KR102166376B1 - 세포 판정 방법, 세포 판정 장치 및 세포 판정 프로그램 - Google Patents

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도요히코 야마우치
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고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
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Abstract

본 발명은 세포 소괴의 광로 길이 화상을 취득하는 취득 단계와, 취득한 광로 길이 화상 중의 세포핵 영역을 추출하는 추출 단계와, 추출한 세포핵 영역의 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교하는 비교 단계와, 비교한 결과에 근거해 세포가 줄기 세포인지 여부를 판정하는 판정 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 세포 판정 방법에 관한 것이다.

Description

세포 판정 방법, 세포 판정 장치 및 세포 판정 프로그램{CELL ASSESSMENT METHOD, CELL ASSESSMENT DEVICE, AND CELL ASSESSMENT PROGRAM}
본 발명은 세포 판정 방법, 세포 판정 장치 및 세포 판정 프로그램에 관한 것이다.
인간 유래의 ES 세포, iPS 세포 등의 줄기 세포는 여러 종류의 세포로 분화하는 능력(다능성)을 가지며, 병의 해명 및 창약(創藥) 스크리닝, 독성 시험, 재생 의료 등, 지금까지 곤란했던 인간 세포를 이용한 대규모 약효 평가 및 의료에 대한 응용이 가능한 점에서 주목받고 있다. 이들 줄기 세포로부터 목적하는 세포로 분화 유도를 실시할 때의 분화 효율은 출발 재료인 줄기 세포의 상태에 크게 의존한다고 여겨지고 있다. 즉 줄기 세포가 다능성을 유지해, 미분화인 상태를 유지하고 있지 않으면 분화 유도의 효율이 저하된다. 그 때문에 이들 줄기 세포를 산업 응용하기 위해서는 줄기 세포의 품질을 관리하는 것이 매우 중요하고, 줄기 세포를 모니터링해, 상태를 비침습으로 판정할 필요가 있다.
그리고, 이들 줄기 세포는 수천~수만개 정도의 복수의 줄기 세포가 접착(접촉)해 밀집한 세포 집단(콜로니)을 형성하기 때문에, 품질의 관리도 콜로니 단위로 실시되는 것이 통상이다.
예를 들면, 특허문헌 1은 다수의 세포로부터 구성되는 세포 콜로니의 광로(光路) 길이 화상(畵像)을 이용하여, 상기 세포 콜로니의 해석을 실시하는 세포 해석 장치에서의 세포 해석 방법으로서, 상기 세포 해석 장치의 취득 수단이 상기 세포 콜로니의 광로 길이 화상을 취득하는 취득 단계와, 상기 세포 해석 장치의 추출 수단이 상기 취득한 광로 길이 화상 중에서, 상기 세포의 세포핵에 대응하는 원형 형상을 추출하는 추출 단계와, 상기 세포 해석 장치의 비교 수단이 상기 추출한 원형 형상에 대해, 그 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교하는 비교 단계와, 상기 세포 해석 장치의 해석 수단이 상기 비교 결과에 근거해 상기 세포 콜로니의 해석을 실시하는 해석 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 세포 해석 방법을 개시한다.
또, 비특허문헌 1에는 분화 세포인 CHO 세포, HeLa 세포, 파골세포 모양(OC) 세포에서의 세포질 영역의 평균 광로 길이가 핵 영역의 평균 광로 길이보다도 낮아진 반면, 콜로니 중의 각 hiPS 세포에서의 세포질 영역의 평균 광로 길이가 핵 영역의 평균 광로 길이보다도 컸던 점, 광로 길이의 비(세포질/핵)가 hiPS 세포와 다른 타입의 분화 세포를 구별하기 위한 간단한 지표가 될 수 있는 점이 기재되어 있다.
일본 특개 2012-231709호 공보
Biomedical Optics Express, Vol.3, Issue 9, pp.2175-2183(2012)
특허문헌 1에 의하면, 「광로 길이」는 「굴절률」에 「물리적 두께」를 곱한 것으로(광로 길이 = 굴절률×물리적 두께), 세포핵(세포핵의 내측)의 굴절률은 일반적으로 세포질(세포핵의 외측)의 굴절률보다도 낮다(세포핵의 내측의 굴절률 ＜ 세포핵의 외측의 굴절률).
그리고, 콜로니를 형성하는 품질이 양호한 줄기 세포는 도 12와 같은 형상을 가지고, 인접하는 줄기 세포의 거리가 가까워 세포핵 간의 세포질이 두꺼워지므로, 세포핵의 내측과 외측의 물리적 두께가 거의 동일하게 되고(세포핵의 내측의 물리적 두께 ≒ 세포핵의 외측의 물리적 두께), 광로 길이에 대해서는 「세포핵의 내측의 광로 길이 ＜ 세포핵의 외측의 광로 길이」가 성립한다고 여겨지고 있다.
이것에 비해서, 콜로니를 형성하는 품질이 나쁜 줄기 세포는 인접하는 줄기 세포의 거리가 멀고, 세포핵 간의 세포질이 얇아지므로, 세포핵의 내측의 물리적 두께가 외측의 물리적 두께에 비해 훨씬 더 두꺼워져(세포핵의 내측의 물리적 두께 ＞＞ 세포핵의 외측의 물리적 두께), 광로 길이에 대해서는 「세포핵의 내측의 광로 길이 ＞ 세포핵의 외측의 광로 길이」가 성립한다고 여겨지고 있다.
이와 같이, 특허문헌 1에서는 「세포핵의 내측의 광로 길이 ＜ 세포핵의 외측의 광로 길이」가 성립하는지 여부는 세포핵의 외측의 물리적 두께에 의하면 되며, 그리고 세포핵의 외측의 물리적 두께는 세포의 형상에 의존한다.
한편, 줄기 세포를 유지하기 위해서는 줄기 세포 콜로니를 소괴화(小塊化)하여 증식시키는 계대가 필수이다. 계대시에 줄기 세포 콜로니의 소괴화물의 품질을 판정해 증식시키는 것이 바람직하지만, 줄기 세포 콜로니를 소괴화할 때, 줄기 세포와 다른 세포의 접착(접촉)이 일부 또는 전부 끊어지기 때문에, 줄기 세포 콜로니를 형성하는 줄기 세포의 형상은 반드시 유지되지 않는다. 예를 들면, 도 1은 ES 세포 콜로니의 소괴화물인 단일 ES 세포를 명시야 현미경으로 관찰해 취득한 화상(명시야 화상. 단일 ES 세포 영역에 부호 W가 붙어 있음)이지만, 도 1에 의하면, 상기 단일 ES 세포의 세포핵은 치우치며 세포질의 두께도 불균일하다.
그 때문에, 세포 소괴를 형성하는 줄기 세포에 대해서는 「세포핵의 내측의 광로 길이 ＜ 세포핵의 외측의 광로 길이」는 성립하지 않는다고 생각되고 있었다.
한편, 분화 세포의 세포질 영역의 평균 광로 길이가 핵 영역의 평균 광로 길이보다도 낮은 것, 콜로니 중의 각 hiPS 세포에서의 세포질 영역의 평균 광로 길이가 핵 영역의 평균 광로 길이보다도 큰 것은 알려져 있었지만(도 13), 상술한 바와 같이, hiPS 세포 콜로니를 소괴화하면 「세포핵의 내측의 광로 길이 ＜ 세포핵의 외측의 광로 길이」는 성립하지 않는다고 예상되었다.
그런데, 본 발명자들은 세포 소괴를 형성하는 줄기 세포에 대해서도, 형상에 의하지 않고 「세포핵의 내측의 광로 길이 ＜ 세포핵의 외측의 광로 길이」가 성립하는 것을 알아내어, 세포핵 영역의 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교하여 세포 소괴를 형성하는 세포가 줄기 세포인지 여부를 판정할 수 있는 것을 알았다.
본 발명은 이 뜻밖의 지견에 근거하는 것으로, 세포 소괴를 형성하는 세포가 줄기 세포인지 여부를 판정하는 세포 판정 방법, 세포 판정 장치 및 세포 판정 프로그램을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 목적을 달성하는 본 발명은 세포 소괴의 광로 길이 화상을 취득하는 취득 단계와, 취득한 광로 길이 화상 중의 세포핵 영역을 추출하는 추출 단계와, 추출한 세포핵 영역의 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교하는 비교 단계와, 비교한 결과에 근거해 세포가 줄기 세포인지 여부를 판정하는 판정 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 세포 판정 방법이다.
또, 본 발명은 세포 소괴의 광로 길이 화상을 취득하는 취득 수단과, 취득한 광로 길이 화상 중의 세포핵 영역을 추출하는 추출 수단과, 추출한 세포핵 영역의 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교하는 비교 수단과, 비교한 결과에 근거해 세포가 줄기 세포인지 여부를 판정하는 판정 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 세포 판정 장치이다.
추가로 본 발명은 컴퓨터를 세포 소괴의 광로 길이 화상을 취득하는 취득 수단, 취득한 광로 길이 화상 중의 세포핵 영역을 추출하는 추출 수단, 추출한 세포핵 영역의 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교하는 비교 수단, 비교한 결과에 근거해 세포가 줄기 세포인지 여부를 판정하는 판정 수단으로서 기능시키기 위한 프로그램이다.
본 발명에서의 「세포 소괴」는 200개 이하의 세포를 포함한 세포 집단을 의미하고, 「줄기 세포」는 복수 계통의 세포로 분화하는 능력(다분화능) 및 세포 분열을 거쳐도 다분화능을 유지할 수 있는 능력(자기 복제능)을 가지는 세포를 의미한다.
또, 「광로 길이」는 「위상차」 또는 「광학 두께」와 동일한 의미이며, 「굴절률」에 「물리적 두께」를 곱한 것이다(광로 길이 = 굴절률×물리적 두께). 그리고, 「광로 길이 화상」이란 광로 길이를 취득 가능한 화상이다.
세포 소괴를 형성하는 줄기 세포에 대해서는 형상에 의하지 않고 「세포핵 영역의 내측의 광로 길이 ＜ 세포핵 영역의 외측의 광로 길이」가 성립하므로, 본 발명에 의해 세포 소괴를 형성하는 세포에 대해서도 줄기 세포인지 여부를 판정할 수 있다.
또, 세포 소괴가 다능성 줄기 세포, 예를 들면 iPS 세포 또는 ES 세포의 콜로니의 소괴화물인 경우에는 판정의 결과에 근거하여, 그 소괴화물, 예를 들면 증식시켜 다능성 줄기 세포 콜로니로 하는데 적당한 것, 유전자 클로닝에 적당한 것을 선택해 사용할 수 있다.
또, 세포 소괴는 단일 세포여도 된다. 취득한 광로 길이 화상 중의 단일 세포 영역을 추출하는 제2 추출 단계를 추가로 구비하는 본 발명의 세포 판정 방법에 의해, 단일 세포 영역만을 추출하는 것이 가능해진다. 상기 세포 판정 방법은 취득한 광로 길이 화상 중의 단일 세포 영역을 추출하는 제2 추출 수단을 추가로 구비하는 본 발명의 세포 판정 장치로 실시할 수 있다.
본 발명에 의하면, 세포 소괴를 형성하는 세포가 줄기 세포인지 여부를 판정할 수 있다.
도 1은 단일 ES 세포의 명시야 화상이다.
도 2는 단일 ES 세포의 정량 위상 화상이다.
도 3은 단일 ES 세포의 광로 길이를 휘도로 표현한 3차원 플롯 화상이다.
도 4는 항nanog 항체에 의해 면역 염색한 ES 세포 소괴의 화상이다.
도 5는 ES 세포 소괴를 형성하는 ES 세포의 광로 길이의 그래프(도 중 (A)) 및 CN비의 그래프(도 중 (B))이다.
도 6은 항nanog 항체에 의해 면역 염색한 분화 세포 소괴의 화상이다.
도 7은 분화 세포 소괴를 형성하는 분화 세포의 광로 길이의 그래프(도 중 (A)) 및 CN비의 그래프(도 중 (B))이다.
도 8은 사이토미터(1)의 구성도이다.
도 9는 세포 판정 장치(D)의 하드웨어적 구성을 나타내는 개요도이다.
도 10은 세포 판정 장치(D)의 기능적 구성을 나타내는 개요도이다.
도 11은 세포 판정 방법의 플로차트이다.
도 12는 줄기 세포 콜로니의 줄기 세포의 정량 위상 화상이다.
도 13은 CHO 세포, HeLa 세포, OC 세포 및 hiPS 세포의 명시야 화상(도 중 (A) 상란) 및 정량 위상 화상(도 중 (A) 하란), 세포핵과 세포질의 광로 길이의 그래프(도 중 (B)) 및 광로 길이비(세포질/핵)의 그래프(도 중 (C))이다.
본 발명은 세포 소괴를 형성하는 줄기 세포에 대해서도, 형상에 의하지 않고 「세포핵 영역의 내측의 광로 길이 ＜ 세포핵 영역의 외측의 광로 길이」가 성립한다는 뜻밖의 지견에 근거하는 것이므로, 우선 이 지견에 대해 설명한다.
도 2는 단일 ES 세포를 정량 위상 현미경으로 관찰해 취득한 화상(정량 위상 화상)이며(부호 W가 붙어 있음), 도 3은 상기 단일 ES 세포의 광로 길이를 휘도로 표현한 3차원 플롯 화상이다. 도 3의 가로축(X 및 Y 방향)은 모두 화소(픽셀)의 개수를 나타내고, 그리고 세로축(Z 방향)은 휘도를 나타낸다. 세로축의 수치가 클수록 휘도가 크고, 광로 길이가 작은 것을 나타낸다.
도 3으로부터, 줄기 세포 콜로니의 줄기 세포와 같은 형상을 갖지 않는 단일 ES 세포여도 「세포핵 영역의 내측의 광로 길이 ＜ 세포핵 영역의 외측의 광로 길이」가 성립하는 것을 알 수 있다.
또, 도 4 및 도 5로부터, ES 세포 소괴에서는 「세포핵 영역의 내측의 광로 길이 ＜ 세포핵 영역의 외측의 광로 길이」, 즉 「세포핵 영역의 외측의 광로 길이/세포핵 영역의 내측의 광로 길이」(CN비)가 1보다 크다는 것을 알 수 있고, 도 6 및 도 7로부터, 레티노인산으로 ES 세포로부터 유도한 분화 세포 소괴(분화 세포 소괴)에서는 CN비가 1보다 작은 것을 알 수 있다.
도 4는 미분화 마커인 항nanog 항체에 의해 면역 염색한 ES 세포 소괴의 화상이며, 화상의 밝은 영역이 ES 세포 소괴를 형성하는 ES 세포에 대응하고 있다. 그리고, 도 5는 동일한 ES 세포 소괴를 형성하는 세포의 광로 길이의 그래프(도 중 (A)) 및 CN비의 그래프(도 중 (B))이며, 도 5로부터 계산하면, ES 세포 소괴를 형성하는 ES 세포에서는 CN비 = 1.06±0.0642(n=34. ±의 값은 표준 편차)가 된다. 도 4와 도 5를 대비하면, ES 세포 소괴를 형성하는 세포의 CN비가 1보다 큰 것을 알 수 있다.
한편, 도 6은 미분화 마커인 항nanog 항체에 의해 면역 염색한, 레티노인산으로 ES 세포로부터 유도한 세포 소괴의 화상이며, 화상의 밝은 영역이 없는 점에서, 이 세포 소괴는 분화 세포 소괴인 것이 확인된다. 그리고, 도 7은 동일한 분화 세포 소괴를 형성하는 세포의 광로 길이의 그래프(도 중 (A) 및 CN비의 그래프(도 중 (B))이며, 도 7로부터 계산하면, 분화 세포 소괴를 형성하는 분화 세포에서는 CN비 = 0.973±0.122(n=27. ±의 값은 표준 편차)가 된다. 도 6과 도 7을 대비하면, 분화 세포 소괴를 형성하는 분화 세포의 CN비가 1보다 작은 것을 알 수 있다.
다음에, 본 발명의 세포 판정 방법, 세포 판정 장치 및 세포 판정 프로그램의 바람직한 실시 형태를 상세하게 설명한다. 또한 도면의 설명에서 동일한 요소에는 동일한 부호를 붙여, 중복되는 설명을 생략한다.
(세포 소괴)
「세포 소괴」는 200개 이하의 세포를 포함한 세포 집단을 의미한다. 세포의 개수는 1개여도 되고 2개 이상이어도 되지만, 1~100개, 특히 1~60개, 특히 1~20개이다. 세포의 개수가 1개일 때, 세포 소괴는 단일 세포이다. 세포 소괴는 아폽토시스 저해제(예를 들면 ROCK 저해제) 부존재 하에서 증식할 수 없는 것도 포함한다.
세포 소괴는 줄기 세포를 포함하고 있어도 되고(줄기 세포 소괴), 특히 줄기 세포만으로 이루어지는 것이어도 된다. 단일 줄기 세포는 줄기 세포의 개수가 1개이고, 또한 줄기 세포 이외의 세포를 포함하지 않는 세포 소괴이다. 세포 소괴에 포함되는 줄기 세포 이외의 세포에는, 예를 들면 분화 세포가 있다.
「줄기 세포」는 복수 계통의 세포로 분화하는 능력(다분화능) 및 세포 분열을 거쳐도 다분화능을 유지할 수 있는 능력(자기 복제능)을 가지는 세포를 의미한다. 줄기 세포로서는, 예를 들면 ES 세포, iPS 세포, 간엽계 줄기 세포 등의 다능성 줄기 세포를 들 수 있고, 또 줄기 세포는 인간 줄기 세포뿐만이 아니라, 마우스, 원숭이, 토끼, 개, 고양이 등의 줄기 세포여도 된다.
세포 소괴는 줄기 세포 콜로니의 소괴화물이어도 된다. 줄기 세포 콜로니의 소괴화물로서는 물리적 또는 화학적 수단에 의해 줄기 세포 콜로니를 소괴화한 것, 예를 들면 피펫팅한 것, 트립신, 아큐타제 등의 효소로 처리한 것을 들 수 있다. 줄기 세포 콜로니의 소괴화로 다른 세포와의 접착(접촉)이 일부 또는 전부 끊어진 줄기 세포는 통상 줄기 세포 콜로니를 형성하고 있었을 때의 형상을 유지하고 있지 않다.
다능성 줄기 세포 콜로니의 소괴화물에는 증식해 다시 다능성 줄기 세포 콜로니를 형성할 수 있는 것도, 증식해 다시 다능성 줄기 세포 콜로니를 형성할 수 없는 것도 포함된다.
세포 소괴의 취득 방법으로 제한은 없지만, 세포 소괴의 취득 방법으로서는 줄기 세포 콜로니를 소괴화해 세포 소괴로 하는 방법을 들 수 있고, 이 소괴화는 줄기 세포의 계대시에 실시해도 된다. 상술한 바와 같이, 소괴화 수단에는 물리적 또는 화학적 수단, 예를 들면 피펫팅, 트립신, 아큐타제 등에 의한 효소 처리가 있다.
(측정 시료)
다음에, 세포 소괴를 측정 시료(S)로 한다. 측정 시료(S)는, 예를 들면 세포 소괴를 포함한 용액을 슬라이드 챔버에 주입해 준비한다. 다능성 줄기 세포의 소괴는 통상 슬라이드 챔버에 접착(접촉)시킨다.
(사이토미터)
다음에, 사용하는 사이토미터(1)의 구성에 대해 설명한다. 도 8은 사이토미터(1)의 구성도이다.
도 8에 나타내는 바와 같이, 사이토미터(1)는 주로 정량 위상 현미경(A) 및 세포 판정 장치(D)에 의해 구성된다.
(정량 위상 현미경)
정량 위상 현미경(A)은 광의 입사 측에, 도시하지 않는 광출사(光出射)부로부터의 조사광(H0)(레이저광)을 유도하는 광파이버(B)의 출사측 단면(B1)에 임하게 한 렌즈(A2)와, 이 렌즈(A2)를 투과하는 조사광(H0)을 반사하는 반사부(A3)를 구비한다. 한편, 정량 위상 현미경의 광의 출사 측에는 광간섭부(A7)에서 생성되는 간섭 무늬(도시하지 않음, 이하 동일)를 촬상하여 화상으로 하는 CCD 카메라 등의 촬상 장치(C)가 마련된다.
정량 위상 현미경(A)은 측정 시료(S)를 지지하는 시료대(A4), 대물렌즈(A5), 반사부(A6), 광간섭부(A7)를 구비하는 현미경 본체(A1)를 구비한다.
시료대(A4)는, 예를 들면 중앙에 광을 투과 가능한 광투과부(A41)를 구비함과 함께, 상향면에 측정 시료(S)를 재치 가능한 재치면(A42)을 가지는 대략 판상인 것이다. 재치면(A42)에 측정 시료(S)를 재치한 상태로 윗쪽에서 광을 조사함으로써, 측정 시료(S)를 투과한 광(피측정광(H1))이 광투과부(A41)를 투과해 대물렌즈(A5)로 향하도록 하고 있다. 또한 광투과부(A41)는, 예를 들면 유리 등의 광을 투과 가능한 부재로부터 형성한 것이어도 되고, 단순한 구멍이어도 된다. 대물렌즈(A5)는, 예를 들면 조작부(도시하지 않음)의 조작에 근거하여, 입사해 오는 피측정광(H1)을 그 조작과 관련된 소정의 배율로 확대시켜 평행광으로서 출사하는 것이다. 반사부(A6)는, 예를 들면 전반사형의 미러로서, 대물렌즈(A5)로부터의 피측정광(H1)을 전반사시켜 광간섭부(A7)에 도입할 수 있도록 하고 있다. 광간섭부(A7)는 피측정광(H1)을, 2개의 광(H1a, H1b)로 분리하는 광 분리 소자(A71)와 이 광 분리 소자(A71)가 출사하는 피측정광(H1)(H1a, H1b)을 수렴광 H2(H2a, H2b)로 변환하는 집광렌즈(A72)와 수렴광(H2)의 수렴 위치에 배치한 공간 필터(A73)와, 공간 필터(A73)를 투과한 물체광(H3)와 참조광(H4)을 포개어 겹쳐 간섭 무늬를 생성하는 합성 렌즈(A75)를 구비하는 것이다. 여기서, 광 분리 소자(A71)는 회절 격자를 이용해 구성한 것이다. 나아가서는 광 분리 소자(A71)는 편광 방향이 서로 상이한 2개의 광으로 분리하는 편광 분리 소자여도 된다. 그 경우, 광간섭부(A7)는 피측정광(H1)을 편광 방향이 서로 상이한 2개의 광(H1a, H1b)으로 분리하는 광 분리 소자(A71)와, 수렴광(H2)(H2a, H2b)로 변환하는 집광렌즈(A72)와, 수렴광(H2)의 수렴 위치에 배치한 공간 필터(A73)와, 공간 필터(A73)를 투과한 물체광(H3)과 참조광(H4)과, 이 공간 필터(A73)의 출사 측에 배치한 반파장판(A74)과 이 반파장판(A74)에 의해 편광 방향을 정렬된 물체광(H3)과 참조광(H4)을 포개어 겹쳐 간섭 무늬를 생성하는 합성 렌즈(A75)를 구비하는 것이다. 혹은 공간 필터(A73)의 출사 측에 배치한 반파장판(A74)을 대신하여 편광자를 배치해 물체광(H3)과 참조광(H4)의 편광 방향을 정렬해도 된다.
(세포 판정 장치)
세포 판정 장치(D)의 구성에 대해 설명한다. 도 9는 세포 판정 장치(D)의 하드웨어적 구성을 나타내는 개요도이며, 도 10은 세포 판정 장치(D)의 기능적 구성을 나타내는 개요도이다.
도 9에 나타내는 바와 같이, 세포 판정 장치(D)는 물리적으로는 CPU D11, ROM D12 및 RAM D13 등의 주기억 장치, 키보드 및 마우스 등의 입력 디바이스(D14), 디스플레이 등의 출력 디바이스(D15), 예를 들면 촬상 장치(C) 등의 다른 장치와의 사이에 데이터의 송수신을 실시하기 위한 네트워크 카드 등의 통신 모듈(D16), 하드 디스크 등의 보조기억장치(D17) 등을 포함한 통상의 컴퓨터로서 구성된다. 후술하는 세포 판정 장치(D)의 각 기능은 CPU D11, ROM D12, RAM D13 등의 하드웨어상에 소정의 컴퓨터 소프트 웨어를 읽게 함으로써, CPU D11의 제어 하에서 입력 디바이스(D14), 출력 디바이스(D15), 통신 모듈(D16)을 동작시키는 것과 함께, 주기억 장치(D12, D13) 및 보조기억장치(D17)에서의 데이터의 판독 및 기입을 실시함으로써 실현된다.
도 10에 나타내는 바와 같이, 세포 판정 장치(D)는 기능적 구성요소로서 취득 수단(D1), 추출 수단(D2), 비교 수단(D3), 판정 수단(D4), 및 표시 수단(D5)을 구비한다.
취득 수단(D1)은 촬상 장치(C)로부터의 화상(정량 위상 화상)을 취득하는 것이다. 추출 수단(D2)은 취득한 정량 위상 화상 중의 세포핵 영역을 추출하는 것이다. 정량 위상 화상 중에서 단일 세포 영역을 추출하는 경우, 세포 판정 장치(D)는 취득한 정량 위상 화상 중의 단일 세포 영역을 추출하는 제2 추출 수단(도시하지 않음)을 추가로 구비한다. 비교 수단(D3)은 추출한 세포핵 영역의 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교하는 것이다. 판정 수단(D4)은 비교한 결과에 근거해 세포가 줄기 세포인지 여부를 판정하는 것이다. 표시 수단(D5)은 판정한 결과를 표시하는 것이다.
(세포 판정 프로그램)
세포 판정 프로그램은 컴퓨터를 상술한 취득 수단(D1), 추출 수단(D2), 비교 수단(D3), 판정 수단(D4), 및 표시 수단(D5)으로서 기능시키는 것이다. 컴퓨터로 세포 판정 프로그램을 읽게 함으로써, 컴퓨터는 세포 판정 장치(D)로서 동작한다. 세포 판정 프로그램은, 예를 들면 기록 매체에 격납되어 제공된다. 또한 기록 매체로서는 플렉서블 디스크, CD, DVD 등의 기록 매체, ROM 등의 기록 매체, 또는 반도체 메모리 등이 예시된다.
(세포 판정 방법)
세포 판정 장치(D)에 의해 실시되는 세포 판정 방법에 대해 설명한다. 도 11은 세포 판정 방법의 플로차트이다. 세포 판정 장치(D)에 의해 실시되는 세포 판정 방법에 의해, 세포 소괴를 형성하는 세포가 줄기 세포인지 여부의 판정을 정량적, 또한 자동적으로 정밀도 높게 실시할 수 있다. 지금까지 세포가 줄기 세포인지 여부는 판정자에 의해 주관적으로 판정되고 있었지만, 판정자에 의하지 않고 객관적으로 판정할 수 있게 된다. 즉, 판정자의 주관, 몸의 상태, 판정자 사이의 차이라는 애매한 요소를 배제할 수 있고, 판정자의 기능에 의하지 않는 일정한 판단 기준에 근거한 세포의 판정을 실시하는 것이 가능하게 된다.
[취득 단계(S1)]
최초로, 취득 수단(D1)이 촬상 장치(C)로부터 세포 소괴의 정량 위상 화상을 취득한다. 필요에 따라 정량 위상 화상의 화상 처리, 예를 들면 확대, 축소, 휘도 조정, 변환을 실시해도 된다.
[추출 단계(S2)]
다음에, 추출 수단(D2)이 취득한 정량 위상 화상 중의 세포핵 영역을 추출한다. 추출 수단에는 특별히 제한은 없지만, 정량 위상 화상의 휘도가 광로 길이에 비례하는 것인 경우, 정량 위상 화상으로부터 세포핵 영역을 추출하는 것도 가능하다. 또, 동일한 세포 소괴를 다른 현미경으로 관찰해 취득한 화상, 예를 들면 동일한 세포 소괴의 명시야 화상으로부터 세포핵 영역을 추출해, 거기에 대응하는 정량 위상 화상 중의 세포핵 영역을 추출하도록 해도 된다.
세포 소괴가 2개 이상의 세포로 이루어지고, 정량 위상 화상 중에 그 2개 이상의 세포의 화상이 포함되는 경우에는 정량 위상 화상 중의 2개 이상의 세포의 세포핵 영역을 추출하도록 해도 된다.
정량 위상 화상 중으로부터 단일 세포 영역을 추출하는 경우, 취득한 정량 위상 화상 중의 단일 세포 영역을 추출하는 제2 추출 단계를 추가로 구비한다. 제2 추출 수단은 정량 위상 화상 중에 존재하는 독립된 세포 영역의 면적을 산출하고, 그 면적이 미리 설정한 단일 세포 영역의 면적보다도 작을 때는 그 세포 영역을 단일 세포 영역으로 판정해 추출하며, 반대로 미리 설정한 단일 세포 영역의 면적보다도 클 때는 그 세포 영역을 단일 세포 영역이 아니라고 판정해 추출하지 않게 하는 것이다.
또, 사이토미터(1)가 간섭 반사 현미경을 구비하는 경우에는 슬라이드 챔버에 접착(접촉)하고 있는 세포 소괴의 영역만을 추출할 수도 있다.
[비교 단계(S3)]
다음에, 비교 수단(D3)이 추출 단계(S2)에서 추출한 세포핵 영역의 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교해, 그 결과를 추출한다. 비교 수단(D3)은 「세포핵 영역의 외측의 광로 길이/세포핵 영역의 내측의 광로 길이」(CN비)의 값을 결과적으로 추출할 수도 있다.
세포 소괴가 2개 이상의 세포로 이루어지고, 정량 위상 화상 중에 그 2개 이상의 세포의 화상이 포함되는 경우에는 그 2개 이상의 세포에 대해서, 비교의 결과를 추출하도록 해도 된다.
[판정 단계(S4)]
다음에, 판정 수단(D4)이 비교 단계(S3)에서 추출한 비교의 결과에 근거해 세포가 줄기 세포인지 여부를 판정한다. 판정 수단(D4)은 비교 단계(S3)의 비교의 결과가 세포핵 영역의 내측의 광로 길이과 비교해 외측의 광로 길이가 큰 경우, 즉 「세포핵 영역의 내측의 광로 길이 ＜ 세포핵 영역의 외측의 광로 길이」의 경우에 세포를 줄기 세포로 판정하고, 세포핵 영역의 내측의 광로 길이과 비교해 외측의 광로 길이가 작은 경우, 즉 「세포핵 영역의 내측의 광로 길이 ＞ 세포핵 영역의 외측의 광로 길이」의 경우에 세포가 줄기 세포가 아니라고 판정한다. 비교한 결과가 CN비일 때는 CN비가 1보다 큰 경우, 세포를 줄기 세포로 판정하고, CN비가 1보다 작은 경우, 세포가 줄기 세포가 아니라고 판정한다.
또, CN비에 근거해 세포의 분화도를 판정할 수도 있다. 그 값이 1보다 큰 경우, 세포의 분화도도 낮아지고, 그 값이 1보다 작은 경우, 세포의 분화도도 높아진다.
세포 소괴가 2개 이상의 세포로 이루어지고, 정량 위상 화상 중에 그 2개 이상의 세포의 화상이 포함되는 경우에는 2개 이상의 세포에 대해서, 줄기 세포인지 여부를 판정하도록 해도 되고, 세포 소괴 중의 줄기 세포의 비율을 판정하도록 해도 된다.
[표시 단계(S5)]
다음에, 표시 수단(D5)이 판정 단계(S4)에서 판정한 결과를 표시한다. 예를 들면, 세포가 줄기 세포인지 여부, 「세포핵 영역의 외측의 광로 길이/세포핵 영역의 내측의 광로 길이」의 값, 세포의 분화도 등이 표시 수단(D5)에 의해서 표시된다.
(판정 종료 후)
판정 종료 후의 세포 소괴는 폐기해도 되고, 다른 목적으로 사용해도 된다.
특히, 세포 소괴가 다능성 줄기 세포, 예를 들면 iPS 세포 또는 ES 세포의 콜로니의 소괴화물인 경우에는 판정의 결과에 근거하여 소괴화물, 예를 들면 증식시켜 다능성 줄기 세포 콜로니로 하는데 적당한 것, 유전자 클로닝에 적당한 것을 선택해 사용할 수 있다.
이상, 광로 길이 화상이 정량 위상 화상인 실시 형태에 대해 상세하게 설명했지만, 광로 길이 화상은 정량 위상 화상으로 한정되는 것은 아니다. 광로 길이 화상은 광로 길이가 취득 가능한 화상이면 되기 때문에, 광로 길이 화상은 위상차 현미경을 사용해 취득한 화상, 예를 들면 위상차 콘트라스트 현미경의 화상(위상차 콘트라스트 화상)이어도 된다. 이 경우에는 장치가 염가가 되어, 코스트 절약으로 이어진다.
또한 도 1~도 3의 화상을 취득하는데 사용한 단일 ES 세포는 다음과 같이 취득했다.
인간 ES 세포(khES3)를 mTeSR1 배지(스템셀 테크놀로지스사 제. 등록상표)로, 마트리겔(벡톤 딕킨손사 제. 등록상표)을 기질로서 배양하여, 인간 ES 세포의 콜로니를 형성시켰다. 그 후 세포를 기질로부터 떼어 0.25% 트립신으로 처리해 인간의 단일 ES 세포를 배지에 분산시켰다. 배지에는 ROCK 저해제(Y27632: 트랜스-4-[(1R)-1-아미노에틸]-N-4-피리디닐시클로헥산카복사마이드2염산염) 10μM를 가했다. 단일 ES 세포의 상태로 3시간 정도 배양해 디쉬 바닥면에 접착시켰다.
W…단일 ES 세포, 1…사이토미터, A…정량 위상 현미경, A1…현미경 본체, B…광파이버, C…촬상 장치, D…세포 판정 장치, D1…취득 수단, D2…추출 수단, D3…비교 수단, D4…판정 수단, D5…표시 수단.

Claims (9)

  1. 다능성 줄기 세포 콜로니의 소괴화물인 세포 소괴의 광로 길이 화상을 취득하는 취득 단계와,
    취득한 광로 길이 화상 중의 세포핵 영역을 추출하는 추출 단계와,
    추출한 세포핵 영역의 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교하는 비교 단계와,
    비교한 결과에 근거해 세포가 다능성 줄기 세포인지 여부를 판정하는 판정 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 세포 판정 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 다능성 줄기 세포는 iPS 세포 또는 ES 세포인 세포 판정 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 세포 소괴는 단일 세포인 세포 판정 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    취득한 광로 길이 화상 중의 단일 세포 영역을 추출하는 제2 추출 단계를 추가로 구비하는 세포 판정 방법.
  5. 다능성 줄기 세포 콜로니의 소괴화물인 세포 소괴의 광로 길이 화상을 취득하는 취득 수단과,
    취득한 광로 길이 화상 중의 세포핵 영역을 추출하는 추출 수단과,
    추출한 세포핵 영역의 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교하는 비교 수단과,
    비교한 결과에 근거해 세포가 다능성 줄기 세포인지 여부를 판정하는 판정 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 세포 판정 장치.
  6. 청구항 5에 있어서,
    취득한 광로 길이 화상 중의 단일 세포 영역을 추출하는 제2 추출 수단을 추가로 구비하는 세포 판정 장치.
  7. 컴퓨터를,
    세포 소괴의 광로 길이 화상을 취득하는 취득 수단,
    취득한 광로 길이 화상 중의 세포핵 영역을 추출하는 추출 수단,
    추출한 세포핵 영역의 내측의 광로 길이 및 외측의 광로 길이를 비교하는 비교 수단,
    비교한 결과에 근거해 세포가 줄기 세포인지 여부를 판정하는 판정 수단으로서 기능시키기 위한, 매체에 저장된 세포 판정 프로그램.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 컴퓨터를,
    취득한 광로 길이 화상 중의 단일 세포 영역을 추출하는 제2 추출 수단으로서 추가로 기능시키는 것을 포함하는, 매체에 저장된 세포 판정 프로그램.
  9. 삭제
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