CN108033881A - 一种半天然来源的酪氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半天然来源的酪氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用；该酪氨酸酶抑制剂以天然产物对羟基肉桂酸为原料，经过三步反应，合成得到(E)‑3‑(4‑羟基苯基)丙烯酸‑2‑乙酰基‑5‑甲氧基苯酯；该化合物能够有效抑制酪氨酸酶，可用于抑制果蔬的酶促褐变、制备美白化妆品、制备用于预防和治疗黑色素过多导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的药物制剂。
Description
技术领域
本发明公开了一种酪氨酸酶抑制剂，具体的说，是一种半天然来源的酪氨酸酶抑制剂,本发明还涉及该半天然来源的酪氨酸酶抑制剂的制备方法。
背景技术
酪氨酸酶是一种多功能、含有铜离子的多酚氧化酶，普遍存在于植物、动物、真菌和细菌中。研究发现，酪氨酸酶在黑色素的合成方面有重要作用，是黑色素合成过程中的限速酶。该酶参与黑色素合成的前两步反应，分别是催化单酚底物酪氨酸羟基化(酪氨酸酶的单酚酶活性)生成二酚L-多巴、催化氧化二酚L-多巴(酪氨酸酶的二酚酶活性)为相应的醌类物质。随后，醌类物质经过一系列的非酶促反应，生成黑色素。尽管黑色素能有效的吸收紫外线，保护皮肤免受紫外线的伤害，但是酪氨酸酶的异常过量表达也可导致色素沉积类疾病，如雀斑、黄褐斑、老年斑等皮肤病。因此，酪氨酸酶抑制剂具有治疗恶性黑色素瘤的潜力，以及治疗常见的黑色素沉着皮肤病。
酪氨酸酶和果蔬的酶促褐变有关，在大多数食品贮藏和加工过程中，酶促褐变会导致新鲜水果、饮料的营养价值和商业价值降低。因此，酪氨酸酶抑制剂也可用于水果和蔬菜的保鲜。此外，酪氨酸酶还与昆虫的生理功能关系密切，它有助于角质层的形成、黑色素的沉积、昆虫外壳的硬化。同时，酪氨酸酶还与昆虫表皮的愈伤和修复有关，可以杀死侵入的微生物和被感染的细胞，阻止其扩散。因此，在农业领域，酪氨酸酶抑制剂可以扰乱昆虫的生理功能，从而达到防治昆虫的效果。
鉴于酪氨酸酶广泛的应用功能，目前市面上常用的酪氨酸酶抑制剂的种类十分有限，主要包括熊果苷，曲酸，维生素C及其衍生物等，熊果苷安全性好，但其抑制活性低且价格高昂，维生素C价格低、安全性好，但存在活性太差使得不能大量使用，曲酸活性好但有致癌作用。鉴于酪氨酸酶抑制剂的广泛应用和良好的潜在应用前景，开发高效低毒的酪氨酸酶抑制剂已成为重要的研究方向。
发明内容
针对上述不足，本发明的第一个目的提供一种半天然来源的酪氨酸酶抑制剂。
本发明的第二个目的提供上述半天然来源的酪氨酸酶抑制剂的制备。
本发明的第三个目的提供上述半天然来源的酪氨酸酶抑制剂的应用。
为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：
一种半天然来源的酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，其结构式如式1所示：
本发明提供的第二个技术方案是这样的：
上述的半天然来源的酪氨酸酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)-5～25℃下，将叔丁基二甲基氯硅烷加入至对羟基肉桂酸的二氯甲烷或氯仿溶液中，然后加入有机碱将反应液的pH值调至9～10，反应液室温下搅拌5～24小时，反应完毕后，反应液依次用1N稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤；收集有机相，将有机相用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到淡黄色油状的粗中间体；
2)将步骤1)中的粗中间体溶解于MeOH和THF的混合溶剂中，室温下加入弱碱溶液搅拌2～10小时，然后将溶剂除去，残留物用二氯甲烷或氯仿稀释，依次用1N稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤；收集有机相，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到白色粉末状的中间体A；
3)室温下将二氯亚砜加入至步骤2)中间体A的二氯甲烷或氯仿溶液中，混合液加热至回流1～10小时，然后蒸馏除去多余的二氯亚砜；冷却至室温后，将残留物溶解于干燥的二氯甲烷或氯仿中，然后-5～25℃下加入丹皮酚，接着加入有机碱，反应在室温下搅拌过夜；反应完毕后，反应液依次用1N稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水，收集有机相并用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到淡黄色油状物中间体B；
4)将2N氢氟酸溶液加入至中间体B的四氢呋喃溶液中，混合液加热回流1～5小时，反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到淡黄色固体状的成品C；
其中：
步骤1)所述的对羟基肉桂酸与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1：1.2～5；
步骤3)所述的中间体A、二氯亚砜、丹皮酚、有机碱的摩尔比为1：1～20：1～5：1～20；
步骤4)所述的中间体B、2N氢氟酸溶液的摩尔比为1：10～100。
进一步的，上述的半天然来源的酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤1)、步骤3)所述的有机碱为三乙胺、或吡啶、或DBU、或DIEA、或N-甲基吗啉；
进一步的，上述的半天然来源的酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的弱碱为碳酸钠、或碳酸钾、或碳酸氢钠、或碳酸氢钾、或氨水。
上述半天然来源的酪氨酸酶抑制剂作为果蔬的抗酶促褐变剂的应用。
上述半天然来源的酪氨酸酶抑制剂作为护肤品添加剂的应用。
上述半天然来源的酪氨酸酶抑制剂作为抑制酪氨酸酶活性药物的应用
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：该产品由两种天然来源的化合物通过酯化反应制备，是一种半天然的酪氨酸酶抑制剂，且制备条件温和、方法易行。与现有常用的酪氨酸酶抑制剂曲酸相比，该产品对酪氨酸酶的抑制活性高出16倍，在医药、化妆品、食品、农业等领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1是中间体A的1H NMR检测谱图；
图2是中间体A的13C NMR检测谱图；
图3是中间体B的1H NMR检测谱图；
图4是中间体B的13C NMR检测谱图；
图5是成品C的1H NMR检测谱图；
图6是成品C的13C NMR检测谱图；
图7是成品C对酪氨酸酶的抑制效应；
图8是成品C对酪氨酸酶的抑制机制；
图9是成品C对酪氨酸酶的抑制动力学。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
(E)-3-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)丙烯酸(中间体A)的合成
-5℃下，将叔丁基二甲基氯硅烷(3.62g,24.0mmol)加入至对羟基肉桂酸(3.28g,20.0mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中，然后加入三乙胺将反应液的pH值调至9～10。反应液室温下搅拌5小时，反应完毕后，反应液依次用1N盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到淡黄色油状的中间体。然后将此中间体溶解于MeOH/THF(6.0mL,1/2)中，室温下加入饱和碳酸钠溶液搅拌2小时。然后将溶剂除去，残留物用二氯甲烷稀释，依次用1N盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到白色粉末状的中间体A(3.56g,64％)。
进行1H NMR，结果参阅图1，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝15.9Hz,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H),6.86(d,J＝8.5Hz,2H),6.31(d,J＝15.9Hz,1H),0.99(s,9H),0.23(s,6H).
进行13C NMR，结果参阅图2，13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.66,158.45,146.94,130.20,127.54,120.74,115.02,25.77,18.40,-4.23.
(E)-3-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯(中间体B)的合成
室温下将二氯亚砜(73μL,1.0mmol)加入至中间体A(278mg,1.0mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中，混合液加热至回流1小时，然后蒸馏除去多余的二氯亚砜。冷却至室温后，将残留物溶解于干燥的二氯甲烷(5mL)中，然后-5℃下加入丹皮酚(166mg,1.0mmol)，接着加入三乙胺(138μL,1.0mmol)，反应在室温下搅拌过夜。反应完毕后，反应液依次用1N盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到淡黄色油状物中间体B(228mg,53％)。
进行1H NMR，结果参阅图3，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91-7.78(m,2H),7.50(d,J＝8.5Hz,2H),6.92-6.80(m,3H),6.68(d,J＝2.1Hz,1H),6.54(d,J＝15.9Hz,1H),3.86(s,3H),2.52(s,3H),1.00(s,9H),0.24(s,6H).
进行13C NMR，结果参阅图4，13C NMR(101MHz,CDCl3)δ196.03,165.57,163.83,158.59,151.74,147.29,132.34,130.30,127.55,124.00,120.77,114.58,112.03,109.25,55.86,29.83,25.77,18.41,-4.21.
(E)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯(成品C)的合成
将2N氢氟酸溶液(1.0mL,2.0mmol)加入至中间体B(80mg,0.2mmol)的四氢呋喃(4.0mL)溶液中，混合液加热回流1小时。反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到淡黄色固体状的成品C(45mg,76％)。
进行1H NMR，结果参阅图5，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90-7.77(m,2H),7.45(d,J＝14.9Hz,2H),6.91-6.81(m,3H),6.69(d,J＝2.5Hz,1H),6.50(d,J＝15.9Hz,1H),5.93(brs,1H),3.87(s,3H),2.54(s,3H).
进行13C NMR，结果参阅图6，13C NMR(101MHz,CDCl3)δ197.37,165.82,164.10,158.94,151.78,147.42,132.58,130.56,126.60,123.59,116.22,113.95,112.00,109.48,55.91,29.85.
实施例2
(E)-3-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)丙烯酸(中间体A)的合成
10℃下，将叔丁基二甲基氯硅烷(9.04g,60.0mmol)加入至对羟基肉桂酸(3.28g,20.0mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中，然后加入吡啶将反应液的pH值调至9～10。反应液室温下搅拌15小时，反应完毕后，反应液依次用1N盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到淡黄色油状的中间体。然后将此中间体溶解于MeOH/THF(6.0mL,1/2)中，室温下加入饱和碳酸钾溶液搅拌6小时。然后将溶剂除去，残留物用二氯甲烷稀释，依次用1N盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到白色粉末状的中间体A(3.23g,58％)。
进行1H NMR，结果参阅图1，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝15.9Hz,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H),6.86(d,J＝8.5Hz,2H),6.31(d,J＝15.9Hz,1H),0.99(s,9H),0.23(s,6H).
进行13C NMR，结果参阅图2，13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.66,158.45,146.94,130.20,127.54,120.74,115.02,25.77,18.40,-4.23.
(E)-3-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯(中间体B)的合成
室温下将二氯亚砜(871μL,12.0mmol)加入至中间体A(278mg,1.0mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中，混合液加热至回流6小时，然后蒸馏除去多余的二氯亚砜。冷却至室温后，将残留物溶解于干燥的二氯甲烷(5mL)中，然后10℃下加入丹皮酚(332mg,2.0mmol)，接着加入吡啶(1mL,12.4mmol)，反应在室温下搅拌过夜。反应完毕后，反应液依次用1N盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到淡黄色油状物中间体B(242mg,57％)。
进行1H NMR，结果参阅图3，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91-7.78(m,2H),7.50(d,J＝8.5Hz,2H),6.92-6.80(m,3H),6.68(d,J＝2.1Hz,1H),6.54(d,J＝15.9Hz,1H),3.86(s,3H),2.52(s,3H),1.00(s,9H),0.24(s,6H).
进行13C NMR，结果参阅图4，13C NMR(101MHz,CDCl3)δ196.03,165.57,163.83,158.59,151.74,147.29,132.34,130.30,127.55,124.00,120.77,114.58,112.03,109.25,55.86,29.83,25.77,18.41,-4.21.
(E)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯(成品C)的合成
将2N氢氟酸溶液(5.0mL,10.0mmol)加入至中间体B(80mg,0.2mmol)的四氢呋喃(4.0mL)溶液中，混合液加热回流3小时。反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到淡黄色固体状的成品C(50mg,84％)。
进行1H NMR，结果参阅图5，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90-7.77(m,2H),7.45(d,J＝14.9Hz,2H),6.91-6.81(m,3H),6.69(d,J＝2.5Hz,1H),6.50(d,J＝15.9Hz,1H),5.93(brs,1H),3.87(s,3H),2.54(s,3H).
进行13C NMR，结果参阅图6，13C NMR(101MHz,CDCl3)δ197.37,165.82,164.10,158.94,151.78,147.42,132.58,130.56,126.60,123.59,116.22,113.95,112.00,109.48,55.91,29.85.
实施例3
(E)-3-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)丙烯酸(中间体A)的合成
25℃下，将叔丁基二甲基氯硅烷(15.07g,100.0mmol)加入至对羟基肉桂酸(3.28g,20.0mmol)的氯仿(50mL)溶液中，然后加入N,N-二异丙基乙胺将反应液的pH值调至9～10。反应液室温下搅拌24小时，反应完毕后，反应液依次用1N盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到淡黄色油状的中间体。然后将此中间体溶解于MeOH/THF(6.0mL,1/2)中，室温下加入饱和碳酸氢钠溶液搅拌10小时。然后将溶剂除去，残留物用氯仿稀释，依次用1N盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到白色粉末状的中间体A(3.72g,67％)。
进行1H NMR，结果参阅图1，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝15.9Hz,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H),6.86(d,J＝8.5Hz,2H),6.31(d,J＝15.9Hz,1H),0.99(s,9H),0.23(s,6H).
进行13C NMR，结果参阅图2，13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.66,158.45,146.94,130.20,127.54,120.74,115.02,25.77,18.40,-4.23.
(E)-3-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯(中间体B)的合成
室温下将二氯亚砜(1451μL,20.0mmol)加入至中间体A(278mg,1.0mmol)的氯仿(5mL)溶液中，混合液加热至回流10小时，然后蒸馏除去多余的二氯亚砜。冷却至室温后，将残留物溶解于干燥的氯仿(5mL)中，然后25℃下加入丹皮酚(830mg,5.0mmol)，接着加入N,N-二异丙基乙胺(3.3mL,20.0mmol)，反应在室温下搅拌过夜。反应完毕后，反应液依次用1N盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到淡黄色油状物中间体B(221mg,52％)。
进行1H NMR，结果参阅图3，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91-7.78(m,2H),7.50(d,J＝8.5Hz,2H),6.92-6.80(m,3H),6.68(d,J＝2.1Hz,1H),6.54(d,J＝15.9Hz,1H),3.86(s,3H),2.52(s,3H),1.00(s,9H),0.24(s,6H).
进行13C NMR，结果参阅图4，13C NMR(101MHz,CDCl3)δ196.03,165.57,163.83,158.59,151.74,147.29,132.34,130.30,127.55,124.00,120.77,114.58,112.03,109.25,55.86,29.83,25.77,18.41,-4.21.
(E)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯(成品C)的合成
将2N氢氟酸溶液(10.0mL,20.0mmol)加入至中间体B(80mg,0.2mmol)的四氢呋喃(4.0mL)溶液中，混合液加热回流5小时。反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到淡黄色固体状的成品C(40mg,67％)。
进行1H NMR，结果参阅图5，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90-7.77(m,2H),7.45(d,J＝14.9Hz,2H),6.91-6.81(m,3H),6.69(d,J＝2.5Hz,1H),6.50(d,J＝15.9Hz,1H),5.93(brs,1H),3.87(s,3H),2.54(s,3H).
进行13C NMR，结果参阅图6，13C NMR(101MHz,CDCl3)δ197.37,165.82,164.10,158.94,151.78,147.42,132.58,130.56,126.60,123.59,116.22,113.95,112.00,109.48,55.91,29.85.
为了更好的说明本发明的效果，下面给出实施例中制备的酪氨酸酶抑制活性评价方法。
实验例1
将(E)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯溶于DMSO中配成不同浓度的溶液；配制浓度为2.5mM的L-多巴磷酸缓冲溶液；配制浓度为5000U/mL的酪氨酸酶磷酸缓冲溶液。首先向样品管中加入813μL的磷酸缓冲液(pH6.86)、7μL的酪氨酸酶溶液、20μL的抑制剂溶液，室温下孵化10min，然后加入160μL的L-多巴溶液，接着立即使用紫外分光光度计在475nm波长处将吸光度归零，然后读取1min后的吸光值。抑制剂对酪氨酸酶的抑制率(％)＝[(B-S)/B]×100，其中B是空白对照的吸光度，S是样品的吸光度。
(E)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯对酪氨酸酶的抑制曲线如图7所示，使用GraphPad Prism计算出IC50值为2.0μM。在同样的测试条件下，阳性对照曲酸的IC50值为32.1μM。因此，实验结果表明(E)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯对酪氨酸酶具有很强的抑制作用。
实验例2
(E)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯对酪氨酸酶的抑制机理
以L-Dopa为底物研究(E)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯对酪氨酸酶的抑制机理，沿用实验例1种酪氨酸酶抑制活性评价的反应体系，固定底物浓度为0.4mM，加入不同浓度的抑制剂，改变酪氨酸酶的浓度，测得的酶活力对酶量如图8所示，得到一组过原点的直线。随着抑制剂浓度的增加，线的斜率减小，说明了该抑制剂对酪氨酸酶的抑制是可逆的。在抑制剂存在的情况下，酪氨酸酶的活力降低，是因为抑制剂抑制了酶的活力，降低了酶的催化效率，而不是因为有效酶量的减少。随着酶浓度不断地变化，催化速率并没有发生任何变化，说明该抑制剂非常快速地结合酪氨酸酶，但没有进一步地诱导酶的构象变化。
实验例3
(E)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯对酪氨酸酶的抑制动力学
以L-Dopa为底物研究(E)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯对酪氨酸酶的抑制类型，沿用上述酪氨酸酶抑制活性评价的反应体系，固定酪氨酸酶的浓度为35U/mL，改变底物的浓度，测定加入不同浓度的抑制剂对酪氨酸酶催化底物的影响。如图9A所示，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，以底物浓度的倒数1/[S]对反应速度的倒数1/V作图，可以得到一组斜率不同但相交于X轴的直线。随着抑制剂浓度的增大，酶的米氏常数(Km)值不变而最大反应速度(Vmax)值减小，说明该抑制剂是非竞争型抑制剂。换句话说，该抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与酶-底物的复合物相结合，且Ki＝Kis。如图9B所示，以Lineweaver-Burk双倒数图中的纵轴截距对抑制剂浓度的作图得到一条直线，如下图B所示，可以求出Ki＝Kis＝3.8μM。
结合实验例子说明可以做为如下应用。
半天然来源的酪氨酸酶抑制剂作为果蔬的抗酶促褐变剂的应用。
上述半天然来源的酪氨酸酶抑制剂作为护肤品添加剂的应用。
上述半天然来源的酪氨酸酶抑制剂作为抑制酪氨酸酶活性药物的应用。
需要说明的是，本发明所采用的原料，除特殊说明外，均通过常规手段制备或者通过商业渠道购买。
Claims (7)
1.一种半天然来源的酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，其结构式如式1所示：
2.一种制备权利要求1所述的半天然来源的酪氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)-5～25℃下，将叔丁基二甲基氯硅烷加入至对羟基肉桂酸的二氯甲烷或氯仿溶液中，然后加入有机碱将反应液的pH值调至9～10，反应液室温下搅拌5～24小时，反应完毕后，反应液依次用1N稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤；收集有机相，将有机相用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到淡黄色油状的粗中间体；
2)将步骤1)中的粗中间体溶解于MeOH和THF的混合溶剂中，室温下加入弱碱溶液搅拌2～10小时，然后将溶剂除去，残留物用二氯甲烷或氯仿稀释，依次用1N稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤；收集有机相，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到白色粉末状的中间体A；
3)室温下将二氯亚砜加入至步骤2)中间体A的二氯甲烷或氯仿溶液中，混合液加热至回流1～10小时，然后蒸馏除去多余的二氯亚砜；冷却至室温后，将残留物溶解于干燥的二氯甲烷或氯仿中，然后-5～25℃下加入丹皮酚，接着加入有机碱，反应在室温下搅拌过夜；反应完毕后，反应液依次用1N稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水，收集有机相并用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到淡黄色油状物中间体B；
4)将2N氢氟酸溶液加入至中间体B的四氢呋喃溶液中，混合液加热回流1～5小时，反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产品，过柱纯化得到淡黄色固体状的成品C；
其中：
步骤1)所述的对羟基肉桂酸与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1：1.2～5；
步骤3)所述的中间体A、二氯亚砜、丹皮酚、有机碱的摩尔比为1：1～20：1～5：1～20；
步骤4)所述的中间体B、2N氢氟酸溶液的摩尔比为1：10～100。
3.根据权利要求2所述的半天然来源的酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤1)、步骤3)所述的有机碱为三乙胺、或吡啶、或DBU、或DIEA、或N-甲基吗啉。
4.根据权利要求2所述的半天然来源的酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的弱碱为碳酸钠、或碳酸钾、或碳酸氢钠、或碳酸氢钾、或氨水。
5.权利要求1所述半天然来源的酪氨酸酶抑制剂作为果蔬的抗酶促褐变剂的应用。
6.权利要求1所述半天然来源的酪氨酸酶抑制剂作为护肤品添加剂的应用。
7.权利要求1所述半天然来源的酪氨酸酶抑制剂作为制备预防和治疗黑色素过多导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其它需要抑制酪氨酸酶活性的药物制剂的应用。
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