CN108037225A - 利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的发明名称为利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，它是使用高效液相色谱分析仪和DAD检测器对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用高效液相色谱分析仪和DAD检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待检测血液中的卡马西平药物浓度，该方法准确、快速、特异性强，具有较高的分离度和灵敏度，为临床上卡马西平的血药浓度监测提供了可靠的实验数据，更便于医生为患者及时提供准确的卡马西平给药方案。

Description

利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法
技术领域
本发明涉及一种精神类药物的药物浓度监测技术领域，尤其涉及一种检测血液中药物卡马西平浓度的方法。
背景技术
卡马西平(Carbamazepine，CBZ)，分子式C15H12N2O，其化学结构为5H-二苯并[b，f]氮杂卓-5-甲酰胺，具体结构如图1所示。CBZ常用于对抗癫痫发作，是简单部分性发作尤其是复杂部分性癫痫的首选药物，对大发作、局限性发作和混合型癫痫亦有疗效。此外，另有临床精神疾病研究指出，其可用于治疗精神分裂症和双相型障碍等。该药物有效浓度为4-12mg/L，具有安全范围小、体内代谢个体差异大、毒性较强等特点，且其疗效和不良反应与血液中药物浓度密切相关，故有必要对其进行药物浓度监测。
目前，卡马西平药物浓度监测的常见方法有：紫外分光光度法、荧光偏振免疫法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法等。在众多的方法中，液相色谱法为测定卡马西平的最准确的方法。以往方法存在前处理复杂、不能重现结果，干扰因素多、分析时间长、灵敏度不高、定性定量不够准确等问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明目的是提供利用在线固相萃取技术检测血液中卡马西平药物浓度的方法，该方法前处理方法简单高效，定量准确快速，特异性强，大大缩短了整体分析时间，更利于进行大通量样本的分析。
本发明采用以下技术方案：
本发明的一种利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其中：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将至少三种不同浓度的标准工作液10μL和90μL的由1∶1的甲醇和水组成的稀释液分别置于1.5mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为g00-1200rpm下涡旋混匀1-2min后，用高效液相色谱分析仪和DAD检测器对上述至少三种标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的卡马西平色谱图，以上述至少三个标准溶液的卡马西平峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有卡马西平的浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为含有卡马西平的溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取卡马西平标准品15mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液，将标准储备液用含水量为20％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有5-400mg/L卡马西平的范围内配置出各标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(b)用一次性无菌注射器吸取步骤(二)中的血清或血浆350μL，然后将上述无菌注射器前端连接针孔滤膜，将上述血清或血浆进行过滤后，将其移入1.5mL管中，得到待测样品；
(四)待测样品的检测
使用高效液相色谱分析仪和DAD检测器对上述步骤(b)待测样品100μL进行检测，得出上述待测样品的卡马西平色谱图，将上述色谱图中的卡马西平峰面积y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物浓度x，即为待检测血液中的卡马西平药物浓度；
高效液相色谱分析仪包括：双三元泵、在线过滤器、SPE柱和色谱柱；标准工作液和待测样品分别通过双三元泵依次进入在线过滤器、SPE柱和色谱柱；
本发明的一种利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其中：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00、320.00mg/L浓度的卡马西平溶液；
本发明的一种利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其中：在步骤(a)中用由1∶1的水和甲醇组成的稀释液进行稀释；
本发明的一种利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其中：所述SPE柱为资生堂公司的C18MG S-3；
本发明的一种利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其中：所述色谱柱为AgiLent公司的Extend-C18，在线过滤器为AgiLent 1290Infinity inLinefiLter；
本发明的一种利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其中：所述高效液相色谱仪设置的柱温为30℃；
本发明的一种利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用流动相为甲醇-水，并且双三元泵采用梯度洗脱，流速为1mL/min，进样量为10uL；
本发明的一种利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其中：所述DAD检测器的检测波长为318nm，采集频率为5Hz，响应常数为1s；
本发明的一种利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其中：所述含水量为体积比的含水量。
本发明有益效果：
本发明所述的检测血液中卡马西平浓度的方法，准确、快速、特异性强，具有较高的分离度和灵敏度，为临床上卡马西平的血药浓度监测提供了可靠的实验数据，更便于医生为患者及时提供准确的卡马西平给药方案。
附图说明
图1为卡马西平化学结构式；
图2为实施例中标准溶液中卡马西平色谱图，其中标号1为卡马西平；
图3为实施例中加标血清或血浆样本中卡马西平色谱图，其中标号1为卡马西平；
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
本发明利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将七种不同浓度的标准工作液10μL和90μL的由1∶1的甲醇和水组成的稀释液分别置于1.5mL离心管中混合制成七种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1200rpm下涡旋混匀1min后，用高效液相色谱分析仪和DAD检测器对上述七种标准溶液进行检测，得出上述七种标准溶液的卡马西平色谱图，以上述至少三个标准溶液的卡马西平峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有卡马西平的浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为含有卡马西平的溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取卡马西平标准品15mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液，将标准储备液用含水量为50％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，配置出含有5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00、320.00mg/L浓度卡马西平溶液的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上消液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(b)用一次性无菌注射器吸取步骤(二)中的血清或血浆350μL，然后将上述无菌注射器前端连接针孔滤膜，将上述血清或血浆进行过滤后，将其移入1.5mL管中，得到待测样品；
(四)待测样品的检测
使用高效液相色谱分析仪和DAD检测器对上述步骤(b)待测样品100μL进行检测，得出上述待测样品的卡马西平色谱图，将上述色谱图中的卡马西平峰面积y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物浓度x，即为待检测血液中的卡马西平药物浓度；
高效液相色谱分析仪包括：双三元泵、在线过滤器、SPE柱和色谱柱；标准工作液和待测样品分别通过双三元泵依次进入在线过滤器、SPE柱和色谱柱，SPE柱为资生堂公司的C18MG S-3，色谱柱为AgiLent公司的Extend-C 18，在线过滤器为AgiLent 1290InfnfinityinLine fiLter，柱温为30℃，高效液相色谱仪所使用流动相为甲醇-水，并且双三元泵采用梯度洗脱，流速为1mL/min，进样量为10uL，DAD检测器的检测波长为318nm，采集频率为5Hz，响应常数为1s。
如果没有特殊说明，本申请中的含水量为体积比的含水量。
表1在线固相萃取、梯度洗脱和阀切换参数
本实施例中技术方法论证如下：
一、该方法的线性关系和定量限
将上述配制的10μL的各个浓度的卡马西平标准工作液，加入90μL稀释液(甲醇：水＝1∶1)，涡旋混匀后进样，按本实施例测定条件浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明卡马西平的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：0.05mg/L。
(2)定量限(LOQ)：0.16mg/L。
(3)线性范围：
卡马西平在0.50mg/L到32.00mg/L范围内，线性良好，相关系数R2＞0.99。
二、该方法的回收率和精密度
取卡马西平标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如下表2。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为91.99％～93.03％，相对标准偏差为0.67％～2.62％，结果见表2。
表2卡马西平加标回收率和精密度
加标量 1.00mg/L 400mg/L 16.00mg/L
平均回收率 91.99％ 9303％ 9286％
精密度RSD 2.62％ 067％ 2.28％
综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中卡马西平药物浓度，重现性良好，且分析时间短，大大提高了检测效率。
血清或血浆样本中卡马西平的色谱图见图3，标准溶液中卡马西平的色谱图见图2，卡马西平的保留时间分别为5.02min，由图2和图3可知本实施例方法借助在线固相萃取技术，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，具有较高准确度。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将至少三种不同浓度的标准工作液10μL和90μL的由1∶1的甲醇和水组成的稀释液分别置于1.5mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为800-1200rpm下涡旋混匀1-2min后，用高效液相色谱分析仪和DAD检测器对上述至少三种标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的卡马西平色谱图，以上述至少三个标准溶液的卡马西平峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有卡马西平的浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为含有卡马西平的溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取卡马西平标准品15mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液，将标准储备液用含水量为20％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有5-400mg/L卡马西平的范围内配置出各标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(b)用一次性无菌注射器吸取步骤(二)中的血清或血浆350μL，然后将上述无菌注射器前端连接针孔滤膜，将上述血清或血浆进行过滤后，将其移入1.5mL管中，得到待测样品；
(四)待测样品的检测
使用高效液相色谱分析仪和DAD检测器对上述步骤(b)待测样品100μL进行检测，得出上述待测样品的卡马西平色谱图，将上述色谱图中的卡马西平峰面积y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物浓度x，即为待检测血液中的卡马西平药物浓度；
高效液相色谱分析仪包括：双三元泵、在线过滤器、SPE柱和色谱柱；标准工作液和待测样品分别通过双三元泵依次进入在线过滤器、SPE柱和色谱柱。
2.如权利要求1所述的利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其特征在于：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00、320.00mg/L浓度的卡马西平溶液。
3.如权利要求2所述的利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其特征在于：在步骤(a)中用由1∶1的水和甲醇组成的稀释液进行稀释。
4.如权利要求3所述的利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其特征在于：所述SPE柱为资生堂公司的C18MG S-3。
5.如权利要求3所述的利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其特征在于：所述色谱柱为AgiLent公司的Extend-C18，在线过滤器为AgiLent 1290InfinityinLine fiLter。
6.如权利要求3所述的利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪设置的柱温为30℃。
7.如权利要求3所述的利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用流动相为甲醇-水，并且双三元泵采用梯度洗脱，流速为1mL/min，进样量为10uL。
8.如权利要求4至7之一所述的利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其特征在于：所述DAD检测器的检测波长为318nm，采集频率为5Hz，响应常数为1s。
9.如权利要求8所述的利用双三元泵在线检测血液中卡马西平药物含量的方法，其特征在于：所述含水量为体积比的含水量。
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