CN108026563A - 细胞判定方法、细胞判定装置及细胞判定程序 - Google Patents

细胞判定方法、细胞判定装置及细胞判定程序 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细胞判定方法，所述细胞判定方法根据细胞内的糖原的含量判定细胞种类，并且具备：取得步骤，测定细胞的光路长度，取得光路长度数据；计算步骤，根据得到的光路长度数据，计算出与细胞的光路长度相关的光路长度指标；比较步骤，将计算出的光路长度指标与阈值进行比较；和判定步骤，根据比较的结果，判定细胞是细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类。

Description

细胞判定方法、细胞判定装置及细胞判定程序
技术领域
本发明涉及细胞判定方法、细胞判定装置及细胞判定程序。
背景技术
来自人的胚胎干细胞(ES细胞)及诱导多能干细胞(iPS细胞)等干细胞具有分化成多种细胞的能力(多能性)，期待在药物开发领域、医疗领域中的应用。进行从干细胞分化诱导成目标细胞时的分化效率大大依赖于作为起始材料的干细胞的状态。即，如果干细胞维持多能性、没有保持未分化的状态，则分化诱导的效率降低。因此，为了将这些干细胞进行产业应用，管理干细胞的品质极为重要，需要监控干细胞，非侵入性地判定状态。
已知ES细胞在未分化状态下厌氧地使用糖酵解系统而产生三磷酸腺苷(ATP)。另外，如果进行分化，则主要成为通过利用了柠檬酸循环(TCA循环)的氧化磷酸化的ATP供给(非专利文献1)。已知ES细胞与分化后的细胞相比葡萄糖需求性更高，而且细胞质含有糖原(非专利文献2)。
作为糖原的检测方法，已知有古典组织化学染色(PAS染色：Periodic acidSchiff stain，系氏高碘酸染色)(例如，非专利文献2)。另外，在非专利文献3中，报道有通过拉曼分光成像，对ES细胞的细胞质中的糖原进行定量。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Cell Stem Cell，2013年，第12卷，pp.127-137.
非专利文献2：J.Anat.，2004年，第205卷，pp.247-255.
非专利文献3：Anal.Chem.，2011年，第83卷，pp.6254-6258.
发明内容
发明所要解决的课题
PAS染色法需要细胞的染色，因此，无法实现非侵入性的观察。在非专利文献3所记载的拉曼分光成像中，能够不对细胞进行染色而观察。然而，由于拉曼散射光的光强度极弱，所以观察所需要的照明光强度也强，有可能对细胞造成损伤。另外，在拉曼分光成像中，难以从来自培养基中的各种成分的拉曼散射光，将细胞特异性的拉曼散射光分光，无法直接观察培养基中的细胞。
本发明是鉴于这些问题而做出的，其目的在于提供能够根据细胞内的糖原的含量，非侵入且简便地判定细胞种类的细胞判定方法、细胞判定装置及细胞判定程序。
用于解决课题的技术手段
本发明提供一种细胞判定方法，其为根据细胞内的糖原的含量判定细胞种类的细胞判定方法，具备：取得步骤，测定细胞的光路长度，取得光路长度数据；计算步骤，根据得到的光路长度数据，计算出与细胞的光路长度相关的光路长度指标；比较步骤，将计算出的光路长度指标与阈值进行比较；和判定步骤，根据比较的结果，判定细胞为细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类。
本发明的细胞判定方法是基于细胞内的糖原含量越多则光路长度越长的关系的发现。在此，“光路长度”与“相位差”或“光学厚度”相同意思。
根据本发明的细胞判定方法，能够根据细胞内的糖原的含量，非侵入且简便地判定细胞种类。另外，由于以光路长度为指标，所以能够直接判定培养基中的细胞。
上述取得步骤也可以是由细胞的定量相位显微镜图像测定光路长度，取得光路长度数据的步骤。
本发明的细胞判定方法可以还具备：拍摄细胞的干涉反射显微镜图像，从该干涉反射显微镜图像测定集落的面积的测定步骤，在上述计算步骤中，计算集落所含的细胞的光路长度数据的合计值除以该集落的面积得到的值作为光路长度指标。由此，能够更简便地以集落单元判定细胞。
上述细胞判定方法中，上述细胞内的糖原含量多的细胞种类是多能干细胞，上述细胞内的糖原含量少的细胞种类是分化后的多能干细胞，上述细胞判定方法可以用于从经过培养的多能干细胞的细胞群中判别未分化的多能干细胞或判别分化后的多能干细胞。
可知未分化的多能干细胞在细胞内积蓄糖原。另一方面，随着多能干细胞分化，细胞内的糖原含量减少。因此，本发明的细胞判定方法例如能够用于在多能干细胞的继代培养中，从培养后的多能干细胞的细胞群中判别未分化的多能干细胞或者判别分化后的多能干细胞。
本发明者们发现：未分化的诱导多能干细胞(iPS细胞)在细胞内积蓄糖原，另一方面，分化后的iPS细胞没有这样的积蓄。因此，利用本发明的细胞判定方法，能够判定未分化的iPS细胞和分化后的iPS细胞。
因此，上述多能干细胞可以是诱导多能干细胞。
另外，本发明提供一种细胞判定装置，其具备：取得单元，其取得细胞的光路长度数据；计算单元，其根据取得的光路长度数据，计算出与细胞的光路长度相关的光路长度指标；比较单元，其将计算出的光路长度指标与阈值进行比较；和判定单元，其根据比较的结果，判定细胞是细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类。该细胞判定装置还可以具备取得细胞的干涉反射显微镜图像或将其二值化后的数据的第二取得单元。通过进一步具备第二取得单元，能够更简便地进行集落单元的判定。
此外，本发明提供用于使计算机作为以下的单元发挥作用的细胞判定程序：取得单元，其取得细胞的光路长度数据；计算单元，其根据取得的光路长度数据，计算出与细胞的光路长度相关的光路长度指标；比较单元，其将计算出的光路长度指标与阈值进行比较；判定单元，其根据比较的结果，判定细胞是细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类。该细胞判定程序还可以包括使计算机作为第二取得单元发挥作用，该第二取得单元取得细胞的干涉反射显微镜图像或将其二值化后的数据。
上述细胞判定程序可以作为记录有该细胞判定程序的计算机可读的记录介质提供。
发明的效果
根据本发明，能够基于细胞内的糖原的含量，非侵入且简便地判定细胞种类。
附图说明
图1中(A)是表示用定量相位显微镜经时地观察iPS细胞发生细胞分裂的情况的结果的照片。(B)是强调显示(A)中亮度高的区域(高光路长度区域)的图。
图2中(A)是表示将iPS细胞的集落进行了PAS染色后的结果的照片。(B)是表示用定量相位显微镜观察iPS细胞的集落得到的结果的照片。
图3中(A)是表示将iPS细胞的集落进行了PAS染色后的结果的照片。(B)是表示将与(A)同样的集落进行了碱性磷酸酶染色(AP染色)后的结果的照片。
图4是一个实施方式的流式细胞仪的构成图。
图5是表示一个实施方式的细胞判定装置的硬件的构成的概要图。
图6是表示一个实施方式的细胞判定装置的功能性构成的概要图。
图7是一个实施方式的细胞判定方法的流程图。
图8是表示iPS细胞的继代培养中，判定进行了分化的细胞和未分化的iPS细胞的例子的照片。(A)是集落的定量相位显微镜图像。(B)是用抗Nanog抗体进行了荧光染色的集落的荧光显微镜图像。
图9中(A)是表示图8所示的各集落的面积的图表。(B)是表示图8所示的各集落的每单位面积的光路长度(集落的平均光学厚度)的图表。
图10是表示未分化的iPS细胞和分化诱导后的iPS细胞的光路长度的图表。
图11是表示来自iPS细胞的肝脏细胞(分化初期)和成熟的肝脏细胞的光路长度的图表。
具体实施方式
以下，根据情况，参照图面，并对本发明的优选的实施方式进行详细地说明，但本发明并不限定于以下的实施方式。此外，在附图中，对相同或相当部分标注相同符号，并适当省略重复的说明。
本发明基于获得了通过在定量相位显微镜观察得到的细胞的光路长度(亮度)与细胞内的糖原的含量之间具有相关关系的新的发现。首先，对于该新的发现进行说明。
图1(A)是表示用定量相位显微镜经时地观察iPS细胞进行细胞分裂的情况的结果的照片。照片每20分钟拍摄。图1(B)是强调显示图1(A)的照片中亮度高的区域(高光路长度区域)的图。如图1所示，伴随细胞分裂，核体消失(00:20)，存在于细胞质的高光路长度区域聚集(00:40)，分裂成二个(04:00)，被分配于两个细胞(05:00)。根据本发明者们的观察，该高光路长度区域在细胞分裂时一定出现。如果关注细胞分裂中的染色线，则以伴随染色线的方式，1～2个高光路长度区域作为内质网那样的结构在细胞内出现。
图2(A)是表示将iPS细胞的集落进行PAS染色后的结果的照片。图2(B)是表示用定量相位显微镜观察iPS细胞的集落的结果的照片。在图2(A)和(B)中，用圆圈包围分裂期的细胞。如图2(A)和图2(B)所示，与上述的高光路长度区域同样的位置用PAS染色进行染色。另外，高光路长度区域由于通过淀粉酶处理而消失(未图示)，所以推测在高光路长度区域积蓄有糖原。
图3(A)是表示将iPS细胞的集落进行PAS染色后的结果的照片。图3(B)是表示将与图3(A)同样的集落进行了碱性磷酸酶染色(AP染色)的结果的照片。在AP染色中，未分化的iPS细胞被染色。根据图3(A)和(B)，不被AP染色的分化后的细胞(中央部)同样地不被PAS染色染色，被AP染色的未分化的iPS细胞被PAS染色染色。
由以上的结果可知，糖原的含量多的细胞的光路长度比糖原的含量少的细胞的长(在定量相位显微镜图像中，亮度变高)。
本发明者关于上述的新的发现推测如下。即，用定量相位显微镜观察的光路长度(亮度)是“细胞的实际厚度”乘以“细胞-培养基之间的折射率差”得到的值。由于可以认为细胞的实际厚度、及培养基与细胞的折射率没有很大差异，所以在产生了少许折射率差的情况下，可以认为作为大的光路长度的变化被观察到。由于糖原的折射率为1.69，比一般的生物大分子的折射率(1～1.5)高，所以如果其积蓄量(含量)多，则可以认为能观察到光路长度的长度(亮度的高度)有大的变化。
〔细胞判定方法〕
本发明的细胞判定方法是根据细胞内的糖原的含量判定细胞种类的方法。
(成为判定对象的细胞种类)
本实施方式的细胞判定方法由于是根据糖原含量进行判定的方法，所以能够用于在混合存在糖原含量多的细胞种类和糖原含量少的细胞种类或者有可能混合存在的细胞体系(总称为“混合细胞系”。)中，判定糖原含量多的细胞种类和/或糖原含量少的细胞种类。
作为糖原含量多的细胞种类和糖原含量少的细胞种类，能够列举例如主要利用无氧糖酵解体系产生作为细胞的能量来源的ATP的细胞种类等的糖原含量多的细胞种类、主要利用TCA循环中的氧化磷酸化产生作为细胞的能量来源的ATP的细胞种类等的糖原含量少的细胞种类。
作为混合细胞系的具体例子，不限于此，可以列举多能干细胞培养体系(以维持多能性为目的的培养体系)；使多能干细胞分化成肝脏、肾脏、心脏、胰脏和神经等的体细胞时的细胞培养体系；来自心肌组织、肝脏组织和神经组织等的细胞的培养体系；神经细胞/星形胶质细胞的混合培养体系；以及白血病患者的淋巴细胞培养体系。
在多能干细胞培养体系中，有可能未分化的多能干细胞(糖原含量多的细胞种类)和分化后的多能干细胞(糖原含量少)混合存在。本实施方式的细胞判定方法也可以用于从培养的多能干细胞的细胞群中判别未分化的多能干细胞或者判别分化后的多能干细胞。由此，能够非侵入且简便地进行继代培养的细胞的品质管理(未分化状态的维持)。另外，在再生医疗等中，在使多能干细胞分化成体细胞时，能够非侵入且简便地判别分化后的多能干细胞。
在心肌细胞培养体系中，有可能胎儿心肌细胞(糖原含量多的细胞种类)和成人心肌细胞(糖原含量少)混合存在。本实施方式的细胞判定方法也可以用于从所培养的心肌细胞的细胞群中判别胎儿心肌细胞或者判别成人心肌细胞。由此，对于再生医疗等中的心肌补片等成熟的心肌细胞的品质评价有效。
已知神经细胞直接消耗葡萄糖，星形胶质细胞将剩余的葡萄糖作为糖原积蓄在细胞内(Cell，2011年，第144卷，5号，pp.810－823)。因此，本实施方式的细胞判定方法可以用于从所培养的神经细胞和星形胶质细胞的细胞群中判别神经细胞或者判别或星形胶质细胞。
白血病的分类和发展度的判定中使用PAS染色(J.Clin.Pathol.，1979年，第32卷，pp.158－161)。因此，本实施方式的细胞判定方法可以用于白血病的分类或发展度的判定。
(光路长度数据)
取得步骤是测定细胞的光路长度、取得光路长度数据的步骤。细胞的光路长度数据通过利用例如定量相位显微镜、相位差显微镜拍摄细胞，能够作为“相位差”或“光学厚度”获得。光路长度数据可以对单一细胞取得，也可以对多个细胞(例如，细胞集落单元、显微镜的视野单元)取得。
在本实施方式的细胞判定方法中，成为对象的细胞通常为培养细胞。由于不易受到由培养基成分产生的对判定结果的影响，所以在取得步骤中，也可以测定培养培养基中的细胞的光路长度，取得光路长度数据。由于能够以培养培养基中的细胞为测定对象，所以操作变得极为简便。
(光路长度指标)
计算步骤是根据取得步骤中得到的光路长度数据，计算出与细胞的光路长度相关的光路长度指标的步骤。光路长度指标是与细胞的光路长度相关的指标。即，只要能够在判定中利用细胞的光路长度与细胞内的糖原的含量之间的相关关系，光路长度指标例如可以直接为取得的光路长度数据，也可以是根据对多个细胞取得的光路长度数据计算出的指标(例如，平均值)。
光路长度指标例如可以设为对某个集落所含的细胞群取得的光路长度数据的合计值除以该集落的面积得到的值(成为某个集落的每单位面积的光路长度)。集落的面积能够通过例如拍摄干涉反射显微镜(IRM)图像，将IRM图像二值化，辨别细胞粘附的培养基材与细胞没有粘附的培养基材，由此进行测定。
光路长度指标还可以设为对显微镜的一个视野中所含的细胞群取得的光路长度数据的合计值除以该视野所含的细胞群的面积所得到的值(成为某个视野中的每单位细胞面积的光路长度)。
(阈值)
比较步骤是将计算步骤中计算出的光路长度指标与阈值进行比较的步骤。阈值能够根据作为判定对象的细胞种类、培养条件等适当设定。例如，在多能干细胞培养体系中，将未分化的多能干细胞或分化后的多能干细胞作为判定对象的情况下，在多能干细胞培养体系中，实施上述的取得步骤和计算步骤，算出光路长度指标。在相同的多能干细胞培养体系中，按照常规方法(例如，AP染色、抗Nanog抗体染色)，判别未分化的多能干细胞和分化后的多能干细胞。根据这些结果，预先设定能够判别未分化的多能干细胞和分化后的多能干细胞的阈值。
(判定步骤)
判定步骤是根据比较步骤中比较的结果，判定细胞是细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类的步骤。
在光路长度指标为与细胞的光路长度呈正相关的指标的情况下(如果细胞的光路长度变长，则光路长度指标变大的情况)，如下进行判定。
(i)在光路长度指标为阈值以上的情况下，判定细胞为细胞内的糖原含量多的细胞种类，或者
(ii)在光路长度指标小于阈值的情况下，判定细胞为细胞内的糖原含量少的细胞种类。
在光路长度指标为与细胞的光路长度呈负相关的指标的情况下，(如果细胞的光路长度变长，则光路长度指标变小的情况下，)，如下进行判定。
(iii)在光路长度指标超过阈值的情况下，判定细胞为细胞内的糖原含量少的细胞种类，或者
(iv)在光路长度指标为阈值以下的情况下，判定细胞为细胞内的糖原含量多的细胞种类。
〔细胞判定装置〕
在一个实施方式中，细胞判定装置与光路长度测定装置组合作为流式细胞仪使用。作为光路长度测定装置，能够使用例如定量相位显微镜、相位差显微镜。
图4是一个实施方式所涉及的流式细胞仪的构成图。图4所示的流式细胞仪1主要由组合有干涉反射显微镜的光学系统和定量相位显微镜的光学系统而成的显微镜系统A和细胞判定装置D构成。显微镜系统A也可以仅由定量相位显微镜的光学系统构成。此外，通过显微镜系统A还具备干涉反射显微镜的光学系统，从而能够一并测定单一细胞的面积、集落的面积、视野中的细胞的面积。
(定量相位显微镜)
定量相位显微镜的光学系统在光的入射侧具备与导出来自未图示的光射出部的照射光H0(激光)的光纤B的射出侧端面B1面对面的透镜A2；和反射透过该透镜A2的照射光H0的反射部A3。另一方面，在定量相位显微镜的光学系统的光的射出侧，设置有拍摄在光干涉部A7生成的干涉条纹(未图示，以下同样)生成图像的CCD相机等的拍摄装置C。
显微镜A具备显微镜主体A1，该显微镜主体A1至少具有支撑测定试样S的试样台A4、物镜A5、反射部A6、光干涉部A7。如图4所示，显微镜主体A1还可以具有干涉反射显微镜的光学系统A8。
试样台A4例如具有在中央能够透过光的光透过部A41，并且是具有在向上的面能够载置测定试样S的载置面A42的大致板状的台子。通过在载置面A42载置了测定试样S的状态下从上方照射光，使透过了测定试样S的光(被测定光H1)透过光透过部A41而朝向物镜A5。此外，光透过部A41例如可以由玻璃等能够透过光的部件形成，也可以是单纯的孔。物镜A5例如根据操作部(未图示)的操作，使入射而来的被测定光H1以该操作所涉及的规定的倍率放大而作为平行光射出。反射部A6例如为全反射型的反光镜，能够使来自物镜A5的被测定光H1全反射而导入到光干涉部A7。光干涉部A7具备：将被测定光H1分离成2个光H1a、H1b的光分离元件A71；将该光分离元件A71射出的被测定光H1(H1a、H1b)转换成会聚光H2(H2a、H2b)的聚光透镜A72；配置于会聚光H2的会聚位置的空间滤波器A73；和将透过了空间滤波器A73的物体光H3与参照光H4重合而生成干涉条纹的合成透镜A75。在此，光分离元件A71是使用衍射光栅而构成的元件。进一步，光分离元件A71也可以是分离为偏振方向互相不同的2个光的偏光分离元件。在该情况下，光干涉部A7具备：将被测定光H1分离成偏振方向互相不同的2个光H1a、H1b的光分离元件A71；转换成会聚光H2(H2a、H2b)的聚光透镜A72；配置于会聚光H2的会聚位置的空间滤波器A73；将透过了空间滤波器A73的物体光H3和参照光H4配置在该空间滤波器A73的射出侧的半波长板A74；和由该半波长板A74使偏振方向一致的物体光H3与参照光H4重合而生成干涉条纹的合成透镜A75。或者，也可以代替配置在空间滤波器A73的射出侧的半波长板A74而配置起偏振镜使物体光H3与参照光H4的偏振方向一致。
(干涉反射显微镜)
干涉反射显微镜的光学系统A8通过在载置面A42载置测定试样S的状态下从下方照射光，测定在测定试样S反射的光(被测定光H1)。干涉反射显微镜的光学系统在光的入射侧具备：与导出来自光源(未图示)的照射光(激光)的光纤B2的射出侧端面B3面对面的带通滤波器A84和开口狭缝A83、和将透过该带通滤波器A84和开口狭缝A83的照射光反射的反射部A81(例如，分束器)。光源由白色LED等构成。另一方面，在干涉反射显微镜的光学系统的光的射出侧设置有将来自物镜5及反射部A81的被测定光H1反射并导向聚光透镜A85的反射部A82(例如，分色镜)和拍摄被聚光透镜A85会聚的被测定光并形成图像的CCD相机等拍摄装置C1。
(细胞判定装置)
对细胞判定装置D的构成进行说明。图5是表示一个实施方式的细胞判定装置D的硬件的构成的概要图，图6是表示一个实施方式的细胞判定装置D的功能性构成的概要图。
如图5所示，细胞判定装置D物理上作为通常的计算机而构成，该计算机包括：CPUD11、ROM D12及RAM D13等主存储装置、键盘及鼠标等输入设备D14、显示器等输出设备D15、用于在与例如拍摄装置C等其他装置之间进行数据的传输和接收的网卡等的通信模块D16、硬盘等辅助存储装置D17等。后述的细胞判定装置D的各功能通过在CPU D11、ROM D12、RAMD13等硬件上加载规定的计算机软件，在CPU D11的控制下使输入设备D14、输出设备D15、通信模块D16工作，并且进行主存储装置D12、D13或辅助存储装置D17中的数据的读取和写入来实现。
如图6所示，细胞判定装置D作为功能性的构成要素，包括取得单元D1、计算单元D2、比较单元D3、判定单元D4和显示单元D5。
取得单元D1是从由拍摄装置C拍摄的定量相位显微镜图像取得光路长度数据的单元。取得单元D1还发挥作为取得由拍摄装置C1拍摄的干涉反射显微镜图像数据或将其二值化后的数据的作用。计算单元D2是根据取得的光路长度数据计算出上述的光路长度指标的单元。比较单元D3是将计算出的光路长度指标与阈值进行比较的单元。阈值可以读取预先收藏于细胞判定装置D的辅助存储装置D17等的阈值。判定单元D4是根据比较的结果判定细胞种类的单元。显示单元D5是显示判定的结果的单元。
〔细胞判定程序〕
细胞判定程序是使计算机发挥作为上述的取得单元D1、计算单元D2、比较单元D3、判定单元D4和显示单元D5的作用的程序。通过在计算机中加载细胞判定程序，计算机作为细胞判定装置D工作。细胞判定程序例如被记录于计算机可读记录介质中提供。记录介质可以是非暂时性记录介质。作为记录介质，可以例示软盘、CD、DVD等的记录介质、ROM等的记录介质、半导体存储器等。
(细胞判定方法)
对利用细胞判定装置D进行的细胞判定方法进行说明。图7是细胞判定方法的流程图。通过利用细胞判定装置D进行的细胞判定方法，能够定量且自动地高精度地进行作为对象的细胞是细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类的判定。
[取得步骤S1]
最开始，取得单元D1从拍摄装置C取得细胞的光路长度数据。在光路长度指标例如为某集落的每单位面积的光路长度的情况或为某视野中的每单位细胞面积的光路长度的情况下，取得了光路长度数据的集落或视野的IRM图像也可以由取得单元D1取得。
[计算步骤S2]
接着，根据计算单元D2取得的光路长度数据算出光路长度指标。在光路长度指标例如为某集落的每单位面积的光路长度的情况或为某视野中的每单位细胞面积的光路长度的情况下，也可以包括根据取得了光路长度数据的集落或视野的IRM图像，计算出细胞面积(例如，集落面积)。
[比较步骤S3]
接着，比较单元D3将由计算步骤S2计算出的光路长度指标和阈值进行比较，提取其结果。比较单元D3也可以包括读取预先收藏于辅助存储装置D17等的阈值。
[判定步骤S4]
接着，判定单元D4根据由比较步骤S3提取的比较的结果，判定细胞是细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类。判定单元D4根据比较步骤S3的比较的结果，如下进行判定。
在光路长度指标为与细胞的光路长度呈正相关的指标的情况下(如果细胞的光路长度变长，则光路长度指标变大的情况)，
(i)在光路长度指标为阈值以上的情况下，判定细胞为细胞内的糖原含量多的细胞种类；或者
(ii)在光路长度指标小于阈值的情况下，判定细胞为细胞内的糖原含量少的细胞种类。
在光路长度指标为与细胞的光路长度呈负相关的指标的情况下(如果细胞的光路长度变长，则光路长度指标变小的情况)，
(iii)在光路长度指标超过阈值的情况下，判定细胞为细胞内的糖原含量少的细胞种类；或者
(iv)在光路长度指标为阈值以下的情况下，判定细胞为细胞内的糖原含量多的细胞种类。
[显示步骤S5]
接着，显示单元D5显示由判定步骤S4判定的结果。例如，由显示单元D5显示细胞是细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类。
实施例
表示通过本发明的细胞判定方法，判定iPS细胞的继代培养中进行了分化的细胞和未分化的iPS细胞的例子。此外，本发明不限于以下所示的例子。
图8是表示在iPS细胞(253G1株)的继代培养中，判定进行了分化的细胞和未分化的iPS细胞的例子的照片。图8(A)是继代后培养3天所形成的集落的定量相位显微镜图像。一个视野中包含多个集落。亮度越高(光路长度越长)，则显示得越白。图8(B)是将与图8(A)相同的集落用抗Nanog抗体进行了免疫染色的荧光显微镜图像。该被免疫染色所染色(观察到荧光)的集落为未分化的iPS细胞。由于免疫染色不是定量性的，所以与图8(A)的亮度并不一致，但可知图8(A)中亮度高(光路长度长)的集落被抗Nanog抗体免疫染色。从图8可知，在由定量相位显微镜观察的光路长度(亮度)超过规定值的情况下，能够判定为未分化的iPS细胞或集落。
图9(A)是表示图8所示的各集落的面积的图表。各集落的面积通过将由干涉反射显微镜另外拍摄的IRM图像利用图像处理进行二值化而辨别粘附有细胞的培养基材和没有粘附细胞的培养基材来计算。横轴是培养时间。可知随着培养时间变长，集落面积增加。图9(B)是表示图8所示的各集落的每单位面积的光路长度(集落的平均光学厚度：nm/mm2)的图表。在细胞的粘附状态稳定的培养第1天(day1)以后，未分化的iPS细胞的集落(Nanog阳性的集落)和分化的iPS细胞的集落(Nanog阴性的集落)在集落的平均光学厚度上存在明显差异。具体而言，在图8的集落A、D及J(Nanog阴性的集落)中，平均光学厚度为90～120nm/mm2，在图8的集落B、C、F、H及L(Nanog阳性集落)中，平均光学厚度为200～250nm/mm2。因此，例如通过将阈值设定在155～165nm/mm2之间，能够判定未分化的iPS细胞的集落和分化的iPS细胞的集落。
图10是表示未分化的iPS细胞和分化诱导的iPS细胞的光路长度的图表。图11是表示源自iPS细胞的未成熟的肝脏细胞和成熟的肝脏细胞的光路长度的图表。图10和图11所示的光路长度表示从定量相位显微镜图像提取的亮度(光路长度)。
图10所示的“iPS细胞”和“iPS细胞(维甲酸诱导)”、以及图11所示的“源自iPS的肝脏细胞”和“原代肝脏细胞”如下进行培养。
“iPS细胞”是在将经过防反射涂层的直径35mm的塑料底培养皿涂布Matrigel(注册商标)基底膜基质(Becton Dickinson公司制造，以下也称为“底物”。)后的培养皿中接种来自人生物成纤维细胞的iPS细胞株(253G1株)使其成为10～20集落/皿，使用多能干细胞培养用合成培养基(mTeSR(注册商标)1，StemCell公司制造，以下也称为“合成培养基”。)无供给地进行培养。1个集落的大小是200μm左右。细胞从接种后培养到第3天。合成培养基每1天更换1次。接种后第3天拍摄定量相位显微镜图像，测定光路长度。
“iPS细胞(维甲酸诱导)”是在接种“iPS细胞”后第2天，更换成添加了12.5μM的维甲酸的合成培养基，再培养4天。维甲酸一般作为诱导分化的试剂使用。在添加维甲酸后第4天拍摄定量相位显微镜图像，测定光路长度。
“源自iPS的肝脏细胞”是由“iPS细胞”按照非专利文献(Molecular Therapy，2011年，第19卷2号，pp.400～407)记载的顺序诱导而成的肝脏细胞。在诱导开始后第18天和第25天拍摄定量相位显微镜图像，测定光路长度。
“原代肝脏细胞”使用从Becton Dickinson公司获得的BD Gentest HumanHepatocyte(目录编号454550，批号299)株，使用Hepato-STIM培养基(Becton Dickinson公司制造)进行培养。在接种后第1天拍摄定量相位显微镜图像，测定光路长度。
如图10所示，与作为未分化的多能干细胞的“iPS细胞”相比，通过添加已知作为诱导分化的试剂的维甲酸，光路长度(亮度)减少。另外，如图11所示，诱导了从iPS细胞向肝脏细胞分化的初期的状态下的未成熟的肝脏细胞(第18天和第25天)中，伴随分化诱导，光路长度减少，但通过作为肝脏细胞成熟，从而由于糖原的积蓄，光路长度增加。
符号的说明
1…流式细胞仪、A…显微镜系统、A1…显微镜主体、B…光纤、C…拍摄装置、D…细胞判定装置、D1…取得单元、D2…计算单元、D3…比较单元、D4…判定单元、D5…显示单元。

Claims (10)

1.一种细胞判定方法，其中，
所述细胞判定方法根据细胞内的糖原的含量判定细胞种类，并且具备：
取得步骤，测定细胞的光路长度，取得光路长度数据；
计算步骤，根据得到的光路长度数据，计算出与细胞的光路长度相关的光路长度指标；
比较步骤，将计算出的光路长度指标与阈值进行比较；和
判定步骤，根据比较的结果，判定细胞为细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类。
2.如权利要求1所述的细胞判定方法，其中，
所述取得步骤是从细胞的定量相位显微镜图像测定光路长度，取得光路长度数据的步骤。
3.如权利要求1或2所述的细胞判定方法，其中，
还具备测定步骤，拍摄细胞的干涉反射显微镜图像，由该干涉反射显微镜图像测定集落的面积，
在所述计算步骤中，计算出集落所含的细胞的光路长度数据的合计值除以该集落的面积得到的值作为光路长度指标。
4.如权利要求1～3中任一项所述的细胞判定方法，其中，
所述细胞内的糖原含量多的细胞种类为多能干细胞，所述细胞内的糖原含量少的细胞种类为分化后的多能干细胞，
所述细胞判定方法用于从经过培养的多能干细胞的细胞群中判别未分化的多能干细胞、或者判别分化后的多能干细胞。
5.如权利要求4所述的细胞判定方法，其中，
所述多能干细胞为诱导多能干细胞。
6.一种细胞判定装置，其中，
具备：
取得单元，其取得细胞的光路长度数据；
计算单元，其根据取得的光路长度数据，计算出与细胞的光路长度相关的光路长度指标；
比较单元，其将计算出的光路长度指标与阈值进行比较；和
判定单元，其根据比较的结果，判定细胞是细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类。
7.如权利要求6所述的细胞判定装置，其中，
还具备第二取得单元，其取得细胞的干涉反射显微镜图像或将其二值化后的数据。
8.一种细胞判定程序，其中，
用于使计算机作为以下单元发挥作用，
取得单元，其取得细胞的光路长度数据；
计算单元，其根据取得的光路长度数据，计算出与细胞的光路长度相关的光路长度指标；
比较单元，其将计算出的光路长度指标与阈值进行比较；
判定单元，其根据比较的结果，判定细胞是细胞内的糖原含量多的细胞种类或者是细胞内的糖原含量少的细胞种类。
9.如权利要求8所述的细胞判定程序，其中，
包括进一步使所述计算机作为第二取得单元发挥作用，该第二取得单元取得细胞的干涉反射显微镜图像或将其二值化后的数据。
10.一种计算机可读记录介质，其中，
记录有权利要求8或9所述的细胞判定程序。
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