CN107964500A - 灌流培养装置以及灌流培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能够实现呈多层结构的细胞的培养的灌流培养装置以及灌流培养方法。灌流培养装置(1)具备：作为片状的载体的膜(115)，其以能够供作为培养液的培养基通过的状态接种细胞；容器(10A)，其以培养基与膜(115)的表背两面接触的状态保持膜(115)；以及气室(119)，其通过从外部对与膜(115)的表背两面中的至少一面接触的一侧的培养基施加压力，从而在与另一面接触的一侧的培养基之间形成压力差，根据压力差而使培养基通过膜(115)。

Description

灌流培养装置以及灌流培养方法

技术领域

本发明涉及包括细胞以及活组织的培养等的细胞培养。

背景技术

以往，开展了面向iPS细胞、ES细胞等的实用化的研究。该研究的目的之一在于实现培养细胞并将其培养物向人体移植的再生医疗。决定这种再生医疗的成败的关键点在于细胞等的培养的可靠性、精度。在将细胞接种于充满培养液即培养基的培养容器中而进行的培养过程中，通过适当地更换培养基能够提高培养的精度。

例如在下述的专利文献1中，提出了自动地更换培养容器内的培养基的培养装置。该培养装置利用泵将气密结构的培养容器的培养基排出并供给新鲜的培养基，从而能够实现培养基的更换。根据该培养装置，能够自动地更换培养容器内的培养基，能够减轻培养基更换的作业负担。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2008-86264号公报

然而，在所述以往的培养装置中，存在如下的问题。即，采用将细胞粘贴于底面而进行接种的培养容器，因此能够向细胞的表面侧相对充分地供给培养基，另一方面，即使适当地实施培养基更换，也存在对于细胞的内侧的培养基的供给不足的可能性，因此，存在不适于细胞呈多层结构这样的组织的培养的问题。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是鉴于所述以往的问题点而完成的，其提供能够实现呈多层结构的细胞的培养的灌流培养装置以及灌流培养方法。

用于解决课题的方案

本发明的一方式涉及一种灌流培养方法，其中，将细胞保持于能够供作为培养液的培养基通过的片状的载体，并且以培养基与所述片状的载体的表背两面中的至少任一面接触的状态保持所述载体，通过从外部对所述片状的载体的表背两面中的至少一面侧施加压力，从而在所述片状的载体的两侧设置压力差，通过所述压力差而使培养基通过所述片状的载体(技术方案1)。

本发明的一方式涉及一种灌流培养装置，具备：片状的载体，其以能够供作为培养液的培养基通过的状态保持细胞；以及容器，其以培养基与表背两面中的至少任一面接触的状态保持所述片状的载体，通过从外部对所述片状的载体的表背两面中的至少一面侧施加压力，从而在所述片状的载体的两侧形成压力差，根据所述压力差而使培养基通过所述片状的载体(技术方案4)。

发明效果

在本发明所涉及的灌流培养方法以及灌流培养装置中，在所述片状的载体的两侧设置压力差，根据该压力差而使培养基通过所述片状的载体。在该灌流培养方法等中，能够在透过由所述片状的载体保持的细胞的方向上供给培养基。因此，例如在培养多层结构的细胞的情况下，能够对下层、中间层的细胞高可靠性地供给培养基。

这样，本发明所涉及的灌流培养方法以及灌流培养装置成为具有能够实现呈多层结构的细胞的培养的优异特性的培养装置。

附图说明

图1是示出灌流培养装置的立体图。

图2是对灌流培养方法进行说明的图。

图3是示出灌流培养装置的电气结构的框图。

图4是示出另一灌流培养装置的结构的局部的说明图。

图5是示出另一灌流培养装置的结构的局部的说明图。

图6是示出另一灌流培养装置的结构的局部的说明图。

图7是对培养容器的培养基与凹井的培养基的水位差进行说明的图。

附图标记说明

1 灌流培养装置；

10 凹井(收纳容器)；

10A 容器；

100 控制单元；

11 培养容器；

115 膜(片状的载体)；

119 气室；

14 壳体；

151、152 液面传感器(液面高度检测部)；

21、211、213 容池；

22、221、223 泵；

251～253 阀。

具体实施方式

在本发明中，对于将细胞保持于所述片状的载体而言，除该片状的载体直接保持细胞的方式以外，还包括所述片状的载体保持胶原、琼脂等直接保持细胞的支承件，从而所述片状的载体经由支承件等其他构件来间接地保持细胞的方式等。

作为从外部对所述片状的载体的表背两面中的至少一面侧施加压力的方法，有从外部对与该一面接触的培养基施加压力的方法、通过与该一面接触的气体的压力而从外部施加压力的方法等。

在本发明中，可以使培养基与所述片状的载体的表背两面中的任一面接触，也可以使培养基与表背两面接触。在培养基仅与任一面接触的情况下，可以从外部对与一面接触的该培养基施加压力。例如在采用利用保持细胞的胶原、琼脂等支承件且所述片状的载体保持该支承件的结构的情况下，可以采用培养基仅与所述片状的载体的表背两面中的任一面接触的结构。对于采用该结构的情况下的培养，采用使培养基从所述片状的载体的不与培养基接触的一侧的面滴落的方式。并且，在采用培养基仅与所述片状的载体的表背两面中的任一面接触的结构的情况下，例如，也可以通过对不与培养基接触的另一面侧施加负压来形成所述压力差。

在本发明所涉及的灌流培养方法中，也可以为，通过使从所述外部施加的压力的大小周期性地变化，从而使所述压力差周期性地变动(技术方案2)。例如若使所述压力差以接近心脏的跳动的周期变动，则能够实现更接近活体的环境下的培养。

也可以为，使不同成分的培养基与所述片状的载体的表背两面接触，并且交替地切换将所述片状的载体贯穿的方向上的压力梯度的朝向(技术方案3)。该方法适用于例如一侧面对血液而另一侧面对尿的肾脏等的细胞、组织的培养。例如也可以在任一方的培养基中含有在细胞增殖、分化时进行协助的饲养细胞。在该情况下，能够在所述片状的载体的两侧高效地培养特性不同的细胞。

也可以为，本发明所涉及的灌流培养装置的所述容器构成为包括外周面的至少一部分由所述片状的载体形成的培养容器、以及能够收容所述培养容器的收纳容器，通过从所述外部对所述收纳容器以及所述培养容器中的至少任一方的容器的内侧施加压力来形成所述压力差(技术方案5)。在该情况下，通过收纳容器收容培养容器这样的比较简单的结构，能够构成利用通过所述片状的载体的培养基来培养细胞的灌流培养装置。

也可以为，在所述培养容器以及所述收纳容器中的至少任一方的容器设置有检测所贮存的培养基的液面高度的液面高度检测部(技术方案6)。在该情况下，容器所贮存的培养基的液面高度的管理变得容易。作为液面高度检测部，可以构成为检测液面高度是否到达规定高度，也可以构成为通过测量距液面的距离来检测液面高度。

也可以为，培养基与所述片状的载体的表背两面接触，所述灌流培养装置还具备用于控制所述培养容器所贮存的培养基的液面高度与所述收纳容器所贮存的培养基的液面高度的不同即水位差的机构。只要控制该水位差，便能够控制来源于水位差并施加于所述片状的载体的液压的成分。例如若将该水位差设为零，则能够使来源于水位差且施加于所述片状的载体的液压的成分接近零。而且，在该情况下，施加于所述片状的载体的液压的接近100％来源于从外部施加于培养基的压力，从而施加于所述片状的载体的液压的调整等变得容易。

也可以为，从外部对所述收纳容器以及所述培养容器中的一方的培养基施加压力，另一方面，在另一方的培养基设定正的水位差。在该情况下，在所述压力差为正值时，能够对所述片状的载体施加从该一方的培养基侧朝向所述另一方的培养基的液压。在所述压力差为零时，能够根据所述水位差，对所述片状的载体施加从所述另一方的培养基侧朝向所述一方的培养基的液压。若像这样设定所述水位差，则即便不使所述压力差的正负反转，也能够反转施加于所述片状的载体的液压的朝向。

也可以为，所述灌流培养装置构成为具备能够填充气体的气室，通过对培养基施加填充于所述气室的气体的压力来形成所述压力差(技术方案7)。在借助气体施加压力的情况下，能够对培养基施加接近均衡的压力。若施加于培养基的压力均衡，则能够避免在培养基中产生急剧的流动的状况，能够抑制过度地刺激细胞的可能性。只要抑制对细胞的过度的刺激，便能够提高培养的可靠性、精度。需要说明的是，所述气室可以是气密结构的气室，也可以是具有流入口和流出口并且通过气体流动时的压力损失来产生所述压力的气室。

[实施例]

使用以下的实施例对本发明的实施方式进行具体说明。

(实施例1)

本例是与能够在透过培养对象的细胞的方向上产生培养基的流动的灌流培养装置1以及由该灌流培养装置1进行的细胞的培养方法相关的例。利用图1～图7对其内容进行说明。

如图1所示，灌流培养装置1是紧凑地设置有收容培养容器11的六处凹井(收纳容器)10、贮存新鲜的培养基(培养液)的容池211、回收使用后的培养基的容池213、用于从外部对培养基施加压力的贮存气体的储气瓶24等的一体型的装置。

在该灌流培养装置1中配备有将容池211的培养基向培养容器11供给的泵221、将凹井10的培养基向容池213回收的泵223、控制储气瓶24的气体的阀251～253(图2)、调节器250(图2)等，并装入有控制整体工作的控制单元100(图3)。

灌流培养装置1能够通过预先装入控制单元100的工作程序等进行单体的工作。例如，灌流培养装置1能够在收纳于温度、湿度、二氧化碳气体浓度等受到管理的未图示的培养器内的状态下使用，能够实施细胞的培养。

灌流培养装置1是将顶板13与设置有形成凹井10、容池21的凹部、储气瓶24的收容空间等的壳体14组合而成的装置。顶板13除具有用于贯通配置泵22的上部的孔以外，还具备用于对凹井10、容池21等进行密闭的气密衬垫130、131、135。另外，在顶板13铺设或形成有将凹井10与泵22连结的未图示的配管、将泵22与容池21连结的未图示的配管、以及从储气瓶24到凹井10的未图示的配管等。

当通过螺纹紧固等将顶板13安装于壳体14时，能够通过气密衬垫130、131、135将凹井10、培养容器11、容池21等密闭。并且，通过将顶板13与壳体14组合，能够将壳体14侧的配管与顶板13侧的配管连接，由此能够确保灌流培养装置1的工作所需的培养基、气体的路径(图2中的附图标记18、17)。需要说明的是，例如也可以采用上板与中间板两张板重叠结构的顶板13。例如通过将上板层叠于在表面贯穿设置有形成配管的槽的中间板，能够利用槽形成培养基、气体的配管等路径。

如图1以及图2所示，凹井10是收容杯状的培养容器11的外侧容器。凹井10具有用于保持培养容器11的未图示的支承架，能够以在培养容器11的下侧设置有间隙的状态固定培养容器11。在将顶板13组合于壳体14时，通过气密衬垫130、131同时对培养容器11以及凹井10各自进行密闭，以各个开口部成为相同的高度的方式设定高度方向上的尺寸等。

培养容器11是形成接种(保持)细胞的片状的载体的一例的在底面设置有多孔质的膜115的杯形状的容器。膜115例如由具有多个直径约为0.3～0.5μm的微孔的膜过滤器等形成。细胞形成与凝胶混合而成的细胞悬浮液的层117而被接种并保持于膜115，以便能够防止膜115的堵塞。需要说明的是，膜115也可以设计为，设置有多个孔径1～10μm或者更大的100μm左右的孔且孔本身不会成为流路阻力。在该情况下，作为用于接种细胞的支承件可以采用胶原、琼脂等，使上述支承件进入孔的内部。

如图1以及图2所示，培养容器11在贮存有培养基的状态下，收容于同样贮存有培养基的凹井10。在本例的灌流培养装置1中，通过培养容器11与凹井10的组合，构成以培养基与接种细胞的膜115的表背两面接触的状态保持膜115的容器10A。在该容器10A中，培养容器11的培养基通过底面的膜115而进入凹井10。形成培养容器11的底面的膜115与凹井10的底面隔开间隙地配置，由此，确保通过膜115的培养基的流路。

如图2所示，在凹井10以及培养容器11中，设置有光学性地检测液面高度的液面传感器(液面高度检测部)151、152。液面传感器151、152是测距传感器，该测距传感器通过将输出与受光位置相应的强度的电信号的一维PSD(Position Sensitive Detector)元件、以及发出红外光的发光二极管组合而成。发光二极管与PSD元件的上述的一维方向错开地配置。根据该液面传感器151、152，能够根据发光二极管发光时的PSD元件所输出的电信号的强度等来测量培养基的液面高度。

在培养容器11中，利用由液面传感器152得到的测量值而将培养基的液面高度控制为规定的高度，由此在培养基与顶板13之间形成有气室119。在该气室119中设置有测量所填充的气体的压力的压力传感器153、测量气体中的氧浓度的O₂传感器154等、用于控制的各种传感器。需要说明的是，与气室119同样地在凹井10形成有气室118，通过未图示的路径将大气压的杀菌后的空气导入该气室118。

如图2所示，在灌流培养装置1中形成有将容池211的新鲜的培养基向培养容器11供给并经由凹井10将使用后的培养基向容池213回收的培养基的路径18、以及从储气瓶24经由培养容器11(气室119)向大气开放的气体(gas)的路径17。

培养基的路径18是用于对接种于膜115的细胞灌流新鲜的培养基的路径。气体的路径17是向气室119填充用于对培养容器11的培养基施加压力的路径。

培养基的路径18形成为包括将容池211的新鲜的培养基向培养容器11供给的供给路径181、以及将凹井10内的使用后的培养基向容池213回收的回收路径183。在供给路径181中设置有汲取容池211的培养基的供给用的泵221。在回收路径183中设置有汲取凹井10内的培养基的回收用的泵223。需要说明的是，对于各凹井10以及各培养容器11，能够通过分别独立的路径来供给或回收培养基，从而进行液面高度等的个别调整。

气体的路径17由以填充有气体的储气瓶24作为起点并到达培养容器11内的气室119的供气路径171、以及从气室119向大气开放的排气路径173形成。作为储气瓶24，具备氧气瓶241、二氧化碳气瓶242、以及氮气瓶243，将混合后的气体向气室119供给。需要说明的是，对于各气室119，能够通过分别独立的路径来供给或排出气体，从而进行压力的个别调整。

在供气路径171的中途设置有针对每个储气瓶241～243而设置的阀251～253、用于对各储气瓶241～243的气体混合而成的高压的气体进行减压并向气室119供给的调节器250、以及未图示的空气流量计等。各储气瓶241～243的气体通过阀251～253的控制以规定比例混合而成为混合气体，并在调节器250中被减压而向气室119填充。需要说明的是，混合气体中的氧和二氧化碳是细胞的生存所需的成分。另外，二氧化碳具有抑制培养基的氧化的效果，其浓度通常5％是合适的。

在本例中，作为调节器250，采用能够通过来自外部的控制来调节要进行减压的压力的调节器。各储气瓶241～243的混合气体由该调节器250减压至所希望的压力而向气室119供给。需要说明的是，也可以代替调节器250或在其基础上配置压缩泵，以便能够适当变更向气室119供给的气体的压力。

在排气路径173中设置有开放阀258，该开放阀258切换是否使培养容器11的气室119内的气体向大气开放。开放阀258在更换气室119内的气体时、调整气室119的内压时被适当控制为打开状态。在更换气体时，将开放阀切换为打开状态，另一方面，在调整压力时，例如可以对开放阀258应用周期性地反复成为打开状态和关闭状态的占空控制。根据占空控制，通过变更一个周期中的打开状态的占有比例，能够变更开放阀258的阀开度从而调整压力损失的大小，由此，能够实现气室119的内压的控制等。这样，在本例的灌流培养装置1中，通过气室119、向气室119供给气体的储气瓶24、调节器250、开放阀258等，形成通过从外部对培养基施加压力而在膜115的两侧设置压力差的压力机构。

如图3所示，灌流培养装置1以控制单元100为中心电气性地构成。在控制单元100连接有用于掌握装置的工作状态的各种传感器，并且连接有作为控制对象的泵、阀等。作为传感器，除上述的液面传感器151、152以外，还有测量气室119的压力的压力传感器153、测量气室119的氧浓度的O₂传感器154等。作为泵，有夹设于培养基的路径18中的上述的供给用的泵221、回收用的泵223、以及夹设于气体的路径17中的上述的调节器250等。作为阀，有夹设于气体的路径17中的上述的阀251～253、上述的开放阀258等。

接下来，对于利用了如上述那样构成的灌流培养装置1的细胞的培养方法，分为(1)准备作业和(2)运转来进行说明。

(1)准备作业

在进行细胞的培养时，首先，在形成各凹井10的培养容器11的底面的膜115接种所培养的细胞。此时，所培养的细胞形成为悬浮液，并且优选与凝胶混合而接种于形成培养容器11的底面的膜115。若像这样使细胞的悬浮液与凝胶混合，则能够防止膜115的堵塞。

在向各凹井10以及各培养容器11填充新鲜的培养基，并且向供给用的容池211填充更换用的新鲜的培养基后，将顶板13安装于壳体14。若安装有顶板13，则如上述那样，能够将容池21、凹井10、培养容器11等密闭，并且能够将顶板13侧的配管等与壳体14侧的配管等连接，从而能够确保培养基的路径18以及气体的路径17。

完成以上所述的准备作业后的灌流培养装置1可以收容于温度、湿度、二氧化碳气体浓度等受到管理的未图示的培养器。若处于培养器内的稳定的环境下，则能够高可靠性且高精度地执行细胞的培养。

(2)运转

向灌流培养装置1接入电源，通过未图示的起动按钮等开始工作。与工作开始相应地，控制单元100首先为了使培养容器11的气室119向大气开放而将开放阀258切换为打开状态，并且控制供气路径171的阀251～253等从而向培养容器11的气室119供给气体。

若在将排气路径173的开放阀258打开的状态下供给气体，则能够将气室119内的空气挤出而填充气体。需要说明的是，控制单元100通过分别控制三个阀251～253的开度从而生成规定的成分比例的混合气体，通过调节器250将该混合气体减压至规定压力并向气室119供给。

控制单元100在供给气室119内的空气的挤出所需的量的气体后，将开放阀258切换为压力控制模式，控制开放阀258使得培养容器11内的气体的压力成为规定压力。需要说明的是，在细胞的培养过程中，控制阀251～253、调节器250使得每单位时间向气室119供给规定量的气体，并且控制调节器250、开放阀258等使得培养容器11的气体的压力成为规定压力。气体的压力施加于培养容器11中贮存的培养基的液面而进行加压，对接种有细胞的膜115施加液压。需要说明的是，在本例中，将气室119内的气体的规定压力设为5kPa。通过气室119的气体的压力与气室118的大气压之差而在膜115的两侧设置压力差。而且，对膜115施加与该压力差相应的液压。

控制单元100在培养过程中每隔例如48时间等预先设定的规定时间而使供给用的泵221以及回收用的泵223工作，从而执行恒定量的培养基的更换。在培养基的更换中，通过供给用的泵221的工作而将新鲜的培养基向培养容器11供给，并且通过回收用的泵223的工作而将大致相等量的使用后的培养基从凹井10向容池213回收。这样，在灌流培养装置1中，能够将使用后的旧的培养基更换为新鲜的培养基并高可靠性地培养细胞。需要说明的是，也可以代替每隔规定时间的培养基的更换，而以不对细胞带来刺激的程度的低流量连续地进行培养基的更换。

控制单元100驱动供给用的泵221使得培养容器11的培养基的液面高度成为规定高度，并且驱动回收用的泵223使得凹井10的培养基的液面高度与培养容器11相同。若像这样在培养容器11和凹井10中使液面高度相同，则能够消除培养基的水位差。若消除水位差，则能够使施加于膜115的培养基的液压中的、来源于气室119的气体的压力的成分接近100％，从而液压的管理变得容易。

如以上那样，若通过本例的灌流培养装置1的运转来培养细胞，则能够对接种于膜115的细胞适当地供给培养基，能够高精度地实施培养。

在该灌流培养装置1中，通过利用气体对培养容器11的培养基进行加压，能够对在培养容器11的底面的膜115上接种的细胞施加培养基的液压。若像这样在贯通膜115的方向上施加培养基的液压，则能够形成透过接种于膜115的细胞的培养基的流动。能够对例如多层的分层的细胞的中间层或者下层的细胞高可靠性地供给培养基，能够避免内侧层的细胞的坏死等。

这样，本例的灌流培养装置1以及灌流培养方法是适于细胞呈多层结构的组织的培养的装置或者培养方法。

在例如将细胞静置于培养皿等容器的底面而进行培养的以往的通常的培养方法中，在仅连续地更换培养基的上清液的灌流培养方式下，无法将培养基充分地供给至组织、细胞团的深部的可能性高。因此，在该培养方法中，无法充分确保可维持细胞的期间的可能性高。另外，细胞具有沿着底面延展的性质，因此在该培养方法中，难以在透过细胞的方向上产生培养基的流动，不适于细胞呈多层结构的组织的培养等。

另一方面，在由本例的灌流培养装置1进行的培养方法中，将在底面开设有孔的如“滤器”这样的膜115用于细胞的接种，通过在该膜115的贯通方向上设置压力差，能够在透过细胞的方向上产生培养基的流动。若在透过细胞的方向上产生培养基的流动，则能够将培养基供给至细胞、组织的深部，能够长期维持细胞的稳定。

例如，在肝脏细胞的代谢过程中，对于以星状细胞、肝窦内皮细胞、肝实质细胞的顺序层叠的三种细胞，若不使培养基以该顺序流动则存在无法正常地生成胆汁的可能性。若像这样实现透过细胞的方向上的流动，则能够实现更加接近活体(in vivo)的环境下的培养。

另外，通过对接种的细胞施加压力，从而即使是具有厚度的带血管的组织也能够产生将培养基供给至组织深部的灌流，能够实现更加接近活体的条件下的培养。若控制所施加的压力，则能够调整透过带血管的组织的培养基的液量。由此，能够实现最佳条件下的培养。

这样，本例的灌流培养装置1是能够有助于由肝脏细胞形成的分层组织的构筑、具有血管的癌细胞的构筑、对于皮肤组织、iPS细胞等多能性干细胞的应用等的装置。

在灌流培养装置1中，通过调整接种细胞的膜115的表背两面侧的压力差，能够调整透过细胞的培养基的液压、流量。若非常细微地调整培养基的液压、流量，则能够提高培养的精度从而提高可靠性。特别是，在灌流培养装置1中，能够对细胞施加较大的液压，因此即使对于例如1mm左右的相对较厚而透过阻力大的组织也能够供给培养基。

作为用于接种细胞的支承件，有时也利用胶原、琼脂等。在将透过阻力高的琼脂用于支承件的情况下，培养基难以透过。另一方面，根据本例的灌流培养装置1，通过从外部对培养基加压能够实现较高的液压，从而即使在采用琼脂等透过阻力高的支承件的情况下也能够使培养基透过。

在灌流培养装置1中，通过调整培养容器11的气室119的压力，能够调整接种细胞的膜115的两侧的压力差，由此能够控制对膜115侧施加的液压。例如若使气室119的压力周期性地升降，则能够实现具有脉动从而模拟心脏的搏动、血压的脉动的液压的控制。若进行产生模拟血压的脉动的压力变动的控制，则能够高精度地培养血压的脉动的影响下的细胞。

在灌流培养装置1中，将大气压导入凹井10侧的气室118。例如若将培养容器11侧的气室119设为负压，则能够反转施加于膜115的液压的朝向(压力梯度的朝向)。与培养容器11侧的气室119同样地，也优选提高气室118的气密性并填充气体。通过增高气室118与气室119中的任一方的压力，能够切换将膜115贯穿的方向上的压力梯度的朝向，从而能够容易地变更对膜115施加液压的施加方向。

需要说明的是，也可以代替图2的培养基的路径18而采用图4所示的培养基的路径18。在该培养基的路径18中，经由供给路径181使凹井10的培养基回流至培养容器11。例如在由pH传感器155检测到凹井10内的培养基的pH降低时，经由路径182将新鲜的培养基从容池215向凹井10供给，并将等量的培养基经由路径185向容池215回收。

若像这样与pH的降低相应地随时将培养基更换为新鲜的培养基，则能够避免凹井10内的培养基的酸化，能够在一定程度的范围内维持向培养容器11回流的培养基的性状。若采用使凹井10的培养基向培养容器11回流的结构，则能够减少作为高价的消耗品的培养基的消耗量，从而能够抑制培养成本。

如图5所示，也可以为如下的灌流培养装置，在接种细胞的膜115的表背两面侧配置性状不同的培养基，并对一方的培养基施加正压或者负压从而在膜115的两侧设置压力差。在该装置中，在能够密闭的容器10A的中间高度设置成为分隔件的膜115，并且分别在膜115的上侧以及下侧设置培养基的供给端口以及回收端口。例如在容器10A的底面静置有向培养基中扩散特定的成分的饲养细胞110，由此，在膜115的上下两侧变更培养基的性状。

膜115的下侧的空间以培养基与膜115接触的方式无间隙地充满有培养基，另一方面，在膜115的上侧的空间中将培养基的液面调节为规定高度，从而在密闭的容器10A内形成气室119。而且，在该气室119连接有气体的路径17。通过调整气室119的气体的压力，能够调整对培养基施加的压力。

对上侧的培养基施加的气室119的压力可以为正压，也可以为负压。若为正压，则能够向接种于膜115的细胞供给上侧的培养基，另一方面，若为负压，则能够向细胞供给下侧的培养基。这种装置适于例如一侧面对血液而另一侧面对尿的肾脏的组织等、表背的两侧面对不同的体液等的细胞的培养。对于气室119的压力，可以控制正负按时间交替地变动。

如图6所示，对于具有将左右分割的分隔件111的容器10A，可以在分隔件111的孔112中配设的膜115的两侧分别设置气室119。可以控制各气室119的压力，也可以控制任一方的气室119的压力。在控制两方的气室119的压力的情况下，例如若将图中左侧的气室119设为正压而将右侧设为大气压，则能够形成从左向右而压力降低的压力梯度。反之，若将右侧的气室119设为正压，则能够形成朝向相反方向而压力降低的压力梯度。若分别控制左右的气室119的压力，则能够不利用负压而使压力梯度的方向反转。

灌流培养装置1具备测量培养容器11以及凹井10的液面高度的液面传感器151、152。通过液面传感器151、152与供给用以及回收用的泵221、223的组合，从而构成用于控制培养容器11所贮存的培养基的液面高度与凹井10所贮存的培养基的液面高度的不同即图7所例示的水位差的机构。需要说明的是，在该图中，为了能够明示水位差而将液面高度设为不同。对于包括液面传感器151、152的水位差的控制机构，不是本发明中的必需的结构。例如，若在准备作业中，适当地调整培养容器11以及凹井10后，控制供给用以及回收用的泵221、223使得向培养容器11供给培养基的供给量与来自凹井10的培养基的回收量相同，则能够在培养过程中适当地维持培养容器11以及凹井10的液面高度。另外，在本例中，将培养容器11的培养基与凹井10的培养基的水位差控制为零，但将水位差设为零不是必需的，也可以在培养过程中一定程度地产生水位差、发生变动，也可以将水位差控制为规定量。

需要说明的是，对于液面传感器151、152，除作为水位差的控制机构而利用以外，也用作防止培养基从培养容器11或凹井10溢出的不良状况的机构。

以上，如实施例那样对本发明的具体例进行了详细说明，但上述具体例仅公开了技术方案所包含的技术的一例。无需言及，不应当通过具体例的结构、数值等对技术方案限定性地进行解释。技术方案包括利用公知常识、本领域技术人员的知识等而对所述具体例进行各种变形、变更或者适当组合而成的技术。

Claims (7)

1.一种灌流培养方法，其中，

将细胞保持于能够供作为培养液的培养基通过的片状的载体，并且以培养基与所述片状的载体的表背两面中的至少任一面接触的状态保持所述载体，

通过从外部对所述片状的载体的表背两面中的至少一面侧施加压力，从而在所述片状的载体的两侧设置压力差，通过所述压力差而使培养基通过所述片状的载体。

2.根据权利要求1所述的灌流培养方法，其中，

通过使从所述外部施加的压力的大小周期性地变化，从而使所述压力差周期性地变动。

3.根据权利要求1或2所述的灌流培养方法，其中，

使不同成分的培养基与所述片状的载体的表背两面接触，并且交替地切换将所述片状的载体贯穿的方向上的压力梯度的朝向。

4.一种灌流培养装置，具备：

片状的载体，其以能够供作为培养液的培养基通过的状态保持细胞；以及

容器，其以培养基与表背两面中的至少任一面接触的状态保持所述片状的载体，

通过从外部对所述片状的载体的表背两面中的至少一面侧施加压力，从而在所述片状的载体的两侧形成压力差，根据所述压力差而使培养基通过所述片状的载体。

5.根据权利要求4所述的灌流培养装置，其中，

所述容器构成为包括外周面的至少一部分由所述片状的载体形成的培养容器、以及能够收容所述培养容器的收纳容器，通过从所述外部对所述收纳容器以及所述培养容器中的至少任一方的容器的内侧施加压力来形成所述压力差。

6.根据权利要求5所述的灌流培养装置，其中，

在所述培养容器以及所述收纳容器中的至少任一方的容器设置有检测所贮存的培养基的液面高度的液面高度检测部。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的灌流培养装置，其中，

所述灌流培养装置构成为具备能够填充气体的气室，通过对培养基施加填充于所述气室的气体的压力来形成所述压力差。