表达，上调对抗H₂O2损伤的基因表达，从而达到保护血管内皮细胞形态及功能的完整性。

目前没有任何现有技术公开麦冬皂苷D能用于治疗代谢综合征，也没有公开其能有效优化与肥胖相关的肠道菌群环境，从而控制因肥胖加剧肠道菌群紊乱的因素。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供麦冬皂苷D在制备治疗代谢综合征药物上的应用；以及其在用于优化与肥胖相关的肠道菌群环境的应用。

技术方案：麦冬[Ophiopogonjaponicus(Linn.f.)Ker-Gawl.]为百合科沿阶草属多年生常绿草本植物，其作为中国传统中草药一直被广泛应用于治疗各种炎性疾病，如咽炎、支气管炎、肺炎和咳嗽等。式I所述化合物麦冬皂苷D(Ophiopogonin D，麦冬皂苷D)是一种从麦冬块根中分离出的甾体皂苷，也是其发挥药理作用的主要活性成分。

本发明利用高脂饲料构建了小鼠肥胖模型，并灌胃不同剂量的麦冬皂苷D，进而分析麦冬皂苷D对小鼠肥胖症的治疗效果。所述治疗代谢综合征的药物包括治疗肥胖症、高血糖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、脂肪肝、腹部脂肪异常堆积任意一种或多种疾病的药物。

本发明还公开了麦冬皂苷D与肥胖相关的肠道菌群的调节机制，证明其对肥胖症的潜在疗效。鉴于口服方式是大多数抗肥胖药物的用药途径，本发明对肠道菌群改善的研究成果在肥胖症治疗上具有重要意义。

有研究表明，在数量庞大的肠道菌群中，厚壁菌和拟杆菌的比值(F/B，Firmicutes/Bacteroidetes)升高、产生内毒素的变形菌(Proteobacteria)数量增加及维持免疫平衡的菌种减少是导致肥胖症肠道微生物生态失调的主要原因。本发明发现，麦冬皂苷D优化的肠道菌群包括厚壁菌门(Fimicutes)、拟杆菌门(Bacteroides)、变形菌门(Proteobacteria)、理研菌门(Rikenellanceea)、螺杆菌门(Helicobacteraceae)、瘤胃球菌门(Ruminococcaceae)、毛螺菌门(Lachnospiraceae)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)。

另有研究表明，与正常进食组相比，高脂进食可诱导肝脏中促进单不饱和脂肪酸合成的关键脂质基因Srebp-1c和Fas的表达，本发明发现了麦冬皂苷可有效拮抗上述基因的高表达。

本发明利用麦冬皂苷D灌胃处理，可以通过有效地优化与代谢参数相关的肠道菌群丰度，从而减少高脂进食诱导的肥胖、炎症及代谢综合征的发生。通过粪便转移实验发现，肥胖症的发生和肠道菌群的优化息息相关。

综上，靶向麦冬皂苷D调节的肠道菌群介入手段有望成为治疗肥胖及其相关代谢疾病的重要方法。

附图说明

图1是试验例1中高脂进食增重的增长曲线；

图2是试验例1中高脂进食摄食量对比的柱形图，其中，N.S.表示无显著性差异；

图3是试验例1中小鼠解剖后脂肪肝和附睾脂肪堆积的形态学分析照片对比；

图4是试验例2葡萄糖耐受实验中小鼠空腹血糖的对比柱形图；

图5是试验例2胰岛素耐受实验中小鼠血清胰岛素含量的对比柱形图；

图6中，A是试验例3葡萄糖耐受实验的曲线图，B是其曲线下面积统计比较图；

图7中，A是试验例3丙酮酸耐受实验的曲线图，B是其曲线下面积统计比较图；

图8中，A是试验例3胰岛素耐受实验的曲线图，B是其曲线下面积统计比较图，图6、图7、图8中B的柱形图从左到右依次表示正常进食组、正常进食组+麦冬皂苷D(高)、高脂进食组、高脂进食组+麦冬皂苷D(低)、高脂进食组+麦冬皂苷D(高)；

图9是试验例4中不同治疗组和对照组的小鼠血清ALT水平；

图10是试验例4中不同治疗组和对照组的小鼠血清AST水平；

图11是试验例4中不同治疗组和对照组的小鼠血清TG水平；

图12是试验例4中不同治疗组和对照组的小鼠血清TC水平；

图13是试验例4中不同治疗组和对照组的小鼠血清LDL-C水平；

图14是试验例4中不同治疗组和对照组的小鼠血清LDL-C/HDL-C比值；

图15是试验例4中不同治疗组和对照组的小鼠血清TNF-α水平；

图16是试验例4中不同治疗组和对照组的小鼠血清MCP-1水平；

图17是试验例4中不同治疗组和对照组的小鼠血清IL-6水平，N.S.表示无显著差异；

图18是试验例5中小鼠肝脏重量的对比示意图；

图19是试验例5中小鼠腹部脂肪重量的对比示意图；

图20是试验例5中小鼠肝脏H&E染色和油红染色(放大倍数200)，其中，第一行是H&E染色，第二行是油红染色；

图21是试验例5中小鼠腹部脂肪H&E染色(200μm)；

图22是试验例5中小鼠肝脏TG含量的对比柱形图；

图23是试验例5中小鼠肝脏TC含量的对比柱形图；

图24是试验例5中小鼠脂合成相关基因Srebp-1c的mRNA表达；

图25是试验例5中小鼠脂合成相关基因Fas的mRNA表达；

图26是试验例5中SREBP-1C和FAS的蛋白表达；

图27是试验例6中稀疏曲线分析；

图28是试验例6中香农多样性指数分析；

图29是试例6中基于加权unifrac分析的PCoA；

图30是试例6中基于unifrac模型的UPGMA分析；

图31是试验例6中特定组别中相对丰度排名前10位的细菌类群；

图32是试例6中特定个体中相对丰度排名前10位的细菌类群；

图33是试验例7中正常进食组和高脂进食组OTUs的RDA分析；

图34是试验例7中“高脂进食组+麦冬皂苷D(低)”和高脂进食组的RDA分析；

图35是试验例7中“高脂进食组+麦冬皂苷D(高)”和高脂进食组的RDA分析；

图36是试验例7中比较“正常进食组+麦冬皂苷D(高)”和正常进食组的RDA分析；

图37是试验例7中维恩分析，每个圆代表一组样品，覆盖部分代表共享的OTUs

图38是试验例8中小鼠体重；

图39是试验例8中小鼠摄食量；

图40是试验例8中小鼠形态学分析；

图41是试验例8中小鼠空腹血糖与随机血糖；

图42是试验例8中小鼠血清胰岛素含量；

图43是试验例8中GTT；

图44是试验例8中PTT；

图45是试验例8中ITT；

图46是试验例8中统计并比较F-H曲线下面积；

图47是试验例8中小鼠血清ALT和AST水平；

图48是试验例8中小鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平；

图49是试验例8中小鼠血清TNF-α、MCP-1和IL-6水平；

图50是试验例8中小鼠肝脏重量；

图51是试验例8中小鼠肝脏的H&E染色和油红染色(放大倍数200)；

图52是试验例8中小鼠肝脏TG和TC含量；

图53是试验例8中小鼠腹部脂肪重量；

图54是试验例8中小鼠腹部脂肪H&E染色；

图55是试验例8中小鼠肝脏Srebp-1c和Fas的mRNA表达水平；

图56是试验例8中小鼠肝脏SREBP-1C和FAS的蛋白表达水平；

图57是试验例9中稀疏曲线分析；

图58是试验例9中香农多样性指数；

图59是试验例9中基于加权unifrac分析的PCoA；

图60是试验例9中基于unifrac模型的UPGMA分析；

图61是试验例9中各组别中相对丰度排名前10位的细菌类群；

图62是试验例9中对“高脂进食组→高脂进食组”和“高脂进食+麦冬皂苷D(高)组”间肠道菌群组成的T-test分析；

图63是试验例9中LDA值分析；

图64是试验例9中对比“高脂进食组→高脂进食组”和“高脂进食+麦冬皂苷D(高)组”的RDA分析；

图65是试验例9中维恩分析两组中特异性的OTUs，左边方框代表“高脂进食组→高脂进食组”，右边方框代表“高脂进食+麦冬皂苷D(高)组”。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

本发明利用高脂饲料构建了小鼠肥胖模型，并灌胃不同剂量的麦冬皂苷D，进而分析麦冬皂苷D对小鼠肥胖症的治疗效果。治疗代谢综合征的药物包括治疗肥胖症、高血糖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、脂肪肝、腹部脂肪异常堆积任意一种或多种疾病的药物。

麦冬皂苷D具有与肥胖相关的肠道菌群的调节机制，其对肥胖症的潜在疗效，对肠道菌群改善的研究成果在肥胖症治疗上具有重要意义。

麦冬皂苷D优化的肠道菌群包括厚壁菌门(Fimicutes)、拟杆菌门(Bacteroides)、变形菌门(Proteobacteria)、理研菌门(Rikenellanceea)、螺杆菌门(Helicobacteraceae)、瘤胃球菌门(Ruminococcaceae)、毛螺菌门(Lachnospiraceae)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)。

高脂进食可诱导肝脏中促进单不饱和脂肪酸合成的关键脂质基因Srebp-1c和Fas的表达，本发明发现了麦冬皂苷可有效拮抗上述基因的高表达。

本发明利用麦冬皂苷D灌胃处理，可以通过有效地优化与代谢参数相关的肠道菌群丰度，从而减少高脂进食诱导的肥胖、炎症及代谢综合征的发生。通过粪便转移实验发现，肥胖症的发生和肠道菌群的优化息息相关。

试验例1高脂进食体增重和摄食量试验

选用实验动物为6周龄健康雄性近交系小鼠。小鼠置于标准实验室环境中饲养，温度24±2℃，相对湿度50％～60％，自由摄食和饮水，普通日光灯照明，自动时控开关控制12L：12D光周期。小鼠适应实验室环境两周后，开始进行分组培养。其中正常进食组给予普通饲料，高脂进食组给予高脂饲料(脂肪含量60％，购自美国Research Diets公司)，持续饲喂2个月来诱导小鼠肥胖模型。实验期间，每天给予小鼠足量食物，自由饮水。

麦冬皂苷D购自南京泽朗药业有限公司，形状为白色粉末，难溶于水，易溶于有机溶剂，纯度＞98％，分子质量855.017g/mol。普通饲料及SPF级垫料均购自江苏省协同医药生物工程公司。

2个月后，肥胖小鼠模型造模成功后，将模型组小鼠随机分为5组如下：

对照组：正常进食组；

高脂进食组；

试验组：正常进食组+麦冬皂苷D(高)，麦冬皂苷D剂量为1mg/kg小鼠体重；

高脂进食组+麦冬皂苷D(低)，麦冬皂苷D剂量为0.2mg/kg小鼠体重；

高脂进食组+麦冬皂苷D(高)，麦冬皂苷D剂量为1mg/kg小鼠体重。

通过灌胃方式给药，每天一次。正常进食组和高脂进食组的对照组以等体积0.9％生理盐水灌胃，治疗组分别以相应剂量的麦冬皂苷D混悬液进行灌胃，实验期间小鼠自由饮水进食，每天同一时间记录小鼠的体重并测量剩余食物量以计算摄食量。灌药8周后，进行后续生理功能检测，处死时对脂肪肝和附睾部位的脂肪堆积进行形态学分析。

如图1所示，高脂饲料喂养小鼠体重较正常进食组显著增加了38.6％。与之相比，8周高剂量麦冬皂苷D灌胃后，高脂进食组小鼠体重显著下降了17％。高脂进食组小鼠的摄食量与正常进食组相比有所下降，而麦冬皂苷D处理并未改变高脂进食组小鼠的摄食量(如图2所示)，说明麦冬皂苷D并不是通过减少摄食量来发挥其降低体重的功效的。

如图3所示，形态学分析显示，相较于对照组来说，麦冬皂苷D处理组的小鼠肝脏及附睾脂肪体积较小，且肝脏的颜色更为鲜艳，说明麦冬皂苷D显著改善了高脂进食诱导的脂肪肝和附睾脂肪堆积。

试验例2麦冬皂苷D降低高脂进食引起的小鼠高血糖及高胰岛素

本试验通过检测小鼠的血糖及胰岛素水平，探究麦冬皂苷D对血糖和血清胰岛素含量的影响，试验结果如图4至图8所示，血糖水平分析发现，相比于正常进食组小鼠，高脂进食组小鼠的空腹血糖水平显著升高。反之，麦冬皂苷D逆转了上述小鼠的空腹高血糖症状，高剂量的麦冬皂苷D逆转效果更明显。

胰岛素水平分析发现，高脂进食诱导了小鼠高胰岛素血症的发生(胰岛素水平与正常进食组相比升高了5.67倍)。而麦冬皂苷D治疗后，高脂进食组小鼠的高胰岛素血症得到了明显缓解(从图5可以看出，低剂量组和高剂量组分别降低了55.2％和64.2％)。

试验例3麦冬皂苷D改善高脂进食诱发的葡萄糖/丙酮酸不耐受、提高胰岛素敏感性

为了进一步评估小鼠的胰岛素耐受力、丙酮酸耐受力和胰岛素敏感性，进行了葡萄糖耐受实验、丙酮酸耐受实验和胰岛素耐受实验。

在葡萄糖耐受实验(Glucose tolerance test，GTT)中，小鼠在禁食16h后，行腹腔注射1g/kg葡萄糖。

在丙酮酸耐受实验(Pyruvate tolerance test，PTT)中，小鼠在禁食16h后，行腹腔注射2g/kg丙酮酸。

在胰岛素耐受实验(Insulin tolerance test，ITT)中，正常进食组小鼠在禁食6h后，行腹腔注射0.75U/kg胰岛素，而高脂进食组小鼠胰岛素用量增至2U/kg。

上述腹腔注射完成后，使用血糖仪分别测定小鼠注射0，15，30，60，120min后的血糖水平，并用Origin8软件统计曲线下面积(Area under curve，AUC)后进行数据分析。

结果发现，高脂进食组小鼠的葡萄糖耐受力、丙酮酸耐受力和胰岛素敏感性均受到严重损害。而治疗组中，如图6至图8所示，高脂进食组小鼠上述症状均发生了不同程度的改善。

试验例4麦冬皂苷D对高脂进食组小鼠血清中脂质和炎症因子水平的影响

采集小鼠血样，放在4℃冰箱，静置过夜。第二天，于4℃4000rpm，离心10min。利用南京建成生物工程有限公司试剂盒检测血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C、TNF-α、MCP-1和IL-6的水平，具体步骤见相关说明书。

检测结果显示，如图9、图10所示，与正常进食组相比，高脂喂养使小鼠血清中ALT和AST活性显著升高，而麦冬皂甙D可有效降低高脂进食组小鼠血清中ALT和AST的活性，随着剂量的增大，降低效果越好，表明麦冬皂甙D对于高脂进食诱导的小鼠肝功能损伤具有显著的改善作用。

从图11至图14可以看出，由于高脂进食会诱导小鼠血清中TG、TC和LDL-C的显著升高。灌胃麦冬皂苷D八周后，上述血脂相关指标均有下降，剂量越大，下降效果越明显，且LDL-C/HDL-C的比值也同时降低。

如前文背景技术中所述，肥胖与机体慢性低劣度炎症密切相关。从图15、图16中可以看出，麦冬皂苷D有效降低了高脂进食组小鼠血清中的TNF-α和MCP-1水平，且随着剂量增大降低效果越明显；但图17表明摄入麦冬皂甙D并未影响血清中IL-6水平。此外，从图15至图17中可以看出，麦冬皂苷D并未改变正常进食组小鼠血清中的炎性因子水平。

试验例5麦冬皂苷D对高脂进食组小鼠脂肪肝及腹部脂肪堆积的影响

处死灌药8周后的小鼠，剪取肝脏、白色脂肪、褐色脂肪等组织，并将全部肝脏和白色脂肪组织分别进行称重。所有组织置于冻存管中在液氮中迅速冷冻后，再保存于-80℃冰箱备用。如图18及图19所示，高脂喂养组小鼠肝重和腹部脂肪重量分别是正常进食组的1.56和7.6倍，而麦冬皂苷D降低了肥胖小鼠的肝重和腹部脂肪重量，随着剂量的增大，肥胖小鼠肝重和腹部脂肪重量进一步降低。

染色分析

分离肝脏组织时，取最大叶肝脏边缘同一部位的小块肝组织。用4％多聚甲醛固定过夜，分别用于苏木精伊红(Hematoxylin-eosin staining，H&E)染色和油红(Oil Red O，ORO)染色(如图20所示)。取同一小块附睾脂肪组织，用4％多聚甲醛固定，置于4℃，用于H&E染色(如图21所示)。染色分析结果表明，麦冬皂苷D剂量依赖性地降低了肥胖小鼠肝细胞和附睾脂肪细胞中脂质含量大小。

肝脏TG和TC含量的测定

称取肝脏组织35～50mg于500mL磷酸缓冲液(PBS)中，匀浆后离心取上清，利用南京建成生物工程有限公司试剂盒检测肝脏中TG和TC的含量，具体步骤参见说明书。

从图22和图23可以看出，麦冬皂苷D显著降低了高脂喂食小鼠肝脏中TG和TC的含量，其中高剂量治疗组小鼠的肝脏中TG和TC含量分别下降了48％和52％。

脂质基因表达

利用常规方法提取小鼠肝脏组织中的RNA，反转录，设计引物如表1所示，小鼠脂合成相关基因Srebp-1c和Fas的mRNA表达。

表1小鼠脂质基因表达的引物设计

如图24至图26所示，与正常进食组相比，高脂进食可诱导肝脏中促进单不饱和脂肪酸合成的关键脂质基因Srebp-1c和Fas的表达，通过对二者的mRNA和蛋白水平进行了检测，结果发现麦冬皂苷D治疗拮抗了上述基因的高表达，且高剂量治疗组效果更显著。

试验例6麦冬皂苷D改善高脂进食导致的小鼠肠道菌群比例紊乱

在8周麦冬皂苷D治疗后，无菌条件下收集小鼠粪便样本，并迅速置于液氮冷冻，而后转至-80℃冰箱中储存。使用粪便DNA分离试剂盒提取DNA(Qiagen，Valencia，CA，USA)后，并委托Novogene公司(北京，中国)对样品进行质检，并对小鼠肠道微生物的16S rRNA(V4区)进行焦磷酸测序。通过移除不合格的序列后，共获得了1409840个原始读值，平均每个样本获得56394±4057个读值。经筛选，共产生139188个有效读值，平均每个粪便样本(每组5只小鼠)产生55676±3979个有效读值。

利用稀疏曲线(Rarefaction curve)来比较测序数量不同的样本物种的丰富度，可进一步说明样本的取样大小是否合理。当曲线趋于平缓时，说明取样深度已基本覆盖到样品中所有的物种，更多的数据量对发现新的OTUs贡献降低；反之，则表示样品中物种多样性较高，还存在较多未被检测到的物种，继续取样还可能产生较多新的OTUs。从图27可以看出，相对于正常进食组，“正常进食组+麦冬皂苷D(高)”和“高脂进食组+麦冬皂苷D(高)”的OTUs数目大于其他试验组。

香农多样性指数(Shannon index)是一种基于信息理论的测量指数，结合图27和图28的结果可以看出此次检测基本涵盖所有物种，取样大小比较合理。

UniFrac是通过利用系统进化的信息来比较样品间的物种群落差异，其计算结果可作为一种衡量β多样性的指数，β多样性指的是样品间的多样性差异，为了计算样品间的多样性，需要每个样品有相同的序列数，β指数越大，表示样品间的差别越大。基于加权UniFrac分析的主坐标分析(PCoA)的方法能展示各个样品间的差异大小，两个样品在坐标轴上的距离较近，则表示这两个样品的物种组成较相似。然后通过UPGMA(非加权组平均法)方法对样品进行聚类分析，发现正常进食组和高脂进食组，高脂进食组及高脂进食+麦冬皂苷D组小鼠肠道微生物之间存在显著的差异，表明麦冬皂苷D能使小鼠因高脂进食扰乱的肠道菌群整体结构朝着正常进食组逆转(如图29和图30所示)。

更重要的是，分类学分析表明，高剂量的麦冬皂苷D治疗使高脂进食组小鼠中F/B比值(厚壁菌和拟杆菌的比值)及变形菌门数量减少，而低剂量麦冬皂苷D治疗组则未观察到明显变化(如图31和图32所示)。

试验例7麦冬皂苷D逆转高脂进食导致的肠道菌群中毛螺菌科的产生

试验例7通过冗余分析RDA(Redundancy analysis，RDA)分析确定了应对高脂进食及麦冬皂苷D治疗的特异性细菌类型。

从图33可以看出，与正常进食组相比，高脂进食显著改变了52个OTUs，其中28个OTUs增加、24个OTUs减少。

从图34和图35可以看出，对于高脂进食组小鼠，低剂量和高剂量麦冬皂苷D处理分别改变了61个OTUs(54个增加、7个减少)和20个OTUs(12个增加、8个减少)，表2表明其共产生73个有明显差异的OTUs，其中高脂进食组只有18个OTUs由于麦冬皂苷D的治疗发生了变化(其中16个增加、2个减少)，其中7个OTUs被高剂量麦冬皂苷D逆转，大部分属于毛螺菌科Lachnospiraceae。这一菌科与代谢紊乱、糖尿病和肥胖症的发生息息相关。有趣的是，

图36和图37表明，正常进食组+麦冬皂苷D(高)组小鼠的肠道菌群聚集度较高，表明相较于正常进食组小鼠，麦冬皂苷D对高脂进食组小鼠的肠道菌群影响更为显著。图34和图35的聚类分析表明OTU_7的丰度在所有麦冬皂苷D处理组增加，而高脂进食组并不存在这种情况，说明它可能是麦冬皂苷D特异调控的菌种(图34和图35)。

如图37所示，通过维恩分析，进一步鉴定出6个特异性响应麦冬皂苷D的OTUs。综上所述，麦冬皂苷D能部分逆转高脂进食组小鼠的肠道菌群中有害菌的产生，维持其肠道菌群稳态。

试验例8粪便转移实验高剂量麦冬皂苷D对代谢综合征的影响

为了进一步评估麦冬皂苷D对由高脂进食导致代谢紊乱的小鼠肠道菌群的改善效应，本试验例进行了粪便移植实验。粪便供体小鼠“高脂进食组”与“高脂进食组+麦冬皂苷D(高)”的小鼠处理方式与试验例1类似。但要在麦冬皂苷D治疗7周以后，每日在无菌环境下收集小鼠粪便。用1mL无菌生理盐水重悬100mg收集到的粪便，振荡10秒，再以800×g离心3min，收集上清。为了防止污染，每次在对受体小鼠灌胃前10min内准备好新鲜转移材料。受体小鼠高脂饲喂4周以后，每日接种新鲜转移材料(每只鼠100μL)，处死之前持续灌胃34天。

然后按照试验例1、试验例2、试验例3、试验例4、试验例5中相同的方法进行试验，获得如下结果：

如图38所示，25日高脂进食后，“高脂进食组+麦冬皂苷D(高)组→高脂进食组”(即，转移“高脂进食组+麦冬皂苷D(高)”组小鼠肠道菌群的受体小鼠饲喂高脂饲料)的小鼠体重相较于移植了高脂进食组粪便的小鼠体重减少了15.8％。另外，这两组间小鼠的摄食量并没有显著性差异(如图39所示)。在形态学方面，相较于“高脂进食组→高脂进食组”(即，转移高脂进食组小鼠肠道菌群的受体小鼠饲喂高脂饲料)，“高脂进食+麦冬皂苷D(高)组→高脂进食组”小鼠的肝脂肪和附睾脂肪堆积得到明显改善(如图40所示)。

如图41和图42所示，转移高剂量麦冬皂苷D治疗组小鼠的粪便后，高脂进食组小鼠的空腹高血糖和高胰岛素血症均有所缓解。

此外，从图43至图46可以看出，粪便移植还能改善“高脂进食组→高脂进食组”的葡萄糖/丙酮酸耐受力和胰岛素敏感性。

如图47至图49所示，“高脂进食组→高脂进食组”小鼠血清中的多项血脂和炎症因子参数，包括ALT、AST、TG、TC、LDL-C、TNF-α、MCP-1，均发生明显升高(绝对值高于正常进食组)，部分数值与高脂进食组相接近，暗示着转移高脂进食组的粪便能加速小鼠的高血脂及体内炎症进程。而当使用高脂进食组+麦冬皂苷D(高)组粪便灌胃高脂喂养喂养的小鼠后，上述血清学参数均发生了不同程度的下降，高脂进食+麦冬皂苷D(高)组的粪便中具有能够调节血脂和炎症代谢的肠道菌群。此外，血清中的IL-6含量并未产生差异，这一结果暗示着IL-6的分泌与高脂进食和肠道菌群之间的关系较弱。

不仅如此，如图50所示，与“高脂进食组→高脂进食组”小鼠相比，“高脂进食+麦冬皂苷D(高)组”小鼠肝脏重量也相应地减少了35％。H&E和ORO染色显示，“高脂进食+麦冬皂苷D(高)组”肝脏中的脂滴相较于“高脂进食组→高脂进食组”明显减小(如图51所示)。一致的是，肝脏中的TG和TC含量也显著降低(如图52所示)。此外，图53表明，上述小鼠的附睾脂肪重量也明显降低，与高脂进食组→高脂进食组小鼠相比减少了52.8％。图54表明，H&E染色显示，脂肪细胞的体积明显减小，暗示着脂肪的脂质储存量明显降低。

在分子水平上，为了进一步确认肝脏的脂质合成情况，采用了RT-qPCR及WesternBlot的方法，检测了上述小鼠肝脏中的Srebp-1c和Fas的表达情况，发现“高脂进食+麦冬皂苷D(高)组”小鼠肝脏中的Srcbp-1c和Fas的mRNA和蛋白的表达明显受到抑制，变得更加迟缓(如图55和图56所示)。总的来说，上述结果均表明麦冬皂苷D通过部分调控肠道菌群改善高脂进食诱导的小鼠代谢紊乱。

试验例9粪便转移实验高剂量麦冬皂苷D对肠道菌群的影响

在试验例8的基础上，按照试验例7的方法对粪便转移后高剂量麦冬皂苷D对肠道菌群的影响进行研究。

为了确认肠道菌群转移成功，通过焦磷酸测序区分了“高脂进食组→高脂进食组和高脂进食+麦冬皂苷D(高)组”的肠道菌群组成。一共获得了628305个原始读值，平均每个样本获得62831±14436个读值。经筛选，共产生611417个有效读值，平均每个粪便样本产生61142±14148个有效读值。

如图57和58所示，稀疏曲线和香农多样性指数分析反应出测序深度覆盖了大部分种系，且取样大小比较合理。

从图59和图60可以看出，与“高脂进食组→高脂进食组”相比，“高脂进食+麦冬皂苷D(高)组”小鼠的肠道菌群具有其特异性菌种，其中F/B比率下降了44.7％，脱铁杆菌Deferribacteres水平显著降低了54.5％，而两组间变形菌Proteobacteria的水平并没有显著差异(如图61所示)。

相应地，通过t-test和LDA的效应值分析结果表明，厚壁菌和脱铁杆菌是“高脂进食组→高脂进食组”小鼠粪便中的主要菌种，而拟杆菌是“高脂进食+麦冬皂苷D(高)组”小鼠粪便中的主要菌种(如图62和图63所示)。

进一步进行RDA分析，结果发现了17个OTUs在粪便移植后发生了改变(如图64所示)。

在RDA分析中，请进一步参考表3所示，其中2个OTUs，分别属于毛螺菌科Lachnospiraceae和理研菌科Rikenellanceea，丰度显著增加。剩余的15个OTUs含量均发生降低，其中1个属于螺杆菌科Helicobacteraceae，5个属于瘤胃球菌科Ruminococcaceae，6个属于毛螺菌科Lachnospiraceae，1个属于Christensenellaceae科，还有2个尚无分类学参数的OTUs减少(如图64和表3所示)。另外，维恩分析显示，在HOPD(HFD)→HFD组小鼠肠道菌群中出现了10个独特的OTUs，但却与麦冬皂苷D单独处理组特异性富集的OTUs不同(图65)。

综上所述，我们的研究结果显示，灌胃麦冬皂苷D能部分通过调节能量代谢调控相关的肠道菌群组分，进而改善高脂进食诱导的肥胖、炎症和代谢综合征等相关症状。麦冬皂苷D的有益效果还能通过粪便转移实验得到部分复制，提示着肥胖的发生和肠道菌群的改变密切关系，并且能被一些功能性药物所逆转。除此以外，我们还发现正常进食组小鼠体内的菌群更加地紧密聚集，表明麦冬皂苷D对高脂进食小鼠的肠道菌群的组成有着更深远的影响。我们推测，麦冬皂苷D的作用效果很可能与饮食习惯有关，也就是说麦冬皂苷D可能对西方饮食习惯的人群有着更好的疗效。麦冬皂苷D是一种从麦冬块根中分离出的甾体皂苷，作为中国传统草药被用来治疗炎症和心血管疾病已有数千年历史。希望本研究在以往研究的基础上进一步为麦冬皂苷D的临床应用打下坚实的理论基础，靶向肠道菌群的麦冬皂苷D干预技术也有望成为治疗肥胖和其他代谢疾病的重要方法。

综上所述：

1.麦冬皂苷D治疗组小鼠的体重明显下降，同时其空腹高血糖和高胰岛素血症也被显著改善，胰岛素敏感性也大大提升。

2.麦冬皂苷D的治疗能拮抗高脂进食导致的血清甘油三酯、胆固醇、LDL-C以及炎症因子的升高。同时，降低上述小鼠肝脏和附睾脂肪堆积，并减少肝脏脂肪合成重要调节基因Srebp-1c和Fas的表达。

3.麦冬皂苷D能改善高脂饲料喂养的小鼠肠道菌群的紊乱，降低高脂进食组小鼠肠道内厚壁菌(Firmicutes)与拟杆菌(Bacteroidetes)的比例，同时减少耐受内毒素的变形菌门(Proteobacteria)含量。尤其是降低了Lachnospiraceae科菌种的含量。

4.麦冬皂苷D的抗肥胖以及肠道菌群改善效果还能通过转移灌胃麦冬皂苷D且进食高脂饲料组的小鼠粪便进入高脂进食组小鼠肠道内实现。

Claims (4)

1.麦冬皂苷D在制备治疗代谢综合征药物上的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述治疗代谢综合征的药物包括治疗肥胖症、高血糖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、脂肪肝、腹部脂肪异常堆积任意一种或多种疾病的药物。

3.麦冬皂苷D在制备优化与肥胖相关的肠道菌群环境药物上的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：麦冬皂苷D优化的肠道菌群包括厚壁菌门（Fimicutes）、拟杆菌门（Bacteroides）、变形菌门（Proteobacteria）、理研菌门（Rikenellanceea）、螺杆菌门（Helicobacteraceae）、瘤胃球菌门（Ruminococcaceae）、毛螺菌门（Lachnospiraceae）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）。