CN108030773A - 一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法的制备方法及应用，可有效解决现有癌症的治疗用药问题，解决的技术方案是：中空介孔二氧化钛纳米粒子物理负载自噬抑制剂，得到负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物，然后在其表面通过挤压包裹癌细胞膜，构成癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物；本发明操作方便，方法稳定可靠，制得的药物复合物具有生物相容性好、靶向性强、毒副作用小等优点，在肿瘤治疗方面可发挥癌细胞膜靶向、TiO2的声疗、自噬抑制剂增敏声疗作用，同时具备声动力治疗，药物治疗，癌细胞膜靶向性等多重功效，针对肿瘤进行双重打击的交互综合治疗。

Description

一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿 生药物复合物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法及应用。
背景技术
手术与放射治疗、化学药物治疗是肿瘤治疗的三大常用手段。然而，手术仅能切除肉眼可见的瘤体，对不可见的亚临床病灶却难以清除；传统化疗往往存在靶向性差和剂量限制毒性的问题；而声动力疗法(SDT)利用超声波对生物组织有较强的穿透能力，并激活一些声敏剂产生活性氧发挥抗肿瘤效应，对正常的细胞没有损坏，故是一种更加安全、高效的肿瘤治疗手段。二氧化钛（TiO2）纳米粒因其尺寸较小，无明显毒副作用，在纳米给药体系中已得到广泛应用。当TiO2纳米粒被超声作用后，产生的活性氧等组分能对癌细胞内外的有机物质产生强氧化作用，从而有效地杀伤癌细胞。目前TiO2已经作为声敏剂被广泛用于声动力学治疗癌症。在众多形态的纳米粒中，中空介孔二氧化钛（HMTNPs）因其较大的比表面积和中空结构使得其成为一种优良的药物载体，引起了更为广泛的注意。
自噬，即“自食”，是一种细胞自我消化的过程。肿瘤细胞较正常细胞和组织更依赖于自噬。在肿瘤发生发展的过程中，自噬的作用具有两面性。在肿瘤发生过程中自噬主要起抑制肿瘤作用（故肿瘤早期使用自噬促进剂可增强抗肿瘤效果），在肿瘤发展过程中则起促进肿瘤生长存活的作用，故肿瘤晚期使用自噬抑制剂可增强抗肿瘤效果。声疗诱导自噬。低剂量SDT的作用下，自噬作为一种保护机制可以清除内质网和线粒体等受损细胞器， 减弱SDT。故我们采用自噬抑制剂自噬抑制剂增敏声疗。
肿瘤治疗的最终目的是开发特异靶向又可逃避免疫系统的纳米粒。目前大多靶向都是受体-配体介导的主动靶向，主动靶向的受体-配体作用受到受体密度和识别选择性的限制，且合成载体不具备人体内源性物质的复杂性，有时会被机体视为外源性毒物，排出体外而无法发挥作用。近年来，基于细胞膜的仿生的肿瘤自我靶向策略的出现引起了研究者们的极大关注，其中细胞膜修饰纳米粒是一种top-down设计，完整的保留了细胞膜表面的复杂组成成分，不需要对其进行修饰，在体内伪装成源细胞与基底物质发生相互作用。一方面，依靠膜表面的粘附蛋白的粘附作用，癌细胞膜（CCM）包裹的纳米粒对本源肿瘤细胞进行自我识别，具有较高的特异靶向归巢能力，可实施个体化治疗或精准诊疗。另一方面，癌细抗原胞膜表面的CD47分子可以与巨噬细胞表面的SIRPs蛋白相互作用传递抗炎信号，隐身逃逸免疫系统，可以提高治疗的安全性。
将自噬抑制剂负载到HMTNPs，外包癌细胞膜。在体循环中免疫逃逸，避免体内特异性肿瘤靶向到癌细胞后，施加US产生ROS导致细胞凋亡。且US敏感释放自噬抑制剂抑制了线粒体自噬，并通过增强血流灌注供氧增敏声疗。该载体及其药物复合物的合成方法简单，并将二氧化钛的声疗、癌细胞膜靶向等有机的整合于一体，加之可以物理负载具有抑制自噬作用的化疗药物增敏声疗，与传统方法相比具有靶向、高效、可控的优势，并且其声动力治疗与化疗技术的结合更体现癌症综合治疗的理念。因此，研究一种靶向的合并声动力治疗和化疗于同一纳米平台的治疗制剂具有重要的意义和价值。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法及应用，可有效解决现有癌症的治疗用药问题。
本发明解决的技术方案是：一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法，中空介孔二氧化钛纳米粒子（HMTNPs）物理负载自噬抑制剂，得到负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物，然后在其表面通过挤压包裹癌细胞膜（CCM），构成癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物；具体包括以下步骤：
（1）制备中空介孔二氧化硅纳米粒：将0.7-0.9ml的正硅酸四乙酯加到0.3-0.6ml水、19-21ml乙醇及0.7-0.9ml氨水中，搅拌10-14h，12000-15000rpm离心10-20min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2-3次，沉淀物即中空介孔二氧化硅纳米粒；
（2）制备中空介孔SiO2@TiO2复合物：将步骤（1）制备的中空介孔二氧化硅纳米粒分散在5-15ml乙醇及0.1-0.3ml水中，然后加入0.1-0.5g 羟丙基纤维素，搅拌28-32min成混合溶液；将1-3ml叔丁醇钛溶于3-7ml乙醇中，滴加到混合溶液中，83-87℃回流90-110min，12000-15000rpm离心5-10min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2-3次，将沉淀物烘干，即得中空介孔SiO2@TiO2复合物；
（3）制备中空介孔TiO2：将步骤（2）制备的中空介孔SiO2@TiO2复合物380-420℃煅烧3-5h，再分散于10-40ml水中，加入浓度4mol/L的氢氧化钠溶液1-3ml，75-85℃下搅拌10-14h，12000-15000rpm离心5-10min得沉淀，沉淀加超纯水复溶，再离心，重复2-3次，即得中空介孔TiO2；
（4）制备负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物：将步骤（3）制备的中空介孔TiO210-20mg分散于10-20ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第一混合液；将20-40mg自噬抑制剂分散于10-20ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第二混合液；再将上述两混合液混合，室温搅拌22-26h，12000-15000rpm离心5-10min，即得负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物；所述的自噬抑制剂为氯喹（CQ），羟氯喹（HCQ），巴佛洛霉素A1和溶酶体蛋白酶抑制剂中的一种；
（5）制备癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物：将细胞用PH=7.4的PBS缓冲液重新悬浮，800-1200rpm离心5-10min，将沉淀分散在裂解缓冲液中重悬，3-5℃放置1-3h，匀浆器匀浆10-30下，6000-7000rpm离心4-6min，收集上清，沉淀用裂解缓冲液重悬；再匀浆10-30下，6000-7000rpm离心4-6min，收集上清，沉淀再重悬，再匀浆，再离心，重复6-10次；收集上清液13000-16000rpm离心20-40 min，沉淀加PH=7.4的PBS缓冲液重悬，与步骤（4）制备的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物用聚碳酸酯膜共挤压，即得癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物；
所述裂解缓冲液为按照浓度20mM Tris-HCl，10 mM KCl，2 mM MgCl2，1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的混合液。
所述方法制备的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的粒径为100-150nm。
所述方法制备的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物在制备抗肿瘤药物注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
所述方法制备的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物在制备基于癌细胞膜的仿生递药系统中的应用。
所述方法制备的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物在制备基于二氧化钛的声动力学治疗联合化疗药物中的应用。
本发明借助中空介孔二氧化钛的强大药物负载能力，物理负载自噬抑制剂得到中空介孔二氧化钛复合物，然后在其表面通过挤压包裹癌细胞膜，构成癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物。
本发明操作方便，方法稳定可靠，所制得的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物具有生物相容性好、靶向性强、毒副作用小等优点，在肿瘤治疗方面可发挥癌细胞膜靶向、TiO2的声疗、自噬抑制剂增敏声疗作用，同时具备声动力治疗，药物治疗，癌细胞膜靶向性等多重功效，针对肿瘤进行双重打击的交互综合治疗，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例实现。
实施例1
一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）制备中空介孔二氧化硅纳米粒：将0.7ml的正硅酸四乙酯加到0.3ml水、19ml乙醇及0.7ml氨水中，搅拌10h，12000rpm离心20min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2次，沉淀物即中空介孔二氧化硅纳米粒；
（2）制备中空介孔SiO2@TiO2复合物：将步骤（1）制备的中空介孔二氧化硅纳米粒分散在5ml乙醇及0.1ml水中，然后加入0.1g羟丙基纤维素，搅拌28min成混合溶液；将1ml叔丁醇钛溶于3ml乙醇中，滴加到混合溶液中，83℃回流110min，12000rpm离心10min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2次，将沉淀物烘干，即得中空介孔SiO2@TiO2复合物；
（3）制备中空介孔TiO2：将步骤（2）制备的中空介孔SiO2@TiO2复合物380℃煅烧5h，再分散于10ml水中，加入浓度4mol/L的氢氧化钠溶液1ml，75℃下搅拌14h，12000rpm离心10min得沉淀，沉淀加超纯水复溶，再离心，重复2次，即得中空介孔TiO2；
（4）制备负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物：将步骤（3）制备的中空介孔TiO210mg分散于10ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第一混合液；将20mg自噬抑制剂氯喹分散于10ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第二混合液；再将上述两混合液混合，室温搅拌22h，12000rpm离心10min，即得负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物；
（5）制备癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物：将细胞用PH=7.4的PBS缓冲液重新悬浮，800rpm离心10min，将沉淀分散在裂解缓冲液中重悬，3℃放置3h，匀浆器匀浆10下，6000rpm离心6min，收集上清，沉淀用裂解缓冲液重悬；再匀浆10下，6000rpm离心6min，收集上清，沉淀再重悬，再匀浆，再离心，重复6次；收集上清液13000rpm离心40 min，沉淀加PH=7.4的PBS缓冲液重悬，与步骤（4）制备的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物用聚碳酸酯膜共挤压，即得癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物。所述裂解缓冲液为按照浓度20mM Tris-HCl，10 mMKCl，2 mM MgCl2，1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的混合液。
实施例2
一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）制备中空介孔二氧化硅纳米粒：将0.8ml的正硅酸四乙酯加到0.45ml水、20ml乙醇及0.7-0.9ml氨水中，搅拌10-14h，12000-15000rpm离心10-20min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2-3次，沉淀物即中空介孔二氧化硅纳米粒；
（2）制备中空介孔SiO2@TiO2复合物：将步骤（1）制备的中空介孔二氧化硅纳米粒分散在10ml乙醇及0.2ml水中，然后加入0.35g 羟丙基纤维素，搅拌30min成混合溶液；将2ml叔丁醇钛溶于5ml乙醇中，滴加到混合溶液中，85℃回流100min，13000rpm离心8min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复3次，将沉淀物烘干，即得中空介孔SiO2@TiO2复合物；
（3）制备中空介孔TiO2：将步骤（2）制备的中空介孔SiO2@TiO2复合物400℃煅烧4h，再分散于25ml水中，加入浓度4mol/L的氢氧化钠溶液2ml，80℃下搅拌12h，13000rpm离心8min得沉淀，沉淀加超纯水复溶，再离心，重复3次，即得中空介孔TiO2；
（4）制备负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物：将步骤（3）制备的中空介孔TiO2 15mg分散于15ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第一混合液；将30mg羟氯喹分散于15ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第二混合液；再将上述两混合液混合，室温搅拌24h，13000rpm离心8min，即得负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物；
（5）制备癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物：将细胞用PH=7.4的PBS缓冲液重新悬浮，1000rpm离心8min，将沉淀分散在裂解缓冲液中重悬，4℃放置2h，匀浆器匀浆20下，6500rpm离心5min，收集上清，沉淀用裂解缓冲液重悬；再匀浆20下，6500rpm离心5min，收集上清，沉淀再重悬，再匀浆，再离心，重复8次；收集上清液14000rpm离心30min，沉淀加PH=7.4的PBS缓冲液重悬，与步骤（4）制备的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物用聚碳酸酯膜共挤压，即得癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物。
所述裂解缓冲液为按照浓度20mM Tris-HCl，10 mM KCl，2 mM MgCl2，1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的混合液。
实施例3
一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）制备中空介孔二氧化硅纳米粒：将0.8ml的正硅酸四乙酯加到0.4ml水、20ml乙醇及0.8ml氨水中，搅拌13h，14000rpm离心17min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2次，沉淀物即中空介孔二氧化硅纳米粒；
（2）制备中空介孔SiO2@TiO2复合物：将步骤（1）制备的中空介孔二氧化硅纳米粒分散在12ml乙醇及0.2ml水中，然后加入0.4g 羟丙基纤维素，搅拌29min成混合溶液；将2ml叔丁醇钛溶于6ml乙醇中，滴加到混合溶液中，86℃回流100min，14000rpm离心7min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2次，将沉淀物烘干，即得中空介孔SiO2@TiO2复合物；
（3）制备中空介孔TiO2：将步骤（2）制备的中空介孔SiO2@TiO2复合物410℃煅烧4h，再分散于25ml水中，加入浓度4mol/L的氢氧化钠溶液2ml，82℃下搅拌13h，14000rpm离心7min得沉淀，沉淀加超纯水复溶，再离心，重复2次，即得中空介孔TiO2；
（4）制备负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物：将步骤（3）制备的中空介孔TiO2 16mg分散于16ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第一混合液；将32mg巴佛洛霉素A1分散于18ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第二混合液；再将上述两混合液混合，室温搅拌24h，14000rpm离心7min，即得负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物；
（5）制备癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物：将细胞用PH=7.4的PBS缓冲液重新悬浮，1100rpm离心8min，将沉淀分散在裂解缓冲液中重悬，4℃放置2h，匀浆器匀浆25下，6300rpm离心5min，收集上清，沉淀用裂解缓冲液重悬；再匀浆25下，6300rpm离心5min，收集上清，沉淀再重悬，再匀浆，再离心，重复7次；收集上清液15000rpm离心28min，沉淀加PH=7.4的PBS缓冲液重悬，与步骤（4）制备的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物用聚碳酸酯膜共挤压，即得癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物。
所述裂解缓冲液为按照浓度20mM Tris-HCl，10 mM KCl，2 mM MgCl2，1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的混合液。
实施例4
一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）制备中空介孔二氧化硅纳米粒：将0.9ml的正硅酸四乙酯加到0.6ml水、21ml乙醇及0.9ml氨水中，搅拌14h，15000rpm离心10min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复3次，沉淀物即中空介孔二氧化硅纳米粒；
（2）制备中空介孔SiO2@TiO2复合物：将步骤（1）制备的中空介孔二氧化硅纳米粒分散在15ml乙醇及0.3ml水中，然后加入0.5g 羟丙基纤维素，搅拌32min成混合溶液；将3ml叔丁醇钛溶于7ml乙醇中，滴加到混合溶液中， 87℃回流90min，15000rpm离心5min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复3次，将沉淀物烘干，即得中空介孔SiO2@TiO2复合物；
（3）制备中空介孔TiO2：将步骤（2）制备的中空介孔SiO2@TiO2复合物420℃煅烧3h，再分散于40ml水中，加入浓度4mol/L的氢氧化钠溶液3ml， 85℃下搅拌10h，15000rpm离心5min得沉淀，沉淀加超纯水复溶，再离心，重复3次，即得中空介孔TiO2；
（4）制备负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物：将步骤（3）制备的中空介孔TiO2 20mg分散于20ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第一混合液；将40mg溶酶体蛋白酶抑制剂分散于20ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第二混合液；再将上述两混合液混合，室温搅拌26h，15000rpm离心5min，即得负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物；
（5）制备癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物：将细胞用PH=7.4的PBS缓冲液重新悬浮，1200rpm离心5min，将沉淀分散在裂解缓冲液中重悬，5℃放置3h，匀浆器匀浆30下， 7000rpm离心4min，收集上清，沉淀用裂解缓冲液重悬；再匀浆30下，7000rpm离心4min，收集上清，沉淀再重悬，再匀浆，再离心，重复10次；收集上清液16000rpm离心20min，沉淀加PH=7.4的PBS缓冲液重悬，与步骤（4）制备的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物用聚碳酸酯膜共挤压，即得癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物。
所述裂解缓冲液为按照浓度20mM Tris-HCl，10 mM KCl，2 mM MgCl2，1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的混合液。
经科学试验，本发明所制得的药物复合物的合成方法简单，并将二氧化钛的声疗、癌细胞膜靶向等有机的整合于一体，加之可以物理负载具有抑制自噬作用的化疗药物增敏声疗，与传统化法相比具有靶向、高效、可控的优势，并且其声动力治疗与化疗技术的结合更体现癌症综合治疗的理念。因此，研究一种靶向的合并声动力治疗和化疗于同一纳米平台的治疗制剂具有重要的意义和价值。本发明经多次反复试验，均取得了一致的结果，有关试验资料如下：
一、癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的表征
1、癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物中自噬抑制剂含量的测定
采用紫外分光光度法，于342 nm波长处测定自噬抑制剂的含量。以公式（1）计算样品的载药量。载药量达到42.66%左右。
2、癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的粒径和电位的测定
取适量负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物分散于水中，用Nano-ZS90 型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为131nm和-21±1.1 mV。
二、癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物在体外产生活性氧实验
选择对数生长期的MCF-7人乳腺癌细胞，调整细胞数为3×105/ml接种于6孔培养板，每孔2ml，细胞贴壁生长24h后加药，依次为空白组、HMTNPs组、CCM-HMTNPs组、CCM-HMTNPs-自噬抑制剂组，并分设超声组（1.5w/cm2，40s，加药4h后超声）和非超声组，其中TiO2终浓度设为10μg/ml。培养24 h后，弃去旧培养液，每孔用新鲜的PBS缓冲液洗2~3遍，每孔加1ml 含DHE的活性氧探针培养基，37℃培养30min后，用新鲜的PBS缓冲液洗2~3遍，在显微镜下观察。结果发现除空白组外，所有超声组均检测到红色的DHE荧光信号，且CCM-HMTNPs-自噬抑制剂超声组最强，为61.4%。该结果与文献报道一致，CCM-HMTNPs-自噬抑制剂可在超声刺激下与产生大量的活性氧，进一步说明了自噬抑制剂与HMTNPs联合作用后能更有效的发挥其抗肿瘤作用。
三、自噬抑制剂抑制中空介孔二氧化钛介导的自噬
细胞分组依次为空白组、HMTNPs组、HMTNPs-US组，自噬抑制剂、HMTNPs-自噬抑制剂组、HMTNPs-自噬抑制剂-US组，药物作用后12 h进行超声(1.5w/cm2，40s)，之后作用4 h，胰酶消化后，收集消化液，1000rpm 4℃离心5min，收集细胞沉淀，加入9ml预冷的2.5%戊二醛固定液。在冰浴摇床中轻轻震摇10 min，之后将冰盒静置于4 ℃冰箱，放置4 h。再次1000rpm4℃离心5min，弃上清，每管加入1 ml预冷的2.5%戊二醛固定液，制片透镜观察。结果显示，与空白组相比，HMTNPs-US组和自噬抑制剂组都有一定的自噬泡累积，而制剂组HMTNPs-自噬抑制剂-US则造成大量的自噬泡累积，可以阻止癌细胞将受损的细胞器转化为能量，因此自噬抑制剂与声疗联用可以增加声疗的敏感性。
四、自噬抑制剂增敏中空介孔二氧化钛介导的声疗的细胞增殖抑制实验
采用SRB法，选择对数生长期的MCF-7人乳腺癌细胞，调整细胞数为5×104/ml接种于96孔培养板，细胞贴壁生长24h后加药，依次为空白组、自噬抑制剂组、HMTNPs组、CCM-HMTNPs-自噬抑制剂组，并分设超声组（1W/cm2，30s，加药4h后超声）和非超声组。24 h后，每孔加入50μl 4℃预冷的50%三氯乙酸（TCA）固定细胞，固定10min后移入4℃冰箱固定1h，取出弃去固定液，用去离子水洗5遍，甩干，室温自然干燥。室温晾干后，每孔加入SRB染液50μ1，室温避光放置15~30min染色，弃染液，用1%的冰醋酸洗5遍，室温干燥。之后，用150μl非缓冲Tris碱液（10mM，pH=10.5）溶解与细胞蛋白结合的染料，摇床微振荡（37℃，100rpm，10min）后，于酶标仪515 nm波长处测每个小孔的OD值，计算肿瘤细胞生长抑制率(% )= (1-实验组OD值/对照组OD值)×100%，计算得到自噬抑制剂组、HMTNPs组、HMTNPs-US组、CCM-HMTNPs-自噬抑制剂组、CCM-HMTNPs-自噬抑制剂-US组等各组的细胞生长抑制率分别为：3.2%，2.9%，25.8%，6.2%，53.4%。结果表明，载体HMTNPs及CCM-HMTNPs-自噬抑制剂在实验剂量下对细胞无明显毒性，但在超声下有较明显的声动力效应及抗肿瘤效应。该实验说明CCM-HMTNPs-自噬抑制剂组在超声刺激可极大的发挥抗肿瘤效应，则是声疗与自噬抑制剂增敏声疗协同治疗的结果。
实验表明，本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
（1）本发明提供的中空介孔二氧化钛具有优良生物相容性、稳定性，能够物理负载自噬抑制剂，提高其载药量；在超声的作用下，刺激声敏剂TiO2消耗氧气产生活性氧进行声动力学治疗，从而促进肿瘤细胞凋亡；
（2) 本发明提供的自噬抑制剂可以增敏声疗作用，TiO2的声疗与自噬抑制剂增敏声疗共同作用，针对肿瘤进行双重打击的交互综合治疗；
（3）本发明选择癌细胞膜包裹纳米粒，完整的保留了细胞膜表面的复杂组成成分，可以在药物转运过程中提供靶向作用：一方面，依靠膜表面的粘附蛋白的粘附作用，癌细胞膜（CCM）包裹的纳米粒对本源肿瘤细胞进行自我识别，具有较高的特异靶向归巢能力，可实施个体化治疗或精准诊疗；另一方面，癌细胞膜表面的CD47分子可以与巨噬细胞表面的SIRPs蛋白相互作用传递抗炎信号，隐身逃逸免疫系统，可以提高治疗的安全性。
本发明操作方便，方法稳定可靠，所制得的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物具有生物相容性好、靶向性强、毒副作用小等优点，在肿瘤治疗方面可发挥癌细胞膜靶向、TiO2的声疗、自噬抑制剂增敏声疗作用，同时具备声动力治疗，药物治疗，癌细胞膜靶向性等多重功效，针对肿瘤进行双重打击的交互综合治疗，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。

Claims (9)

1.一种癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法，其特征在于，中空介孔二氧化钛纳米粒子物理负载自噬抑制剂，得到负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物，然后在其表面通过挤压包裹癌细胞膜，构成癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物；具体包括以下步骤：
（1）制备中空介孔二氧化硅纳米粒：将0.7-0.9ml的正硅酸四乙酯加到0.3-0.6ml水、19-21ml乙醇及0.7-0.9ml氨水中，搅拌10-14h，12000-15000rpm离心10-20min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2-3次，沉淀物即中空介孔二氧化硅纳米粒；
（2）制备中空介孔SiO2@TiO2复合物：将步骤（1）制备的中空介孔二氧化硅纳米粒分散在5-15ml乙醇及0.1-0.3ml水中，然后加入0.1-0.5g 羟丙基纤维素，搅拌28-32min成混合溶液；将1-3ml叔丁醇钛溶于3-7ml乙醇中，滴加到混合溶液中，83-87℃回流90-110min，12000-15000rpm离心5-10min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2-3次，将沉淀物烘干，即得中空介孔SiO2@TiO2复合物；
（3）制备中空介孔TiO2：将步骤（2）制备的中空介孔SiO2@TiO2复合物380-420℃煅烧3-5h，再分散于10-40ml水中，加入浓度4mol/L的氢氧化钠溶液1-3ml，75-85℃下搅拌10-14h，12000-15000rpm离心5-10min得沉淀，沉淀加超纯水复溶，再离心，重复2-3次，即得中空介孔TiO2；
（4）制备负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物：将步骤（3）制备的中空介孔TiO210-20mg分散于10-20ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第一混合液；将20-40mg自噬抑制剂分散于10-20ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第二混合液；再将上述两混合液混合，室温搅拌22-26h，12000-15000rpm离心5-10min，即得负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物；所述的自噬抑制剂为氯喹，羟氯喹，巴佛洛霉素A1和溶酶体蛋白酶抑制剂中的一种；
（5）制备癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物：将细胞用PH=7.4的PBS缓冲液重新悬浮，800-1200rpm离心5-10min，将沉淀分散在裂解缓冲液中重悬，3-5℃放置1-3h，匀浆器匀浆10-30下，6000-7000rpm离心4-6min，收集上清，沉淀用裂解缓冲液重悬；再匀浆10-30下，6000-7000rpm离心4-6min，收集上清，沉淀再重悬，再匀浆，再离心，重复6-10次；收集上清液13000-16000rpm离心20-40 min，沉淀加PH=7.4的PBS缓冲液重悬，与步骤（4）制备的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物用聚碳酸酯膜共挤压，即得癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物；
所述裂解缓冲液为按照浓度20mM Tris-HCl，10 mM KCl，2 mM MgCl2，1mM苯甲基磺酰氟的混合液。
2.根据权利要求1所述的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）制备中空介孔二氧化硅纳米粒：将0.7ml的正硅酸四乙酯加到0.3ml水、19ml乙醇及0.7ml氨水中，搅拌10h，12000rpm离心20min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2次，沉淀物即中空介孔二氧化硅纳米粒；
（2）制备中空介孔SiO2@TiO2复合物：将步骤（1）制备的中空介孔二氧化硅纳米粒分散在5ml乙醇及0.1ml水中，然后加入0.1g羟丙基纤维素，搅拌28min成混合溶液；将1ml叔丁醇钛溶于3ml乙醇中，滴加到混合溶液中，83℃回流110min，12000rpm离心10min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2次，将沉淀物烘干，即得中空介孔SiO2@TiO2复合物；
（3）制备中空介孔TiO2：将步骤（2）制备的中空介孔SiO2@TiO2复合物380℃煅烧5h，再分散于10ml水中，加入浓度4mol/L的氢氧化钠溶液1ml，75℃下搅拌14h，12000rpm离心10min得沉淀，沉淀加超纯水复溶，再离心，重复2次，即得中空介孔TiO2；
（4）制备负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物：将步骤（3）制备的中空介孔TiO210mg分散于10ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第一混合液；将20mg自噬抑制剂氯喹分散于10ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第二混合液；再将上述两混合液混合，室温搅拌22h，12000rpm离心10min，即得负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物；
（5）制备癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物：将细胞用PH=7.4的PBS缓冲液重新悬浮，800rpm离心10min，将沉淀分散在裂解缓冲液中重悬，3℃放置3h，匀浆器匀浆10下，6000rpm离心6min，收集上清，沉淀用裂解缓冲液重悬；再匀浆10下，6000rpm离心6min，收集上清，沉淀再重悬，再匀浆，再离心，重复6次；收集上清液13000rpm离心40 min，沉淀加PH=7.4的PBS缓冲液重悬，与步骤（4）制备的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物用聚碳酸酯膜共挤压，即得癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物。
3.根据权利要求1所述的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）制备中空介孔二氧化硅纳米粒：将0.8ml的正硅酸四乙酯加到0.45ml水、20ml乙醇及0.7-0.9ml氨水中，搅拌10-14h，12000-15000rpm离心10-20min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2-3次，沉淀物即中空介孔二氧化硅纳米粒；
（2）制备中空介孔SiO2@TiO2复合物：将步骤（1）制备的中空介孔二氧化硅纳米粒分散在10ml乙醇及0.2ml水中，然后加入0.35g 羟丙基纤维素，搅拌30min成混合溶液；将2ml叔丁醇钛溶于5ml乙醇中，滴加到混合溶液中，85℃回流100min，13000rpm离心8min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复3次，将沉淀物烘干，即得中空介孔SiO2@TiO2复合物；
（3）制备中空介孔TiO2：将步骤（2）制备的中空介孔SiO2@TiO2复合物400℃煅烧4h，再分散于25ml水中，加入浓度4mol/L的氢氧化钠溶液2ml，80℃下搅拌12h，13000rpm离心8min得沉淀，沉淀加超纯水复溶，再离心，重复3次，即得中空介孔TiO2；
（4）制备负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物：将步骤（3）制备的中空介孔TiO2 15mg分散于15ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第一混合液；将30mg自噬抑制剂羟氯喹分散于15ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第二混合液；再将上述两混合液混合，室温搅拌24h，13000rpm离心8min，即得负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物；
（5）制备癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物：将细胞用PH=7.4的PBS缓冲液重新悬浮，1000rpm离心8min，将沉淀分散在裂解缓冲液中重悬，4℃放置2h，匀浆器匀浆20下，6500rpm离心5min，收集上清，沉淀用裂解缓冲液重悬；再匀浆20下，6500rpm离心5min，收集上清，沉淀再重悬，再匀浆，再离心，重复8次；收集上清液14000rpm离心30min，沉淀加PH=7.4的PBS缓冲液重悬，与步骤（4）制备的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物用聚碳酸酯膜共挤压，即得癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物。
4.根据权利要求1所述的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）制备中空介孔二氧化硅纳米粒：将0.8ml的正硅酸四乙酯加到0.4ml水、20ml乙醇及0.8ml氨水中，搅拌13h，14000rpm离心17min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2次，沉淀物即中空介孔二氧化硅纳米粒；
（2）制备中空介孔SiO2@TiO2复合物：将步骤（1）制备的中空介孔二氧化硅纳米粒分散在12ml乙醇及0.2ml水中，然后加入0.4g 羟丙基纤维素，搅拌29min成混合溶液；将2ml叔丁醇钛溶于6ml乙醇中，滴加到混合溶液中，86℃回流100min，14000rpm离心7min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复2次，将沉淀物烘干，即得中空介孔SiO2@TiO2复合物；
（3）制备中空介孔TiO2：将步骤（2）制备的中空介孔SiO2@TiO2复合物410℃煅烧4h，再分散于25ml水中，加入浓度4mol/L的氢氧化钠溶液2ml，82℃下搅拌13h，14000rpm离心7min得沉淀，沉淀加超纯水复溶，再离心，重复2次，即得中空介孔TiO2；
（4）制备负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物：将步骤（3）制备的中空介孔TiO2 16mg分散于16ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第一混合液；将32mg自噬抑制剂巴佛洛霉素A1分散于18ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第二混合液；再将上述两混合液混合，室温搅拌24h，14000rpm离心7min，即得负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物；
（5）制备癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物：将细胞用PH=7.4的PBS缓冲液重新悬浮，1100rpm离心8min，将沉淀分散在裂解缓冲液中重悬，4℃放置2h，匀浆器匀浆25下，6300rpm离心5min，收集上清，沉淀用裂解缓冲液重悬；再匀浆25下，6300rpm离心5min，收集上清，沉淀再重悬，再匀浆，再离心，重复7次；收集上清液15000rpm离心28min，沉淀加PH=7.4的PBS缓冲液重悬，与步骤（4）制备的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物用聚碳酸酯膜共挤压，即得癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物。
5.根据权利要求1所述的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）制备中空介孔二氧化硅纳米粒：将0.9ml的正硅酸四乙酯加到0.6ml水、21ml乙醇及0.9ml氨水中，搅拌14h，15000rpm离心10min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复3次，沉淀物即中空介孔二氧化硅纳米粒；
（2）制备中空介孔SiO2@TiO2复合物：将步骤（1）制备的中空介孔二氧化硅纳米粒分散在15ml乙醇及0.3ml水中，然后加入0.5g 羟丙基纤维素，搅拌32min成混合溶液；将3ml叔丁醇钛溶于7ml乙醇中，滴加到混合溶液中， 87℃回流90min，15000rpm离心5min得沉淀，沉淀加无水乙醇复溶，再离心，重复3次，将沉淀物烘干，即得中空介孔SiO2@TiO2复合物；
（3）制备中空介孔TiO2：将步骤（2）制备的中空介孔SiO2@TiO2复合物420℃煅烧3h，再分散于40ml水中，加入浓度4mol/L的氢氧化钠溶液3ml， 85℃下搅拌10h，15000rpm离心5min得沉淀，沉淀加超纯水复溶，再离心，重复3次，即得中空介孔TiO2；
（4）制备负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物：将步骤（3）制备的中空介孔TiO2 20mg分散于20ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第一混合液；将40mg自噬抑制剂溶酶体蛋白酶抑制剂分散于20ml无水乙醇和水按照体积比9：1混合的混合液中，成第二混合液；再将上述两混合液混合，室温搅拌26h，15000rpm离心5min，即得负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物；
（5）制备癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物：将细胞用PH=7.4的PBS缓冲液重新悬浮，1200rpm离心5min，将沉淀分散在裂解缓冲液中重悬，5℃放置3h，匀浆器匀浆30下， 7000rpm离心4min，收集上清，沉淀用裂解缓冲液重悬；再匀浆30下，7000rpm离心4min，收集上清，沉淀再重悬，再匀浆，再离心，重复10次；收集上清液16000rpm离心20min，沉淀加PH=7.4的PBS缓冲液重悬，与步骤（4）制备的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛复合物用聚碳酸酯膜共挤压，即得癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物。
6.权利要求1或2-5任一相所述方法制备的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物的粒径为100-150nm。
7.权利要求1或2-5任一相所述方法制备的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物在制备抗肿瘤药物注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
8.权利要求1或2-5任一相所述方法制备的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物在制备基于癌细胞膜的仿生递药系统中的应用。
9.权利要求1或2-5任一相所述方法制备的癌细胞膜包裹的负载自噬抑制剂的中空介孔二氧化钛仿生药物复合物在制备基于二氧化钛的声动力学治疗联合化疗药物中的应用。
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CN108030773B (zh) 2019-11-15

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