JP6518173B2 - 細胞判定方法、細胞判定装置及び細胞判定プログラム - Google Patents
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Description
本発明の細胞判定方法は、細胞内のグリコーゲンの含有量に基づいて細胞種を判定するものである。
本実施形態の細胞判定方法は、グリコーゲン含有量に基づく判定を行うものであるため、グリコーゲン含有量の多い細胞種とグリコーゲン含有量の少ない細胞種とが混在している、又は混在している可能性がある細胞系(まとめて「混在細胞系」という。)において、グリコーゲン含有量の多い細胞種、及び/又はグリコーゲン含有量の少ない細胞種を判定するために用いることができる。
取得ステップは、細胞の光路長を測定し、光路長データを取得するステップである。細胞の光路長データは、例えば、定量位相顕微鏡、位相差顕微鏡により細胞を撮像することで、「位相差」又は「光学厚さ」として得ることができる。光路長データは、単一細胞について取得してもよいし、複数の細胞(例えば、細胞コロニー単位、顕微鏡の視野単位)について取得してもよい。
算出ステップは、取得ステップで得られた光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出するステップである。光路長指標は、細胞の光路長と相関するものである。すなわち、細胞の光路長と細胞内のグリコーゲンの含有量との間の相関関係を判定に利用できる限りにおいて、光路長指標は、例えば、取得した光路長データそのままであってもよいし、複数の細胞について取得した光路長データに基づいて算出した指標(例えば、平均値)であってもよい。
比較ステップは、算出ステップで算出された光路長指標を閾値と比較するステップである。閾値は、判定対象とする細胞種、培養条件等に応じて適宜設定することができる。例えば、多能性幹細胞培養系で、未分化の多能性幹細胞、又は分化した多能性幹細胞を判定対象とする場合、多能性幹細胞培養系において、上述した取得ステップ、及び算出ステップを実施し、光路長指標を算出する。同じ多能性幹細胞培養系で、常法に従い(例えば、AP染色、抗Nanog抗体染色)、未分化の多能性幹細胞、及び分化した多能性幹細胞を判別する。これらの結果に基づき、未分化の多能性幹細胞、及び分化した多能性幹細胞を判別可能な閾値を予め設定する。
判定ステップは、比較ステップで比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定するステップである。
(i)光路長指標が閾値以上である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であると判定する、又は
(ii)光路長指標が閾値未満である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であると判定する。
(iii)光路長指標が閾値を超える場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であると判定する、又は
(iv)光路長指標が閾値以下である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であると判定する。
一実施形態において、細胞判定装置は、光路長測定装置と組み合わせてサイトメーターとして使用される。光路長測定装置としては、例えば、定量位相顕微鏡、位相差顕微鏡を使用できる。
定量位相顕微鏡の光学系は、光の入射側に、図示しない光出射部からの照射光H0(レーザ光)を導く光ファイバBの出射側端面B1に臨ませたレンズA2と、このレンズA2を透過する照射光H0を反射する反射部A3を具備する。一方、定量位相顕微鏡の光学系の光の出射側には、光干渉部A7で生成される干渉縞(図示せず、以下同様)を撮像して画像とするCCDカメラ等の撮像装置Cが設けられる。
干渉反射顕微鏡の光学系A8は、載置面A42に測定試料Sを載置した状態で下方から光を照射することにより、測定試料Sで反射した光(被測定光H1)を測定する。干渉反射顕微鏡の光学系は、光の入射側に、光源(図示せず)からの照射光(レーザ光)を導く光ファイバB2の出射側端面B3に臨ませたバンドパスフィルタA84及び開口スリットA83と、このバンドパスフィルタA84及び開口スリットA83を透過する照射光を反射する反射部A81(例えば、ビームスプリッタ)を具備する。光源は、白色LED等で構成される。一方、干渉反射顕微鏡の光学系の光の出射側には、対物レンズ5及び反射部A81からの被測定光H1を反射させて集光レンズA85に導く、反射部A82(例えば、ダイクロイックミラー)と、集光レンズA85で収束された被測定光を撮像して画像とするCCDカメラ等の撮像装置C1が設けられる。
細胞判定装置Dの構成について説明する。図5は、一実施形態に係る細胞判定装置Dのハードウェア的構成を示す概要図であり、図6は、一実施形態に係る細胞判定装置Dの機能的構成を示す概要図である。
細胞判定プログラムは、コンピュータを、上述した取得手段D1、算出手段D2、比較手段D3、判定手段D4、及び表示手段D5として機能させるものである。コンピュータに細胞判定プログラムを読み込ませることにより、コンピュータは細胞判定装置Dとして動作する。細胞判定プログラムは、例えば、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されて提供される。記録媒体は、非一時的記録媒体であってもよい。記録媒体としては、フレキシブルディスク、CD、DVD等の記録媒体、ROM等の記録媒体、半導体メモリ等が例示される。
細胞判定装置Dにより行われる細胞判定方法について説明する。図7は細胞判定方法のフローチャートである。細胞判定装置Dにより行われる細胞判定方法により、対象となる細胞が、細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であるか、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であるかの判定を定量的且つ自動的に精度高く行うことができる。
最初に、取得手段D1が撮像装置Cから細胞の光路長データを取得する。光路長指標が、例えば、あるコロニーの単位面積あたりの光路長である場合、又はある視野中の単位細胞面積あたりの光路長である場合、光路長データを取得したコロニー又は視野のIRM像は、取得手段D1により取得してもよい。
次に、算出手段D2が取得した光路長データから光路長指標を算出する。光路長指標が、例えば、あるコロニーの単位面積あたりの光路長である場合、又はある視野中の単位細胞面積あたりの光路長である場合、光路長データを取得したコロニー又は視野のIRM像から細胞面積(例えば、コロニー面積)を算出することを含んでもよい。
次に、比較手段D3が、算出ステップS2にて算出した光路長指標と閾値を比較し、その結果を抽出する。比較手段D3は、補助記憶装置D17等に予め格納されている閾値を読み出すことを含んでもよい。
次に、判定手段D4が、比較ステップS3にて抽出した比較の結果に基づき、細胞が、細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であるか、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であるかを判定する。判定手段D4は、比較ステップS3の比較の結果に基づいて、以下のように判定する。
光路長指標が、細胞の光路長と正に相関する指標である場合(細胞の光路長が長くなると光路長指標が大きくなる場合);
(i)光路長指標が閾値以上である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であると判定する、又は
(ii)光路長指標が閾値未満である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であると判定する。
光路長指標が、細胞の光路長と負に相関する指標である場合(細胞の光路長が長くなると光路長指標が小さくなる場合);
(iii)光路長指標が閾値を超える場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であると判定する、又は
(iv)光路長指標が閾値以下である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であると判定する。
次に、表示手段D5が、判定ステップS4にて判定した結果を表示する。例えば、細胞が、細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であるか、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であるかが表示手段D5によって表示される。
Claims (10)
- 細胞内のグリコーゲンの含有量に基づいて細胞種を判定する細胞判定方法であって、
細胞の光路長を測定し、光路長データを取得する取得ステップと、
得られた光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出する算出ステップと、
算出された光路長指標を閾値と比較する比較ステップと、
比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定する判定ステップと、
を備える、細胞判定方法。 - 前記取得ステップは、細胞の定量位相顕微鏡像から光路長を測定し、光路長データを取得するステップである、請求項1に記載の細胞判定方法。
- 細胞の干渉反射顕微鏡像を撮像し、当該干渉反射顕微鏡像からコロニーの面積を測定する測定ステップを更に備え、
前記算出ステップでは、コロニーに含まれる細胞の光路長データの合計値を当該コロニーの面積で除した値を光路長指標として算出する、請求項1又は2に記載の細胞判定方法。 - 前記細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種が、多能性幹細胞であり、前記細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種が、分化した多能性幹細胞であり、
培養された多能性幹細胞の細胞集団から未分化の多能性幹細胞を判別する、又は分化した多能性幹細胞を判別するために用いられる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞判定方法。 - 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項4に記載の細胞判定方法。
- 細胞の光路長データを取得する取得手段と、
取得した光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出する算出手段と、
算出した光路長指標を閾値と比較する比較手段と、
比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定する判定手段と、
を備える、細胞判定装置。 - 細胞の干渉反射顕微鏡像又はこれを二値化したデータを取得する第2の取得手段を更に備える、請求項6に記載の細胞判定装置。
- コンピュータを、
細胞の光路長データを取得する取得手段、
取得した光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出する算出手段、
算出した光路長指標を閾値と比較する比較手段、
比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定する判定手段、
として機能させるための細胞判定プログラム。 - 前記コンピュータを、細胞の干渉反射顕微鏡像又はこれを二値化したデータを取得する第2の取得手段として更に機能させることを含む、請求項8に記載の細胞判定プログラム。
- 請求項8又は9に記載の細胞判定プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
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