CN107966504A - 一种血栓通注射剂中5-羟甲基糠醛的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血栓通注射剂中5‑羟甲基糠醛的检测方法，采用高效液相法测定血栓通注射剂中的5‑羟甲基糠醛的含量，其色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱采用CAPCELLPAK C18，5μm，4.6×250mm；流动相为甲醇‑0.1%磷酸溶液（10：90）；流速0.8～1.0ml/min；柱温23～28℃；测定波长282～286nm；进样量10～15μl；理论板数按5‑羟甲基糠醛峰计算不低于8000。该法具有操作简单、快速、准确度高、精密度高、稳定性好的优点，适合实验室对于血栓通注射剂的专门性检测工作，可批量进行检测，提高检测效率。

Description

一种血栓通注射剂中5-羟甲基糠醛的检测方法

技术领域

本发明涉及药品检测领域，具体是一种血栓通注射剂中5-羟甲基糠醛的检测方法。

背景技术

5-羟甲基糠醛由葡萄糖或果糖脱水生成的化学物质，分子中含有一个呋喃环，一个醛基和一个羟甲基，其化学性质比较活泼，可以通过氧化、氢化和缩合等反应制备多种衍生物，是重要的精细化工原料。中文同义词: 5-羟甲基糠醛，5-羟甲基-2-呋喃甲醛，5-羟甲基-2-糠醛，5-(羟甲基)-2-呋喃甲醛，5-羟基甲基糠醛，5-羟基甲基呋喃甲醛，5-羟甲基糠醛(4度冷藏)，5-羟甲-2-呋喃甲醛，5-羟甲-2-糠醛，5-羟基甲基呋喃甲醛，5-羟甲基-2-呋喃甲醛(含稳定剂水)；英文名称:5-hydroxymethylfurfural；简称为5-HMF。

血栓通注射液（别名：田七人参注射液），是一种注射剂处方药，为淡黄色至黄色的澄明液体，适用于视网膜中央静脉阻塞、眼前房出血、青光眼、脑血管病后遗症的治疗，也可用于治疗病毒性肝炎，还具备活血祛瘀，扩张血管，改善血循环的作用，但偶有过敏反应。注射用血栓通为类白色或淡黄色无定形粉末或疏松固体状物，昧微苦、微甘，有引湿性。适应症为活血祛瘀，通脉活络。用于瘀血阻络，中风偏瘫，胸痹心痛及视网膜中央静脉阻塞症。

血栓通注射液和注射用血栓通统称为血栓通注射剂，其主要成分是三七总皂苷和氯化钠。三七含有单糖、低聚糖和多糖，三七药材中含有的部分皂苷类成分都是苷元与葡萄糖结合，在提取、纯化过程中，会有可能发生水解，产生部分葡萄糖。5-羟甲基糠醛（5-HMF）是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一个醛类化合物，有报道称该化合物对人体横纹肌和内脏有毒副作用能与蛋白质结合产生积蓄毒性，医药、食品等工业中往往对其产品进行5-HMF含量的控制。

5-HMF 的检测方法和含量测定方法的研究也较多，其在284nm 处有最大吸收。紫外-可见分光光度法是较为普遍的测定方法。近年来 HPLC 的应用克服了5-HMF 和其他成分在同一波长处 (284nm) 有吸收的问题，从而能够更准确的测定其含量和控制注射液的质量。由于中药注射液是临床常用的制剂，其质量的优劣直接关系到人民的身体健康，因此药典中对其相关杂质含量作出了明确规定。因此控制注射剂中杂质 5- 羟甲基糠醛的含量是一项重要课题。

目前公开文献中也有关5-羟甲基糠醛检测的相关技术，但血栓通注射剂中5-羟甲基糠醛的含量测定方法还未见有报道。下面是检索到相关的专利文献：

1、中国专利：一种注射剂中5-羟甲基糠醛含量的测定方法；申请号：201010541638.8；申请日： 2010.11.12；申请人：天津天士力之骄药业有限公司；摘要：本发明涉及一种注射剂中5-羟甲基糠醛含量的测定方法，该方法经过以下步骤：1)注射剂预处理配成样品溶液；2)5-羟甲基糠醛对照品溶液的配制；3)采用高效液相色谱法对样品和对照品进行测定；4)计算样品中5-羟甲基糠醛的含量；其中所述预处理包括过大孔吸附树脂。

2、中国专利：一种五味子中5-羟甲基糠醛的含量检测方法；申请号：201410104211.X；申请日： 2014.03.20；申请人：天津天士力之骄药业有限公司；摘要：本发明公开了一种五味子中5-羟甲基糠醛的含量检测方法，采用高效液相法测定五味子中5-羟甲基糠醛，色谱条件，采用C18柱或C8，流动相为5-15∶95-85的甲醇-0.5%醋酸水溶液或体积比为10-15:90-85乙腈-水溶液，等度洗脱，检测波长为280-284nm。该方法操作简便、灵敏度高，重现性好。

3、中国专利：一种熟地黄中5-羟甲基糠醛的含量检测方法；申请号：201410438257.5；申请日： 2014.09.01；申请人：李晓枫；摘要：本发明公开了一种熟地黄中5-羟甲基糠醛的含量检测方法，采用高效液相法测定熟地黄中5-羟甲基糠醛，色谱条件，采用C18柱或C8，流动相为5-15∶95-85的醋酸乙酯-0.5％醋酸水溶液或体积比为10-15:90-85乙腈-水溶液，等度洗脱，检测波长为280-284nm。该方法操作简便、灵敏度高，重现性好。

4、中国专利：一种腹膜透析液中5-羟甲基糠醛的检测方法；申请号201510598114.5；申请日： 2015.09.18；申请人：华仁药业股份有限公司；摘要：本发明属于医药技术领域，涉及一种腹膜透析液中5-羟甲基糠醛的检测方法，精密称定5-羟甲基糠醛对照品，加水溶解配置对照品溶液，取适量的腹膜透析液置于量瓶中，用水稀释至刻度，配置供试品溶液，分别精取对照液和供试液各20μl，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得腹膜透析液中5-羟甲基糠醛的标示量；通过高效液相色谱法，精确检测腹膜透析液中5-羟甲基糠醛的含量，对腹膜透析液的质量进行精确控制，有利于优化工艺，提高产品质量和安全性。

发明内容

本发明的目的是提供一种血栓通注射剂中5-羟甲基糠醛的检测方法，该法具有操作简单、快速、准确度高、精密度高、稳定性好的优点。

本发明通过以下技术方案实现：

一种血栓通注射剂中5-羟甲基糠醛的检测方法，包括以下步骤：

（a）对照品溶液的制备：取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加水制成1μg/ml的溶液；

（b）供试品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为供试品溶液，或取注射用血栓通配成37mg/ml的溶液作为供试品；

（c）设置色谱条件，并进行检测：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定；

（d）计算得出5-羟甲基糠醛的含量：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；由样品色谱图求出峰面积，将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中5-羟甲基糠醛的含量。

所述色谱条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

色谱柱：CAPCELLPAK C18，5μm ，4.6×250mm；

流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（10：90）；

流速：0.8～1.0ml/min；

柱温：23～28℃；

测定波长：282～286nm；

进样量10～15μl；

理论板数:按5-羟甲基糠醛峰计算不低于8000。

本发明采用的检测条件和方法是在查阅大量文献的基础上，经过多次实验探索研究之后筛选出来的，能够达到精确度高、稳定性好的目的。以下为本发明的稳定性、准确度、精密度、重复性和现行关系的验证试验：

（1）被测溶液的稳定性试验

对同一份血栓通注射液供试品溶液，同一份注射用血栓通（冻干）供试品溶液按上述色谱条件，每隔一定时间测定一次，共考察13小时，测定了5次，结果5次测定中，血栓通注射液和注射用血栓通（冻干）的平均峰面积分别为20.004 、20.406，RSD分别为1.4％、1.6（n＝5），详见表1。试验表明，供试品溶液至少在13小时内稳定。

表1 稳定性试验结果

（2）准确度试验

对照品溶液制备：精密称取5-HMF对照品6.77mg(纯度100.0%)，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml置20ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀（1.354μg/ml）。

精密量取已知含量的血栓通注射液(5-HMF含量为0.1683μg/ml)1.00ml共6份，置2ml量瓶中，分别精密加入对照品溶液0.1ml，加水至刻度、测定，计算加样回收率；另精密称取已知含量的注射用血栓通（冻干）(5-HMF含量为4.2962μg/g)20mg，共6份，至1ml量瓶中，分别精密加入对照品溶液0.1ml，加水至刻度、测定，计算加样回收率。

实验结果：血栓通注射液和注射用血栓通（冻干）中5-HMF平均回收率分别为103.07％、100.22%，RSD分别为2.8%、1.2%，详见表2、表3。结果表明本发明所述方法的准确度良好。

表2 血栓通注射液加样回收率计算结果

表3 注射用血栓通（冻干）加样回收率计算结果

（3）精密度试验

同一份血栓通注射液供试品溶液，同一份注射用血栓通（冻干）供试品溶液按上述色谱条件，连续测定5次。实验结果中5次测定的5-HMF峰面积平均值分别为20.054、21.050，RSD分别为1.7%、1.4%（n＝5），详见表4。结果表明本发明所述方法的精密度良好。

表4 精密度试验结果

（4）重复性试验

取同一批血栓通注射液供试品溶液按上述方法平行测定2份，另取同一批注射用血栓通（冻干）供试品溶液按上述方法平行测定6份，计算，结果如表5、表6所示。血栓通注射液和注射用血栓通（冻干）中5-HMF含量的平均值分别为0.1683μg/ml、4.2962μg/g, RSD分别为2.9％、1.7%。试验结果表明，本发明所述方法的重现性较好。

表5 血栓通注射液重复性试验结果

表6 注射用血栓通（冻干）重复性试验结果

（5）线性关系的考察

精密称取5-HMF对照品6.77 mg(纯度检查：100.0%)，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。

精密量取上述贮备液0.5ml、1.0ml、1.0ml、10ml分别置50、20、5、10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得曲线2、3、4、5，再精密量取曲线2溶液0.5ml置20ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得曲线1。

将上述对照品溶液按上述色谱条件分别进样10μl，以对照品的进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（如图1），并求出线性方程。

结果表明：5-HMF对照品进样量在0.0677～270.8ng范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=1.1804×10X+1.2421，r=1.0000

上述试验结果见表7。

表7 5-HMF标准曲线

本发明的有益效果：

1、本发明所述血栓通注射剂中5-羟甲基糠醛的检测方法，经过被测溶液的稳定性试验、准确度试验、精密度试验、重复性试验和线性关系的考察之后，证实具有操作简单、快速、准确度高、精密度高、稳定性好、重现性好等优点。

2、本发明所述血栓通注射剂中5-羟甲基糠醛的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，适合检测机构等实验室中对于血栓通注射剂的专门性检测工作，特别是可大批量检测，大大提高检测效率。此外，本发明所述方法可以为企业标准或者行业标准的建立提供重要的参考依据。

附图说明

图1是5-羟甲基糠醛的标准曲线。

图2是5-羟甲基糠醛对照品HPLC图。

图3是血栓通注射液的HPLC图。

图4是注射用血栓通（冻干）的HPLC图。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1

（1）仪器和试剂

高效液相色谱仪: Agjlent 1100 ；5-羟甲基糠醛对照品购自中国药品生物制品鉴定所，鉴别用，批号：111626-200301，其高效液相色谱图如图2所示；甲醇为色谱纯；血栓通注射液生产企业为广西梧州制药（集团）股份有限公司，生产批号：090801。

（2）方法与结果

（a）对照品溶液的制备：取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加水制成1μg/ml的溶液；

（b）供试品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为供试品溶液；

（c）设置色谱条件，并进行检测：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定；

（d）计算得出5-羟甲基糠醛的含量：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；由样品色谱图求出峰面积，将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中5-羟甲基糠醛的含量。

所述色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：CAPCELLPAK C18，5μm ，4.6×250mm；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（10：90）；流速：0.8ml/min；柱温：25℃；测定波长：284nm；进样量10μl；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算为8000。

实验结果如图3所示，测得5-羟甲基糠醛的含量为0.101μg/ml。

实施例2

（1）仪器和试剂

高效液相色谱仪: Agjlent 1100 ；5-羟甲基糠醛对照品购自中国药品生物制品鉴定所，鉴别用，批号：111626-200301，其高效液相色谱图如图2所示；甲醇为色谱纯；注射用血栓通（冻干）生产企业为广西梧州制药（集团）股份有限公司，生产批号：10040114。

（2）方法与结果

（a）对照品溶液的制备：取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加水制成1μg/ml的溶液；

（b）供试品溶液的制备：精密称取注射用血栓通（冻干）约37mg，精密加入1ml水溶解，配成37mg/ml的溶液作为供试品；

（c）设置色谱条件，并进行检测：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定；

（d）计算得出5-羟甲基糠醛的含量：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；由样品色谱图求出峰面积，将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中5-羟甲基糠醛的含量。

所述色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：CAPCELLPAK C18，5μm ，4.6×250mm；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（10：90）；流速：0.9ml/min；柱温：26℃；测定波长：285nm；进样量10μl；理论板数按5-羟甲基糠醛峰计算为8000。

实验结果如图4所示，测得5-羟甲基糠醛的含量为1.250μg/ml。

Claims (2)

1.一种血栓通注射剂中5-羟甲基糠醛的检测方法，其特征在于：其检测方法包括以下步骤：

（a）对照品溶液的制备：取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加水制成1μg/ml的溶液；

（b）供试品溶液的制备：取血栓通注射液直接作为供试品溶液，或取注射用血栓通配成37mg/ml的溶液作为供试品；

（c）设置色谱条件，并进行检测：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照一定的色谱条件进行测定；

（d）计算得出5-羟甲基糠醛的含量：以对照品进样量为横坐标（X），对照品峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程；由样品色谱图求出峰面积，将样品峰面积代入回归方程，计算得出样品中5-羟甲基糠醛的含量。

2.根据权利要求1所述血栓通注射剂中5-羟甲基糠醛的检测方法，其特征在于：所述色谱条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

色谱柱：CAPCELLPAK C18，5μm ，4.6×250mm；

流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（10：90）；

流速：0.8～1.0ml/min；

柱温：23～28℃；

测定波长：282～286nm；

进样量10～15μl；

理论板数:按5-羟甲基糠醛峰计算不低于8000。