JP5947623B2 - 抗がん剤の効果増強剤 - Google Patents
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Description
(1)リバビリン又はそのプロドラッグ若しくは誘導体を有効成分として含有する抗がん剤効果増強剤。
(2)本発明の第二の態様として、上記(1)の抗がん剤効果増強剤は、1以上の抗がん剤と組み合わせて併用療法に用いられる。
(3)上記1以上の抗がん剤には、以下の薬剤が含まれる:
(i)微小管作用抗がん薬
(ii)アルキル化薬
(iii)抗腫瘍性抗生物質
(iv)白金製剤
(v)代謝拮抗薬
(vi)トポイソメラーゼ阻害剤。
(4)抗がん剤は微小管作用抗がん薬であることができる。
(5)微小管作用抗がん薬はタキサン系抗がん剤であることができる。
(6)微小管作用抗がん薬はドセタキセル又はパクリタキセルであってもよい。
(7)本発明の第三の態様として、上記(1)の抗がん剤効果増強剤を、難治性のがんの併用療法に用いることができる。
(8)難治性のがんは、化学療法抵抗性のがんであることができる。
(9)本発明の第四の態様として、上記(1)の抗がん剤効果増強剤を、化学療法抵抗性の前立腺がんの併用療法に用いることができる。
(10)上記第四の態様において、抗がん剤効果増強剤は、微小管作用抗がん薬と組み合わせて、化学療法抵抗性の前立腺がんの併用療法に用いられてもよい。
(11)上記第四の態様において、抗がん剤効果増強剤は、ドセタキセルと組み合わせて、化学療法抵抗性の前立腺がんの併用療法に用いられてもよい。
(12)本発明の第五の態様は、リバビリン又はそのプロドラッグ若しくは誘導体を抗がん剤と共にがん患者に投与することを含む、がん患者において抗がん剤の効果を増強させる方法である。
(13)上記方法において、リバビリン又はそのプロドラッグ若しくは誘導体と抗がん剤は、
(イ)別々の投薬形態で、同時(一部同時、逐次を含む)に投与される;
(ロ)別々の投薬形態が、時間をおいて投与される;あるいは
(ハ)単一の投与形態で投与される。
「難治性のがん(refractory cancer)」は広い意味で使用され、標準的な治療(外科療法・化学療法・放射線療法)では治療が困難と診断される種々の状態のがんを指す。例えば、全身にがんが転移している場合、または、がん細胞の性質自体が放射線や薬物を用いた療法に抵抗性を示す場合が含まれる。後者は、治療に反応しないという意味で、一般的に抵抗性あるいは耐性(resistant)のがんと称されることもある。がんは、治療初期から抵抗性である場合もあれば、治療を実施している間に抵抗性になる場合もある。用語「難治性のがん」は、悪性度(malignancy)の高いがん(悪性のがん)と同義であることが多い。
したがって、本発明は、リバビリンの新たな医薬用途を提供することを特徴とする。具体的には、本発明では、リバビリン又はそのプロドラッグ若しくは誘導体を、抗がん剤の効果増強剤としてがんの治療に使用する。
リバビリンは、1-β-D-リボフラノシル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド(分子式:C8H12N4O5):
・(i)微小管作用抗がん薬:(a)ビンアルカロイド;(b)タキサン;(c)エポチロン;(d)その他
・(ii)アルキル化薬
・(iii)抗腫瘍性抗生物質
・(iv)白金製剤
・(v)代謝拮抗薬:(a)フッ化ピリミジン誘導体;(b)シチジン誘導体;(c)プリン拮抗薬;(d)葉酸拮抗薬
・(vi)トポイソメラーゼ阻害剤:(a)トポイソメラーゼI阻害剤;(b)トポイソメラーゼII阻害剤
がん種や症状によって、これらの抗がん剤の好適な用法・用量は異なるが、詳細な情報は米国FDA、日本医薬品医薬機器情報提供ホームページ等、容易にアクセス可能なソースにより入手可能である。但し、本発明において、抗がん剤の適応はこの表に記載されたものに限定されない。リバビリンと併用する抗がん剤は、目的とするがん種に通常用いられる抗がん剤、特に標準療法に用いられる抗がん剤であることが好ましい。例えば、将来的にある特定のがん種の標準療法に用いられるようになった抗がん剤との併用も本発明の範囲内である。標準療法に用いられる抗がん剤(標準治療薬)は、疾患への適応が当局に承認された薬剤であることが望ましいが、効能が公知で、国内では未承認の薬剤であってもよい。また、標準療法自体が、2以上の薬剤の併用による療法であってもよい。そのような標準療法に使用される1又は2以上の抗がん剤に加えて、リバビリンを併用することによって、目的とするがん種の治療において、治療効果の増強が期待できる。
細胞株および培養
5%CO2、37℃の加湿雰囲気下、10%FBSを補充したRPMI-1640(Invitrogen, Carlsbad, CA)中で、前立腺がん細胞株であるDU145およびLNCaP細胞を継代培養した。
DU145-PGK、DU145-GFP、sh-OCT4 DU145-EOS、sh-luci DU145-EOSの各細胞を回収し、PBSで洗浄し、Matrigel(BD Biosciences)中で再懸濁した。103または104個の細胞を6週齢のBALB/Cヌードマウスの側腹部に皮下注射した。注射後5日ごとに腫瘍を測定した。
前立腺がん株化細胞を96ウェルプレートで平板培養し、24時間接着させ、薬剤(ドセタキセル、リバビリン)で処理した。培養期間の終わりに、水溶性テトラゾリウム(WST)試薬を各ウェルに添加し、1時間インキュベートした。570nmに設定したプレートリーダーを使用することによって、細胞の生死を比色法で判別した。
全細胞抽出物および核抽出物を、標準的な方法で得た。ウェスタンブロット分析のためにブロットを一晩、抗OCT4抗体、抗βアクチン(Sigma,St. Louis, MO)および抗ラミン(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)抗体とともに培養した。強化化学発光試薬(ECL Plus Western Blotting Detection System; Amersham Pharmacia Biotech)によって信号を検知し、LAS3000システム(富士フィルム、東京)を用いて分析した。
RNA全量をRNeasy Mini kit (Qiagen)を用いて単離した。High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems)を用いて、RNAからcDNAへの逆転写を行った。続いて、その反応混合物(1μL)を、TaqMan Fast real-time quantitative PCR assayおよび7500 Fast Real-time PCR system (Applied Biosystems)においてテンプレートとして用いた。ヒトOCT4およびGAPDH固有コントロール(Hs99999903_m1)のプライマーおよびTaqMan プローブセット (TaqMan Gene Expression Assays)をApplied Biosystemsから購入した(配列は開示されていない)。試料ごとに、GAPDH mRNAに対する各因子の相対発現の比率を計算し、相対mRNA発現量を評価した。
OCT4の発現と臨床病理学的特性との関連は、χ2(カイ二乗)検定によって評価された。臨床的因子の各状態におけるOCT4発現レベルの差は、Mann-Whitney U-testにより評価された。無再発生存期間(RFS)曲線は、Kaplan-Meier法によって算出した。Cox比例ハザード回帰分析を使って、年齢、pT stage、グリソンスコア(Gleason Score: GS)およびOCT4発現について予後指標であるかを評価した。統計的有意水準をp<0.05に設定した。これらの分析は、SPSS version 17.0の統計ソフトウェアパッケージ(SPSS Corporation, Chicago, IL)で行った。計測実験は、3回以上の反復試験(replicate)として行われた。スチューデントt検定によるp<0.05を示す項目間は統計的有意差ありと認められた。
腫瘍細胞の薬物抵抗性は不均一であり、がん幹細胞では薬物抵抗性および/または悪性度の上昇が見られることが予測される。Yamanakaらは、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCという4個の転写因子(4TF)が体細胞における多能性を誘導することを示した(Takahashiら、2007;TakahashiおよびYamanaka、2006)。人工多能性幹(iPS)細胞は、適切な誘導に続いてあらゆる種類の細胞に分化し得る。しかし、これらの細胞を未分化状態で動物に導入すると、未分化腫瘍を引き起こす可能性がある(Miuraら、2009、Nat Biotechnol 27, 743-745;MurryおよびKeller、2008、Cell 132, 661-680)。これは、4TFのうち一部の転写因子が体細胞内で腫瘍形成能を強化することを示唆している。
現在、予後予測のためにPCA(前立腺がん)を層別化する方法は、グリソン分類、前立腺特異抗原(PSA)レベルおよび病期(ステージ)等の臨床病理学的要素を基に構成されている。これらの要素は有用だが不十分だという認識に端を発し、PCAの進行に関して、患者の管理を改善し新たな治療目標をもたらすバイオマーカーの特定を目標とした遺伝子学的および生物学的分析が行われている。
試料は、慶応大学病院でPCAと診断された患者118人から採取された。患者の中で、手術の前にホルモン療法を受けた者はいない。再発は、連続三回にわたる測定における、血清PSA(前立腺特異抗原)レベルの上昇によって決定した。検体の組織学的所見は、病理学者2名が個別にHE染色法を用いて評価した。調査参加者全員からインフォームドコンセントを得て、調査計画への承認を倫理委員会で受けた。
2.355×病理学的Tステージ+1.404×OCT4。
腫瘍細胞における高OCT4発現および予後におけるその有意性に関する観察は、高OCT4発現の腫瘍細胞が、高い腫瘍形成能並びに抗がん剤耐性を有することを示唆している。この仮説を実証するために、本発明者らは、ヒトPCA細胞株DU145におけるOCT4発現を分析した。DU145細胞の細胞質および核におけるOCT4発現は低レベルであり(データは示さない)、in vivoであれば進行度の低い前立腺がんに相当すると思われた。
悪性のヒト前立腺がんにおける高レベルのOCT4発現は、OCT4発現が亢進した腫瘍細胞が抗がん剤に対してより強い抵抗を示すことを示唆している。この可能性をin vitroおよびin vivoで確認するために、現在認可されているCRPCの化学療法剤であるドセタキセルを用いて試験を行った。
1×106個のDU145-PGK細胞またはDU145-EOS細胞をヌードマウスに接種し、腫瘍形成を開始させた。5日ごとに腫瘍の大きさを測定した。3週間後、腫瘍の大きさが200mm3に達した時、マウスをコントロール群とドセタキセル処理群(10mg/kg)の2群に分けた。ドセタキセル処理群には、1日目からドセタキセルを腹腔内(IP)投与し、その後の腫瘍の成長を確認した。図4bに、所定の各時点での平均腫瘍体積を示す(n=6、* p<0.01、** p<0.001、# p<0.01)。DU145-PGK細胞を注射され、ドセタキセルを適用された群(DU145 PGK doc 10mg/kg)では、非適用群(DU145 PGK none)と比べて腫瘍体積が大幅に縮小し、ドセタキセル治療が有効であった。しかし、DU145-EOS細胞を注射されたマウス(DU145 EOS doc 10mg/kg)では、非治療群(DU145 EOS none)と比べて腫瘍の規模はわずかに縮小しただけだった。すなわち、OCT4発現が亢進したDU145-EOS細胞により誘導された腫瘍は、ドセタキセル治療に対して抵抗性であった。
腫瘍形成及び化学療法抵抗性についての高OCT4発現の貢献を明らかにするために、DU145-EOS選択細胞におけるOCT4ノックダウン(図5a〜c)、および非選択細胞におけるOCT4強制発現(図5d〜f)の実験を行った。
本発明者らの発見は、高レベルのOCT4発現を示す転移性前立腺がんがドセタキセル治療に耐性であることを示唆する。そこで、本発明者らは、EOS選択細胞を難治性の前立腺がんのモデルとして利用し、そのドセタキセル耐性を克服できる薬剤を探索した。そして、驚くべきことに、抗ウイルス剤として知られる薬剤であるリバビリンが、そのような所望の治療効果を奏することを見出した。
(1)In vitro; 前立腺がん細胞株(DU145、LNCaP)アッセイ
実施例4と同様に、in vitroでDU145-PGKおよびDU145-EOS選択細胞に種々濃度のドセタキセルを添加し、リバビリン適用有と無の場合で、細胞生存率を測定した。結果を図6aに示す。背景細胞群(DU145 PGK)ではリバビリン(Rib)の有無に関わらず、ドセタキセル用量依存的に抗腫瘍効果がみられた。OCT4発現群(DU145 EOS)では、背景細胞群と比べてドセタキセル感受性が悪いが、リバビリンとの併用により、背景細胞群レベルまで抗腫瘍効果が回復した。
(2)In vivo;OCT4発現細胞群(EOS)のXenograftモデル
実施例4と同様に、Xenograftモデルによる試験を行った。ヌードマウスにEOS選択細胞(DU145-EOS、LNCaP-EOS)を注射して腫瘍形成を開始させた。リバビリンの効果をin vivoで分析するために、腫瘍体積の平均が約200 mm3に達した時点でヌードマウスを以下の6群に分けた:薬剤処理無しのコントロール(no treatment)、ドセタキセル単剤10mg/kg投与(Doc 10mg/kg)、ドセタキセル単剤5mg/kg投与(Doc 5mg/kg)、ドセタキセル10mg/kgとリバビリン投与(Doc 10mg/kg + Rib)、ドセタキセル5mg/kgとリバビリン投与(Doc 5mg/kg + Rib)、およびリバビリン単剤投与(Rib)。各群は6〜8匹のマウスからなる。ドセタキセルは1日目から腹腔内に注射した。経口によるリバビリン投与を1日目に開始し、毎日継続した。40μg/kg/日の量で毎日経口投与されたリバビリンは、平均体内濃度が約1μMとなり、マウスによる耐容が良好であり、マウスに対して毒性を持たない(Kentsis et al.、2004年)
ドセタキセル単剤に比べ、リバビリンおよびドセタキセルの両方を投与されたマウスは、腫瘍体積が著しく低減していた(図7a-b、図8a、図8c)。図8aは、ドセタキセルおよびリバビリンの投与から16日後のDU145-EOS腫瘍の2種類の典型例を示す。図8bはこれらの腫瘍組織のHE染色像である。半定量的に壊死領域を推定した(スケールバーは200μm)。図8cと図8dはLNCaP-EOS腫瘍の例である。リバビリン併用マウスの腫瘍では組織の壊死範囲が顕著に大きかった(図8b、図8d)。したがって、ドセタキセル単剤に比べ、リバビリンとの併用はより高い抗腫瘍効果を示すことがin vivoでも確認された。リバビリン単剤投与では、殆ど効果が認められなかった。
EOS選択細胞により誘導された腫瘍に対するリバビリンの有効性を裏付ける機構を評価するために、リバビリンがOCT4発現を変化(modulate)させるか否かを調べた。そのために、異なる濃度のリバビリンの存在下で培養されたDU145-EOS選択細胞のOCT4 mRNA及びタンパク質の発現量を測定した。
Claims (9)
- リバビリンを有効成分として含有する抗がん剤効果増強剤であって、
抗がん剤としてドセタキセルを用いる去勢抵抗性前立腺がんの化学療法において、ドセタキセルの効果を増強するために使用される、抗がん剤効果増強剤。 - 去勢抵抗性前立腺がんが、ドセタキセル抵抗性の癌細胞を含む、請求項1に記載の抗がん剤効果増強剤。
- 前記癌細胞のドセタキセルへの感受性を回復させる、請求項2に記載の抗がん剤効果増強剤。
- ドセタキセルとリバビリンとを組み合わせてなる、去勢抵抗性前立腺がんの治療剤。
- 去勢抵抗性前立腺がんが、OCT4を発現する癌細胞を含む、請求項1から3のいずれかに記載の抗がん剤効果増強剤または請求項4に記載の治療剤。
- ドセタキセルに耐性の転移性前立腺がんの化学療法においてドセタキセル耐性を克服するために使用される、リバビリンを含有する薬剤。
- リバビリンの投与により、前立腺がんの進行に関し患者の管理を改善し新たな治療目標をもたらすバイオマーカーのレベルが低下する請求項6に記載の薬剤。
- リバビリンの投与により、ドセタキセル耐性と相関する腫瘍マーカーのレベルが低下する請求項6に記載の薬剤。
- リバビリンの投与により癌細胞のOCT4発現レベルが低下する、請求項6に記載の薬剤。
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