CN107980802B - 环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用及抑菌剂 - Google Patents
环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用及抑菌剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及棉花防病领域,具体涉及环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用及抑菌剂。本发明利用CGTase实现了对病原菌的抑制及对棉花防御相关基因的诱导,不仅提供了CGTase的用途,也为植物病害的防治提供了新的拮抗物质。CGTase作为一种蛋白质,其不会造成环境污染和残留的特点,使其具有应用的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及棉花防病领域,具体涉及环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用及抑菌剂。
背景技术
棉花(Gossypium hirsutum)是全球重要的经济作物,棉花黄萎病(Verticilliumwilt)是棉花毁灭性损失重要胁迫因子之一。生产上化学农药是相对稳定可靠的作物保护方法,然而施用化学农药导致病原物抗药性增强,微生态环境破坏。化学防治对环境污染严重且对土传病害防治效果不佳,生物防治符合绿色、安全的现代农业发展需求,成为防治棉花黄萎病的重要途径。
环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是一种重要的工业用酶,能够将淀粉转移糖基形成环糊精,目前还未见CGTase作为抑菌物质的报道。
发明内容
本发明的目的是提供环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用。
本发明的再一目的是提供棉花黄萎病菌抑菌剂。
根据本发明的具体实施方式,所述环糊精葡萄糖基转移酶来自蜡状芽孢杆菌YUPP-10。
根据本发明的具体实施方式,所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示,该酶包括718个氨基酸,其第8-32氨基酸区域有一个跨膜结构区,第1-23氨基酸为信号肽序列,局部亲水良好。
SEQ ID No.1:
MFQMAKRVLLSTTLTFSLLAGSALPFLPASAIYADADTAVTNKQNFSTDVIYQVFTDRFLDGNPSNNPTGAAFDGTCSNLKLYCGGDWQGLINKINDNYFSDLGVTALWISQPVENIFATINYSGVTNTAYHGYWARDFKKTNPYFGTMTDFQNLVTTAHAKGIKIIIDFAPNHTSPAMETDTSFAENGKLYDNGSLVGGYTNDTNGYFHHNGGSDFSTLENGIYKNLYDLADLNHNNSTIDTYFKDAIKLWLDMGVDGIRVDAVKHMPQGWQKNWMSSIYAHKPVFTFGEWFLGSAASDADNTDFANESGMSLLDFRFNSAVRNVFRDNTSNMYALDSMLTATAADYNQVNDQVTFIDNHDMDRFKTSAVNNRRLEQALAFTLTSRGVPAIYYGTEQYLTGNGDPDNRGKMPSFSKSTTAFNVISKLAPLRKSNPAIAYGSTQQRWINNDVYIYERKFGKSVAVVAVNRNLTTPTSITNLNTSLPSGTYTDVLGGVLNGNNITSSGGNISSFTLAAGATAVWQYTASETTPTIGHVGPVMGKPGNVVTIDGRGFGSAKGTVYFGTTAVTGSAITSWEDTQIKVTIPPVAGGDYAVKVAANGVNSNAYNDFTILSGDQVSVRFVINNATTALGENIYLTGNVSELGNWTTGAASIGPAFNQVIHAYPTWYYDVSVPAGKQLEFKFFKKNGATITWEGGSNHTFTTPTSGTATVTVNWQ
根据本发明的具体实施方式,从蜡状芽孢杆菌YUPP-10中筛选到抑菌物质环糊精葡萄糖基转移酶,其能抑制棉花黄萎病病原菌。
本发明提供了环糊精葡萄糖基转移酶在诱导棉花防御相关基因表达方面的应用。
本发明的有益效果是:
(1)环糊精葡萄糖基转移酶由棉花内生细菌蜡状芽孢杆菌YUPP-10产生,作为植物内生细菌产生的胞外酶,其对寄主无破坏、对环境无污染,是一种安全的蛋白质。本发明首次将该种类酶用于植物病害的防治和诱导植物防御基因的激发。
(2)环糊精葡萄糖基转移酶对分生孢子产孢量的抑制率最高达58.44%,对孢子萌发的抑制率最高达63.58%,对微菌核萌发的抑制率最高达28.35%,均达到了较好的抑制效果。
(3)使用环糊精葡萄糖基转移酶蛋白液注射棉花叶片,注射后不同时间点检测防御相关基因的表达,其能激活过敏反应的标志基因,并能诱导苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和水杨酸信号通路的标志基因病程相关基因1(PR1)的表达。
附图说明
图1显示环糊精葡萄糖基转移酶处理后棉花防御相关基因PAL的表达。
图2显示环糊精葡萄糖基转移酶处理后棉花防御相关基因POD的表达。
图3显示环糊精葡萄糖基转移酶处理后棉花过敏反应标志基因HSR203J的表达。
图4显示环糊精葡萄糖基转移酶处理后棉花防御相关基因PR1的表达。
具体实施方式
实施例1环糊精葡萄糖基转移酶对大丽轮枝菌的抑制作用
一、环糊精葡萄糖基转移酶对大丽轮枝菌孢子萌发的影响
1、环糊精葡萄糖基转移酶的分离纯化
将去除信号肽的片段连接亲水标签,通过PCR在CGTase基因N端连接His6标签和Sumo标签,再插入到pET41a的NdeI/NotI位点中,得到重组质粒,通过热击转化,成功将pET41a-CGTase转入大肠杆菌BL21。
将成功转化的菌株BL21接种到LB液体培养基中,37℃振荡培养,生长至OD600为0.6-0.8时,加入终浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00和1.25mM的IPTG在低温16℃,250r/min培养18h诱导目标蛋白的表达;取生长至OD600为0.6-0.8时,加入1mM的IPTG在16、17、18、19和20℃的低温下250r/min振荡培养18h诱导目标蛋白的表达。离心收集菌体,弃上清,使用平衡缓冲液重悬菌体(10mL/g),用超声波破碎仪处理,然后吸取50mL至新管为全菌样品;将超声处理的样品高速离心,上清移至新管为上清样品,沉淀使用缓冲液重悬为沉淀样品。SDS-PAGE检测各种样品中目的蛋白表达情况。
在试验所选择的IPTG浓度中,1mM的IPTG终浓度表达量最高;在加入1mM的IPTG诱导剂浓度后,分别在5个不同的低温诱导下,18℃的表达量最高,因此选择CGTase表达培养的最佳IPTG浓度为1mM,温度为18℃。
将成功转化的菌株BL21接种到LB液体培养基中,37℃振荡培养,生长至OD600为0.6-0.8时,加入终浓度为1mM的IPTG,18℃,250r/min振荡培养18h,收集菌体,制备上清样品,SDS-PAGE检测蛋白表达。上清过滤后,使用AKTA系统进行蛋白纯化。
2、测定环糊精葡萄糖基转移酶对大丽轮枝菌孢子萌发的影响、及对大丽轮枝菌分生孢子产孢量的影响
利用悬滴法测定环糊精葡萄糖基转移酶对大丽轮枝菌孢子萌发的影响。在Czapek培养基中接种PDA平板上已经活化的直径为5mm的Vd080菌饼,在25℃,180r/min的恒温振荡培养箱中培养7d后,用4层医用无菌纱布过滤,滤液即为Vd080孢子悬浮液,利用血球计数板查看孢子浓度。取浓度分别为0.24、0.48、和0.96mg/mL的环糊精葡萄糖基转移酶溶液500μL,与等体积的大丽轮枝菌孢子悬浮液(2×103cfu/mL,Czapek培养液)混合,取20μL悬滴于载玻片上,在25℃下保湿培养,3h后镜检孢子萌发情况,以蛋白缓冲液与Vd080孢子悬浮液的等体积混合液为对照,镜检检测其萌发率,每处理重复3次,每次观察100个微菌核的萌发情况。微菌核长出的芽管长度超过微菌核直径的一半视为萌发。
用不同浓度的环糊精葡萄糖基转移酶处理后,对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制率、对微菌核萌发的抑制率和产孢量的抑制率分别在23.94-63.58%、13.79-28.35%和37.72-58.44%的范围内,且抑制率与环糊精糖基转移酶的浓度呈剂量依赖型关系(CGTase对大丽轮枝菌的抑制效果表1)。
表1环糊精葡萄糖基转移酶对大丽轮枝菌的抑制效果
实施例2环糊精葡萄糖基转移酶诱导棉花防御相关基因的表达
供试棉花种子经消毒后用无菌水浸种处理,播种于灭菌的蛭石中,在日光温室中培养7d,取长势相同的棉花用于水培,营养配置方法为1L去离子水中加2g MS培养基,调节pH为6.0。待水培苗长出一片真叶时,用10uL 20ug/mL的环糊精葡萄糖基转移酶注射棉花叶片,处理后12、24、36、48、60和72h取棉花叶片,提取棉花叶片RNA、并反转录为cDNA进行荧光定量PCR。分别检测防御相关基因和信号通路标志基因的表达(特异引物见表2),以注射蛋白缓冲液为对照。
表2防御相关基因的特异引物
用环糊精葡萄糖基转移酶处理棉花后,尚未观察到明显的过敏性坏死反应,提取不同时间段的叶片RNA,检测防御酶基因的表达及部分信号通路的标志基因。如图1所示,试验中,检测到PAL在处理后12h与对照差异极显著,在48h表达量最高为对照7.3倍;如图2所示,POD在36h内对照与差异不显著,在48和72h时处理分别是对照的1.4和1.3倍,表现出了显著差异;如图3所示,虽未观察的过敏性坏死反应,但过敏反应的标志基因HSR203J在12h时便极显著高于对照,在72h表达量达到最大值;如图4所示,处理中PR1基因在36h开始与对照表现出了极显著差异,并表达量持续上升,在72h表达量达到最大值为对照的6.9倍。
PAL和POD是植物中重要的防御酶,能够催化或参与植物木质素和酚类化合物的合成,与植物形成抵抗病原物的屏障有关。本发明中PAL和POD被环糊精葡萄糖基转移酶成功诱导表达,表明环糊精葡萄糖基转移酶能激活部分防御酶的表达。PR1基因是水杨酸信号通路的标志基因,该基因能够上调表达,表明环糊精葡萄糖基转移酶激活了水杨酸信号通路参与植物的防御反应,表明环糊精葡萄糖基转移酶通过激活水杨酸的信号通路实现了诱导植物系统抗病性。过敏反应的标志基因HSR203J在处理后12h便显著高于对照,标明CGTase能激活棉花的过敏反应。因此,本发明首次发现CGTase具有抑菌活性,并能诱导部分防御酶的表达,同时激活了水杨酸信号通路以引发植物防御反应,还能通过过敏反应激发早期植物防御反应,具有重要的应用价值。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用及抑菌剂
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 718
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
Met Phe Gln Met Ala Lys Arg Val Leu Leu Ser Thr Thr Leu Thr Phe
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ala Gly Ser Ala Leu Pro Phe Leu Pro Ala Ser Ala Ile
20 25 30
Tyr Ala Asp Ala Asp Thr Ala Val Thr Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr
35 40 45
Asp Val Ile Tyr Gln Val Phe Thr Asp Arg Phe Leu Asp Gly Asn Pro
50 55 60
Ser Asn Asn Pro Thr Gly Ala Ala Phe Asp Gly Thr Cys Ser Asn Leu
65 70 75 80
Lys Leu Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Leu Ile Asn Lys Ile Asn
85 90 95
Asp Asn Tyr Phe Ser Asp Leu Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln
100 105 110
Pro Val Glu Asn Ile Phe Ala Thr Ile Asn Tyr Ser Gly Val Thr Asn
115 120 125
Thr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro
130 135 140
Tyr Phe Gly Thr Met Thr Asp Phe Gln Asn Leu Val Thr Thr Ala His
145 150 155 160
Ala Lys Gly Ile Lys Ile Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser
165 170 175
Pro Ala Met Glu Thr Asp Thr Ser Phe Ala Glu Asn Gly Lys Leu Tyr
180 185 190
Asp Asn Gly Ser Leu Val Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Asn Gly Tyr
195 200 205
Phe His His Asn Gly Gly Ser Asp Phe Ser Thr Leu Glu Asn Gly Ile
210 215 220
Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Thr
225 230 235 240
Ile Asp Thr Tyr Phe Lys Asp Ala Ile Lys Leu Trp Leu Asp Met Gly
245 250 255
Val Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met Pro Gln Gly Trp
260 265 270
Gln Lys Asn Trp Met Ser Ser Ile Tyr Ala His Lys Pro Val Phe Thr
275 280 285
Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly Ser Ala Ala Ser Asp Ala Asp Asn Thr
290 295 300
Asp Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Asn
305 310 315 320
Ser Ala Val Arg Asn Val Phe Arg Asp Asn Thr Ser Asn Met Tyr Ala
325 330 335
Leu Asp Ser Met Leu Thr Ala Thr Ala Ala Asp Tyr Asn Gln Val Asn
340 345 350
Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Lys Thr
355 360 365
Ser Ala Val Asn Asn Arg Arg Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu
370 375 380
Thr Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Leu
385 390 395 400
Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asp Asn Arg Gly Lys Met Pro Ser Phe Ser
405 410 415
Lys Ser Thr Thr Ala Phe Asn Val Ile Ser Lys Leu Ala Pro Leu Arg
420 425 430
Lys Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Ser Thr Gln Gln Arg Trp Ile
435 440 445
Asn Asn Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Lys Ser Val Ala
450 455 460
Val Val Ala Val Asn Arg Asn Leu Thr Thr Pro Thr Ser Ile Thr Asn
465 470 475 480
Leu Asn Thr Ser Leu Pro Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Val Leu Gly Gly
485 490 495
Val Leu Asn Gly Asn Asn Ile Thr Ser Ser Gly Gly Asn Ile Ser Ser
500 505 510
Phe Thr Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Ser
515 520 525
Glu Thr Thr Pro Thr Ile Gly His Val Gly Pro Val Met Gly Lys Pro
530 535 540
Gly Asn Val Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Ser Ala Lys Gly
545 550 555 560
Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Ala Ile Thr Ser
565 570 575
Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Val Thr Ile Pro Pro Val Ala Gly Gly
580 585 590
Asp Tyr Ala Val Lys Val Ala Ala Asn Gly Val Asn Ser Asn Ala Tyr
595 600 605
Asn Asp Phe Thr Ile Leu Ser Gly Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val
610 615 620
Ile Asn Asn Ala Thr Thr Ala Leu Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Thr Gly
625 630 635 640
Asn Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Thr Thr Gly Ala Ala Ser Ile Gly
645 650 655
Pro Ala Phe Asn Gln Val Ile His Ala Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp
660 665 670
Val Ser Val Pro Ala Gly Lys Gln Leu Glu Phe Lys Phe Phe Lys Lys
675 680 685
Asn Gly Ala Thr Ile Thr Trp Glu Gly Gly Ser Asn His Thr Phe Thr
690 695 700
Thr Pro Thr Ser Gly Thr Ala Thr Val Thr Val Asn Trp Gln
705 710 715
Claims (2)
1.环糊精葡萄糖基转移酶用于抑制棉花黄萎病菌的应用,其中,所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.环糊精葡萄糖基转移酶用于制备棉花黄萎病菌抑菌剂的应用,其中,所述环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
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