CN108030793A - 一种防治少精症的复合微生物制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了防治少精症的复合微生物制剂及其制备方法；制备该微生物制剂的原料为：桃红荚硫菌发酵液、冠突散囊菌种子、解淀粉芽孢杆菌发酵液、红糖、大豆分离蛋白粉、蜂蜜、氯化钠，低聚木糖、去离子水等；本发明的复合微生物制剂含有大量的微生物多糖物质及活性益生菌，具有疏肝调气、补肾通精，调节肠道等作用，可以明显改善临床症状及体征，提高精子参数和内分泌水平，改善不育兼症，能够缩短病程，提高疗效，市场前景将非常广泛。

Description

一种防治少精症的复合微生物制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物医药与食品饮品技术领域，具体是涉及到一种防治少精症的复合微生物制剂及其制备方法。
背景技术
少精症(oligospermatism)是指精液中的精子数目低于正常具有生育能力男性的一种病症，世界卫生组织(World Health Organization， WHO)规定男性的精子密度在每毫升精液中低于2千万为少精子症，生育方面就会有很大影响。据WHO统计，在过去的50年中，正常男子的精子密度平均减少40%- 50%，精子数量以每年0. 25%的速度下降。每七对夫妇就约有1对不育者，在世界范围内，不育患者高达5000万-8000万，而且每年以200万对不育夫妇的速度增加。在中国不育夫妇中约占已婚夫妇的10%左右，其中因男性生育能力缺陷所致不育者不少于不育夫妇的50%。我国近年来男性不育症患者呈逐年增长的趋势，男性生殖健康令人担忧，以少精子症和精子活力低下症为临床表现的男性不育给人们的生活带来了极大地挑战，成为了影响人们生活的常见病之一。
一般认为，近50年来，环境污染、食品中激素含量过多、性病蔓延、吸毒、酗酒、过度吸烟、生活压力过大、一些药物如激素类药、神经系统药、心血管系统药和化疗药物的长期应用等生物、物理、化学和心理因素造成男性生殖器官翠丸损害，是导致男性精子质量和数量下降的主要原因。中医认为少精症病因主要是先天票赋不足、房事不节、久病劳倦、饮食不节、痰浊淤血、淫毒侵染、情志不遂等导致少精不育。
西医对于少精症的现有治疗手段有限，有辅助生殖技术如体外授精和胚胎移植(IVF-ET、卵浆内单精子显微注射(ICI)等，药物治疗一般使用克罗米芬、精氨酸、翠丸酮提高精子密度，但上述治疗手段具有成功率低，药物副作用较大等弊端。故需找新的安全、有效的治疗药物十分必要。
本发明的复合微生物制剂在治疗少精不育症上取得重大突破，解决了传统治疗药物疗效差和毒副作用大的难题，可作为治疗药物与保健应用，社会意义巨大，特申请此发明专利。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种复合微生物活菌含量高、活性高、稳定性高、作用效果快的、无副作用，保存时间长，具有明显防治少精症的复合微生物制剂，制备该微生物制剂的原料按重量份为：桃红荚硫菌发酵液20-40份、冠突散囊菌种子5-10份、解淀粉芽孢杆菌发酵液20-40份、红糖3-6份、大豆分离蛋白粉2-4份、蜂蜜1-2份、氯化钠0.2-0.4份，低聚木糖0.5-2份、去离子水80份。
为了实现上述目的，本发明防治少精症的复合微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
在发酵罐中加入红糖3-6份、大豆分离蛋白粉2-4份、蜂蜜1-2份、氯化钠0.2-0.4份，低聚木糖0.5-2份、去离子水80份，混匀后再在105℃下保温50分钟，然后降温至30℃；
在步骤⑴制取的冷却液加入：冠突散囊菌种子5-10份28-30℃通气培养，每分钟液气比通气量为1:1，开搅拌150r/min培养72-96小时，待菌体含量达到40g/L，胞外多糖含量达到1 g/L，即向发酵罐转入桃红荚硫菌发酵液20-40份，继续培养48-72小时，检测其残还原糖小于1g/L；即可结束第二阶段发酵；
在步骤⑵培养的发酵液中加入解淀粉芽孢杆菌发酵液20-40份，检测其总活菌不低于3×109CFU/ml，芽孢含量不低于2×109CFU/ml，即可灌装，包装成品。
其中，所述的桃红荚硫菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体紫硫光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的菌种
、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
、发酵培养：将种子培养液与桃红荚硫菌发酵培养基以1：5的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养7-10天，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为50转/分钟，待检测其OD650≥4，活菌数≥10亿cfu/ml，多糖含量达到5 g/L，即为桃红荚硫菌发酵液；
其中，所述的半固体紫硫光合细菌培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.08g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，苹果酸钠1g/L，九水硫化钠0.2g/L，琼脂10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.05g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，甘油0.5g/L，九水硫化钠0.2g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的桃红荚硫菌发酵培养基为：大豆分离蛋白20 g/L，氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.08g/L，氯化镁0.2g/L，果糖20g/L，醋酸钠2 g/L，蜂蜜10g/L，硫代硫酸钠1g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，桃红荚硫菌由本发明人保藏在中国普通微生物菌种管理中心，编号为CGMCC10344。保藏日期为2015年1月12日。
其中，所述的解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：一、取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，33℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中33℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2LLB培养基的5L大三角瓶中， 33℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；
二、将步骤一培养的解淀粉芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，33℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于100亿/毫升，即可结束发酵；
其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述发酵培养基：大豆分离蛋白40 g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉20 g/L， 蛋白胨8 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，所述的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ）YHSH-58由本专利权人已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．13664保藏日期为2017年2月16日。
其中，所述的冠突散囊菌种子液按以下方法制备：取出冠突散囊菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，28℃培养5天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中28℃培养5-7天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为1亿cfu/ml，即为冠突散囊菌种子液；
其中，冠突散囊菌菌种是购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC3.7928。
本发明中含有的桃红荚硫菌，本发明人对其有比较说细的研究与试验，开始主要着重研究其超强的硫化氢的降解能力与氨氮去除能力，因此主要应用着重于做为微生物菌肥，污水处理剂等领域，但在发酵培养基优化过程中发现其有时会比较粘稠，经过分析发现其粘稠物质主要为多糖物质，经过分析发现其主要多糖物质为半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和葡萄糖醛酸构成；而且经过不同的培养基试验其最高多糖物质可达到10g/L以上（后面本发明人团队将会有研究报告或专利进行进一步公开），但如果多糖物质较高时，其残余还原糖含量也比较高，不适合后期产品的保存，最后我们经过试验确定其本发明公开的培养基与培养工艺比较合适，不仅仅残还原糖较少，多糖物质也是可起到明显的效果，有文献报道多糖能增加少精症模型小鼠生精细胞数及精子密度，其机制可能与上调凋亡抑制蛋白bcl-w表达、下调bax表达有关，因此本发明人团队也进行了相关试验。
本发明中含有的解淀粉芽孢杆菌，其是一种产芽孢、兼性需氧的革兰氏阳性菌，具有抗逆性强、抑菌谱广、代谢产物丰富等特点，作为益生菌，通过抑制病原菌粘附、生物夺氧、拮抗病原菌、分泌多种消化酶等，营造健康肠道环境，促进营养物质吸收利用，提高畜禽健康水平。 本发明的解淀粉芽孢杆菌YHSH-58已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．13664保藏日期为2017年2月16日；其是我们在湖南省隆回县滩头镇野外的野生野猪的肠道内容物中分离得到的，能产生多种胞外活性物质，包括脂肽类、肽类、蛋白类等。这些代谢产物能够抑制病原细菌、病毒等。本解淀粉芽孢杆菌可产生抑菌蛋白TasA，与urfactin类抗菌脂肽，能够改变细胞膜通透性，破坏细胞膜结构，对多重耐药性大肠杆菌，铜绿假单胞菌，粪肠球菌，阴沟肠杆菌，绿脓杆菌，变形杆菌，金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。
本发明中含有的冠突散囊菌(Eurotium cristatum,EC)是黑茶生产过程中产生金花的优势菌，是形成黑茶独特品质的主要因素。本发明利用黑化茶中分离纯化出来的冠突散囊菌进行深层液体发酵，在不同培养基发酵产生胞外多糖，尽管其多糖含量较低，但较桃红荚硫菌所产生的多糖物质有明显的差异，其主要是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等单糖组成，而且本发明中的冠突散囊菌在液体发酵条件下紧密交织在一起呈菌丝球，并不断增大，发酵后期出现大部分衰老自溶，而其本身所含有大量的氨基酸与未知营养因子随即释放出来，对人体有明显的有益效果。
本发明的有益效果：
1、本发明的复合微生物制剂能增加少精症模型小鼠生精细胞数及精子密度，调节提高小鼠血清性激素水平；其机制可能与上调凋亡抑制蛋白bcl-w表达、下调bax表达有关。
2. 本发明的复合微生物制剂含有大量的微生物多糖物质及活性益生菌，具有疏肝调气、补肾通精，调节肠道等作用，可以明显改善临床症状及体征，提高精子参数和内分泌水平，改善不育兼症，能够缩短病程，提高疗效。
3、本发明的复合微生物制剂治疗少弱精子不育症效果显著，临床应用未发现任何毒副作用，具有高效、安全、价廉、简便的优点。目前未见相同的公开研究报道，说明了该法是治疗少弱精子不育症的一种行之有效的新方法，值得推广应用。
4、本发明的复合微生物菌剂以活菌进入肠道后，对葡萄球菌、大肠杆菌等致病菌有拮抗作用，而对双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、消化链球菌有促进生长作用，从而可调整菌群失调。本发明的复合微生物菌剂可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。此外通过夺氧生物效应使肠道缺氧，有利于大量厌氧菌生长。
具体实施方式
实施例1解淀粉芽孢杆菌的分离与鉴定
2014年12月，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株是在湖南省隆回县滩头镇野外的野生野猪的肠道内容物中分离得到的。具体方法是: 取野生野猪的肠道内容物加入盛有10mL灭菌水的三角瓶中，震荡培养30min (200r/min)，然后取悬浮液1mL置于9mL无菌水中，制成10-2稀释悬浮液，依次类推，制成10-5 ，10-6稀释悬液;在其中各吸取100u L，加到营养肉汤培养基平板上，用涂布棒涂布均匀，每个处理重复3次。将上述培养皿，置于37℃恒温培养箱中培养1-2d。挑选单菌落转接到营养肉汤平板培养，长出菌落后，用接种环进行划线分离纯化，纯化菌株于4℃保存，编号为YHSH-58。
分离、纯化获得的菌株在营养肉汤培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为园形，四周光滑，乳白色；细胞形状为杆状，细胞直径大于lum；形成芽孢，不形成伴孢晶体;需氧生
长;接触酶、氧化酶反应为阳性;精氨酸双水解酶、赖氨酸脱梭酶、鸟氨酸脱梭酶、脉酶、色
氨酸脱梭酶反应为阴性；VP试验和硝酸盐还原为阳性;能利用葡萄糖，木糖，L-阿拉伯糖，
甘露糖，乳糖，蔗糖，山梨糖，苦杏仁昔;不能利用蜜二糖，鼠李糖，肌醇等。最适PH为6-8.5，最适生长温度为25-38℃，通过16s rDNA鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
实施例2 解淀粉芽孢杆菌YHSH-58抑菌活性初步测定
采用滤纸片扩散法测定解淀粉芽孢杆菌发酵液的抑菌活性。采用以涂布法无菌操作接种，每种菌接 5 个培养皿，每皿接种量 0.2 mL，用刮铲抹匀，取适量浸膏水浴加热（温度不超过 45℃）溶解，然后取灭菌滤纸圆片(真径9毫米)分别浸入各样品数分钟取出，稍干后放入接有菌种的培养皿，每皿 3 片，各纸片间距离相等，呈等边三角形放置，每个处理做 4个重复。同时以滤纸片浸入无菌水作对照，放置于 28℃下（细菌培养 24h，真菌培养 72h），用十字交叉法测量抑菌圈直径，取其平均值作为实验结果。以蒸馏水作对照。
最低抑菌浓度（MIC）的测定
采用二倍稀释法测定 MIC，即将各样品配成每 mL 含 10mg 芽孢杆菌发酵液的药液，再按倍比稀释法依次将药液稀释成 10～0.002mg·mL-1的稀释液。取组织培养板（96 孔），每孔加入 190μL及10μL菌悬液，同时做稀释及无菌水对照。培养板培养条件同上，无菌生长的那一孔药液即为最低抑菌浓度。试验结果见表1
表1解淀粉芽孢杆菌YHSH-58抑菌活性结果
大肠杆菌 铜绿假单胞菌 粪肠球菌 阴沟肠杆菌 绿脓杆菌 变形杆菌 金黄色葡萄球菌
抑菌直径(mm) 21.6 19.2 18.9 20.1 22.4 21.0 24.2
MIC 0.005 0.01 0.02 0.02 0.01 0.005 0.001
从表1中可以看出本解淀粉芽孢杆菌可产生抑菌蛋白，类抗菌脂肽，能够改变细胞膜通透性，破坏细胞膜结构，对多重耐药性大肠杆菌，铜绿假单胞菌，粪肠球菌，阴沟肠杆菌，绿脓杆菌，变形杆菌，金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。
实施例3 复合微生物制剂的制备
一种防治少精症的复合微生物制剂，制备该微生物制剂的原料按重量份为：桃红荚硫菌发酵液35份、冠突散囊菌种子8份、解淀粉芽孢杆菌发酵液40份、红糖5份、大豆分离蛋白粉3份、蜂蜜2份、氯化钠0.2份，低聚木糖1份、去离子水80份。
其中，所述的防治少精症的复合微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
在发酵罐中加入、红糖5份、大豆分离蛋白粉3份、蜂蜜2份、氯化钠0.2份，低聚木糖1份、去离子水80份，混匀后再在105℃下保温50分钟，然后降温至30℃；
在步骤⑴制取的冷却液加入：冠突散囊菌种子8份28-30℃通气培养，每分钟液气比通气量为1:1，开搅拌150r/min培养84小时，检测菌体含量为45g/L，胞外多糖含量为1.2 g/L，即向发酵罐转入桃红荚硫菌发酵液35份，继续培养60小时，检测其残还原糖为0.8g/L；结束第二阶段发酵；
在步骤⑵培养的发酵液中加入解淀粉芽孢杆菌发酵液40份，检测其总活菌为5.2×109CFU/ml，芽孢含量为3.8×109CFU/ml，即可灌装，包装成品。
其中，桃红荚硫菌发酵液制制备方法，包括如下步骤：
、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体紫硫光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的菌种
、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
、发酵培养：将种子培养液与桃红荚硫菌发酵培养基以1：5的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养7-10天，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为50转/分钟，待检测其OD650≥4，活菌数≥10亿cfu/ml，多糖含量达到5 g/L，即为桃红荚硫菌发酵液；
其中，所述的半固体紫硫光合细菌培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.08g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，苹果酸钠1g/L，九水硫化钠0.2g/L，琼脂10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.05g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，甘油0.5g/L，九水硫化钠0.2g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的桃红荚硫菌发酵培养基为：大豆分离蛋白20 g/L，氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.08g/L，氯化镁0.2g/L，果糖20g/L，醋酸钠2 g/L，蜂蜜10g/L，硫代硫酸钠1g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，桃红荚硫菌由本发明人保藏在中国普通微生物菌种管理中心，编号为CGMCC10344。保藏日期为2015年1月12日。
其中，解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：一、取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，33℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中33℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2L LB培养基的5L大三角瓶中， 33℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；
二、将步骤一培养的解淀粉芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，33℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于100亿/毫升，即可结束发酵；
其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述发酵培养基：大豆分离蛋白40 g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉20 g/L， 蛋白胨8 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，所述的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌YHSH-58，由本专利权人已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．13664保藏日期为2017年2月16日。
其中，所述的冠突散囊菌种子液按以下方法制备：取出冠突散囊菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，28℃培养5天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中28℃培养5-7天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为1亿cfu/ml，即为冠突散囊菌种子液；
其中，冠突散囊菌菌种是购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC3.7928。
实施例4 复合微生物制剂在治疗小鼠不育症试验结果
1实验分组及给药方法
将40只雄性小鼠按照体重有小到大编号，编号从00至40，再用随机数字表法随机分为4组：空白组、模型组、阳性对照组、试验组。空白组给予腹腔注射生理盐水2ml/d，其他各组采用腹腔注射0. 1%环磷酰胺2mg/d，连续注射5d制作少精症模型，第6天起空白组和模型组给予lml/d生理盐水灌胃，阳性对照组按体重给予0.2%，2mg/ml的枸椽酸氯米芬水溶液150μg.g-1.d-1灌胃治疗，试验组每天给予实施例3生产的复合微生物制剂0.15m1/20g灌胃治疗灌胃治疗，连续给药35d。
2试验结果：
各组血清T， LH， FSH水平的比较
结果显示模型组血清FSH， LH水平较其他组显著升高(P<0. 01) ， T水平较其他组显著降低(P<0. 01)；空白组、阳性对照组及试验组之间血清FSH， LH， T水平差异无统计学意义(P >0. 05)，见表2。表明本发明的复合微生物制剂可以调节提高小鼠血清性激素水平。
表2各组血清T， LH， FSH水平的比较
各组精子密度变化结果
模型组精子密度显著低于空白组，表明环磷酰胺对小鼠的生殖功能有较明显影响，而试验组较模型组对比，精子密度有显著上升(P<0. 0l)，与阳性对照组比较，各治疗组精子密度有明显上升(P<0.01)，与空白组比较差异无统计学意义(P>0. 05)，见表3。显示试验组可较好治疗少精症，增加小鼠精子数量，且治疗效果优于枸椽酸氯米芬。并且安全可靠的
表3各组精子密度变化结果
实施例5复合微生物制剂在治疗不育症试验结果
1方法：150例少弱精子不育症患者，随机分为2组，治疗组100例服用复合微生物制剂50ml/次，一日三次，对照组50例服用五子衍宗丸，每次9克，一是三次，连续服用三个月。服药期间不服其它药物，忌食或少食辛、辣、酒等刺激食物和油腻食物。治疗1个疗程后进行相关检查及资料统计。观察两组的临床疗效，治疗3个月后的升精作用及对性激素水平的影响。
2、一般资料
2.1分组：本组观察对象均为男科门诊就诊患者，按上述标准共收治不育患者150例，采用数字表方法分为2组：微生物菌剂治疗组100例、五子衍宗丸对照组50例。
2.2年龄和病程：治疗组100例中年龄最大40岁、最小22岁，22--29岁48例、30-35岁38例、大于35岁14例，平均29士2.1岁；病程最长10年，最短2年，平均5士1.4年；对照组50例中年龄最大40岁、最小23岁，23--29岁27例、30-35岁18例、大于35岁5例，平均28 ± 1.6年；病程最长9年，最短2年，平均4±1.6年。
2.3兼症：兼有前列腺炎61例，精液不液化53例，抗精子抗体阳性32例，轻度精索静脉曲张19例。
2.4病情分级：治疗组100例中精子密度>20 x 106/m1 12例，轻度少精子症39例、中度35例、重度14例；精子活动力正常10例，轻度弱精子症38例、中度39例、重度13例；成活率为41-60%的44例，成活率为21-40%的46例，成活率<20%的10例；少精症13例，弱精症14例，少精症+弱精症73例。对照组50例中精子密度>20×106/m1 10例，轻度少精子症20例、中度17例、重度3例；精子活动力正常7例，轻度弱精子症23例、中度16例，重度4例；成活率为41-60%22例、21-40% 15例、<20%3例；少精症7例，弱精症9例，少精症+弱精症34例。
3疗效标准
根据WHO《不育夫妇标准检查与诊断手册))的疗效标准进行评定：
临床治愈：女方怀孕；
显效：少精症治疗后精子密度>20×106/ml，弱精症精子活动力a级十b级>50%或a级>25%，成活率1小时>60%；
有效：少精症治疗后精子密度的提升>30%，弱精症治疗后精子活力a+b级或a级的提升>30%，成活率1小时的提升>30%0
无效：治疗后精子密度、成活率及活力的提升<30%，或治疗后无变化。
4治疗结果
治疗前后肝肾功能的检查未发现异常。其临床总疗效见表4，治疗组、对照组的临床治愈率分别为45%，11%，总有效率分别为99 %，66% ( P<0.01 )，两组疗效比较有显著性差异(P<0.05 )。精子参数比较见表5，治疗组、对照组精子密度、精子成活率和精子活动率平改善比较，差异有非常显著性(p<0.01 )。两组前列腺炎、精液不液化、抗精子抗体阳性和精索静脉曲张等兼症改善，差异有非常显著性(p<0.01 )。治疗组与对照组后来又持续再服用了一个疗程，其临床治愈率可达到87%，35%；差异显著。
表4两组治疗后疗效比较(n，%)
组别 例数 临床治愈 显效 有效 无效 总有效率（%）
治疗组 100 45 48 6 1 99
对照组 50 11 12 10 17 66
表5精子参数比较
结论：1复合微生物制剂能增加少精症模型小鼠生精细胞数及精子密度，其机制可能与上调凋亡抑制蛋白bcl-w表达、下调bax表达有关。
2.复合微生物制剂含有大量的微生物多糖物质及活性益生菌，具有疏肝调气、补肾通精，调节肠道等作用，可以明显改善临床症状及体征，提高精子参数和内分泌水平，改善不育兼症，能够缩短病程，提高疗效。
3、复合微生物制剂方治疗少弱精子不育症效果显著，临床应用未发现任何毒副作用，具有高效、安全、价廉、简便的优点。目前未见相同的公开研究报道，说明了该法是治疗少弱精子不育症的一种行之有效的新方法，值得推广应用。

Claims (5)

1.一种防治少精症的复合微生物制剂，其特征在于,制备该微生物制剂的原料按重量份为：桃红荚硫菌发酵液20-40份、冠突散囊菌种子5-10份、解淀粉芽孢杆菌发酵液20-40份、红糖3-6份、大豆分离蛋白粉2-4份、蜂蜜1-2份、氯化钠0.2-0.4份，低聚木糖0.5-2份、去离子水80份。
2.根据权利要求1所述的防治少精症的复合微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
在发酵罐中加入红糖3-6份、大豆分离蛋白粉2-4份、蜂蜜1-2份、氯化钠0.2-0.4份，低聚木糖0.5-2份、去离子水80份，混匀后再在105℃下保温50分钟，然后降温至30℃；
在步骤⑴制取的冷却液加入：冠突散囊菌种子5-10份28-30℃通气培养，每分钟液气比通气量为1:1，开搅拌150r/min培养72-96小时，待菌体含量达到40g/L，胞外多糖含量达到1g/L，即向发酵罐转入桃红荚硫菌发酵液20-40份，继续培养48-72小时，检测其残还原糖小于1g/L；即可结束第二阶段发酵；
在步骤⑵培养的发酵液中加入解淀粉芽孢杆菌发酵液20-40份，检测其总活菌不低于3×109CFU/ml，芽孢含量不低于2×109CFU/ml，即可灌装，包装成品。
3.根据权利要求1所述的一种防治少精症的复合微生物制剂，其特征在于，桃红荚硫菌发酵液制制备方法，包括如下步骤：
、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体紫硫光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的菌种
、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
、发酵培养：将种子培养液与桃红荚硫菌发酵培养基以1：5的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养7-10天，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为50转/分钟，待检测其OD650≥4，活菌数≥10亿cfu/ml，多糖含量达到5 g/L，即为桃红荚硫菌发酵液；
其中，所述的半固体紫硫光合细菌培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.08g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，苹果酸钠1g/L，九水硫化钠0.2g/L，琼脂10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.05g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，甘油0.5g/L，九水硫化钠0.2g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的桃红荚硫菌发酵培养基为：大豆分离蛋白20 g/L，氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.08g/L，氯化镁0.2g/L，果糖20g/L，醋酸钠2 g/L，蜂蜜10g/L，硫代硫酸钠1g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，桃红荚硫菌由本发明人保藏在中国普通微生物菌种管理中心，编号为CGMCC10344，保藏日期为2015年1月12日。
4.根据权利要求1所述的一种防治少精症的复合微生物制剂，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：一、取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，33℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中33℃震荡培养24小时，种子采用5%的接种量，接种至装液量为2L LB培养基的5L大三角瓶中， 33℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为解淀粉芽孢杆菌液体菌种；
二、将步骤一培养的解淀粉芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，33℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于100亿/毫升，即可结束发酵；
其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述发酵培养基：大豆分离蛋白40 g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉20 g/L， 蛋白胨8 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，所述的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌YHSH-58，由本专利权人已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．13664保藏日期为2017年2月16日。
5.根据权利要求1所述的一种防治少精症的复合微生物制剂，其特征在于，所述的冠突散囊菌种子液按以下方法制备：取出冠突散囊菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，28℃培养5天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中28℃培养5-7天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为1亿cfu/ml，即为冠突散囊菌种子液；
其中，冠突散囊菌菌种是购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC3.7928。
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