CN107969507B - 一种低咖啡碱普洱茶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种低咖啡碱普洱茶及其制备方法，所述低咖啡碱普洱茶，其中，咖啡碱的重量百分含量不高于0.3％，所述制备方法步骤如下：步骤1：取纯种酿酒酵母菌种1623与1930制备成茶曲，或制备成菌液，或制备成菌剂；步骤2：潮水：测定晒青茶的水分含量，潮水至32％～35％；步骤3：前期处理：茶叶表层基本上均匀布满菌丝，堆温约40～45℃，起堆潮水至32％～35％，入柜发酵；步骤4：接种、翻堆：将步骤(1)中的茶曲、菌液或菌剂中任一种，按照各自的接种方法与大堆重重量份比(0.4～20)︰100的比例均匀摊撒到大堆茶叶中，潮水至32％～35％；拌匀，发酵，翻堆1～3次；步骤5：出堆摊晾：每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆。

Description

一种低咖啡碱普洱茶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种茶制品，特别涉及一种低咖啡碱普洱茶及其制备方法。

背景技术

普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青茶为原料，并在地理标志保护范围内采用特定的加工工艺制成，具有独特品质特征的茶叶。普洱茶按加工工艺及品质特征分为普洱茶(生茶)、普洱茶(熟茶)两种类型。按外观形态分普洱茶(熟茶)散茶、普洱茶(生茶、熟茶)紧压茶。

咖啡碱亦称咖啡因，属黄嘌呤生物碱，主要来源于茶叶，约占茶叶干物质的2％～5％，是茶叶重要的风味物质及生理活性特征成分，80％的咖啡碱可以溶于茶汤，其主要药理作用是兴奋中枢神经，产生提神、醒脑的功效，同时对呼吸系统和心脏也有兴奋作用。但是长期饮茶会对其中的咖啡碱产生依赖性，一旦停止饮用，会产生一系列综合症，如头痛、焦虑、恶心和失眠等症状，对咖啡碱敏感的人群一次性摄入10mg咖啡碱便会引起某些不适症状，儿童、孕妇、高血压患者等人群不宜饮茶。因此开发各类低咖啡碱茶以及如何有效降低茶制品中咖啡碱含量的方法研究已经引起越来越多的关注。

咖啡碱易溶于氯仿、热水等，在乙醇、水、丙酮中略溶，根据咖啡碱的理化性质，脱除咖啡碱的方法主要有热水浸提法、有机溶剂萃取法、超临界CO₂提取法、色谱吸附法、常规杂交育种法和基因工程法等，但前几种方法脱除率不高并且费时费力，还有可能造成有机溶剂残留或环境污染，而后两种方法实验周期长，投入成本高。微生物法因其降解效率高、安全无毒等优点得到越来越多学者的青睐。

本发明在现有技术的基础上经过对发酵菌的筛选，获得了一种适合制备低咖啡碱普洱茶的发酵菌，同时发现使用该发酵菌制备普洱茶可以获得高产，口感优良，咖啡碱含量低的全新普洱茶。

发明内容

本发明提供一种低咖啡碱普洱茶，本发明还提供了低咖啡碱普洱茶的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现的：

一种低咖啡碱普洱茶，其中，咖啡碱的重量百分含量不高于0.3％。

优选的，本发明的低咖啡碱普洱茶，其中，咖啡碱的重量百分含量不高于0.2％。

本发明进一步提供本发明所述的低咖啡碱普洱茶的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤1：取纯种酿酒酵母菌种1623与1930制备成茶曲，或制备成菌液，或制备成菌剂；

步骤2：测定晒青茶的水分含量，潮水至32％～35％；

步骤3：茶叶表层基本上均匀布满菌丝，堆温约40～45℃，起堆潮水至32％～35％，入柜发酵；

步骤4：将步骤(1)中的茶曲、菌液或菌剂中任一种接种，其与大堆的重量比为(0.4～20)︰100，潮水至32％～35％，拌匀，发酵，翻堆1～3次；

步骤5：当水分含量在12％以下时即可收堆；

步骤6：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶，根据需要可以制作成熟散茶或压制成饼；也可以用提取的方法制备成茶饮料，或茶制品。

其中，步骤1所述，取纯种酿酒酵母菌种1623与1930制备成茶曲，或制备成菌液，或制备成菌剂；方法分别如下：

所述茶曲，制备方法如下：

1)晒青毛茶，水分含量控制在28％～33％，灭菌；

2)将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于培养基中，28～30℃恒温摇床上培养；

3)分别将已培养好的菌液以3％～10％的比例接入已灭菌的晒青茶中培养，菌落数量级达到1.0～5.0×10⁶，即分别为酿酒酵母菌种1623和1930茶曲；

4)将上述酿酒酵母菌种1623茶曲和酿酒酵母菌种1930茶曲按重量(3～10％)：(3～10％)混匀即得本发明所述的茶曲。

优选的，所述的茶曲，制备方法如下：

1)晒青毛茶，水分含量控制在30％，121℃灭菌15min；

2)将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于液体YEPD培养基中，于30℃温度下在恒温摇床上培养48h；

3)将培养好的菌液分别以5％的比例接入已灭菌的晒青茶中，于30℃条件下培养3～4d，在茶叶表面有一层肉眼可见的白色菌体斑点，菌落数量级达到10⁶，即分别为酿酒酵母菌种1623和1930茶曲；

4)将上述酿酒酵母菌种1623茶曲和酿酒酵母菌种1930按相对重量比(3～5％)：(3～10％)(最佳5％：5％)进行混匀后即得本发明所述的茶曲。

本发明茶曲接种形式中步骤(3)所述的“％”是指占菌液体积占晒青茶重量的比例。

所述菌液，制备方法如下：

1)一级培养种子液:将纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于培养基中，在30℃恒温摇床上培养24h-48h。

2)二级培养菌液：将上步培养好的一级培养种子液分别以3％～10％比例接入液体摇瓶中，恒温摇床上培养24h-48h即为菌液。

3)将上述酿酒酵母菌种1623菌液和酿酒酵母菌种1930菌液按相对体积比(3％～6％)：(3％～6％)混合均匀，即得本发明所述的菌液。

优选的，所述菌液，制备方法如下：

1)一级培养种子液:将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930接种于5mL液体YEPD培养基中，于30℃温度下200rpm转速在恒温摇床上培养24h；

2)二级培养菌液：将上步培养好的一级培养种子液分别以5％比例接入液体摇瓶中，于30℃温度下200rpm转速在恒温摇床上培养24h，分别得酿酒酵母菌种1623、1930菌液；

3)将上述酿酒酵母菌种1623菌液和酿酒酵母菌种1930菌液按相对体积比5％：(3％～6％)混合即得本发明所述的菌液形式。

本发明菌液接种形式中所述的“％”是指体积比。

所述菌剂，制备方法如下：

1)种子培养：将纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于培养基中，28-30℃恒温培养，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0，得种子液；

2)二级培养：将上步培养好的种子液分别以3％～10％比例接入液体摇瓶中，28-30℃恒温培养，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0，得菌体；

3)收集菌体，混合保护剂：离心收集菌体称重；取灭菌后的冷冻保护剂与菌体按(0.5～1.5):(0.5～1.5)的质量混合，搅拌，乳化即得混合保护剂样品；

4)真空冷冻干燥：将混合好保护剂的样品冷冻干燥得冻干菌剂；所述的冻干菌剂水分含量小于7％；菌剂的活菌数大于1.0×10¹⁰cfu/g以上。

5)活化：冻干菌剂采用无菌水和液体培养基两种方式进行活化后使用。

上述步骤③中所述的冷冻保护剂为(含10％脱脂乳+6％蔗糖的水溶液)，即100ml蒸馏水中添加10g脱脂乳和6g蔗糖，混合均匀后，110℃灭菌30min。

优选的，所述菌剂，制备方法如下：

1)种子培养：将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于50mL液体YEPD培养基中，于30℃温度下200rpm转速在恒温摇床上培养24h，取菌液稀释10倍，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0；

2)二级培养：将上步培养好的种子液分别以5％比例接入液体摇瓶中，于30℃条件下培养24h，取菌液稀释10倍，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0。

3)收集菌体，混合保护剂：离心收集摇瓶中的菌体，离心条件为3500rpm，10min，对离心好的菌体进行称重，记录菌体重量，冻保护剂灭菌后与收集的菌体按1:1的质量比进行混合，充分搅拌乳化后平铺于平板底部，厚度不应超过0.5cm；

4)真空冷冻干燥：将混合好保护剂的样品在-70℃预冻8h，冻干机预先冷冻到-50℃，将预冻好的样品放入冻干机中在-50℃进行冷冻干燥，真空度保持在50pa以下，连续冻干12h，将冻干后的菌粉在无菌条件下进行收集、碾碎、包装，即得菌剂成品；所述的冻干菌剂水分含量小于7％；

1623菌种活菌数＝(107×10mL)/(1.0g×0.1mL×10^-6)＝1.07×10¹⁰cfu/g

1930菌种活菌数＝(121×10mL)/(1.0g×0.1mL×10^-6)＝1.21×10¹⁰cfu/g

5)活化：冻干菌剂采用无菌水或液体培养基两种方式进行活化。

上述步骤5)中活化溶液用量为，(0.5g菌剂)/(100mL无菌水)或(0.5g菌剂)/(100mL液体培养基)。

所述液体培养基的配制：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL,121℃灭菌15min。

本发明方法中，

步骤1：菌种培养

本发明通过本发明的茶曲接种，菌液接种、菌剂接种这三种接种方式，均可制备出符合本发明要求的普洱茶，不仅降解率高，而且发酵出堆样品无异杂味产生，都能使发酵出堆样品咖啡碱降解率达40％以上，咖啡碱含量不高于0.3％。从成本和操作便捷性考虑，优选茶曲接种方式。

步骤2：潮水

测定晒青茶的水分含量，根据茶叶老嫩、空气湿度等条件进行补水，补充水分至32％～35％，(优选33％)放置于发酵车间离地的木板上，上面盖上一层发酵布。

步骤3：前期处理

注意观察茶叶表层微生物生长情况以及温度变化，一般2～3d茶叶变柔软，茶叶有较浓的菌香味，茶叶表层基本上均匀布满菌丝，堆温约40～45℃时，即可起堆，补充水分至32％～35％，(优选33％)拌匀，入柜发酵。

步骤4：所述接种降解菌株及翻堆

所述接种是指将制备好的菌种形式按下述接种形式及比例均匀摊撒到大堆茶叶中，补充水分至32％～35％(优选33％)，拌匀，发酵；

当茶曲接种，其与大堆茶叶重量比(6～20)︰100，优选比例(8～12):100；

当菌液接种，其与大堆茶叶体积重量比(6～12)︰100，优选比例(8～12):100；

当菌剂接种，其与大堆茶叶重量比(0.4～3.0)︰100，优选比例(0.8～1.2):100。

所述翻堆优选3次，普洱茶入柜后温度逐渐升高，3～4d时堆温达到60℃以上，维持2～3d，此时冲泡茶汤，一般为橙黄色，滋味苦涩味较浓，有酸味和霉味，此时进行第一次翻堆同时接种菌种，潮水32％～35％发酵；

6～8d后即可进行二次翻堆，堆温达到60℃以上，维持2～3d，，此时冲泡茶汤，一般浅红色，苦涩味变淡，略有陈香，潮水32％～35％，发酵；

6～8d后进行第三次翻堆，堆温达到60℃以上，维持2～3d，，此时冲泡茶汤，一般为深红色，苦涩味变淡，有陈香，潮水32％～35％，发酵。

步骤5：出堆摊晾

翻堆后，当茶汤呈红浓明亮，入口顺滑，尚醇厚，苦涩味较淡，有陈香和甜香及类似于糯米香的味道，叶底呈红褐色时，每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆。

本发明还包括步骤6制成成品

当搁置一段时间后，即可将茶样制作成熟散茶或压制成饼；同时，也可以将此茶样作为原料，直接提取成茶珍或与其它原料配比生产系列低咖产品。

以下是本发明名称术语的解释

纯种酿酒酵母菌种1623，购买自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)。

纯种酿酒酵母菌种1930，购买自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)。

晒青茶：将采摘的鲜叶经过杀青-揉捻-晒干，茶体呈卷曲自然，条型蓬松适度，叶芽分明，色泽墨绿或黄绿相间的茶叶。

潮水：采用人工喷水壶或专用的潮水机加水至茶叶中拌匀，使茶叶水份含量达到所设定的值。

起堆：将发酵到一定程度的茶叶从地面上收集起来。

入柜：将茶叶转移到发酵柜中。

接种：将所需要的菌种制备成菌液、菌剂或茶曲，按照设定的比例添加到渥堆发酵的茶叶中，拌匀。

翻堆：当发酵温度达到60℃时，维持2-3d后，将茶叶从发酵柜中移出，通过解块机解块后，摊撒到地面上，使其散发热量，加水拌匀后再装入发酵柜中。

大堆：参与渥堆发酵的茶叶。

培养方法中的培养基YEPD培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL,121℃灭菌15min。

本发明的有益效果

试验例一、纯种酿酒酵母菌种1623与1930验筛试验

1材料与方法

1.1材料

霉菌：F1、F2；具体菌种见表1

酵母菌：Y1、Y2；具体见表1

纯种酿酒酵母菌种1623、1930：

茶叶：云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司提供。

表1菌种

1.2仪器设备

培养箱，水浴锅，灭菌锅，电热烘箱，电子天平，高效液相色谱仪，紫外分光光度计，等。

1.3标准品

咖啡碱：中国药品生物制品检定所。

1.4方法

1.4.1降解菌种筛选方法

1.4.1.1培养基

种子培养基：霉菌-察氏培养基；酵母菌-YEPD培养基；

固体培养基：100g含水量35％的晒青毛茶(灭菌)

1.4.1.2实验方法

霉菌：将斜面中的菌落接到种子培养基中，28℃培养48h后转接到固体培养基中，28℃培养，以咖啡碱降解率为主要筛选依据。

酵母：将斜面中的菌落接到种子培养基中，30℃培养48h后转接到固体培养基中，30℃培养，以咖啡碱降解率为主要筛选依据。

1.4.1.3混菌发酵

将筛选的单菌进行混菌发酵，确定最佳的混菌配比比例。

1.4.2水分测定

按照国家标准“GB/T 8304-2013茶水分测定”进行。

1.4.3咖啡碱测定(HPLC法)

2菌种筛选

2.1单菌降解菌种筛选

以咖啡碱降解率为主要指标，进行单菌降解菌株的筛选，咖啡碱检测结果见表2～表4

表2 8株菌发酵茶叶中咖啡碱含量变化结果

样品编号	咖啡碱含量(mg/g)	降解率(％)
			空白	4.68	—
F1	4.71	-0.64
			F2	4.68	0.00
F3	3.88	17.09
			F4	4.12	11.97
Y1	3.85	17.74
			Y2	3.92	16.24
1623	3.49	25.43
			1930	3.44	26.50

由表2可以明显看出，6株菌发酵茶叶中咖啡碱含量都有所降低，但是1623与1930发酵茶茶叶中咖啡碱含量降解率达25％以上，因此将6株菌进一步进行单菌发酵验证实验，咖啡碱含量变化情况见表3。

表3筛选出的8株菌发酵茶叶中咖啡碱含量变化结果

由表3可以看出，Y1、Y2、1623与1930这4株酵母菌的降解效果较好，

因此选择这4株菌再进行下一步实验。

2.2混菌发酵

实验菌株：Y1，Y2，1623，1930

种子培养基：YEPD培养基

固体培养基：300g含水量35％的晒青毛茶(灭菌)

实验方法：将斜面中的菌落接到种子培养基中，30℃培养48h后转接到固体培养基中，按照表4混菌接种比例进行混菌发酵。

表4混菌发酵比例配比

由表4可以看出，当Y1:Y2＝5％:5％时，降解率达25.57％；当1623:1930＝5％:5％时，降解率高达51.51％；Y1:Y2:1930＝2％:2％:2％时，降解率达31.12％。因此，选择1623与1930这两株菌为最终的降解菌株进行中试放大试验。

试验例二茶曲接种量筛选

1.茶曲制备：按照实施例1。

2.茶曲接种比例

当培养的茶曲中菌体菌落数达到菌液同等数量级时，即可达到同样降解咖啡碱的效果，茶曲接种比例分别设定了1:25、1:50、1:100、1:150，茶曲中菌体生长情况见表5和表6.

表5 1623菌种菌落计数(10^-6)

表6 1930菌种菌落计数(10^-6)

结果表明，对于1623菌种，1:25与1:50接种比例分别在第4d和第5d菌落数多一个数量级，1:100与1:150接种比例在第5d时菌落数趋于稳定，但是1:100比例的茶曲菌种比1:150茶曲菌体多。

对于1930菌种，1:25、1:50、1:100三个不同接种比例分别在第2d、第3d、第4d时菌落数趋于稳定，而1:150接种比例的菌体生长缓慢。

结合实际生产与成本问题，并且考虑到操作的方便性，最后确定1623与1930的茶曲比例均为1:100，1623菌种发酵5d为茶曲的最佳时间，1930菌种发酵4d为茶曲的最佳发酵时间。

试验例三菌液接种量筛选

1.菌液制备：实施例1

2菌液考察

通过模拟普洱茶发酵工艺，将1623与1930菌液按照不同比例接种于茶叶固体培养基中，定期取样检测咖啡碱含量，以发酵茶叶的口感和咖啡碱含量为主要指标，对菌液接种量进行考察，结果见表7。

表7咖啡碱含量计算结果。

由表7中可以看出，随着接种比例的增加，咖啡碱降解率也随之增加，当接种比例1623:1930＝5％:5％时，咖啡碱降解率最高。因此，确定最佳的菌种接种比例为1623:1930＝5％:5％。

试验例三菌剂接种

1菌剂制备：实施例1

2菌剂方式考察

将制作好的菌剂按照总量1.0g/100g茶叶的接种量，采用无菌水和液体培养基两种方式进行活化，然后接种于茶叶固体培养基中，定期取样检测茶叶中咖啡碱的含量，以发酵茶叶的口感和咖啡碱含量为主要指标。对直接将10％菌液(实施例1中的菌液)接种于茶叶中和这两种复活方式进行考察。结果见表8。

表8三种方式咖啡碱检测结果

注：菌液—直接将10％菌液接种于茶叶中；

无菌水—采用无菌水将菌剂进行活化接种于茶叶中；

培养液—采用培养液将菌剂进行活化接种于茶叶中。

由表8的结果可以看出，将菌液制备成菌剂，使用时再进行活化，可以起到同样降解咖啡碱的效果，并且均无异杂味产生。培养液配制比较繁琐，并且成本较大，因此为了方便快捷，最终确定采用无菌水对菌剂进行活化。

菌剂接种量

将菌剂分别按照0.4g/100g、1.0g/100g、2.0g/100g、3.0g/100g采用无菌水进行活化接种，定期取样检测咖啡碱含量，结果见表9。

表9不同菌剂接种量咖啡碱检测结果

由表9可以看出，随着菌剂接种量的增加，咖啡碱降解率也在逐步增加，但是在1.0g/100g～3.0g/100g之间咖啡碱降解率变化不大，考虑到实际生产和成本问题，最后确定菌剂添加量为1.0g/100g。

试验例四三种接种方式比较

对菌液接种、菌剂接种、茶曲接种三种接种方式进行综合比较见表10。

表10三种接种方式咖啡碱检测结果

从表10中可以看出，三种接种方式可以达到同样的咖啡碱降解效果，另外从成本和操作便捷性综合比较，按照1t的生产量计算进行对比如下：

(1)成本

①菌液：50L/株菌×2株菌＝100L，需要培养基原料酵母膏1kg、蛋白胨2kg、葡萄糖2kg、水100L，费用约550元；

②菌剂：5kg/株菌×2株菌＝10kg，需要找到具有资质的生产厂家，费用＞＞1000元；

③茶曲：10kg/株菌×2株菌＝20kg，大概50元/kg×20kg＝1000元；

(2)储存与运输：菌液既不好储存，也不好运输；

(3)设备需求

①菌液需要额外的发酵罐设备；

②菌剂生产需要相关资质的合作机构；

③茶曲生产不需添加额外设备，现有设备条件即可满足生产；

(4)投入使用

①菌剂使用需要活化；

②菌液和茶曲需与茶叶拌匀即可。

全面综合考虑，茶曲成本最低，并且茶曲生产也不需添加额外设备，同时也方便运输与储存，在投入使用过程中也比较方便快捷，因此最后选用茶曲的接种方式进行中试实验验证。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

低咖啡碱普洱茶的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤1：取纯种酿酒酵母菌种1623与1930制备成茶曲，

①晒青毛茶潮水拌匀，水分含量控制在30％，121℃灭菌15min；

②将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于50ml液体YEPD培养基中，于30℃温度下180rpm转速在恒温摇床上培养48h；

③将培养好的菌液以8％的比例接入已灭菌的晒青茶中，于30℃条件下培养3d～4d，在茶叶表面有一层肉眼可见的白色菌体斑点，菌落数量级达到10⁶，

④将上述酿酒酵母菌种1623茶曲和酿酒酵母菌种1930按相对重量比5％：5％进行混匀后即得本发明所述的茶曲即为茶曲。

步骤2：测定晒青茶的水分含量，根据茶叶老嫩、空气湿度等条件进行补水，补充水分至33％，放置于发酵车间离地的木板上，上面盖上一层发酵布；

步骤3：注意观察茶叶表层微生物生长情况以及温度变化，2-3d茶叶变柔软，茶叶有较浓的菌香味，茶叶表层基本上均匀布满菌丝，此时堆温约40～45℃时，补充水分至33％，拌匀，即可起堆入柜发酵；

步骤4：入柜后温度逐渐升高，堆温达到60℃以上，维持3d即可翻堆，此时冲泡茶汤，一般为橙黄色，滋味苦涩味较浓，有酸味和霉味。

将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，将步骤(1)中的茶曲与大堆的重量比为7︰100，潮水至33％；拌匀，发酵，翻堆1～3次；7-8d后即可进行二次翻堆，仍以发酵温度为主要依据，此时冲泡茶汤，一般浅红色，苦涩味变淡，略有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵；二次翻堆后7-8d后进行第三次翻堆，仍以发酵温度为翻堆主要依据，此时冲泡茶汤，一般为深红色，苦涩味变淡，有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵。

步骤5：三次翻堆后6-7d冲泡茶汤，请专业审评人员进行审评，当茶汤呈红浓明亮，入口顺滑，尚醇厚，苦涩味较淡，有陈香和甜香及类似于糯米香的味道，叶底呈红褐色时，即可出堆摊晾每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆；

步骤6.：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶，根据需要可以制作成熟散茶或压制成饼；也可以用提取的方法制备成茶饮料，或茶制品。

实施例2

低咖啡碱普洱茶的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤1：取纯种酿酒酵母菌种1623与1930制备成茶曲，

①晒青毛茶潮水拌匀，水分含量控制在28％，121℃灭菌15min；

②将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于50ml液体YEPD培养基中，于28℃温度下180rpm转速在恒温摇床上培养48h；

③将培养好的菌液以10％的比例接入已灭菌的晒青茶中，于30℃条件下培养3d～4d，在茶叶表面有一层肉眼可见的白色菌体斑点，菌落数量级达到5×10⁶，

④将上述酿酒酵母菌种1623茶曲和酿酒酵母菌种1930按相对重量比3％：5％进行混匀后即得茶曲。

步骤2：测定晒青茶的水分含量，根据茶叶老嫩、空气湿度等条件进行补水，补充水分至35％，放置于发酵车间离地的木板上，上面盖上一层发酵布；

步骤3：注意观察茶叶表层微生物生长情况以及温度变化，2-3d茶叶变柔软，茶叶有较浓的菌香味，茶叶表层基本上均匀布满菌丝，此时堆温约40～45℃，补充水分至35％，拌匀，即可起堆入柜发酵；

步骤4：入柜后温度逐渐升高，堆温达到60℃以上，维持2-3d即可翻堆，此时冲泡茶汤，一般为橙黄色，滋味苦涩味较浓，有酸味和霉味。

将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，将步骤(1)中的茶曲、与大堆的重量比为4︰100，潮水至35％；拌匀，发酵，翻堆1～3次；7-8d后即可进行二次翻堆，仍以发酵温度为主要依据，此时冲泡茶汤，一般浅红色，苦涩味变淡，略有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵；二次翻堆后7-8d后进行第三次翻堆，仍以发酵温度为翻堆主要依据，此时冲泡茶汤，一般为深红色，苦涩味变淡，有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至35％，拌匀，发酵。

步骤5：三次翻堆后6-7d冲泡茶汤，请专业审评人员进行审评，当茶汤呈红浓明亮，入口顺滑，尚醇厚，苦涩味较淡，有陈香和甜香及类似于糯米香的味道，叶底呈红褐色时，即可出堆摊晾每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆；

步骤6.：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶，根据需要可以制作成熟散茶或压制成饼；也可以用提取的方法制备成茶饮料，或茶制品。

实施例3

低咖啡碱普洱茶的制备方法，所述方法步骤如下：

步骤1：取纯种酿酒酵母菌种1623与1930制备成茶曲，

①晒青毛茶潮水拌匀，水分含量控制在32％，121℃灭菌15min；

②将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于50ml液体YEPD培养基中，于30℃温度下180rpm转速在恒温摇床上培养48h；

③将培养好的菌液以3％的比例接入已灭菌的晒青茶中，于30℃条件下培养3d～4d，在茶叶表面有一层肉眼可见的白色菌体斑点，菌落数量级达到3×10⁶，

④将上述酿酒酵母菌种1623茶曲和酿酒酵母菌种1930按相对重量比5％：10％进行混匀后即得本发明所述的茶曲即为茶曲。

步骤2：测定晒青茶的水分含量，根据茶叶老嫩、空气湿度等条件进行补水，补充水分至33％，放置于发酵车间离地的木板上，上面盖上一层发酵布；

步骤3：注意观察茶叶表层微生物生长情况以及温度变化，2-3d茶叶变柔软，茶叶有较浓的菌香味，茶叶表层基本上均匀布满菌丝，此时堆温约40～45℃，补充水分至32％，拌匀，即可起堆入柜发酵；

步骤4：入柜后温度逐渐升高，堆温达到60℃以上，维持2-3d即可翻堆，此时冲泡茶汤，一般为橙黄色，滋味苦涩味较浓，有酸味和霉味。

将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，将步骤(1)中的茶曲、与大堆的重量比为12︰100，潮水至32％；拌匀，发酵，翻堆1～3次；7-8d后即可进行二次翻堆，仍以发酵温度为主要依据，此时冲泡茶汤，一般浅红色，苦涩味变淡，略有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵；二次翻堆后7-8d后进行第三次翻堆，仍以发酵温度为翻堆主要依据，此时冲泡茶汤，一般为深红色，苦涩味变淡，有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至32％，拌匀，发酵。

步骤5：三次翻堆后6-7d冲泡茶汤，请专业审评人员进行审评，当茶汤呈红浓明亮，入口顺滑，尚醇厚，苦涩味较淡，有陈香和甜香及类似于糯米香的味道，叶底呈红褐色时，即可出堆摊晾每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆；

步骤6.：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶，根据需要可以制作成熟散茶或压制成饼；也可以用提取的方法制备成茶饮料，或茶制品。

实施例4

步骤1：取纯种酿酒酵母菌种1623与1930制备成菌液，

①一级培养种子液:将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930接种于培养基中，在，28～30℃恒温摇床上培养24h-48h。

②二级培养菌液：将培养好的种子液以3％比例接入液体摇瓶中，，28～30℃恒温摇床上培养24h-48h即为菌液。

③将上述酿酒酵母菌种1623菌液和酿酒酵母菌种1930菌液按相对体积比3％：3％混合均匀，即得本发明所述的菌液形式。

步骤2：测定晒青茶的水分含量，根据茶叶老嫩、空气湿度等条件进行补水，补充水分至33％，放置于发酵车间离地的木板上，上面盖上一层发酵布；

步骤3：注意观察茶叶表层微生物生长情况以及温度变化，2-3d茶叶变柔软，茶叶有较浓的菌香味，茶叶表层基本上均匀布满菌丝，此时堆温约40～45℃，补充水分至33％，拌匀，即可起堆入柜发酵；

步骤4：入柜后温度逐渐升高，堆温达到60℃以上，维持2-3d即可翻堆，此时冲泡茶汤，一般为橙黄色，滋味苦涩味较浓，有酸味和霉味。

将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，将步骤(1)中菌液与大堆的重量比为8︰100，潮水至33％；拌匀，发酵，翻堆1～3次；7-8d后即可进行二次翻堆，仍以发酵温度为主要依据，此时冲泡茶汤，一般浅红色，苦涩味变淡，略有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵；二次翻堆后8d后进行第三次翻堆，仍以发酵温度为翻堆主要依据，此时冲泡茶汤，一般为深红色，苦涩味变淡，有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵。

步骤5：三次翻堆后6-7d冲泡茶汤，请专业审评人员进行审评，当茶汤呈红浓明亮，入口顺滑，尚醇厚，苦涩味较淡，有陈香和甜香及类似于糯米香的味道，叶底呈红褐色时，即可出堆摊晾每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆；

步骤6.：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶，根据需要可以制作成熟散茶或压制成饼；也可以用提取的方法制备成茶饮料，或茶制品。

实施例5

步骤1：取纯种酿酒酵母菌种1623与1930制备成菌液，

①一级培养种子液:将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930接种于培养基中，在，28～30℃恒温摇床上培养24h-48h。

②二级培养菌液：将培养好的种子液以3％比例分别接入液体摇瓶中，28～30℃恒温摇床上培养24h-48h即为菌液。

③将上述酿酒酵母菌种1623菌液和酿酒酵母菌种1930菌液按相对体积比5％：6％混合均匀，即得本发明所述的菌液形式。

步骤2：测定晒青茶的水分含量，根据茶叶老嫩、空气湿度等条件进行补水，补充水分至35％，放置于发酵车间离地的木板上，上面盖上一层发酵布；

步骤3：注意观察茶叶表层微生物生长情况以及温度变化，2-3d茶叶变柔软，茶叶有较浓的菌香味，茶叶表层基本上均匀布满菌丝，此时堆温约40～45℃，补充水分至35％，拌匀，即可起堆入柜发酵；

步骤4：入柜后温度逐渐升高，堆温达到60℃以上，维持2-3d即可翻堆，此时冲泡茶汤，一般为橙黄色，滋味苦涩味较浓，有酸味和霉味。

将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，将步骤(1)中的菌液与大堆的重量比为10︰100，潮水至35％；拌匀，发酵，翻堆1～3次；8d后即可进行二次翻堆，仍以发酵温度为主要依据，此时冲泡茶汤，一般浅红色，苦涩味变淡，略有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至35％，拌匀，发酵；二次翻堆后8d后进行第三次翻堆，仍以发酵温度为翻堆主要依据，此时冲泡茶汤，一般为深红色，苦涩味变淡，有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至35％，拌匀，发酵。

步骤5：三次翻堆后6-7d冲泡茶汤，请专业审评人员进行审评，当茶汤呈红浓明亮，入口顺滑，尚醇厚，苦涩味较淡，有陈香和甜香及类似于糯米香的味道，叶底呈红褐色时，即可出堆摊晾每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆；

步骤6.：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶，根据需要可以制作成熟散茶或压制成饼；也可以用提取的方法制备成茶饮料，或茶制品。

实施例6

步骤1：取纯种酿酒酵母菌种1623与1930制备成菌液，

①一级培养种子液:将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930接种于培养基中，在，28～30℃恒温摇床上培养24h-48h。

②二级培养菌液：将培养好的种子液以10％比例分别接入液体摇瓶中，，28～30℃恒温摇床上培养24h-48h即为菌液。

③将上述酿酒酵母菌种1623菌液和酿酒酵母菌种1930菌液按相对体积比5％：3％混合均匀，即得本发明所述的菌液形式。

步骤2：测定晒青茶的水分含量，根据茶叶老嫩、空气湿度等条件进行补水，补充水分至33％，放置于发酵车间离地的木板上，上面盖上一层发酵布；

步骤3：注意观察茶叶表层微生物生长情况以及温度变化，2-3d茶叶变柔软，茶叶有较浓的菌香味，茶叶表层基本上均匀布满菌丝，堆温43℃时，补充水分至33％，拌匀，即可起堆入柜发酵；

步骤4：入柜后温度逐渐升高，堆温达到60℃以上，维持2-3d即可翻堆，此时冲泡茶汤，一般为橙黄色，滋味苦涩味较浓，有酸味和霉味。

将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，将步骤(1)中的茶曲、菌液或菌剂中任一种接种，其与大堆的重量比为7︰100，潮水至33％；拌匀，发酵，翻堆1～3次；8d后即可进行二次翻堆，仍以发酵温度为主要依据，此时冲泡茶汤，一般浅红色，苦涩味变淡，略有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵；二次翻堆后7-8d后进行第三次翻堆，仍以发酵温度为翻堆主要依据，此时冲泡茶汤，一般为深红色，苦涩味变淡，有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵。

步骤5：三次翻堆后6-7d冲泡茶汤，请专业审评人员进行审评，当茶汤呈红浓明亮，入口顺滑，尚醇厚，苦涩味较淡，有陈香和甜香及类似于糯米香的味道，叶底呈红褐色时，即可出堆摊晾每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆；

步骤6.：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶，根据需要可以制作成熟散茶或压制成饼；也可以用提取的方法制备成茶饮料，或茶制品。

实施例7

1)种子培养：将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于50mL液体YEPD培养基中，于30℃温度下200rpm转速在恒温摇床上培养24h，取菌液稀释10倍，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0。

2)二级培养：将培养好的种子液以5％比例分别接入液体摇瓶中，于30℃条件下培养24h，取菌液稀释10倍，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0。

3)收集菌体，混合保护剂：离心收集摇瓶中的菌体，离心条件为3500rpm，10min，对离心好的菌体进行称重，记录菌体重量。确定最佳冷冻保护剂为10％脱脂乳+6％蔗糖，灭菌后与收集的菌体按1:1的质量比进行混合，充分搅拌乳化后平铺于平板底部，厚度不应超过0.5cm。

4)真空冷冻干燥：将混合好保护剂的样品在-70℃预冻8h，冻干机预先冷冻到-50℃，将预冻好的样品放入冻干机中在-50℃进行冷冻干燥，真空度保持在50pa以下，连续冻干12h，将冻干后的菌粉在无菌条件下进行收集、碾碎、包装，即得菌剂成品；所述的冻干菌剂水分含量小于7％；

1623菌种活菌数＝(107×10mL)/(1.0g×0.1mL×10^-6)＝1.07*10¹⁰cfu/g

1930菌种活菌数＝(121×10mL)/(1.0g×0.1mL×10^-6)＝1.21*10¹⁰cfu/g

5)活化：冻干菌剂采用无菌水或液体培养基两种方式进行活化。活化溶液用量为，0.5g菌剂/100mL无菌水或0.5g菌剂/100mL液体培养基。所述液体培养基的配制：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL,121℃灭菌15min。

步骤2：测定晒青茶的水分含量，根据茶叶老嫩、空气湿度等条件进行补水，补充水分至33％，放置于发酵车间离地的木板上，上面盖上一层发酵布；

步骤3：注意观察茶叶表层微生物生长情况以及温度变化，2-3d茶叶变柔软，茶叶有较浓的菌香味，茶叶表层基本上均匀布满菌丝，此时堆温约40～45℃，补充水分至33％，拌匀，即可起堆入柜发酵；

步骤4：入柜后温度逐渐升高，堆温达到60℃以上，维持2-3d即可翻堆，此时冲泡茶汤，一般为橙黄色，滋味苦涩味较浓，有酸味和霉味。

将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，将步骤(1)中的茶曲、菌液或菌剂中任一种接种，其与大堆的重量比为0.4︰100，潮水至33％；拌匀，发酵，翻堆1～3次；7-8d后即可进行二次翻堆，仍以发酵温度为主要依据，此时冲泡茶汤，一般浅红色，苦涩味变淡，略有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵；二次翻堆后7-8d后进行第三次翻堆，仍以发酵温度为翻堆主要依据，此时冲泡茶汤，一般为深红色，苦涩味变淡，有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵。

步骤5：三次翻堆后6-7d冲泡茶汤，请专业审评人员进行审评，当茶汤呈红浓明亮，入口顺滑，尚醇厚，苦涩味较淡，有陈香和甜香及类似于糯米香的味道，叶底呈红褐色时，即可出堆摊晾每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆；

步骤6.：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶，根据需要可以制作成熟散茶或压制成饼；也可以用提取的方法制备成茶饮料，或茶制品。

实施例8

1)种子培养：将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930接种于50mL液体YEPD培养基中，于30℃温度下200rpm转速在恒温摇床上培养24h，取菌液稀释10倍，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0。

2)二级培养：将培养好的种子液以3％比例分别接入液体摇瓶中，于30℃条件下培养24h，取菌液稀释10倍，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0。

3)收集菌体，混合保护剂：离心收集摇瓶中的菌体，离心条件为3500rpm，10min，对离心好的菌体进行称重，记录菌体重量。确定最佳冷冻保护剂为10％脱脂乳+6％蔗糖，灭菌后与收集的菌体按1:3的质量比进行混合，充分搅拌乳化后平铺于平板底部，厚度不应超过0.5cm。

4)真空冷冻干燥：将混合好保护剂的样品在-70℃预冻8h，冻干机预先冷冻到-50℃，将预冻好的样品放入冻干机中在-50℃进行冷冻干燥，真空度保持在50pa以下，连续冻干12h，将冻干后的菌粉在无菌条件下进行收集、碾碎、包装，即得菌剂成品；所述的冻干菌剂水分含量小于7％；

1623菌种活菌数＝(107×10mL)/(1.0g×0.1mL×10^-6)＝1.07*10¹⁰cfu/g

1930菌种活菌数＝(121×10mL)/(1.0g×0.1mL×10^-6)＝1.21*10¹⁰cfu/g

5)活化：冻干菌剂采用无菌水或液体培养基两种方式进行活化。活化溶液用量为，0.5g菌剂/100mL无菌水或0.5g菌剂/100mL液体培养基。所述液体培养基的配制：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL,121℃灭菌15min。

步骤2：测定晒青茶的水分含量，根据茶叶老嫩、空气湿度等条件进行补水，补充水分至33％，放置于发酵车间离地的木板上，上面盖上一层发酵布；

步骤3：注意观察茶叶表层微生物生长情况以及温度变化，2-3d茶叶变柔软，茶叶有较浓的菌香味，茶叶表层基本上均匀布满菌丝，此时堆温约40～45℃，补充水分至33％，拌匀，即可起堆入柜发酵；

步骤4：入柜后温度逐渐升高，堆温达到60℃以上，维持2-3d即可翻堆，此时冲泡茶汤，一般为橙黄色，滋味苦涩味较浓，有酸味和霉味。

将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，将步骤(1)中的茶曲、菌液或菌剂中任一种接种，其与大堆的重量比为1.2︰100，潮水至33％；拌匀，发酵，翻堆1～3次；7-8d后即可进行二次翻堆，仍以发酵温度为主要依据，此时冲泡茶汤，一般浅红色，苦涩味变淡，略有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵；二次翻堆后7-8d后进行第三次翻堆，仍以发酵温度为翻堆主要依据，此时冲泡茶汤，一般为深红色，苦涩味变淡，有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵。

步骤5：三次翻堆后6-7d冲泡茶汤，请专业审评人员进行审评，当茶汤呈红浓明亮，入口顺滑，尚醇厚，苦涩味较淡，有陈香和甜香及类似于糯米香的味道，叶底呈红褐色时，即可出堆摊晾每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆；

步骤6.：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶，根据需要可以制作成熟散茶或压制成饼；也可以用提取的方法制备成茶饮料，或茶制品。

实施例9

1)种子培养：将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930接种于50mL液体YEPD培养基中，于30℃温度下200rpm转速在恒温摇床上培养24h，取菌液稀释10倍，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0。

2)二级培养：将培养好的种子液以10％比例分别接入液体摇瓶中，于30℃条件下培养24h，取菌液稀释10倍，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0。

3)收集菌体，混合保护剂：离心收集摇瓶中的菌体，离心条件为3500rpm，10min，对离心好的菌体进行称重，记录菌体重量。确定最佳冷冻保护剂为10％脱脂乳+6％蔗糖，灭菌后与收集的菌体按3:1的质量比进行混合，充分搅拌乳化后平铺于平板底部，厚度不应超过0.5cm。

4)真空冷冻干燥：将混合好保护剂的样品在-70℃预冻8h，冻干机预先冷冻到-50℃，将预冻好的样品放入冻干机中在-50℃进行冷冻干燥，真空度保持在50pa以下，连续冻干12h，将冻干后的菌粉在无菌条件下进行收集、碾碎、包装，即得菌剂成品；所述的冻干菌剂水分含量小于7％；

1623菌种活菌数＝(107×10mL)/(1.0g×0.1mL×10^-6)＝1.07*10¹⁰cfu/g

1930菌种活菌数＝(121×10mL)/(1.0g×0.1mL×10^-6)＝1.21*10¹⁰cfu/g

5)活化：冻干菌剂采用无菌水或液体培养基两种方式进行活化。活化溶液用量为，0.5g菌剂/100mL无菌水或0.5g菌剂/100mL液体培养基。所述液体培养基的配制：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL,121℃灭菌15min。

步骤2：测定晒青茶的水分含量，根据茶叶老嫩、空气湿度等条件进行补水，补充水分至33％，放置于发酵车间离地的木板上，上面盖上一层发酵布；

步骤3：注意观察茶叶表层微生物生长情况以及温度变化，3d茶叶变柔软，茶叶有较浓的菌香味，茶叶表层基本上均匀布满菌丝，堆温43℃时，补充水分至33％，拌匀，即可起堆入柜发酵；

步骤4：入柜后温度逐渐升高，堆温达到60℃以上，维持2-3d即可翻堆，此时冲泡茶汤，一般为橙黄色，滋味苦涩味较浓，有酸味和霉味。

将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，将步骤(1)中的茶曲、菌液或菌剂中任一种接种，其与大堆的重量比为0.8︰100，潮水至33％；拌匀，发酵，翻堆1～3次；7-8d后即可进行二次翻堆，仍以发酵温度为主要依据，此时冲泡茶汤，一般浅红色，苦涩味变淡，略有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵；二次翻堆后7-8d后进行第三次翻堆，仍以发酵温度为翻堆主要依据，此时冲泡茶汤，一般为深红色，苦涩味变淡，有陈香；将滚筒中的茶叶转出，解块，拌匀，测定水分含量，补充水分至33％，拌匀，发酵。

步骤5：三次翻堆后6-7d冲泡茶汤，请专业审评人员进行审评，当茶汤呈红浓明亮，入口顺滑，尚醇厚，苦涩味较淡，有陈香和甜香及类似于糯米香的味道，叶底呈红褐色时，即可出堆摊晾每天通一次沟，当水分含量在12％以下时即可收堆；

步骤6.：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶，根据需要可以制作成熟散茶或压制成饼；也可以用提取的方法制备成茶饮料，或茶制品。

Claims (10)

1.一种低咖啡碱普洱茶的制备方法，其特征在于，其中，所述普洱茶中，咖啡碱的重量百分含量不高于0.3%，所述制备方法步骤如下：

步骤1：取纯种酿酒酵母菌种1623与1930制备成茶曲，或制备成菌液，或制备成菌剂；

步骤2：测定晒青茶的水分含量，潮水至32%~35%；

步骤3：茶叶表层基本上均匀布满菌丝，堆温40~45℃，起堆潮水至32%~35%，入柜发酵；

步骤4：将步骤（1）中的茶曲、菌液或菌剂中任一种接种，其与大堆的重量比为0.4~20︰100，潮水至32%~35%；拌匀，发酵，翻堆1~3次；

步骤5：当水分含量在12%以下时即可收堆；

步骤6：收堆后的茶叶即为低咖啡碱普洱茶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述普洱茶中，咖啡碱的重量百分含量不高于0.2%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤1所述茶曲，制备方法如下：

1）晒青毛茶，水分含量控制在28%~33%，灭菌；

2）将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于培养基中，28~30℃恒温摇床上培养；

3）分别将已培养好的菌液以3%~10%的比例接入已灭菌的晒青茶中培养，菌落数量级达到1.0~5.0×10⁶，即分别为酿酒酵母菌种1623和1930茶曲；

4）将上述酿酒酵母菌种1623茶曲和酿酒酵母菌种1930茶曲按重量3~10%：3~10%混匀即得。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤1所述茶曲，制备方法如下：

1）晒青毛茶，水分含量控制在30%，121℃灭菌15min；

2）将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于液体YEPD培养基中，于30℃温度下在恒温摇床上培养48h；

3）将培养好的菌液分别以5%的比例接入已灭菌的晒青茶中，于30℃条件下培养3~4d，在茶叶表面有一层肉眼可见的白色菌体斑点，菌落数量级达到10⁶，即分别为酿酒酵母菌种1623和1930茶曲；

4）将上述酿酒酵母菌种1623茶曲和酿酒酵母菌种1930按相对重量比3-5%：3-10%进行混匀后即得。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤1所述菌液，制备方法如下：

1）一级培养种子液:将纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于培养基中，在30℃恒温摇床上培养24h-48h，

2）二级培养菌液：将上步培养好的一级培养种子液分别以3%~10%比例接入液体摇瓶中，恒温摇床上培养24h-48h即为菌液，

3）将上述酿酒酵母菌种1623菌液和酿酒酵母菌种1930菌液按相对体积比3%~6%：3%~6%混合均匀，即得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤1所述菌液，制备方法如下：

1）一级培养种子液:将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于5mL液体YEPD培养基中，于30℃温度下200rpm转速在恒温摇床上培养24h，

2）二级培养菌液：将上步培养好的一级培养种子液分别以5%比例接入液体摇瓶中，于30℃温度下200rpm转速在恒温摇床上培养24h，分别得酿酒酵母菌种1623、1930菌液，

3）将上述酿酒酵母菌种1623菌液和酿酒酵母菌种1930菌液按相对体积比5%：3%~6%混合即得。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤1所述菌剂，制备方法如下：

1）种子培养：将纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于培养基中，30℃恒温培养，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0，得种子液；

2）二级培养：将上步培养好的种子液分别以3%~10%比例接入液体摇瓶中，28-30℃恒温培养，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0，得菌体；

收集菌体，混合保护剂：离心收集菌体称重；取灭菌后的冷冻保护剂与菌体

按0.5~1.5：0.5~1.5的质量混合，搅拌，乳化即得混合保护剂样品；

4）真空冷冻干燥：将混合好保护剂的样品冷冻干燥得冻干菌剂；所述的冻干菌剂水分含量小于7%，菌剂的活菌数大于1.0×10¹⁰cfu/g以上；

5）活化：冻干菌剂采用无菌水和液体培养基两种方式进行活化后使用。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤1所述菌剂，制备方法如下：

1）种子培养：将斜面培养的纯种酿酒酵母菌种1623与1930分别接种于50mL液体YEPD培养基中，于30℃温度下200rpm转速在恒温摇床上培养24h，取菌液稀释10倍，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0；

2）二级培养：将上步培养好的种子液分别以5%比例接入液体摇瓶中，于30℃条件下培养24h，取菌液稀释10倍，在分光光度计上测定确保OD₆₀₀值＞1.0；

3）收集菌体，混合保护剂：离心收集摇瓶中的菌体，冷冻保护剂灭菌后与收集的菌体按1:1的质量比进行混合，充分搅拌乳化后平铺于平板底部，厚度不应超过0.5cm，所述冷冻保护剂为含有10%脱脂乳和6%蔗糖的水溶液；

4）真空冷冻干燥：将混合好保护剂的样品在-70℃预冻8h，冻干机预先冷冻到-50℃，将预冻好的样品放入冻干机中在-50℃进行冷冻干燥，真空度保持在50pa以下，连续冻干12h，将冻干后的菌粉在无菌条件下进行收集、碾碎、包装，即得菌剂成品；所述的冻干菌剂水分含量小于7%；

1623菌种活菌数1.07×10¹⁰cfu/g；

1930菌种活菌数1.21×10¹⁰cfu/g；

5）活化：冻干菌剂采用无菌水或液体培养基两种方式进行活化。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中，

当茶曲接种，其与大堆茶叶重量比6~20：100，

当菌液接种，其与大堆茶叶体积重量比6~12：100，

当菌剂接种，其与大堆茶叶重量比0.4~3.0：100。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中，

当茶曲接种，其与大堆茶叶重量比8~12：100；

当菌液接种，其与大堆茶叶体积重量比8~12：100；

当菌剂接种，其与大堆茶叶重量比0.8~1.2：100。