KR20230170045A - 상호 의존적 결합 공정 제어 루프를 갖는 최적화된 산업용 생물반응기 및 이의 방법 - Google Patents
상호 의존적 결합 공정 제어 루프를 갖는 최적화된 산업용 생물반응기 및 이의 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 영양 배지(11)에서 세포 배양물(5/51), 세포 성분(5/512) 또는 세포의 대사 생성물(5/52)에 대해 최적화된 배양 공정(21)을 제공하는 이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1)에 관한 것이다. 생물반응기는 배양 공정(21)에 대한 제어된 생물반응기 조건을 제공하는 반응기 용기(12), 적어도 영양 배지(11)의 조성(1411) 및/또는 영양 배지(11)의 농도(1412) 및/또는 산소(1413) 및/또는 온도(1413) 및/또는 pH-값(1415) 및/또는 멸균(1416)에 대한 측정치를 포함하는 센서 파라미터(141) 값을 측정하는 센서 장치(14)에 연결된 제어 유닛(13)을 포함한다. 제어 유닛(13)은 측정된 센서 파라미터(141) 값에 영향을 미치는 생물반응기(1)의 작동 파라미터를 조정함으로써 배양 공정(21) 동안 세포에 적용되는 처리 공정(31)의 작동 파라미터 및 배양 공정(21)의 작동 파라미터를 제어하고 자동으로 최적화한다.
Description
본 발명은 일반적으로 바이오매스의 산업적 생산, 및 특히 생물반응기를 이용하여 세포 배양물, 세포의 성분 또는 세포 배양물의 대사 생성물에 대한 제어된 배양 공정을 제공함으로써 바이오매스를 생성하는 산업적 공정에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 생물반응기 내에서 세포 배양 및 처리에 의해, 예를 들어 펄스-조절된 전계 전위를 적용함으로써 바이오매스를 생성하는 산업적 공정에 관한 것이다.
(i) 생물반응기
생물반응기(유기물을 산, 가스 또는 알코올로 미생물 또는 효소적 변환하는 맥락에서 발효기라고도 지칭됨)는 전형적으로 특정 미생물, 세포 또는 작은 식물이 기술적으로 제어된 조건이 적용되는 하에서 배양(발효)되는 용기이다. 따라서, 생물반응기의 작동은 기술적 설비에서 생물학적 공정(생물 전환, 생물 촉매)을 사용하거나 활용하는 생명공학 분야의 응용이다. 대부분의 생물반응기에서 제어 가능하거나 조작 가능한 중요한 인자, 특성 및/또는 작동 파라미터는 예를 들어, 영양 배지(또한 영양 용액 또는 기질)의 조성, 산소 공급, 온도, pH 값, 멸균 등이다. 생물반응기에서 배양의 목적은 세포 또는 세포의 성분의 제어된 회수 또는 대사 생성물의 회수 또는 이와 같은 세포 배양물의 제어된 대사일 수 있다. 세포, 세포의 성분 또는 대사 생성물은 예를 들어, 제약 산업의 활성 성분으로서, 화학 산업의 기초 화학물질로서, 또는 세포 배양, 예를 들어, 템페(tempeh), 미소, 코지(koji), 및 간장 등과 같은 발효 식품 또는 배양된 고기 생산으로서, 예를 들어 배양된 식품 생산의 맥락에서, 또는 장기 또는 조직 대체 치료 등과 같은 의료적 응용에서 사용될 수 있다. 화학 화합물의 분해는 하수 처리 공장의 폐수 처리에서와 같이 생물반응기에서 또한 발생할 수 있다. 더욱이, 맥주, 와인 및 기타 제품의 생산은 또한 생물반응기(발효기)에서 발생한다. 오늘날, 다양한 생물체가 상이한 목적으로 생물반응기에서 배양된다. 여러 반응기 변형들은 상이한 설계로 이용 가능하다. 예들은, 수 리터 내지 수천 리터의 부피를 가질 수 있는 금속으로 제조된 교반 탱크 반응기이고, 영양 용액으로 채워진다. 그러나, 고정층 반응기, 광생물반응기 등과 같이 광범위하고 상이한 변형들이 또한 사용된다.
생물 반응기의 주요 목적은 가능한 가장 높은 제품 수율을 제공하는 것이다. 이는 특히 특정한 경우에서 성장한 유기체 또는 세포에 대한 최적의 조건을 생성함으로써 달성된다. 생물 반응기의 조건은 자연 서식지, 배양된 유기체 또는 배양된 세포의 자연 환경에 널리 퍼져 있는 다양한 파라미터로 조정된다. 전형적으로, 영양분의 유형 및 농도, 온도, 산소 함량, pH 값 등으로서의 배양 공정 파라미터는 최적화된 배양을 달성하기 위해 중요하거나 중대하다. 파라미터의 제어는 예를 들어, 반응기 챔버 위에서 이러한 파라미터의 균질한 조정을 보장하기 위해 필요한 센서, 액추에이터 또는 기타 장치로서 기술적 장치를 사용하여 실현된다. 유기체 또는 세포의 요건에 추가하여, 작동 파라미터의 선택에 영향을 미치는 다른 기술적, 조직적 및 경제적 요인들이 보통 고려되어야 한다. 예들은, 특히 거품 형성 방지 및 연속식 또는 배치 모드 작동 중 하나의 선택이 될 수 있다. 프로브 또는 센서를 사용하여 이러한 많은 파라미터들이 예를 들어, 영양 배지 또는 배기 공기에서 직접 측정될 수 있다. 또한, 공정의 과정은 또한 일반적으로 이러한 파라미터를 통해 평가되거나 모니터링될 수 있다. 세포 밀도는 흡광도(광학 밀도)를 측정함으로써 결정될 수 있으며, 이는 결과적으로 제품 수량에 대한 결론을 도출할 수 있게 한다. 대안은, 예를 들어, 광학 센서 또는 다른 적절한 센서에 의한, 흔히 특징적인 화학 화합물의 농도 예를 들어, 대사 생성물의 농도 증가 또는 기질의 농도 감소의 측정이다. 배양 또는 발효 공정의 초기에, 일반적으로 사전 배양에서 배양되고 수득될 미생물 또는 세포의 소량이 배양 배지에 첨가된다. 이 양을 접종량이라고 하며, 이러한 공정을 보통 접종이라고 한다. 배양 공정으로부터 수득된 현탁액은 소위 하류 가공 동안 여러 공정 단계로 제조된다.
영양 배지는 유기체/세포에 그들이 성장에 필요한 모든 영양소를 제공해야 한다. 여기에는 예를 들어, 탄소, 질소 및 인과 같이 더 많은 양이 필요한 주요 영양소(대량 영양소)가 포함된다. 또한, 다양한 미량 요소(미량 영양소)가 필요할 수 있다. 배양하고자 하는 유기체/세포에 따라, 유기체/세포 자체에서 합성될 수 없는 다른 화합물(예컨대, 비타민, 필수 아미노산 등)이 필요할 수 있다. 당 포도당과 같은 에너지-제공 화합물이 또한 필요할 수 있다(광영양 유기체에서는 제외). 유기체와 세포는 전형적으로 각각 그들이 가장 잘 자라고 번식할 수 있는 최적의 온도를 가진다. 이 온도를 초과하면 단백질의 변성을 통해 비가역적 손상으로 이어질 수 있고, 이 온도 미만으로 떨어지면 대사율이 저하되어 공정 기간이 더 길어질 수 있다. 온도 제어는 예를 들어, 적용된 가열 및 냉각 회로의 제어에 의해 실현될 수 있다. 생물반응기가 시작되면 전체 반응기 내용물이 작동 온도로 가열되거나 데워진다. 어떤 경우에는 배양된 유기체 또는 세포가 그들의 대사를 통해 폐열을 너무 많이 생성시켜 냉각 회로가 특정 세포 농도 초과로 활성화되어야 한다. 열 교환기는 이 회로에 통합될 수 있거나, 에너지-함유 배지가 직접 공급될 수 있다. 이 경우에서 반응 챔버에서 사용가능한 유일한 열 교환 표면은 대개 이중 용기 벽이거나, 다른 경우에서 또한 내장된 냉각 레지스터이다.
배양되는 유기체 또는 세포 및/또는 제품에 따라, 배양(발효) 공정은 호기성(산소 함유 대기에서) 또는 혐기성(산소 없이)으로 수행될 수 있다. 산소는 물에 잘 용해되지 않기 때문에, 호기성 접근을 적절하게 공급하는 것이 어려울 수 있다. 예를 들어, 37℃의 온도를 지닌 발효 배지에 대한 산소 용해도는 3-5 mg/L이다. 반응기의 산소 분압은 예를 들어, (i)가스 유량의 변경, (ii)교반기 속도의 변경, (iii)교반기 공구 기하학의 변경, (iv)가스 혼합물 조성의 변경, 또는 (v)헤드 압력의 변경으로서, 상이한 방법들로 조절될 수 있다(하지만, 이는 또한 다른 가스, 예를 들어, 이산화탄소의 용해도를 증가시킨다). 반면에, 혐기성 유기체의 경우, 산소 공급은 전형적으로 독성이 있을 수 있으므로 일반적으로 피해야 한다. 혐기성 유기체의 혐기성 접근에서, 산소 공급은, 예를 들어, 공정 수율을 감소시킬 수 있는, 원하지 않는 호기성 반응을 가능하게 할 수 있다. 배양된 유기체 또는 세포는 보통 pH 최적의 제한된 pH-값 허용 범위를 가진다. pH는 예를 들어, 제어 조종 및/또는 프로그램 가능 논리 제어기(PLC)를 통해 pH-센서에 결합 또는 연결된 펌프로 제어될 수 있으며, 여기서, 펌프는 필요에 따라, 인산(H3PO4), 염산(HCl) 또는 수산화나트륨 용액(NaOH) 등을 생물반응기로 펌핑하여 pH-값을 감소 또는 증가시킨다. 특정한 경우, 정의된 pH-값은 기질 공급 속도를 조정함으로써 또한 달성될 수 있다. 정의된 균질화에 도달하기 위해, 생물반응기는 배지가 이를 통해 순환되는 교반기 또는 가스 주입기와 같은 교반 장치를 더 포함할 수 있다. 이는 반응기 전체에 걸쳐 다양한 파라미터의 가능한 균질한 설정을 보장하고, 이에 따라 보다 균일한 공정 흐름을 보장하는 데 사용된다. 생물반응기의 작동 모드는 전형적으로 다음과 같이 구별될 수 있다: (i)배치 작동: 반응기의 충전, 배양/발효 공정 동안 첨가 또는 제거 없음, 단순한 제어, 오염 가능성 없음; (ii)공급-배치 작동: 배치 작동과 유사하지만, 예를 들어, 초기의 높은 기질 농도로서, 공정 동안의 기질 첨가가 억제될 수 있음; 및 (iii)키모스태트(chemostat) 생물반응기에서의 연속적인 작동: 기질 첨가 및 생성물 제거에 의한 중단 없는 작동, 복잡한 제어, 오염 처리, 및 값비싸고 복잡한 하류 공정이 또한 연속적으로 수행될 수 있으므로, 보다 최적으로 활용됨.
유지될 작동 파라미터는 기술적 또는 다른 이유로 유기체 또는 세포 유형에 강력히 의존될 수 있다. 따라서, 특정 용도를 위해, 적절한 생물반응기를 종종 설계해야 하거나, 다양한 파라미터가 다양한 유기체 또는 세포의 배양에 사용될 수 있도록 넓은 매개변수 값 범위 또는 창 내에서 제어될 수 있는 특정 유형의 생물반응기가 사용될 수 있다. 일반적인 유형은 상이한 변형(물질, 크기 등)의 가스화 가능한 교반 탱크 반응기이다. 종래 기술에서, 예를 들어, (i)교반 탱크 반응기: 광범위한 유형; 액체 상은 교반기에 의해 순환되고; 필요에 따라 가스화가 수행됨; (ii)고정층 반응기: 반응기는 유기체(또는 효소)가 고정화될 수 있는 고체, 다공성 매트릭스로 채워짐; 따라서, 유기체는 배지로 내보내지는 대신 반응기에 남아 유기체의 성장이 덜 제한적인 요인이 됨(또는 효소 요구량이 감소됨); (iii)낙차 스트림 반응기(낙수 필터): 고정층에 액체(예를 들어, 처리될 폐수)가 뿌려짐; 분해되는 유기체는 표면에 위치됨; (iv)광생물반응기(조류 반응기, 수소 생물반응기): 광합성을 수행하는 유기체(조류, 식물(세포)의 배양을 위함; 반응기는 유리로 만들어져 필요한 빛이 유기체에 도달하도록 함; 빛의 사용은, 예를 들어, 판- 또는 관-형 반응기에 의해 최적화될 수 있음; (v)관형 반응기: 관형 반응기에서 플러그 흐름이 생성될 수 있음; 및 (vi)막 생물반응기: (적용에 따라 달라지는) 반응 생성물, 바이오매스 또는 정제수가 막에 의해 영구적으로 분리될 수 있는 반응기를 포함하는 반응기 설계의 유형에 따라 분류를 구별하는 것이 이루어질 수 있다. 이를 위한 적용은 폐수 처리(막 생물반응기(MBR)), 젖산 회수 및 의약품을 포함한다. 마지막으로, 생물반응기의 공정들은 기술적으로 예를 들어, 구현된 반응속도론에 의한 파라미터 처리에 의해 시뮬레이션될 수 있지만, 시뮬레이션은 생물학적 공정(예를 들어, 미카엘리스-멘텐 이론(Michaelis-Menten theory), 모노드 속도론(Monod kinetics), 효소 속도론(enzyme kinetics), 효소 억제 등)의 세부사항을 고려해야 한다.
예를 들어, 생물반응기로서, 산업적 공정 및 장치 설정에서, 제어 시스템은 생물반응기 내의 배양 또는 처리 공정으로서, 산업 또는 화학/생물화학 공정의 생물반응기, 설비, 시설 또는 다른 장비, 및 작동/공정을 모니터링, 제어, 조종 및 신호화하는 데 사용된다. 전형적으로, 제어 및 모니터링을 수행하는 시스템은 산업적 공정 내의 핵심 위치, 예를 들어, 생물반응기 내에서 분산된 필드 장치(field device)를 사용하고, 공정 제어 루프에 의해 제어 회로에 결합된다. 용어 "필드 장치"는 산업적 공정 및 공정 설비의 예를 들어, 센서 및 측정 장치로서 측정, 제어, 모니터링 및 신호화에 사용되는 모든 장치를 포함하여, 분산 제어 또는 공정 모니터링 시스템에서 기능을 수행하는 임의의 장치를 지칭한다. 각각의 필드 장치는 예를 들어, 통신 수단, 및 공정 제어 루프를 통해 공정 제어기, 다른 필드 장치 또는 다른 회로와 특히 유선 또는 무선 통신하기 위해 사용되는 회로를 포함할 수 있다. 일부 설비에서, 공정 제어 루프는 또한 필드 장치에 전력을 공급하기 위한 조절된 전류 및/또는 전압을 필드 장치에 전달하는 데 사용된다. 공정 제어 루프는 또한 아날로그 또는 디지털 형식으로, 데이터를 운반한다. 전형적으로, 필드 장치는 산업적 공정 및/또는 특정 설비에서, 필요한 경우, 필드 장치의 로컬 환경을 모니터링하기 위해 공정 변수를 감지 또는 제어하는 데 사용된다.
요약하면, 생물반응기, 센서 및 관련 파라미터를 측정하기 위한 방법이 알려져 있다(또한 예를 들어, EP 2725095 B1, WO 2016092281 A1, CN 105044038 A 참조). 추가로, 상이한 성격의 파라미터 및 값이 연속적인 단계에서 공정을 적응시키기 위한 기초로서 주기적으로 취해지는 생물반응기의 자동화된 시스템이 알려져 있다(또한 예를 들어, CN 105543085 A, US 10751715 B1, US 10336978 B2, EP 3819367 A1 참조). 그러나, 추가의 개선은 특히 배양 공정의 성능을 제어 및 조종하는 세포 배양 및/또는 미생물학에서의 응용을 위해 바람직하다.
(ii) 세포 대사 및 지질 이중층 막
상기 논의된 바를 고려하면, 주변 영역(세포외 배지) 및 해당 영역의 환경 조건과 물리적으로 상호 작용하는 세포 메커니즘 및 세포 특성이 예를 들어, 세포 배양 및 처리에 의해 바이오매스를 생성하기 위해, 산업적이고 확장가능한 공정을 제공하는 생물반응기를 위해 필수적이다. 세포 재생산의 기초는 유기체 또는 세포에서 생명-지속 화학 반응의 집합으로 정의될 수 있는 대사이다. 대사의 세 가지 핵심 요소는 (i)세포 공정을 운영하기 위한 영양분의 에너지로의 전환; (ii)단백질, 지질, 핵산 및 일부 탄수화물을 위한 영양분의 구성 블록으로의 전환; 및 (iii)대사 폐기물의 제거이다. 이러한 효소 촉매 반응은 유기체가 성장하고 세포가 세포 구조를 재생산, 유지하고 그들의 환경에 반응할 수 있도록 한다. 대사라는 단어는 또한 다른 세포 내로 및 다른 세포 간의 물질 수송을 포함하여 살아있는 유기체 또는 세포에서 발생하는 모든 화학 반응의 총합을 지칭할 수 있으며, 이 경우 세포 내에서 상술된 일련의 반응은 중간 또는 중간 대사라고 불린다.
특히 중간 대사(intermediary metabolism)나 중간 대사(intermediate metabolism)에서 지질막은 세포가 세포외 매질과 다른 내부 조성을 유지할 수 있도록 해주는 효과적인 장벽으로 기능한다. 천연 및 인공 모두의 막 투과는 횡단 기공의 외관을 통해 일어날 수 있다. 플라즈마 막의 경우, 지질 이중층이 주요한 구조적 구성 요소를 구성한다. 상기 지질 이중층(또는 인지질 이중층)은 지질 분자의 두 층으로 이루어진 얇은 극성 막이다. 이 막들은 모든 세포 주위에 연속적인 장벽을 형성하는 평평한 시트이다. 거의 모든 유기체와 다양한 바이러스의 세포막은 세포핵을 둘러싸고 있는 핵막과 세포 내 막 결합된 세포기관의 막과 마찬가지로 지질 이중층으로 만들어진다. 지질 이중층은 이온, 단백질 및 기타 분자가 이들이 필요한 곳에 머물게 하고, 이들이 있어서는 안 되는 영역으로 확산되는 것을 방지하는 장벽이다. 지질 이중층은 대부분의 수용성(친수성) 분자에 불침투성이기 때문에, 폭이 몇 나노미터에 불과함에도 불구하고 이 역할에 이상적으로 적합하다. 이중층은 이온 펌프라고 불리는 단백질을 사용하여 세포가 막을 가로질러 이온을 수송함으로써 염분 농도와 pH를 조절할 수 있도록 하는 이온에 특히 불침투성이다. 지질 분자 즉, 친수성(물-친화, 극성) 및 친유성(지방-친화) 특성을 모두 가져서, 극성 및 소수성 부분을 모두 포함하는 분자의 양친매성은, 광범위한 물질에 대한 지질 이중층의 저투과성을 결정하므로 세포에서 막이 효과적으로 장벽 기능을 수행하게 할 수 있다. 플라즈마 막의 인공 투과는 다양한 생명공학 및 의료 목적으로 사용된다. 막을 통한 침투에는 두 가지 대체 메커니즘이 있다: 작은 개별 분자가 아마도 지질 포장의 국소 결함을 통해 막을 가로지를 수 있으며, 전체 막을 통해 물로 채워진 기공이 형성되어 다양한 극성 물질의 비특이적인 전달을 가능하게 한다. 본 발명은 지질 이중층 막에서 횡단 기공의 형성 메커니즘에 대부분 의존한다.
따라서, 생물막의 장벽 특성에 대한 이해는 생물반응기에서 대사를 제어하는데 필수적이다. 종래 기술에서 세포막의 기하학적 구조 및 크기를 모방하지만 이온채널 및 세포막에 흔히 존재하는 다수의 다른 내장 성분이 없는, 인공 리포좀 또는 소포(vesicle)와 같은 조사 가능한 모델 시스템이 개발된다. 세포막 패치의 가장 간단한 모델은 평면 지질 이중층이다. 평면 지질 이중층의 화학적 조성은 사전에 선택될 수 있으므로, 잘 정의된다. 반면, 세포막의 비-곡면 단편을 모방하기 위해, 평면 지질 이중층은 2개의 전해질을 분리해야 한다. 따라서, 평면 지질 이중층은 통상 전해질로 채워진 2개의 구획을 분리하는 소수성 구획에서 작은 개구에 걸쳐 수직으로 형성된다. 이러한 실험 시스템에서 평면 지질 이중층의 육안 관찰은 제한적이다. 반면, 전해질에 침지된 전극은 평면 지질 이중층의 전기 파라미터의 측정을 허용한다. 평면 지질 이중층은 비-완벽 축전기로서 전기적으로 고려될 수 있으므로, 이상적인 축전기의 정전용량(C) 및 병렬 저항의 저항(R)은 모두 평면 지질 이중층의 특성을 기술한다. 전압-제어 및 전류-제어 방법은 전기적 특성에서 반영되는 평면 지질 이중층의 전기적 특성 및 이의 구조적 변화를 관찰할 수 있게 한다. 종래 기술에서 정전용량(C)은 평면 지질 이중층의 안정성 및 적절한 형성을 조사하기에 가장 적합한 측정 파라미터로 간주되며, 결과적으로, 심지어 다른 특성에 기술적으로 초점이 맞춰질 때도, 전기적 방법으로 조사된 각각의 평면 지질 이중층에 대해 거의 항상 측정된다. 평면 지질 이중층의 외부 전기 자극에 대한 노출과 막횡단 전압의 형성은 평면 지질 이중층 시스템의 전기적 파라미터(R 및 C)를 모두 변화시킨다. 분자 동역학(MD) 시뮬레이션 결과, 작은, 소위 워터 핑거(water finger)들이 막경유 전압 존재 하에서 평면 지질 이중층의 양쪽에 형성되고 물 또는 소수성 기공을 생성하는 것으로 나타났다. 기공 내부의 물 분자에 인접한 지질은 그들의 극성 헤드그룹을 물 분자를 향해 방향을 바꾸고 기공을 친수성 상태로 안정화시키기 시작하여, 더 많은 물과 이온이 기공으로 들어갈 수 있게 한다. 이러한 전도성 경로는 평면 지질 이중층의 (R)을 감소시킨다. 낮은 막경유 전압에서는 기공이 아직 생성되지 않았을 때, 정전용량 증가가 관찰될 수 있다. 평면 지질 이중층의 전기-제한적 박판화가 이러한 현상의 원인이 되는 메커니즘으로 추정될 수 있다. 평면 지질 이중층의 정전용량은 하기 관계식에 따르는 인가 전압(U)에 따라 달라진다:
여기서, C0는 영점 막경유 전압에서 평면 지질 이중층 정전용량이고, α는 비례성 계수이다. 실험 결과, 이의 값은 전형적으로 약 0.02 V-2인 반면, 수치 시뮬레이션 모델을 사용하여, 이는 0.053-0.082 V-2 범위 내로 평가되었다. 하지만, 더 높은 막경유 전압에서, 물 및 친수성 기공의 출현은 지질 이중층과 물의 유전 상수 값의 상당한 차이로 인해, 평면 지질 이중층 정전용량의 감소를 초래한다. 강한 전기 자극에 장기간 노출되면 평면 지질 이중층에 비가역적 손상을 초래한다. 전기적 측정은 파괴 전압 값(Ubr)의 측정을 가능하게 한다.
(iii) 전기광학: 소수성 기공 및 소수성 결함
평면 지질 이중층에 형성된 소수성 기공은 예를 들어, MD(분자 동역학) 시뮬레이션에 의해 성공적으로 수공이 캡쳐될 수 있는, 알려진 아비돌(Abidor)의 전기천공 모델에 의해 모델링될 수 있다. 이러한 수공은 분자 규모의 일시적인 구조이기 때문에, 이들을 직접 관찰할 수는 없다. 그러나, 막 정전용량 변화로 인한 작은 전류 변동으로 기인하는, 막 전류의 변화의 실험적으로 관찰된 증가는 상전이 동안 막 내 소수성 기공의 개수와 관련될 수 있다. 친수성 기공을 전도하는 것과 그 특성에 대한 실험적 정보조차도 전류 변동 측정, 전압 변동 측정, 또는 전압 강하 관찰과 같은 간접적인 측정으로부터만 얻어진다. 보다 최근에는 기공 형성에 대한 개선된 이론에 의해 기계적 응력의 부재 및 존재 모두에서 기공 형성의 연속적인 궤적을 캡쳐할 수 있다. 이러한 이론은 거대한 단일라멜라 소포(GUV) 흡인 실험에서 연구될 수 있는 다양한 로딩 속도 체제에서도, 측면 장력 하에서 기공의 형성 동안 기공의 복잡한 거동을 설명할 수 있다. 즉, 낮은 로딩 속도에서 GUV 막은 작은 장력에서 파열되었고, 이론에 따르면, 기공의 확장에 의해 막 파괴가 제어된다. 반면, 높은 로딩 속도에서 GUV 막 파열은 높은 값의 장력에서 발생하며, 이론적으로 지질 유형(곡률)에 의존적인 수공 형성에 의해 제한된다. 아키모프(Akimov)의 이론은 전기장에 노출된 평면 지질 이중층이 측면 장력의 존재에서와 유사하게 거동한다고 예측한다. 실험적으로, 이산 전도도 형태로 발현되는 생물막의 지질 이중층의 투과성 증가가 전기적 측정 시, 리포좀 내용물의 누출 및 플립플롭(flip-flop)의 향상에서, 세제의 추가뿐만 아니라 사슬 용융 전이에 가까운 막 장력 및 전기장의 작용 하에서 발생한다는 것을 보여줄 수 있다. 이들 경우 모두에서 이중층의 투과성을 증가시키기 위한 분자적 메커니즘은 많은 공통점을 가지고 있을 것으로 보인다. 특히 지질 이중층 투과성의 증가를 가상적인 소수성 결함 및 친수성 기공의 형성과 연관시키는 것이 타당해 보인다. 비록 이용 가능한 실험 방법이 이러한 구조에 대한 직접적인 연구를 허용하지는 않지만, 편평한 이중층에서의 전류 변동의 발생, 리포좀의 누출, 및 플립플롭 강화는 이중층 내 친수성 기공의 존재에 대한 간접적인 증거가 될 수 있다.
친수성 기공의 형성을 이해하기 위해, 친수성 기공이 소수성 결함으로 지칭되는 중간 상태를 통해 원래 온전한 이중층에서 형성된다고 추정할 수 있다. 친수성 기공 형성 공정 단계에서, 소수성 결함으로 지칭되는 작고 준안정한 "사전-기공"의 존재에 대한 전기천공 실험으로부터 증거가 있다. 그러나, 소수성 기공의 구조, 특성 및 발생 공정뿐만 아니라 1차 소수성 결함의 형성을 위한 분자적 메커니즘은 여전히 불분명하며, 예를 들어, 분자 동역학의 방법을 사용하여 설명되지 않는다. 소수성 결함은 열 변동의 결과로 온전한 막에서 발생할 수 있다. 그러나, 이들은 출현 빈도가 작기 때문에 거시적인 결과를 초래하지 않는다. 실험적으로 관찰된 막 투과도의 증가는 자극(전기장, 상전이 중 열역학적 변화 등)의 작용 하에서 발생 빈도 및 소수성 결함의 수 증가와 관련될 수 있다. 예를 들어, 상전이 중에 충분히 많은 수의 가상적인 소수성 결함의 발생은 면적 변동의 증가와 관련될 수 있다. 기공의 형성 및 진화의 이 단계를 설명하는 한 가지 어려움은 소수성 기공과 관련된 실험 데이터의 부족에 있다. 현재, 사전-기공(소수성 결함)은 막 내 "메모리"의 영향을 관찰하고 사전-기공의 수명 동안의 전도성 사건의 깜박임에 의해 간접적으로 검출될 뿐이다. 따라서, 지질 이중층 내의 소수성 기공의 존재와 관련되고 이들의 수 및 발생 원인을 측정하는 것을 허용하는 실험 데이터는 근본적인 관심사이다. 가능한 접근법으로서, 특별한 유형의 에너지 프로파일 및 추정된 소수성 기공 소스 항을 갖는 스몰루쇼스키(Smoluchowski) 방정식을 사용하여 겔-액 상 전이에서 지질 이중층에서의 친수성 기공 형성 공정을 캡쳐할 수 있다. 소스 항은 상 전이 시 지질 이중층에서의 분자 패킹 결함의 발생을 반영하였다. 이는 다양한 열역학적 특성을 갖는 상 전이 시 발생하는 전류 임펄스의 시간적 시퀀스를 모델링하는 것을 허용하였다. 고전적인 전기 천공 이론에서, 소수성 기공은 소수성 지질 꼬리와 접촉하는 물기둥의 형태로 나타난다. 이러한 기공은 이온의 이동을 허용하지 않지만, 그것의 유전체 유전율을 변화시킴으로써 막의 정전용량을 변화시킬 수 있다. 소수성 기공이 고정 전압 체제 하에서 열리거나 닫히므로, 이에 따라 전류 변동이 유도되어야 하며, 전류 평균은 0이다. 막을 통한 전류 변화의 증가를 모델링하기 위해, 그 온도가 감소하여 상 전이 온도에 접근하는 것을 측정할 수 있다. 그런 다음 모델링은 소수성 기공의 수를 막 전류의 변화와 연결시킨다. 따라서, 측정으로부터 얻은 소수성 기공의 수는 상 전이 시 지질 이중층에서 패킹 결함의 발생을 반영하는 소수성 기공의 소스와 스몰루쇼스키 방정식을 사용하여 제공된 이론적 값과 비교될 수 있다. 이 모델에 기초하여, 상 전이 동안 막 내 소수성 기공의 수의 추정치를 얻을 수 있다.
(iv) 나노초 펄스 전기장 적용(nsPEF)
지난 수십 년 동안 특히 의료 및 생명공학 분야에서 적용되어 온 펄스 전기장(PEF)의 적용에 대한 관심이 증가했다. 그들은 식품 가공 산업에서 세포주의 동결 보존, 세포에 의한 유전자 또는 약물 흡수 강화, 괴사 또는 세포 사멸 경로를 통한 세포 사멸 유도에 광범위하게 적용되는 것으로 나타났다. 전기장이 세포의 거동에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것은 현재의 치료 옵션을 기술적으로 개선하거나 확장하는 방법을 고려할 때 중요하다. 위에서 이미 세포와 그 세포 내 내용물, 그리고 더 구체적으로 전기장이 상호 작용할 것으로 예상되는 그들을 둘러싸는 막에 대해 논의되었다.
생명공학의 기술 분야에서, 전기천공(또한 전기 투과화(electro-permeabilization))은 세포막을 자극하는 고전압 전기 펄스에 생물학적 물질(세포 현탁액, 조직)이 노출되는 것으로 정의되어, 세포막이 그렇지 않으면 이를 통과할 수 없는 분자에 더 투과성이 되도록 한다. 공정을 모델링하고 이해하는 데 있어 기술적이고 이론적인 문제에도 불구하고, 전기천공은 현재 전기화학요법, 유전자 전기전달, 조직절제술, 다양한 화합물의 추출, 및 식품 보존의 미생물 비활성화와 같은 생명공학 및 의약 분야의 적용에 대한 기초로 널리 사용되고 있다. 전기천공을 적용할 때, 나노초 지속 기간(nsEP: 나노초 전기 펄스; nsPEF: 나노초 펄스 전기장이라고도 함)의 더 짧은 전기 펄스는 마이크로초 및 밀리초 지속 기간의 더 긴 펄스보다 세포 내부에 더 깊은 영향을 미치므로, 화학적 개입 없이 nsPEF를 세포 내 조작을 위한 도구로 사용할 수 있음이 나타날 수 있었다. 수십 MV/m(메가볼트/미터(전기장 세기))의 매우 높은 전기장의 초단파 펄스를 생성하는 새로운 펄스 생성기의 개발로, 그 효과는 세포 소기관에 영향을 미치는 나노초 전기 펄스인 세포에서 입증될 수 있으며, 세포 내 칼슘을 증가시키고, 세포 자멸 및 스트레스 반응을 유발한다. 또한, 플라즈마 막도 영향을 받는다. nsPEF에 의해 생성된 기공은 나노미터 크기의 작은 크기이므로, "나노기공"이라고도 한다. nsPEF에 노출된 세포는 막 투과성의 고전적 지표인 프로피듐(PI)과 트리판 블루(TB) 모두에 대한 막 투과성을 나타내지만, 나노초 펄스 노출 후 이러한 염료와 다른 작은 분자의 유입(influx)에서 검출하는 것은 더 긴 펄스에 사용되는 것보다 더 큰 감도의 방법을 필요로 한다. 그러나, 다양한 세포, 펄스 파라미터, 노출 구성 및 검출 방법을 사용하면 다른 결과를 초래할 수 있다. 따라서, 생물반응기에서 nsPEF의 산업적 사용은 사소한 것이 아니며 생물반응기의 기술적 설정과 사용된 작동 파라미터에 복잡한 의존성을 가질 수 있다.
세포에 nsPEF를 적용하는 것은 예를 들어, (A)1-10ns, (B)11-100ns 및 (C) 101-999ns와 같이 별개의 주파수 영역으로 분류될 수 있다. 나노초 펄스를 사용하면, 펄스가 짧아짐에 따라 전형적으로 세포 내 효과가 더 많아지고 플라즈마 막에 대한 효과가 더 적어질 것으로 예상된다. 첫 번째 카테고리 (A)는 몇 ns의 상승 시간(대부분 전해질 이완 시간보다 짧음)을 가진 매우 짧은 펄스 1-10ns를 포함한다. 이 체제에서 막의 유전 특성과 세포 내 및 세포 외 매체는 막에 대한 펄스 전기장 효과를 지배하며, 이동 전하의 이동에 의한 막의 맥스웰-바그너 편광은 더 긴 펄스의 경우보다 덜 중요하다. 또한, 1-10ns 펄스를 가진 세포 내 막에서 더 긴 펄스보다 비례적으로 더 큰 효과를 기대할 수 있다. 두 번째 카테고리 (B)에서는 펄스 지속 시간이 플라즈마 막의 충전 시간보다 작다. 세 번째 카테고리 (C)는 플라즈마 막 충전 시간보다 더 긴 지속 시간을 가진 nsPEF를 포함한다. 특히, 생물 반응기에서 진핵 생물학적 인간, 동물 및 식물 세포 배양으로서, 생물 세포에 대한 nsPEF의 동반 측정가능한 효과와 관련하여 펄스 지속 시간의 역할을 제어하는, 최적화된 생물반응기 및 생물반응기 공정을 제공하는 것은 기술 분야에서 요구되는 것이다. 예를 들어, 플라즈마 막의 변화 발생은 nsPEF 펄스 지속 시간에 크게 의존할 수 있고/있거나 세포 내 효과의 발생은 nsPEF 펄스 지속 시간에 크게 의존할 수 있으며, 여기서, PM 효과는 펄스가 길수록 더 클 수 있고 세포 내 효과는 펄스가 짧을수록 더 클 수 있으므로, 이러한 최적화된 생물 반응기 및 생물 반응기 배양 공정은 다양한 조건에 대응할 수 있어야 한다.
추가의 기술적 설정을 위해, 전기천공 공정 동안 생물(bio-logical) 세포는 진폭, 지속 시간, 형태, 펄스 수 및 펄스 반복률과 같은 특정 전기 파라미터를 갖는 펄스 전기장에 노출된다. 펄스의 지속 시간은 반치전폭(FWHM)으로 특정될 수 있고 펄스의 상승 및 하강 시간에 따라 펄스 형태에 대한 설명이 개선될 수 있다. 기술적 방법을 정확하게 특정하여 생물반응기 내에서 배양 및 처리 공정의 재현을 가능하게 하기 위해, 전형적으로 이러한 전기 파라미터를 정확하게 측정하는 것이 필요하다. 펄스 수 및 펄스 반복률과 같은 일부 전기 파라미터는 캡처하기 비교적 쉽다. 다른 전기 파라미터는 생물반응기 내에서 전달 동안 노출 구성 내에서 나노초 전기장의 시간 과정 및 분포를 측정하는 것이 어렵기 때문에, 측정하기가 더 어렵다. nsPEF에 의한 생물 세포의 전기천공에 관한 종래 기술에서 생물반응기 내에서 생물세포가 노출되는 전기장의 정확한 측정 및 최적화된 제어 및 배양 및/또는 처리 공정에 대한 요구가 있다.
전기장에 대한 막 노출 후 결과에 영향을 미치는 것으로 알려진 몇 가지 요인이 있다. 일반적으로 PEF 노출 후 막 분해의 초기 단계는 유도된 막경유 전위의 크기로 추정될 수 있다. 따라서, 전기장 강도는 이 공정에서 중요한 역할을 할 수 있다. 이 반응에 대한 임계값을 찾는 것은 PEF 적용의 이러한 결과를 활용하려는 많은 생물반응기 시스템의 주제가 되어 왔다. 그러나, 이 임계값을 달성하는 것은 전달되는 펄스의 지속 시간에 크게 의존하므로, 더 짧은 펄스를 사용하여 반응을 이끌어 내는 것은 더 긴 펄스를 사용하는 동일한 반응보다 더 강한 전기장을 필요로 할 것이다. 예를 들어, 특정 근육 세포를 자극하기 위해 1ns 내지 100ms 범위의 펄스를 사용하는 경우, 1.8ns 펄스가 0.02kV에서 전달되는 100ms 펄스에 유사한 반응을 이끌어 내기 위해 4.5kV의 인가 전압이 필요할 수 있다. 전기장 강도와 펄스 지속 시간 외에도 다른 중요한 특징은 펄스의 수와 펄스가 전달되는 주파수이다.
다른 특징은 상이한 펄스 형상을 적용할 때 명백해진다. 예를 들어, 50%의 세포를 투과시키는데 필요한 전기장 세기를 갖는 μsPEF를 사용하면, 대칭 양극 펄스가 사용될 때 이는 20% 감소될 수 있다. 그 이유는 i)단극 펄스를 따르는 극성 비대칭성이 양극 펄스가 전달될 때 평형을 이루고 ii)양극 펄스가 비구면 세포가 투과될 확률을 증가시킨다는 사실에 있을 수 있다. 그러나, 이와 대조적으로, 양극 나노초 펄스가 사용될 때 감쇠 효과(dampened effect)가 또한 발생할 수 있다. 예를 들어, (반대 극성의) 제2 위상의 추가는 세포 내 칼슘 동원 및 세포 생존 모두에서 초기 단극 위상의 효과를 상쇄시킬 수 있다. 양극 효과를 단극 효과와 비교할 때 칼슘 흡수뿐만 아니라 플라즈마 막 무결성 측정에 대해 유사한 감쇠 효과가 관찰될 수 있다. μs와 ns의 양극 펄스 간의 차이를 캡쳐하기 위한 기존 모델에도 불구하고, 펄스의 지속 시간은 임계적이고 막 충전 상수로 알려진 생물학적 상수에 기초한다고 기술될 수 있다.
앞서 논의된 바와 같이, 유도 막경유 전위는 세포막을 따라 이온이 축적되기 때문이라고 추정될 수 있다. 이 공정은 시간을 필요로 하며, 충전 시간, 또는 충전 상수로 지칭된다. 세포들마다 약간씩 다르지만, 충전 시간은 수백 나노초 수준이다. 충전 상수보다 긴 펄스 지속 시간은 그보다 짧은 시간에 비해 매우 다른 영향을 미칠 것이다. 전술한 바와 같이, 본원에서는 충전 시간보다 긴 펄스를 펄스 전기장(PEF)이라고 지칭하고, 그보다 짧은 펄스를 나노초 펄스 전기장(nsPEF)이라고 지칭할 것이다.
보다 긴 지속 시간, 마이크로 또는 밀리초 범위에서, PEF는 단백질, 약물, 및 DNA를 세포막을 가로질러 전달하는 데 효과적인 것으로 나타났고, 즉, PEF는 분자가 세포 내로 확산될 수 있도록 막을 투과성으로 만든다. 펄스의 수, 주파수 및 강도를 조정함으로써 플라즈마 막을 가역적으로 또는 비가역적으로 투과시킬 수 있다. 종래 기술에서, 비가역적 전기-투과화(IRE)는 주로 종양에 대한 전기적 치료로서 적용되어 왔다. IRE를 사용하면, 세포는 전기장에 의해 발생된 손상을 복구할 수 없다. IRE와 대조적으로, 가역적 전기-투과화는 막이 스스로를 복구하는 능력을 장점으로 활용한다. 둘 중, 가역적 전기-투과화는 가장 철저히 조사되었고, 더 많은 수의 잠재적인 적용을 제공한다. 유전자 전기이동(GET)은 DNA가 세포 내로 도입되고 원하는 형질전환 유전자의 생성을 조절하는 것을 가능하게 하는 그러한 적용의 한 예이다. 의료 분야에서, 파킨슨병, HIV/AIDS 및 암 등을 포함하여 가역적 전기-투과화 시스템을 사용하여 잠재적으로 치료될 수 있는 방대한 수의 장애들이 있다. 전기화학요법(ECT)은 화학요법 (또는 고농도의 칼슘)이 조직적으로 또는 국소적으로 주입되고 이어서 조직의 전기-맥동(pulsation)이 뒤따를 수 있는, 가역적 전기-투과화를 위한 또 다른 기술적 적용이다.
nsPEF에서, 충전 상수보다 짧은 펄스 지속 시간이 적용되면, 플라즈마 막은 더 이상 세포 내 환경을 차폐하지 않으며, 매우 다른 효과가 전형적으로 발생한다. 세포 자멸에 의한 세포 사멸의 전형적인 모든 효과인 미토콘드리아 탈분극, 카스파아제(caspase) 활성화 및 핵 응축과 같은 효과가 관찰될 수 있다. 미세관 및 액틴 어셈블리를 포함한 세포골격 파괴와 같은 추가 효과도 관찰되었다. 세포 내 효과는 nsPEF에 특정적인 반면, 플라즈마 막에서 추가적인 효과가 발생함을 시사하는 증거가 증가하고 있다. 예를 들어, nsPEF 노출 후 막 투과성이 향상되는 것으로 나타났다. 이러한 초단장은 플라즈마 막의 막경유 단백질 채널에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다고 추정될 수 있다. 종래 기술에서는 나노초 펄스가 전압-개폐 채널의 직접적인 활성화를 초래(도 2 참조)하는, 이를 뒷받침하는 실험적 증거가 존재한다.
의료 분야에서의 적용을 무시하고, 펄스 전기장(PEF) 및 nsPEF의 적용은 식품 산업 및 생체 공정 공학의 다양한 영역에서 사용될 수 있다. 여기서, 생성물 세포 구조 및/또는 배양된 세포의 대사에 영향을 미치는 데 목적이 있다. 세포는 식물 또는 동물 세포, 예를 들어, 감자 또는 고기의 세포일 수 있지만, 미생물의 세포일 수도 있다. 세포는 크기에 따라, 그리고 특히 그 조성에 따라, 물리적 특성에서 차이를 보인다. 그러나, 모든 세포는 인지질을 주성분으로 하는 막으로 둘러싸여 있다(도 1 참조). 생체 공정 공학, 예를 들어 생물반응기의 경우에도, 인지질의 특성으로 인해 막은 절연체로 볼 수 있으며, 따라서 세포는 막경유 전압으로 이미 전술한 자연 전하를 갖는다. PEF의 경우, 외부 전압의 인가, 전하 축적 및 전위의 증가가 유도되고 전기적 압축이 촉발된다. 이는 막에 기공이 형성되는 결과를 초래하고, 이는 PEF(전기천공)로 기공 유도의 상기 논의된 공정이다. 인가된 펄스 특성(전기장 강도, 펄스 형상 및 폭, 에너지 입력)에 따라 달라지는 생체 공정 공학에서도, 가역적 또는 비가역적 기공이 형성될 수 있다. 가역적 기공은 친수성이며 짧은 시간 후 자발적으로 폐쇄된다. 전기 펄스의 강도가 더 높고 처리 기간이 길면 초기 친수성 기공은 다시 치유될 수 없는 소수성 기공으로 변한다. 이는 세포에 영구적인 손상을 유발한다. 생성물에 포함된 미생물의 경우, 환경에 대한 경계의 상실은 생존 가능성의 상실을 의미한다. 식물 세포, 예를 들어, 감자 세포는 PEF 처리를 받을 때 내부 세포 압력(팽압)이 느슨해지고 막 투과성의 증가는 예를 들어, 가치 있는 성분을 추출할 때 더 용이한 대량 수송을 초래한다. 이와 같이, PEF 처리 적용은 미생물의 불활성화, 식물성 세균의 감소, 세균성 내포자의 불활성화, 생성물의 건조 등으로서의 다양한 상이한 적용에 사용될 수 있다.
식물 세포 외에도, 동물 세포, 예를 들어, 육류 세포는 PEF 또는 nsPEF 처리에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명은 특히 가축-자율(livestock-autonomous) 육류 생산과 같은 배양육 생산을 향상시키기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. "배양육"의 개념적 약속(예를 들어, 시험관 내 세포 배양, 조직 공학 및 식품 기술 방법에 의한 동물-자율 육류 생산)은 생산 효율성 증가, 환경 영향 감소, 요리 적용 효용성 확대, 영양 가치 향상, 무공해 생산 및 종래 생산된 육류에 비한 식품 안전성의 개선을 포함한다. 그러나, 현재까지의 기술은 확장 가능하고, 경제적으로 지속 가능하고, 제어 가능한 (품질/특성) 생산을 지원하기에 충분히 발전되지 않았다. 현재의 실험실 규모의 원형 조직 배양은 동물 조직 및 혈청과 같은 주요 동물 구성 요소를 활용함으로써, 동물-자율 육류 생산의 이점을 크게 부정하였다. 따라서, 현재의 방법은 배양육 생산으로부터 동물 의존성을 충분히 해결하여 "배양육"의 개념적 약속을 실현하고 상업적으로 유리한 제품을 제공하는 데 실패한다. 따라서, 식이 영양 및 기타 적용을 위해 시험관 내 자체 재생 소스로부터 확장 가능한 육류 배양을 위한 새롭고 개선된 방법을 제공할 필요가 있다. 나아가, 대량의 세포 생산에 대한 필요성이 보이지 않는 배양육 제품 제조에서의 기술적 과제는 가시적인 외관, 질감, 맛 및 향을 포함하여 소비자에게 호소력 있는 센서 품질을 갖는 제품을 생산하는 것을 포함한다. 그러나, 인간의 소비에 적합한 대량의 육류 제품을 제조하기 위해 생산 공정의 규모를 증대하는 것이 주된 과제로 남아 있다. 특히 도전적인 임무는 서빙(serving)에 적합한 육류 부분을 얻기 위해 융합되거나 연결될 필요가 있는 별도의 배양육 집합체 또는 층이 아닌, 서빙에 적합한 육류 부분을 직접 생산하는 것이다.
대량의 포유동물 세포를 생산하고, 물질에 세포를 부착하려는 시도는 또한 제약 산업에서, 예를 들어, 치료용 및 조직 및 장기 이식을 위한 줄기 세포를 생산하기 위한 시도로 받아들여지고 있다. 예를 들어, 특허 출원 US 6,911,201 및 US 2010/0233130은 정지상 플러그-유동 생물반응기를 사용하여 미분화 조혈 줄기세포를 생산하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 미분화 조혈 줄기세포 또는 간세포(progenitor cell)를 생리학적으로 허용 가능한 3차원 섬유 네트워크를 형성하는 비직물 섬유 매트릭스를 포함하는 기판 상에 시트 형태로 미리 확립된 정지상 플러그-유동 생물반응기에 식종하는 것을 포함한다. 문헌 WO 2008/152640은 조혈 줄기세포를 포함하는 3차원 기질 세포 배양물을 수용체에 이식하는 방법을 개시한다. 또 다른 예는 단일 사용, 단일 또는 다중 조직, 장기 및 이식 생물반응기 및 환경 제어 시스템을 개시하는 US 9,127,242에 의해 제공될 수 있다.
요약하면, 생물반응기에서 전기장에 의한 nsPEF 유도 성장 자극은 종래 기술에 알려져 있으며, 특히 균류, 콩, 미세 조류 및 기타 세포에서 문서화된 효과가 있다. 그러나, 제어되고 재현 가능한 성장 자극은 현재까지 불가능했다. 전기장 및 PEF는 정확한 자극창(stimulation window)을 가질 수 있지만, 제어 가능하고 신뢰할 수 있는 성장 및/또는 화합물 자극은 nsPEF 조건 하에서만 달성되었다. 그러나, nsPEF 처리에 기초한 성장 자극은 배치 시스템을 사용하여 유망한 결과를 도출했기 때문에, 적합한 시스템이 제공되는 경우, nsPEF는 나머지 화합물의 기술-기능적 특성을 유지하면서 성장뿐만 아니라 특정 세포 화합물을 증가시킬 가능성이 있다. 또한, nsPEF-기반 성장/세포 화합물 자극은 자원 효율성, 경제성 및 도출된 제품의 가격경쟁력(aordability)을 증가시킬 가능성이 있으므로, 증가하는 세계 인구의 요구를 충족시킨다.
본 발명의 목적은 종래 기술로부터 공지된 단점 및 기술적 문제를 극복하는 것이다. 특히, 목적은 생물반응기에서 산업 배양 공정에 대한 최적의 처리 파라미터의 신뢰성 있고, 제어 가능하며, 자동화된 검출을 제공하고, 이에 따라 생물반응기에서 배양 공정의 최적화된 조종을 제공할 수 있는 자동화된 최적화 공정을 갖는 정확하고 효율적인 산업용 생물반응기를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가적인 목적은 생물반응기에서 세포 배양물에 대한 자동으로 제어되고 재현 가능한, nsPEF 유도 성장 자극, 특히 제어 가능하고 신뢰할 수 있는 성장 및/또는 화합물 자극을 위한 전용 자극창을 갖는 전기장 및 PEF 적용을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 목적은 특히 독립항 및 종속항에서 묘사된 구성요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 수 있다. 전술한 일반적인 기재와 이하의 상세한 기재는 모두 예시적이고 설명적인 것일 뿐, 기술된 바와 같이 본 발명에 제한적이지 않음을 유의한다.
본 발명에 따르면, 세포 배양을 위한 최적화된 배양 공정, 영양 배지에서의 세포 성분 또는 세포의 대사 생성물 및 적절한 방법을 제공하는 이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기를 위한 전술한 목적이 달성되고, 특히, 여기서, 생물반응기는 배양 공정을 위한 제어된 생물반응기 조건을 제공하는 반응기 용기, 적어도 영양 배지의 조성 및/또는 영양 배지의 농도 및/또는 산소 및/또는 온도 및/또는 pH-값 및/또는 멸균과 관련된 측정치를 포함하는 센서 파라미터 값을 측정하고, 이를 제어 유닛로 전송하는 센서 장치와 연결된 제어 유닛를 포함하고, 여기서, 제어 유닛은 측정된 센서 파라미터 값에 영향을 주는 생물반응기의 작동 파라미터를 조정함으로써 배양 공정을 제어하고/하거나 조종하고, 이중 주기-제어된 최적화 공정은 생물학적으로 최적화된 처리 창을 식별하는 생물반응기의 작동 제1 파라미터를 조절하여 배양 공정의 배양 성능을 최적화하는 배양 최적화 주기, 및 생물반응기의 작동 제2 파라미터를 적용하여 최적화된 처리 창 내에서 배양 공정 동안 세포 배양에 적용되는 처리 공정을 최적화하는 처리 최적화 주기를 포함하고, 배양 최적화 주기는 배양 공정의 배양 성능을 캡쳐하는 제1 센서 장치에 의해 제1 센서 파라미터를 측정하는 것을 포함하며, 여기서, 제1 센서 파라미터는 목표 배양 성능과 측정된 배양 성능 사이를 조정(즉, 도달될 목표 배양 성능을 위한 측정된 배양 성능의 촉발)하는 제1 분석기(fist analyzer)로 전송되며, 목표 배양 성능이 충족되지 않으면, 작동 제1 파라미터가 조정되고 측정 및 조정이 반복(즉, 작동 제1 파라미터의 조정 및 조정의 추가 반복이 촉발됨)되고, 목표 배양 성능이 충족되면, 처리 최적화 주기가 촉발되는 것은, 배양 성능에서 처리 유도 편차를 측정하여 처리 공정의 처리 성능을 캡쳐하는 제2 센서 장치에 의해 제2 센서 파라미터를 측정하는 것을 포함하고, 여기서, 제2 센서 파라미터는 목표 처리 성능과 측정된 처리 성능 사이를 조정하는 제2 분석기로 전송되고, 목표 처리 성능이 충족되지 않으면, 작동 제2 파라미터가 조정되고 측정 및 조정이 반복되며, 그렇지 않으면 이중 주기-제어된 최적화 공정이 완료된다. 본 발명의 장점들 중 하나는, 특히, 이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 본 발명의 산업용 생물반응기가 생물반응기에서 산업용 배양 공정에 대한 최적의 처리 파라미터의 신뢰할 수 있고 제어 가능한 검출을 최초로 제공할 수 있다는 것이다. 이는 제1 단계에서 배양될 세포의 세포 특성에 기초하여 최적의 생물학적 처리 창을 검출함으로써 달성된다. 제2 단계에서, 기술적 처리는, 즉 적용될 처리의 작동 파라미터는 최적화된다. 이러한 제1 단계는 전체 처리 동안 계속될 수 있고, 따라서, 제2 단계가 공정 효율을 정량화하고 따라서 배양/성장 효율의 백분율 증가를 검출하고 따라서 또한 공정 실행시간의 예측을 허용하는 동안 처리 중지를 식별하는 역할을 할 수 있다.
일 변형예로서, 제어 유닛은 예를 들어, 유전체 분광계에 의해 측정된, 측정된 처리 성능 및/또는 유동 세포계(flow cytometer)에 의해 측정된, 측정된 처리 성능을 캡쳐하는 기계학습 또는 인공지능 기반 모듈을 포함할 수 있고, 여기서, 작동 제1 파라미터 및/또는 작동 제2 파라미터는 제어 유닛에 의해 자동으로 적응되며, 여기서, 적어도 제1 및 제2 센서 파라미터는 기계학습 또는 인공지능 기반 모듈에 입력 값으로 적용되며, 여기서, 기계학습 또는 인공지능 기반 모듈의 출력은 적용된 처리 공정으로 목표 배양 성능에 도달할 때까지 작동 제1 파라미터 및/또는 작동 제2 파라미터의 조정을 촉발한다. 예를 들어, 측정된 센서 파라미터 중 적어도 일부는 기계학습 모듈에 대한 입력 역할을 할 수 있는 반면, 작동 파라미터 중 적어도 일부는 기계학습 또는 인공지능 기반 모듈의 출력 값의 영향을 받는다. 기계학습 모듈은 예를 들어, 감독되거나 비감독된 학습 구조에 기반할 수 있다. 다른 적절한 기계학습 구조 중 예로서, 기계학습 모듈은 예를 들어, 가변적 숨겨진 마르코프(Markov) 모델 파라미터가 있는 기계학습 모듈의 다차원 데이터 구조의 훈련을 위한 최대 우도 파라미터 추정을 적용하여, 측정된 제1 및/또는 제2 센서 파라미터를 할당된 이진 입력 코드의 시퀀스로 변환하고 할당된 이진 입력 코드의 시퀀스를 처리할 수 있고, 여기서, 마르코프 체인의 저장 가능 파라미터 상태의 시퀀스의 요소는 서로 독립적인 측정으로 가정되며, 여기서, 다차원 데이터 구조의 훈련된 모델 파라미터를 획득하기 위해 확률의 곱셈 값을 최대화함으로써 다차원 데이터 구조의 모델 파라미터가 가변된다.
다차원 데이터 구조의 모델 파라미터는 예를 들어, 미리 정의된 수렴 임계치에 도달할 때까지 반복적으로 변화할 수 있다. 작동 제1 및/또는 제2 작동 파라미터의 최적화를 위한 측정을 나타내거나 제공하는 (예를 들어, 손실 함수에 의해 주어진) 스코어의 상기 임계 값을 결정하기 위해, 평균화 공정은 예를 들어, 식별된 시간 프레임의 센서 및/또는 측정 데이터의 제1 및/또는 제2 센서 파라미터의 상이한 패턴에 기초하여 적용될 수 있다. 일 변형예에서, 선택된 작동 파라미터의 감도는 예를 들어, 임계 값의 동적 조정에 기초하여 자동으로 조정될 수 있다. 이 변형예는 특히 다차원 데이터 구조의 가변적 숨겨진 마르코프 모델 파라미터를 훈련함으로써 수렴 속도가 최적화될 수 있다는 이점을 갖는다. 변형예는 특히, 세포 배양물의 배양 및 산업용 생물반응기에 사용되는 적용된 처리에 영향을 미치는 제1 및 제2 작동 파라미터에 대한 최적화된 설정의 자동화된 검출, 측정 및 촉발을 위한 새로운 방법 및 생물반응기를 제공한다는 이점을 갖는다. 이는 전형적으로 제어하기 어려운(예를 들어, 배양육 생산에 사용되는) 소규모 내지 대규모 산업용 생물반응기의 제어 및 모니터링을 위한 효율적인 자동화된 시스템을 제공한다. 게다가, 이 변형예는 특히, 시스템이 실제/목표 비교에 의해 자체를 최적화하므로, AI 통합이 또한 생물반응기의 제1 및/또는 제2 작동 파라미터에 대한 적절한 설정을 실증적으로 평가하지 않고 완전히 알려지지 않은 유기체를 처리할 수도 있다는 이점을 갖는다.
본 발명은 예를 들어, 다음과 같은 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이다:
도 1은 생물학적 막을 개략적으로 도시한 도해이다. 세포가 그의 환경과 어떻게 상호작용하는지를 이해하기 위한 핵심은 세포를 분리하는 경계, 즉 그의 막이다. 세포막(도 1)은 이중층으로 조직된 소수성 및 친수성 영역을 갖는 일련의 극성 지질 분자로 구성된다. 이러한 구조는 세포 외 유체로부터 세포질을 분리하는 경계 조건을 초래하는 수성 환경에서 자기조직화 특성을 나타낸다. 세포 내의 매우 유사한 양친매성 지질 분자 배열은 세포질로부터 세포소기관을 분리하는 역할을 한다. 이들 막은 세포 내 및 세포 밖으로의 선택적 수송에 중요하다. 인지질 이중층 외에도 다른 지질, 단백질 및 탄수화물의 숙주를 확인할 수 있다. 이들 분자는 막을 따르는 분포에서 매우 가변적이며, 각각은 분자를 신호전달하는 데에서부터 구조적 지지 등까지 다른 기능을 한다. 막경유 단백질 채널은 이 주제의 특별한 관심 대상이다. 세포막은, 도 1에 나타낸 바와 같이, 기본 유닛이 인지질 분자(도 1의 우측 하단)인 매우 복잡한 구조이다. 이 분자의 양친매성 구조는 수용액 상에 이중층을 형성하는 결과를 초래한다. 막 내에 내장된 다수의 추가 지질, 단백질 및 탄수화물은 외부 환경과 소통하는 역할을 한다.
도 2는 그들의 활성을 조절하는 자극에 의해 분류된 이온 채널을 개략적으로 나타낸 도해이다. 막경유 단백질은, 넓은 범위에서, 세포의 기능을 지시한다. 일부는 신호 도관의 역할을 하여, 세포 외 분자가 단백질과 상호 작용하여 특정한 세포 내 효과를 초래하게 한다. 다른 것들은 수동적 또는 능동적으로 이온의 통과를 조절하는 역할을 하는 선택성 필터의 역할을 한다. 이러한 이온 채널은 매우 가변적이며 많은 세포 공정에 중요하다. 이온 채널은 열린 상태와 닫힌 상태 사이에서 변동하며, 이러한 상태는 도 2에 나타낸 바와 같이, 다수의 메커니즘을 통해 영향을 받을 수 있다. 일부 예는 전압 개폐된 채널, 기계적으로 개폐된 채널, 또는 리간드 개폐된 채널을 포함한다. 활성화되면, 이러한 채널은 특정 이온에 투과성이 된다. 이들은 매우 특이적일 수 있는데, 이는 단지 한 종류의 이온만 통과시키거나, 전하-특이적으로 양이온 또는 음이온 중 하나를 통과시킬 수 있음을 의미한다. 전압 개폐된 채널은 세포의 막경유 전위의 변동에 의해 활성화될 수 있다. 리간드 개폐된 채널은 채널의 세포 외 부위 또는 세포 내 부위에 결합하는 신호 분자를 통해 활성화된다. 기계적으로 개폐된 채널은 물리적 자극과 관련된 형상의 변화를 통해 변조된다. 이러한 이온 채널의 선택적 특성은 세포 내 소기관 간에 동일하게 존재하고 변하는 막경유 전위의 생성을 담당하고, 이는 플라즈마 막에 걸쳐 있기 때문이다. 휴지 막 전위로 알려진 이 전압-구배율의 화학적 기초는 세포 내부 및 외부의 이온의 불균일한 분포이다. 단백질 채널의 전도성 특성 및 지질 이중층 막의 절연 특성과 조합된 이온의 전기적 특성은, 세포를 전기 회로로 모델링할 수 있게 하였다. 이는 예를 들어, 세포 간의 전기적 통신을 모델링할 때뿐만 아니라 세포 활성 및 세포 배양을 조절하기 위한 기술적 배양 및/또는 처리 전략을 개발할 때에도 유용하였다.
도 3은 호지킨-헉슬리(Hodgkin-Huxley) 파라미터화에 의해 캡쳐된 전기 회로로서 작동하는 세포를 개략적으로 도시한 도해이다. (A. 호지킨 및 A. 헉슬리에 의해 소개된) 호지킨-헉슬리 파라미터화는 거대 오징어 축색돌기를 따라 전기 자극의 전파를 담당하는 이온 메커니즘을 캡쳐하기 위한 작동 구조 또는 모델을 제안한다. 도 3에 의해 보여지는 일반적인 개요로서, 호지킨-헉슬리 파라미터화는 지질 이중층을 전하를 저장할 수 있는 병렬 축전기로, 이온 채널을 전류를 통과시킬 수 있는 가변 저항기로 가정한다. 막경유 전위는 세포막에 걸쳐 생성되고 이온 채널의 활성에 따라 변동한다. 이 모델 가정은 세포들 사이, 특히 신경 조직과 근육 조직에서 전기적으로 들뜨기쉬운(excitable) 세포들 사이의 전기화학적 통신과 같은 특정 생물학적 현상을 캡처하거나 모델링하기 위해 중요하다. 이 모델에 대한 또 다른 적용은 생물반응기에서 적용된 전기장을 사용하여 세포 활동을 조절하고 조종하기 위해 본 출원에 흥미로운 기술 분야로 확장된다. 도 3에서 지질 이중층은 한 쌍의 병렬 축전기로 표시되고 막경유 이온 채널은 가변 저항기로 표시된다.
도 4는 세포막과의 전기장 상호 작용을 개략적으로 나타낸 도해이다. 세포가 전기장에 노출되면 전기력이 발생하고, 이는 세포 내부와 외부 매체 모두에서 이온에 작용한다. 이온은 대전된 이온이기 때문에, 이 힘에 의해 전기장 선을 따라 이동하게 된다. 세포 외 용액과 세포 내 용액은 전도성인 반면, 세포 지질 막은 비전도성이다. 결과적으로 이 이온들은 막을 따라 축적되고 큰 막경유 전위를 생성시킨다. 종래 기술에서 대략 1V로 가정되는 특정 지점에서 유도 전압이 막 정전용량을 초과하여 막의 분해가 일어난다. 막의 직경을 대략 10nm라고 고려할 때, 이 임계치와 관련된 전기장 세기는 1MV/cm 정도이다. 이 공정, 즉 전기천공 또는 천기-투과화(위의 내용 참조)는 향상된 막 투과성과 관련이 있다. 이 효과를 캡쳐하기 위해 슈완 파라미터화(Schwan parametrization) 관계식이 각각 다음과 같이 개발되었다:
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위의 관계식은 구형 세포를 캡쳐하는 것으로 제한되며, 유도 막 전위(V m )는 세포(R)의 반지름과 적용 전기장(E)에 비례하며, 도 4와 같이 세포막을 따라 균일하지 않을 것임을 명시한다. 이 모델의 확장은 구형 또는 타원체로 정확하게 설명될 수 없는 불규칙한 형상의 세포와 같은 더 복잡한 구조를 캡쳐할 수 있도록 개발되었다. 슈완 관계식(정상 상태)은 각도(θ)의 함수로 세포 반경(R)이 주어지면 적용 전기장(E)이 막경유 전위(Vm)에 미치는 영향을 캡쳐할 수 있게 한다. 도 4에서, 유도 막 전위는 세포막을 따라 변한다. 이 예는 반경 10 μm 및 44 kV/cm의 적용된 장 강도를 갖는 구형 세포에 슈완 매개변수화를 적용한다. 종래 기술에서, 전기장이 지질 이중층과 상호 작용할 때 발생하는 생체 분자 사건을 캡쳐하거나 파라미터화하는 쪽으로 방법론의 변화가 있었다. 분자 동역학(MD) 시뮬레이션은 전기 투과화와 관련된 사건의 일부를 모델링하는 데 도움이 되었으며, 막 파괴와 관련된 동역학을 시각화하는 데 사용될 수 있다. 지금까지, 계산 능력의 제한은 MD를 펄스 전달 후 1 밀리초 미만의 기간으로 제한하였지만, 많은 효과가 훨씬 더 긴 기간에 걸쳐 보고되었다. 이러한 효과는 펄스 지속 시간, 전기장 강도, 펄스 수 및 전달되는 펄스의 주파수와 같은 여러 요인에 크게 의존하는 것으로 보인다.
도 5는 PEF/nsPEF 기반한 배양된 세포의 처리 및 이의 각각의 효과의 예시적인 작동 원리를 개략적으로 도시한 도해이다.
도 6은 선택적 불활성화, 미생물 플로라(flora) 및 미세조류 클로렐라 불가리스의 예에 의한 불활성화, 고부가가치 성분의 지속적인 추출 및 성장 촉진을 위한 처리 창을 개략적으로 도시한 도해이다.
도 7은 영양 배지(11)에서 세포 배양물(5/51), 세포 성분(5/512) 또는 세포의 대사 산물(5/52)에 대해 최적화된 배양 공정(21)을 제공하는 이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 본 발명의 산업용 생물반응기(1)의 일 변형예를 개략적으로 도시한 블록도이다. 이중 주기-제어된 최적화 공정은 배양 및/또는 처리를 위해 생물학적으로 최적화된 창을 식별하는 생물반응기(1)의 작동 제1 파라미터(1311)를 조절하여 배양 공정(21)의 배양 성능(241)을 최적화하는 배양 최적화 주기(2)와, 생물반응기(1)의 작동 제2 파라미터(1312)를 적용하여 최적화된 처리 창 내에서 배양 공정(21) 동안 세포 배양물(51)에 적용되는 처리 공정(32)을 최적화하는 처리 최적화 주기(3)를 포함하고, 여기서, 배양 최적화 주기(2)는 배양 공정(21)의 배양 성능(241)을 캡처하는 제1 센서 장치(221)에 의해 제1 센서 파라미터(222)를 측정하는 것(22)을 포함하고, 여기서, 제1 센서 파라미터(222)는 목표 배양 성능(242)과 측정된 배양 성능(241) 사이를 조정하는 제1 분석기(23)로 전달되고, 목표 배양 성능(242)이 충족되지 않으면 작동 제1 파라미터(1311)를 조정하고 측정(22) 및 조정(24)을 반복한다. 목표 배양 성능(242)이 충족되면 처리 최적화 주기(3)가 촉발되고, 이는 배양 성능(241)의 처리 유도 편차를 측정하여 처리 공정(31)의 처리 성능(341)을 캡처하는 제2 센서 장치(321)에 의해 제2 센서 파라미터(322)를 측정하는 것(32)을 포함하고, 여기서, 제2 센서 파라미터(322)는 목표 처리 성능(342)과 측정된 처리 성능(341) 사이를 조정하는 제2 분석기(33)로 전달되고, 목표 처리 성능(342)이 충족되지 않으면 작동 제2 파라미터(1312)가 조정되고 측정(32) 및 조정(34)이 반복되며, 그렇지 않으면 이중 주기-제어된 최적화 공정이 완료된다.
도 8 및 도 9는 유동 세포계(FC) 측정법에 의해 세포 모집단의 물리 화학적 특성이 측정되는 산업 처리 주기의 측정 데이터를 개략적으로 나타낸 도해이다. 참조 번호 012의 도표선은 올바르게 처리된 세포 샘플을 보여주고, 참조 번호 018 및 019의 도표선은 적용된 처리 공정 없는 대조군 샘플을 보여주며, 참조 번호 010, 016 및 0112의 도표선은 잘못 처리된 세포 샘플, 즉 진폭, 펄스 길이 및 펄스 수의 올바르거나 최적화된 조합이 아닌 적용된 처리를 갖는 세포 샘플을 보여준다. 유동 세포계 측정 공정에서, 세포를 포함하는 샘플은 유체에 현탁되고 유동 세포계산 측정 장치로 주입된다. 샘플은 레이저 빔을 통해 한 번에 하나의 세포를 이상적으로 흐르는 데 초점이 맞춰지고, 여기서, 산란된 빛은 세포와 그 성분에 특징적이다. 세포는 형광 마커로 라벨링되어 빛이 특정 파장 대역에서 흡수되고 그 다음 방출된다. 도해에서 파란색 수직 라인은 생물반응기에서 처리 공정의 시작을 나타낸다.
도 10은 세포 배양물 또는 미생물이 액체 배지에 침지되어 성장한, 본 발명에 사용될 수 있는 생물반응기의 유형인 산업용 액체 생물반응기(1)의 블록도를 개략적으로 도시한 것이다. 산업용 액체 생물반응기(1)는 펌프(15)로서의 장치, 센서 또는 센서 장치(14), 처리 장치(311) 및 액체 영양 배지(11/111)를 포함하는 반응기 용기(12)를 포함한다. 이러한 산업용 액체 또는 고체 상태 생물반응기(1)는 효소 또는 전체 세포/세포 구조가 생화학물질을 생성물로 변환하는데 효과적인 환경을 제공하도록 설계된 용기이다. 세포의 불활성화 또는 살균은 수처리와 같은 생물반응기에서 수행될 수 있는 적용들 중 하나이다. 이러한 산업용 생물반응기는 또한 세포 성장, 효소 생산, 생체 촉매, 바이오 센서, 식품 생산, 우유 가공, 압출, 조직 공학, 조류 생산, 단백질 합성 및 혐기성 소화를 위한 적용들을 포함하는 매우 다양한 다른 생물반응기 적용들에 사용될 수 있다.
도 11은 생물반응기(1)의 유형이 또한 본 발명에 사용 가능한 산업파 생물반응기(1)를 개략적으로 도시한 블록도를 나타낸다. 액체 생물반응기는 동물, 식물 및 곤충 세포의 배양을 위한 산업 배양 기술이 필요한 배치 부피에 의존하기 때문에, 모든 배양에 적합하지는 않다. 스피너 플라스크, 롤러 보틀, T-플라스크 및 유사한 시스템과 같은 장치를 사용할 수 있지만, 이러한 장치는 고유하게 제한된 산소 전달 능력으로 인해 전형적으로 배치당 1 내지 2 L의 배양액만 생산할 수 있다. 예를 들어, 스피너 플라스크는 현탁 배양액뿐만 아니라 마이크로캐리어 상의 앵커리지-의존성 시스템에 매우 대중적이지만, 전형적으로 1 L 미만의 부피에 대해서만 유용하다. 더 큰 부피에 대해서는, 전단력을 감소시키도록 변형된 교반-탱크 생물반응기를 사용하는 것이 보통 필요하다. 이러한 생물반응기는 복잡하고 고가의 장치이지만, 높은 국부 유체 전단 및 기포 에어레이션(aeration)의 사용으로 인해 종종 세포 성장에 이상적인 환경을 제공하지 않는다. 예를 들어, 단백질 특성화, 접종체 전파 및 파일럿-규모 생산에 필요한 전형적인 부피인 1 내지 100 L의 세포 배양액의 산업 생산을 위해, 이러한 설계는 스케일업(scale-up)을 매우 어렵게 하는 본질적으로 높은 국부 전단율을 갖기 때문에 교반 탱크 기술의 세포 배양액에 대한 적응은 무익한 연습이다. 대신에, 이러한 요구를 직접적으로 만족시키기 위한 세포 배양의 특별한 요구를 이해하는 것이 중요하다. 이러한 요구에는 전단 감도, 기포 없는 에어레이션 및 사전-살균 배지의 사용 및 작은 산소 흡수율이 포함된다. 산업용 사용을 위해 임의의 배양 시스템이 작동 가능한 한 간단한 것이 추가로 필수적이다. 이러한 의미에서, 유동층 생물반응기 및 중공 섬유 시스템과 같은 많은 그렇지 않은 유용한 장치들은, 세포 배양의 작업마(workhorse)로서 스피너 플라스크를 대체하기에는 너무 복잡한 것으로 밝혀졌다. 반면에, 산업 적용에서 파동 생물반응기(1)의 사용은 때때로 이러한 문제들을 극복하게 한다. 파동 생물반응기는 전형적으로 사전살균된 챔버(121), 예를 들어, 매체로 부분적으로 충전되고 세포로 접종되는, 팽창 가능한 가요성 플라스틱 챔버로 구성된다. 챔버(121)의 나머지는 공기로 팽창된다. 공기는 배양 동안 헤드스페이스를 통해 연속적으로 통과된다. 혼합 및 물질 전달은 챔버를 앞뒤로 흔드는 것에 의해 달성된다. 이러한 흔들기 운동은 액체-공기 인터페이스에서 파동을 발생시켜 산소 전달을 크게 향상시킨다. 파동 운동은 또한 벌크 혼합, 및 셀 및 입자의 바닥 외 현탁을 촉진한다. 교반을 위해 흔들기를 사용하는 이러한 개념은 예를 들어, 산업 분석 플레이트 및 겔 내의 액체의 교반을 위해 사용될 수 있다. 도 9에 나타낸 흔들기 장치는 예를 들어, 5° 내지 10° 사이에서 조정될 수 있는 각도를 통해 일 축으로 회전하는 플랫폼으로 구성될 수 있다. 공압 벨로우즈는 플랫폼을, 예를 들어, 5 내지 40 흔들기/분(rpm)으로 조정될 수 있는 흔들기 속도로 흔들기 위해 사용될 수 있다. 공압 시스템이 사용되면, 이는 유닛이 작동 동안 어떠한 열도 발생하지 않도록 보장하여 인큐베이터 내에 배치될 수 있게 한다. 전형적으로 사전-살균된 일회용 세포 배양 챔버(121)는 배지(111)로 부분적으로 충전된 다음 일체형 멸균 입구 필터를 사용하여 팽창되는 플랫폼 상에 배치된다. 공기는 챔버(121)의 헤드스페이스를 통해 연속적으로 통과될 수 있다. 이러한 기류는 pH 조절(141121) 및 CO2 제거를 위한 산소화(141122) 및 가스 교환을 제공한다. 배기 공기는 살균 필터 및 배압 조절 밸브를 통과한다. 배압 조절 밸브는 챔버(121)가 임의의 기류에서 항상 완전히 팽창되는 것을 보장할 수 있다. 그러한 밸브는 또한 챔버(121)의 과팽창 및 잠재적 파열을 방지할 수 있다. 온도(14111) 및 pH 제어(141121)는 예를 들어, 종래의 세포 배양 CO2 인큐베이터 내에 전체 유닛을 위치시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 온도 제어(14111)는 예를 들어, 배양 챔버(121)의 하부를 가열함으로써 달성될 수 있다. 파동 모션은 양호한 벌크 액체(111) 움직임을 촉진하고 온도 구배들의 발생을 최소화한다. 산업파 생물반응기(1)는 펌프(15)로서의 장치들, 센서들 또는 센서 장치들(14), 처리 장치(311), 및 반응기 용기(12)로서의 액체 영양 배지(11/111)를 수용하는 챔버(121)를 더 포함한다.
도 12는 본 발명에 또한 사용될수 있는 유형의 생물반응기인 고체-상태 생물반응기를 개략적으로 도시하는 블록도를 나타낸다. 고체-상태 생물반응기(SSF: 고체-상태 발효)는, 특히, 더 낮은 물 사용 및 더 높은 체적 생산성과 같은, 액침 발효를 갖는 다른 유형의 생물반응기에 비해 중요한 이점을 갖는다. 그 결과, SSF 기술은 지난 수십 년 동안 생물반응기의 산업적 적용에서 증가하는 분야를 다룬다. SSF 생물반응기는 예를 들어, 트레이, 패킹-베드, 회전/교반-드럼, 유동-베드, 흔들-드럼 및 교반-공기 생물반응기와 같은 다양한 유형의 반응기 기술에 기초할 수 있다. 기술적으로 중요한 것은 전형적으로 반응기 설계, 열 및 물질 전달의 제어 및 적용된 작동 전략이다. 세포의 산업적 배양과 미생물의 성장 둘 모두가 SSF 생물반응기에서 실현될 수 있다. 언급된 바와 같이, SSF 생물반응기의 산업적 적용을 위해 중요한 것은, 전형적으로 대규모 열 전달의 제어 및 세포 성장의 정량적 특성화 및 측정이다. 후자의 경우, 기술적 과제 중 하나는 예를 들어, SSF 공정 동안 비파괴 검출 방법의 적절한 선택이다. 일반적으로, 액침 발효에 비해 SSF에 사용되는 고체 배지(112)은 물을 더 적게 함유하지만, 중요한 기체 상이 전형적으로 입자들 사이에 존재한다. 이러한 특징은 물에 비해 공기의 열악한 열전도도 때문에 기술적으로 매우 중요하다. 또 다른 점은 SSF 생물반응기에서 사용되는 다양한 매트릭스(112)이며, 이는 조성, 크기, 기계적 저항, 공극률 및 물 보유 능력 측면에서 다양하다. 모든 이들 인자는 반응기 설계 및 파라미터에 대한 제어 전략에 영향을 미칠 수 있다. 실제로 액침 발효에서, 모든 배지는 본질적으로 물로 제조되는 것으로 고려될 수 있다. 따라서, 액체 생물반응기에서, 온도(14111) 및 pH(141121) 규정은 공정의 산업적 스케일업 동안 전형적으로 달성하기 간단하며 아무런 문제를 제기하지 않는다. 액침 발효에서, 주요 난점은 전형적으로 형상, 반응기의 크기 및 사용되는 교반/에어레이션 시스템에 의존하는 미생물 또는 세포로의 산소 전달이다. 이러한 전달은 파라미터 KLa(산소 전달 계수)에 의해 측정될 수 있으며, 여기서 그 값은 반응기의 부피에 독립적으로 산소를 전달하는 장비의 용량을 표현하므로, 액침 발효에서 스케일업 설계에 사용되는 중요한 파라미터를 구성한다. 액체 생물 반응기와는 대조적으로, 일부 설계의 제한 인자가 될 수 있는 산소 전달(141122) 외에, SSF 생물 반응기에서, 기술적 문제는 두 가지 중요한 파라미터, 즉 온도(14111) 및 고체 배지(112), 즉 기질(112)의 물 함량의 제어에 영향을 미치는 바 더 복잡하다. 다양한 유형의 고체-상태 생물 반응기와 관련하여, 일반적으로 많은 유형의 반응기가 소량의 배지(112)로 실험실 규모에서 배양 공정을 운영할 수 있음을 유의하는 것이 중요하다. 그러나 산업적 스케일업은 특히 종종 시스템 내의 강도 높은 열 발생 및 이질성으로 인해 복잡하며, 이는 또한 배양 공정의 기술적 제어를 복잡하게 한다. 산업적 고체-상태 생물 반응기에서, 위에서 논의된 열 및 물질 전달 문제는 특히 열악한 에어레이션에 기인할 수 있다. 이러한 문제는 예를 들어, (i) 기질층(112) 주위의 공기를 순환시키거나 (ii) 기질층(112)을 통해 공기를 유도함으로써 해결될 수 있다. 후자의 경우, 종래 기술에서 세 가지 가능성이 사용되며, 이는 비 혼합, 간헐적 또는 연속적으로 혼합된 베드이다. 하지만, 이미 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 고체-상태 생물반응기와 함께 사용될 수도 있다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 적합한 산업용 고체-상태 생물반응기(1)는 예를 들어, 펌프(15), 센서 또는 센서 장치(14), 처리 장치(311) 및 반응기 용기(12)로서 기질(11/112)을 함유하는 배양 용기(121)를 포함하여 실현될 수 있다.
도 1은 생물학적 막을 개략적으로 도시한 도해이다. 세포가 그의 환경과 어떻게 상호작용하는지를 이해하기 위한 핵심은 세포를 분리하는 경계, 즉 그의 막이다. 세포막(도 1)은 이중층으로 조직된 소수성 및 친수성 영역을 갖는 일련의 극성 지질 분자로 구성된다. 이러한 구조는 세포 외 유체로부터 세포질을 분리하는 경계 조건을 초래하는 수성 환경에서 자기조직화 특성을 나타낸다. 세포 내의 매우 유사한 양친매성 지질 분자 배열은 세포질로부터 세포소기관을 분리하는 역할을 한다. 이들 막은 세포 내 및 세포 밖으로의 선택적 수송에 중요하다. 인지질 이중층 외에도 다른 지질, 단백질 및 탄수화물의 숙주를 확인할 수 있다. 이들 분자는 막을 따르는 분포에서 매우 가변적이며, 각각은 분자를 신호전달하는 데에서부터 구조적 지지 등까지 다른 기능을 한다. 막경유 단백질 채널은 이 주제의 특별한 관심 대상이다. 세포막은, 도 1에 나타낸 바와 같이, 기본 유닛이 인지질 분자(도 1의 우측 하단)인 매우 복잡한 구조이다. 이 분자의 양친매성 구조는 수용액 상에 이중층을 형성하는 결과를 초래한다. 막 내에 내장된 다수의 추가 지질, 단백질 및 탄수화물은 외부 환경과 소통하는 역할을 한다.
도 2는 그들의 활성을 조절하는 자극에 의해 분류된 이온 채널을 개략적으로 나타낸 도해이다. 막경유 단백질은, 넓은 범위에서, 세포의 기능을 지시한다. 일부는 신호 도관의 역할을 하여, 세포 외 분자가 단백질과 상호 작용하여 특정한 세포 내 효과를 초래하게 한다. 다른 것들은 수동적 또는 능동적으로 이온의 통과를 조절하는 역할을 하는 선택성 필터의 역할을 한다. 이러한 이온 채널은 매우 가변적이며 많은 세포 공정에 중요하다. 이온 채널은 열린 상태와 닫힌 상태 사이에서 변동하며, 이러한 상태는 도 2에 나타낸 바와 같이, 다수의 메커니즘을 통해 영향을 받을 수 있다. 일부 예는 전압 개폐된 채널, 기계적으로 개폐된 채널, 또는 리간드 개폐된 채널을 포함한다. 활성화되면, 이러한 채널은 특정 이온에 투과성이 된다. 이들은 매우 특이적일 수 있는데, 이는 단지 한 종류의 이온만 통과시키거나, 전하-특이적으로 양이온 또는 음이온 중 하나를 통과시킬 수 있음을 의미한다. 전압 개폐된 채널은 세포의 막경유 전위의 변동에 의해 활성화될 수 있다. 리간드 개폐된 채널은 채널의 세포 외 부위 또는 세포 내 부위에 결합하는 신호 분자를 통해 활성화된다. 기계적으로 개폐된 채널은 물리적 자극과 관련된 형상의 변화를 통해 변조된다. 이러한 이온 채널의 선택적 특성은 세포 내 소기관 간에 동일하게 존재하고 변하는 막경유 전위의 생성을 담당하고, 이는 플라즈마 막에 걸쳐 있기 때문이다. 휴지 막 전위로 알려진 이 전압-구배율의 화학적 기초는 세포 내부 및 외부의 이온의 불균일한 분포이다. 단백질 채널의 전도성 특성 및 지질 이중층 막의 절연 특성과 조합된 이온의 전기적 특성은, 세포를 전기 회로로 모델링할 수 있게 하였다. 이는 예를 들어, 세포 간의 전기적 통신을 모델링할 때뿐만 아니라 세포 활성 및 세포 배양을 조절하기 위한 기술적 배양 및/또는 처리 전략을 개발할 때에도 유용하였다.
도 3은 호지킨-헉슬리(Hodgkin-Huxley) 파라미터화에 의해 캡쳐된 전기 회로로서 작동하는 세포를 개략적으로 도시한 도해이다. (A. 호지킨 및 A. 헉슬리에 의해 소개된) 호지킨-헉슬리 파라미터화는 거대 오징어 축색돌기를 따라 전기 자극의 전파를 담당하는 이온 메커니즘을 캡쳐하기 위한 작동 구조 또는 모델을 제안한다. 도 3에 의해 보여지는 일반적인 개요로서, 호지킨-헉슬리 파라미터화는 지질 이중층을 전하를 저장할 수 있는 병렬 축전기로, 이온 채널을 전류를 통과시킬 수 있는 가변 저항기로 가정한다. 막경유 전위는 세포막에 걸쳐 생성되고 이온 채널의 활성에 따라 변동한다. 이 모델 가정은 세포들 사이, 특히 신경 조직과 근육 조직에서 전기적으로 들뜨기쉬운(excitable) 세포들 사이의 전기화학적 통신과 같은 특정 생물학적 현상을 캡처하거나 모델링하기 위해 중요하다. 이 모델에 대한 또 다른 적용은 생물반응기에서 적용된 전기장을 사용하여 세포 활동을 조절하고 조종하기 위해 본 출원에 흥미로운 기술 분야로 확장된다. 도 3에서 지질 이중층은 한 쌍의 병렬 축전기로 표시되고 막경유 이온 채널은 가변 저항기로 표시된다.
도 4는 세포막과의 전기장 상호 작용을 개략적으로 나타낸 도해이다. 세포가 전기장에 노출되면 전기력이 발생하고, 이는 세포 내부와 외부 매체 모두에서 이온에 작용한다. 이온은 대전된 이온이기 때문에, 이 힘에 의해 전기장 선을 따라 이동하게 된다. 세포 외 용액과 세포 내 용액은 전도성인 반면, 세포 지질 막은 비전도성이다. 결과적으로 이 이온들은 막을 따라 축적되고 큰 막경유 전위를 생성시킨다. 종래 기술에서 대략 1V로 가정되는 특정 지점에서 유도 전압이 막 정전용량을 초과하여 막의 분해가 일어난다. 막의 직경을 대략 10nm라고 고려할 때, 이 임계치와 관련된 전기장 세기는 1MV/cm 정도이다. 이 공정, 즉 전기천공 또는 천기-투과화(위의 내용 참조)는 향상된 막 투과성과 관련이 있다. 이 효과를 캡쳐하기 위해 슈완 파라미터화(Schwan parametrization) 관계식이 각각 다음과 같이 개발되었다:
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위의 관계식은 구형 세포를 캡쳐하는 것으로 제한되며, 유도 막 전위(V m )는 세포(R)의 반지름과 적용 전기장(E)에 비례하며, 도 4와 같이 세포막을 따라 균일하지 않을 것임을 명시한다. 이 모델의 확장은 구형 또는 타원체로 정확하게 설명될 수 없는 불규칙한 형상의 세포와 같은 더 복잡한 구조를 캡쳐할 수 있도록 개발되었다. 슈완 관계식(정상 상태)은 각도(θ)의 함수로 세포 반경(R)이 주어지면 적용 전기장(E)이 막경유 전위(Vm)에 미치는 영향을 캡쳐할 수 있게 한다. 도 4에서, 유도 막 전위는 세포막을 따라 변한다. 이 예는 반경 10 μm 및 44 kV/cm의 적용된 장 강도를 갖는 구형 세포에 슈완 매개변수화를 적용한다. 종래 기술에서, 전기장이 지질 이중층과 상호 작용할 때 발생하는 생체 분자 사건을 캡쳐하거나 파라미터화하는 쪽으로 방법론의 변화가 있었다. 분자 동역학(MD) 시뮬레이션은 전기 투과화와 관련된 사건의 일부를 모델링하는 데 도움이 되었으며, 막 파괴와 관련된 동역학을 시각화하는 데 사용될 수 있다. 지금까지, 계산 능력의 제한은 MD를 펄스 전달 후 1 밀리초 미만의 기간으로 제한하였지만, 많은 효과가 훨씬 더 긴 기간에 걸쳐 보고되었다. 이러한 효과는 펄스 지속 시간, 전기장 강도, 펄스 수 및 전달되는 펄스의 주파수와 같은 여러 요인에 크게 의존하는 것으로 보인다.
도 5는 PEF/nsPEF 기반한 배양된 세포의 처리 및 이의 각각의 효과의 예시적인 작동 원리를 개략적으로 도시한 도해이다.
도 6은 선택적 불활성화, 미생물 플로라(flora) 및 미세조류 클로렐라 불가리스의 예에 의한 불활성화, 고부가가치 성분의 지속적인 추출 및 성장 촉진을 위한 처리 창을 개략적으로 도시한 도해이다.
도 7은 영양 배지(11)에서 세포 배양물(5/51), 세포 성분(5/512) 또는 세포의 대사 산물(5/52)에 대해 최적화된 배양 공정(21)을 제공하는 이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 본 발명의 산업용 생물반응기(1)의 일 변형예를 개략적으로 도시한 블록도이다. 이중 주기-제어된 최적화 공정은 배양 및/또는 처리를 위해 생물학적으로 최적화된 창을 식별하는 생물반응기(1)의 작동 제1 파라미터(1311)를 조절하여 배양 공정(21)의 배양 성능(241)을 최적화하는 배양 최적화 주기(2)와, 생물반응기(1)의 작동 제2 파라미터(1312)를 적용하여 최적화된 처리 창 내에서 배양 공정(21) 동안 세포 배양물(51)에 적용되는 처리 공정(32)을 최적화하는 처리 최적화 주기(3)를 포함하고, 여기서, 배양 최적화 주기(2)는 배양 공정(21)의 배양 성능(241)을 캡처하는 제1 센서 장치(221)에 의해 제1 센서 파라미터(222)를 측정하는 것(22)을 포함하고, 여기서, 제1 센서 파라미터(222)는 목표 배양 성능(242)과 측정된 배양 성능(241) 사이를 조정하는 제1 분석기(23)로 전달되고, 목표 배양 성능(242)이 충족되지 않으면 작동 제1 파라미터(1311)를 조정하고 측정(22) 및 조정(24)을 반복한다. 목표 배양 성능(242)이 충족되면 처리 최적화 주기(3)가 촉발되고, 이는 배양 성능(241)의 처리 유도 편차를 측정하여 처리 공정(31)의 처리 성능(341)을 캡처하는 제2 센서 장치(321)에 의해 제2 센서 파라미터(322)를 측정하는 것(32)을 포함하고, 여기서, 제2 센서 파라미터(322)는 목표 처리 성능(342)과 측정된 처리 성능(341) 사이를 조정하는 제2 분석기(33)로 전달되고, 목표 처리 성능(342)이 충족되지 않으면 작동 제2 파라미터(1312)가 조정되고 측정(32) 및 조정(34)이 반복되며, 그렇지 않으면 이중 주기-제어된 최적화 공정이 완료된다.
도 8 및 도 9는 유동 세포계(FC) 측정법에 의해 세포 모집단의 물리 화학적 특성이 측정되는 산업 처리 주기의 측정 데이터를 개략적으로 나타낸 도해이다. 참조 번호 012의 도표선은 올바르게 처리된 세포 샘플을 보여주고, 참조 번호 018 및 019의 도표선은 적용된 처리 공정 없는 대조군 샘플을 보여주며, 참조 번호 010, 016 및 0112의 도표선은 잘못 처리된 세포 샘플, 즉 진폭, 펄스 길이 및 펄스 수의 올바르거나 최적화된 조합이 아닌 적용된 처리를 갖는 세포 샘플을 보여준다. 유동 세포계 측정 공정에서, 세포를 포함하는 샘플은 유체에 현탁되고 유동 세포계산 측정 장치로 주입된다. 샘플은 레이저 빔을 통해 한 번에 하나의 세포를 이상적으로 흐르는 데 초점이 맞춰지고, 여기서, 산란된 빛은 세포와 그 성분에 특징적이다. 세포는 형광 마커로 라벨링되어 빛이 특정 파장 대역에서 흡수되고 그 다음 방출된다. 도해에서 파란색 수직 라인은 생물반응기에서 처리 공정의 시작을 나타낸다.
도 10은 세포 배양물 또는 미생물이 액체 배지에 침지되어 성장한, 본 발명에 사용될 수 있는 생물반응기의 유형인 산업용 액체 생물반응기(1)의 블록도를 개략적으로 도시한 것이다. 산업용 액체 생물반응기(1)는 펌프(15)로서의 장치, 센서 또는 센서 장치(14), 처리 장치(311) 및 액체 영양 배지(11/111)를 포함하는 반응기 용기(12)를 포함한다. 이러한 산업용 액체 또는 고체 상태 생물반응기(1)는 효소 또는 전체 세포/세포 구조가 생화학물질을 생성물로 변환하는데 효과적인 환경을 제공하도록 설계된 용기이다. 세포의 불활성화 또는 살균은 수처리와 같은 생물반응기에서 수행될 수 있는 적용들 중 하나이다. 이러한 산업용 생물반응기는 또한 세포 성장, 효소 생산, 생체 촉매, 바이오 센서, 식품 생산, 우유 가공, 압출, 조직 공학, 조류 생산, 단백질 합성 및 혐기성 소화를 위한 적용들을 포함하는 매우 다양한 다른 생물반응기 적용들에 사용될 수 있다.
도 11은 생물반응기(1)의 유형이 또한 본 발명에 사용 가능한 산업파 생물반응기(1)를 개략적으로 도시한 블록도를 나타낸다. 액체 생물반응기는 동물, 식물 및 곤충 세포의 배양을 위한 산업 배양 기술이 필요한 배치 부피에 의존하기 때문에, 모든 배양에 적합하지는 않다. 스피너 플라스크, 롤러 보틀, T-플라스크 및 유사한 시스템과 같은 장치를 사용할 수 있지만, 이러한 장치는 고유하게 제한된 산소 전달 능력으로 인해 전형적으로 배치당 1 내지 2 L의 배양액만 생산할 수 있다. 예를 들어, 스피너 플라스크는 현탁 배양액뿐만 아니라 마이크로캐리어 상의 앵커리지-의존성 시스템에 매우 대중적이지만, 전형적으로 1 L 미만의 부피에 대해서만 유용하다. 더 큰 부피에 대해서는, 전단력을 감소시키도록 변형된 교반-탱크 생물반응기를 사용하는 것이 보통 필요하다. 이러한 생물반응기는 복잡하고 고가의 장치이지만, 높은 국부 유체 전단 및 기포 에어레이션(aeration)의 사용으로 인해 종종 세포 성장에 이상적인 환경을 제공하지 않는다. 예를 들어, 단백질 특성화, 접종체 전파 및 파일럿-규모 생산에 필요한 전형적인 부피인 1 내지 100 L의 세포 배양액의 산업 생산을 위해, 이러한 설계는 스케일업(scale-up)을 매우 어렵게 하는 본질적으로 높은 국부 전단율을 갖기 때문에 교반 탱크 기술의 세포 배양액에 대한 적응은 무익한 연습이다. 대신에, 이러한 요구를 직접적으로 만족시키기 위한 세포 배양의 특별한 요구를 이해하는 것이 중요하다. 이러한 요구에는 전단 감도, 기포 없는 에어레이션 및 사전-살균 배지의 사용 및 작은 산소 흡수율이 포함된다. 산업용 사용을 위해 임의의 배양 시스템이 작동 가능한 한 간단한 것이 추가로 필수적이다. 이러한 의미에서, 유동층 생물반응기 및 중공 섬유 시스템과 같은 많은 그렇지 않은 유용한 장치들은, 세포 배양의 작업마(workhorse)로서 스피너 플라스크를 대체하기에는 너무 복잡한 것으로 밝혀졌다. 반면에, 산업 적용에서 파동 생물반응기(1)의 사용은 때때로 이러한 문제들을 극복하게 한다. 파동 생물반응기는 전형적으로 사전살균된 챔버(121), 예를 들어, 매체로 부분적으로 충전되고 세포로 접종되는, 팽창 가능한 가요성 플라스틱 챔버로 구성된다. 챔버(121)의 나머지는 공기로 팽창된다. 공기는 배양 동안 헤드스페이스를 통해 연속적으로 통과된다. 혼합 및 물질 전달은 챔버를 앞뒤로 흔드는 것에 의해 달성된다. 이러한 흔들기 운동은 액체-공기 인터페이스에서 파동을 발생시켜 산소 전달을 크게 향상시킨다. 파동 운동은 또한 벌크 혼합, 및 셀 및 입자의 바닥 외 현탁을 촉진한다. 교반을 위해 흔들기를 사용하는 이러한 개념은 예를 들어, 산업 분석 플레이트 및 겔 내의 액체의 교반을 위해 사용될 수 있다. 도 9에 나타낸 흔들기 장치는 예를 들어, 5° 내지 10° 사이에서 조정될 수 있는 각도를 통해 일 축으로 회전하는 플랫폼으로 구성될 수 있다. 공압 벨로우즈는 플랫폼을, 예를 들어, 5 내지 40 흔들기/분(rpm)으로 조정될 수 있는 흔들기 속도로 흔들기 위해 사용될 수 있다. 공압 시스템이 사용되면, 이는 유닛이 작동 동안 어떠한 열도 발생하지 않도록 보장하여 인큐베이터 내에 배치될 수 있게 한다. 전형적으로 사전-살균된 일회용 세포 배양 챔버(121)는 배지(111)로 부분적으로 충전된 다음 일체형 멸균 입구 필터를 사용하여 팽창되는 플랫폼 상에 배치된다. 공기는 챔버(121)의 헤드스페이스를 통해 연속적으로 통과될 수 있다. 이러한 기류는 pH 조절(141121) 및 CO2 제거를 위한 산소화(141122) 및 가스 교환을 제공한다. 배기 공기는 살균 필터 및 배압 조절 밸브를 통과한다. 배압 조절 밸브는 챔버(121)가 임의의 기류에서 항상 완전히 팽창되는 것을 보장할 수 있다. 그러한 밸브는 또한 챔버(121)의 과팽창 및 잠재적 파열을 방지할 수 있다. 온도(14111) 및 pH 제어(141121)는 예를 들어, 종래의 세포 배양 CO2 인큐베이터 내에 전체 유닛을 위치시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 온도 제어(14111)는 예를 들어, 배양 챔버(121)의 하부를 가열함으로써 달성될 수 있다. 파동 모션은 양호한 벌크 액체(111) 움직임을 촉진하고 온도 구배들의 발생을 최소화한다. 산업파 생물반응기(1)는 펌프(15)로서의 장치들, 센서들 또는 센서 장치들(14), 처리 장치(311), 및 반응기 용기(12)로서의 액체 영양 배지(11/111)를 수용하는 챔버(121)를 더 포함한다.
도 12는 본 발명에 또한 사용될수 있는 유형의 생물반응기인 고체-상태 생물반응기를 개략적으로 도시하는 블록도를 나타낸다. 고체-상태 생물반응기(SSF: 고체-상태 발효)는, 특히, 더 낮은 물 사용 및 더 높은 체적 생산성과 같은, 액침 발효를 갖는 다른 유형의 생물반응기에 비해 중요한 이점을 갖는다. 그 결과, SSF 기술은 지난 수십 년 동안 생물반응기의 산업적 적용에서 증가하는 분야를 다룬다. SSF 생물반응기는 예를 들어, 트레이, 패킹-베드, 회전/교반-드럼, 유동-베드, 흔들-드럼 및 교반-공기 생물반응기와 같은 다양한 유형의 반응기 기술에 기초할 수 있다. 기술적으로 중요한 것은 전형적으로 반응기 설계, 열 및 물질 전달의 제어 및 적용된 작동 전략이다. 세포의 산업적 배양과 미생물의 성장 둘 모두가 SSF 생물반응기에서 실현될 수 있다. 언급된 바와 같이, SSF 생물반응기의 산업적 적용을 위해 중요한 것은, 전형적으로 대규모 열 전달의 제어 및 세포 성장의 정량적 특성화 및 측정이다. 후자의 경우, 기술적 과제 중 하나는 예를 들어, SSF 공정 동안 비파괴 검출 방법의 적절한 선택이다. 일반적으로, 액침 발효에 비해 SSF에 사용되는 고체 배지(112)은 물을 더 적게 함유하지만, 중요한 기체 상이 전형적으로 입자들 사이에 존재한다. 이러한 특징은 물에 비해 공기의 열악한 열전도도 때문에 기술적으로 매우 중요하다. 또 다른 점은 SSF 생물반응기에서 사용되는 다양한 매트릭스(112)이며, 이는 조성, 크기, 기계적 저항, 공극률 및 물 보유 능력 측면에서 다양하다. 모든 이들 인자는 반응기 설계 및 파라미터에 대한 제어 전략에 영향을 미칠 수 있다. 실제로 액침 발효에서, 모든 배지는 본질적으로 물로 제조되는 것으로 고려될 수 있다. 따라서, 액체 생물반응기에서, 온도(14111) 및 pH(141121) 규정은 공정의 산업적 스케일업 동안 전형적으로 달성하기 간단하며 아무런 문제를 제기하지 않는다. 액침 발효에서, 주요 난점은 전형적으로 형상, 반응기의 크기 및 사용되는 교반/에어레이션 시스템에 의존하는 미생물 또는 세포로의 산소 전달이다. 이러한 전달은 파라미터 KLa(산소 전달 계수)에 의해 측정될 수 있으며, 여기서 그 값은 반응기의 부피에 독립적으로 산소를 전달하는 장비의 용량을 표현하므로, 액침 발효에서 스케일업 설계에 사용되는 중요한 파라미터를 구성한다. 액체 생물 반응기와는 대조적으로, 일부 설계의 제한 인자가 될 수 있는 산소 전달(141122) 외에, SSF 생물 반응기에서, 기술적 문제는 두 가지 중요한 파라미터, 즉 온도(14111) 및 고체 배지(112), 즉 기질(112)의 물 함량의 제어에 영향을 미치는 바 더 복잡하다. 다양한 유형의 고체-상태 생물 반응기와 관련하여, 일반적으로 많은 유형의 반응기가 소량의 배지(112)로 실험실 규모에서 배양 공정을 운영할 수 있음을 유의하는 것이 중요하다. 그러나 산업적 스케일업은 특히 종종 시스템 내의 강도 높은 열 발생 및 이질성으로 인해 복잡하며, 이는 또한 배양 공정의 기술적 제어를 복잡하게 한다. 산업적 고체-상태 생물 반응기에서, 위에서 논의된 열 및 물질 전달 문제는 특히 열악한 에어레이션에 기인할 수 있다. 이러한 문제는 예를 들어, (i) 기질층(112) 주위의 공기를 순환시키거나 (ii) 기질층(112)을 통해 공기를 유도함으로써 해결될 수 있다. 후자의 경우, 종래 기술에서 세 가지 가능성이 사용되며, 이는 비 혼합, 간헐적 또는 연속적으로 혼합된 베드이다. 하지만, 이미 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 고체-상태 생물반응기와 함께 사용될 수도 있다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 적합한 산업용 고체-상태 생물반응기(1)는 예를 들어, 펌프(15), 센서 또는 센서 장치(14), 처리 장치(311) 및 반응기 용기(12)로서 기질(11/112)을 함유하는 배양 용기(121)를 포함하여 실현될 수 있다.
도 7은 영양 배지(11)에서 세포 배양물(5/51), 세포 성분(5/512) 또는 세포의 대사 산물(5/52)에 대해 최적화된 배양 공정(21)을 제공하는 이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 본 발명의 산업용 생물반응기(1)의 일 구현예의 가능한 구현을 위한 아키텍처(architecture)를 개략적으로 도시한다. 산업용 생물반응기(1)는 배양 공정(21)에 대한 제어된 생물 반응기 조건을 제공하는 반응기 용기(12)를 포함한다. 생물반응기는 배양육 생산과 같은 세포 또는 세포 배양물의 생산을 위한 산업용 생물반응기이다. 생물반응기(1)는 예를 들어, 종자 발아 적용의 경우 발효기 및/또는 발아 박스로서도 구현될 수 있다. 추가로, 생물반응기는 또한 대사 산물, 예컨대, 생물학적 활성 2차 대사산물(항생제, 세균 독소, 면역 약물 및 알칼로이드), 단일 세포 단백질, 효소, 산업용 화학 물질, 바이오 연료, 식품, 페놀수지, 사료 및 의약품의 생산을 위한 산업용 생물반응기일 수 있다. 다만, 본 발명은 고체-상태 발효(SSF) 생물반응기 또는 액침 발효(SmF) 생물반응기와 같은 임의의 종류의 액체 생물반응기 또는 고체-상태 생물반응기, 특히 폐기물 관리 기술 분야, 및 생물정화, 해독(detoxication), 미생물용출 및 생체펄핑 등을 포함하는 적용들에 사용되는 생물반응기에 적용될 수 있다. 바람직한 구현 변형예에서, 생물반응기는 배양육 또는 발효 식품, 예를 들어, 템페, 미소, 코지 및 간장 등의 식품 생산에 사용된다. 생물반응기(1)는 예를 들어, 반응기 용기(12)에 들어갈 수 있는 하나 또는 복수의 기질 용기(121, 트레이라고도 함)를 포함할 수 있으며, 여기서, 세포 배양물(51)은 기질 용기(121)에 또한 수용된 영양 배지(11) 상에서 배양된다. 하지만, 생물반응기는 트레이 생물반응기로 구현될 수 있을 뿐만 아니라, 포장된 베드 생물반응기, 기압 맥동 생물반응기, 또는 간헐적 또는 연속적 혼합 SSF 생물반응기 등으로도 구현될 수 있다. 생물반응기가 배양육 생산을 위해 사용되는 경우, 세포의 군집을 포함하는 하나 이상의 기질 용기(121)를 수용하는 스캐폴드를 포함할 수 있다. 생물반응기에서 생산된 배양육 제품은 예를 들어, 약 100 μm 내지 약 500 mm의 두께, 또는 임의의 다른 크기를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 이러한 배양육 제품을 생산하는 방법은 스캐폴드를 제조하는 단계, 스캐폴드를 생물반응기에 배치하는 단계, 영양 배지(11) 및 세포 배양물 또는 세포 군집과 함께 기질 용기(121)를 생물반응기(1)에 투입하는 단계, 일정 시간 동안 스캐폴드를 포함하는 생물반응기의 세포 군집을 각각 배양 및 재배하여 배양육 제품을 형성하는 단계, 및 배양육 제품을 생물반응기(1)에서 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 생물반응기(1)에서 배양 공정(21) 동안, 후술하는 바와 같이, 처리(31)가 세포 배양에 적용될 수 있다. 배양육 제품은 예를 들어, 전통적인 도축육의 맛, 질감, 크기, 형상 및/또는 지형(topography)을 모방하도록 구성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "전통적인 도축육"이란 소비를 목적으로 한때 살아있던 동물로부터 수득된 하나 이상의 종류의 육류를 의미한다. 이러한 육류는, 항상은 아니지만, 일반적으로 주로 식품의 생산을 목적으로 사육 또는 도축된 가축, 어류, 또는 기타 동물로부터 수득된다. 전통적인 도축육의 비제한적인 예는 닭, 칠면조, 돼지고기, 소고기, 어류 등을 포함한다. 전통적인 도축육은 일반적으로 하나 이상의 포유동물 종에 의해 소비되기에 적절하다. 또한 본원에서 사용되는 바와 같이, "배양육 제품"이란 살아있는 동물의 천연 성분으로 성장한 것이 아니라, 인간 또는 기계의 개입에 의해 생산된 육류 제품을 의미한다. 따라서, 배양육 제품은 살아있는 동물의 도살로부터 직접 수득되는 것이 아니라, 예를 들어, 제어된 생물반응기 환경에서 유도된 인공 배양 과정에 의해 수득된다. 전통적인 도살된 육류와 마찬가지로, 배양육 제품은 일반적으로 하나 이상의 포유동물 종에 의해 소비되기에 적절하다.
생물반응기(1)의 제어 유닛(13)는 적어도 영양 배지(11)의 조성(1411) 및/또는 영양 배지(11)의 농도(1412) 및/또는 산소(1413) 및/또는 온도(1414) 및/또는 pH-값(1415) 및/또는 멸균(1416)과 관련된 측정치를 포함하는 센서 파라미터(141) 값을 측정하고 이들을 제어 유닛(13)로 송신하는 센서 장치(14)에 연결된다. 배양 공정(21)은 측정된 센서 파라미터(141) 값에 영향을 미치는 생물반응기(1)의 작동 파라미터를 조절함으로써 제어 유닛(13)에 의해 제어 및/또는 조종된다.
이중 주기-제어된 최적화 공정은 배양 및/또는 처리를 위해 생물학적으로 최적화된 창을 식별하는 생물반응기(1)의 작동 제1 파라미터(1311)를 조절하여 배양 공정(21)의 배양 성능(241)을 최적화하는 배양 최적화 주기(2)를 포함한다. 또한, 이중 주기-제어된 최적화 공정은 생물반응기(1)의 작동 제2 파라미터(1312)를 적용하여 최적화된 처리 창 내에서 배양 공정(21) 동안 세포 배양물(51)에 적용되는 처리 공정(32)을 최적화하는 처리 최적화 주기(3)를 포함한다.
배양 최적화 사이클(2)은 배양 공정(21)의 배양 성능(241)을 캡처하는 센서 장치(14)의 제1 센서 장치(221)에 의해 제1 센서 파라미터(222)를 측정하는 것(22)을 포함한다. 제1 센서 파라미터(222)는 목표 배양 성능(242)과 측정된 배양 성능(241) 사이를 조정하는 제1 분석기(23)로 전달되며, 목표 배양 성능(242)이 충족되지 않으면, 작동 제1 파라미터(1311)가 조정되고 측정(22) 및 조정(24)이 반복된다. 제1 센서 파라미터(222)에 의해 배양 공정(21)의 배양 성능(241)을 측정하는 제1 센서 장치(221)는 예를 들어, 전기 여기(electric excitation)에 대한 그들의 반응을 검출하는 생체 임피던스 측정기에 대한 측정 장치(2211)를 포함할 수 있고, 여기서, 전극에 의해 전류 또는 전위 기반의 여기 신호가 세포 배양에 적용되고 반응이 전하를 이온 전하로 전환하고, 그 반대로(vice versa) 적어도 세포(51)의 세포 수(2221) 및/또는 세포 크기(2222) 및/또는 세포 생존율(2223)의 검출을 제공하여 측정된다.
목표 배양 성능(242)이 충족되면, 배양 성능(241)의 처리 유도 편차를 측정하여 처리 공정(31)의 처리 성능(341)을 캡쳐하는 센서 장치(14)의 제2 센서 장치(321)에 의해 제2 센서 파라미터(322)를 측정하는 것(32)을 포함하는 처리 최적화 주기(3)가 촉발된다. 제2 센서 파라미터(322)는 목표 처리 성능(342)과 측정된 처리 성능(341) 사이를 조정하는 제2 분석기(33)로 전달되고, 목표 처리 성능(342)이 충족되지 않으면, 작동 제2 파라미터(1312)를 조정하고 측정(32) 및 조정(34)을 반복하며, 그렇지 않으면 이중 주기-제어된 최적화 과정이 완료된다.
예를 들어, 처리 공정(31)은 적어도 2개의 인가된 전극(3112)을 사용하여 세포 배양물에 나노초 펄스 전기장(nsPEF)(3113)을 인가하는 것을 포함할 수 있고, 여기서, 전기장(3113)은 하나의 전극(3112)을 더 높은 전압에 커플링하고 하나의 전극(3112)을 접지 또는 더 낮은 전압에 커플링하여 인가되고, 펄스 전기장은 정의 가능한 형상(31131) 및/또는 주파수(31132) 및/또는 강도(31133)를 갖는다. 변형예로서, 제어 유닛(13)는 각각의 가능한 세포 유형(511)에 대한 미리 정의된 기본 나노초 펄스 전기장(3113) 설정을 포함할 수 있다.
나노초 펄스 전기장(nsPEF)(3113)은 예를 들어, 전극에 의해 이와 같은 생물반응기(1)에 인가될 수 있다. 생물반응기가 영양 배지(11) 및 세포 배양물(51)을 유지하는 하나 이상의 기질 용기(121)를 포함하면, 전극은 또한 예를 들어, 기질 용기(121)의 가능한 벽 내로 이를 통합함으로써 각각의 기질 용기(121)에 인가될 수 있다. 마지막으로, 생물반응기(1)는 또한 펄스 전기장(PEF) 스테이션을 포함하거나 요구되는 펄스 전기장을 제공하는 펄스 전기장(PEF) 스테이션에 포함될 수 있다. 후자의 경우, 생물학적 물질은 예를 들어, 입구를 통해 PEF 스테이션으로 유입될 수 있고, 처리될 수 있고, 그 다음 출구를 통해 방출될 수 있다. PEF 발생은 예를 들어, PEF 처리가 세포 배양물(51)을 포함하는 특정 처리 구역에서 효과적인 펄스 생성기에 의해 제공될 수 있다. 특히, 처리 구역에 수용되거나 처리 구역을 통과하는 물질은 펄스 생성기에 의해 생성된 비-아크(non-arcing) 전기장 펄스에 의해 처리된다. 전기장 펄스는 예를 들어, 전압 펄스를 전극에 인가함으로써 생성될 수 있으며, 펄스는 예를 들어, 정사각형파 형상을 가질 수 있다. 하지만, 펄스는 지수함수적으로 감쇠하거나 발진하는 형상을 가질 수도 있다. 추가로, 펄스는 단극성, 양극성, 또는 심지어 순간적인 역전하일 수도 있다. 전기장 펄스는 예를 들어, 10 내지 수백 나노초의 바람직한 지속시간일 수 있지만, 처리에 의존하여, 펄스 지속시간은 또한 15 내지 100 kV/cm 등의 피크장 강도를 갖는 2 내지 15 마이크로초의 범위에 있을 수 있다. 결과적인 처리 기간은 예를 들어, 처리 구역(예를 들어, 전극)의 형상 및 전기장 펄스의 특성의 함수일 수 있다. 바람직하게, 처리는 더 큰 부분 또는 전체 배양 공정(21) 동안 적용된다. 펄스 생성기는 예를 들어, 전력 공급기에 결합될 수 있으며, 펄스 생성기는 이를 사용하여 처리 구역과 연관된 전극에 걸쳐 일련의 고전압 비-아크 전기장 펄스를 생성한다. 사용되는 전력 공급기에 따라, 전압 변환기가 예를 들어, 전력 공급기와 펄스 생성기 사이에 결합될 수 있다. 펄스 생성기는 축전기의 뱅크 및 처리 챔버 내에 펄스들을 생성하기 위해 전극들을 가로질러 축전기의 뱅크를 연결할 수 있는 스위칭 회로부를 포함할 수 있다. 스위칭 회로부는 예를 들어, 신호 생성기로부터의 신호를 입력으로서 가지는 제어기에 의해 제어될 수 있다. 신호 생성기로부터의 신호의 특성을 변화시킴으로써, 처리 구역 내의 펄스들의 특성이 변화될 수 있다.
구현의 변형예로서, 생물반응기 용기(12) 또는 기질 용기(121)에는 더 높은 전압에 결합된 전극 중 하나와 접지 또는 더 낮은 전압에 결합된 다른 하나의 전극이 배치될 수 있다. 절연체가 전극의 어느 측에 그리고 전극 사이에 배치될 수 있다. 절연체는 물론, 예를 들어 절연 물질로 제조될 수 있는 기질 용기(121)는 기질 용기(121)의 어느 단부에 부착되거나 고정될 수 있는 결합으로부터 전극을 분리한다. 유사하게, 절연체와 기질 용기(121)는 그 사이에 배치된 처리 구역을 정의하기 위해 전극을 간격을 두어 배치시킨다. 동작시, 생물학적 물질, 즉 세포 배양물(51)은 예를 들어, 배양 공정(21) 동안 처리 구역에서 처리될 것이다.
처리 성능(341)은 예를 들어, 주파수의 함수로서 세포(51)의 유전체 특성을 측정하는 유전체 분광법(3211)에 의해 측정될 수 있고, 여기서, 목표 범위에서의 주파수-의존 유전율이 측정되며, 측정된 진폭 또는 신호 세기가 처리의 성능에 대한 측정된 목표 파라미터 값으로 작용한다. 목표 범위는 예를 들어, 0.1 내지 30 MHz에 놓일 수 있다. 따라서, 처리 성능(341)은 예를 들어, 형광 분석, 형광 염료의 변환 및 처리의 성능에 대한 측정된 목표 파라미터 값으로 작용하는 신호 세기에 기초하여 대사 활성을 측정하는 적어도 하나의 제2 센서 장치(321)로서 유동 세포계(3212)에 의해 측정될 수 있다. 형광 분석은 예를 들어, 플루오레신 디아세테이트(FDA)일 수 있다. 유동 세포계(3212)는 예를 들어, 적어도 측정 시스템, 검출기 및 증폭 유닛을 포함할 수 있고, 유동 세포계는 측정 신호에 연결되어 전송된 신호의 분석을 위해 측정 신호를 제어 유닛(13)으로 전달한다. 측정 시스템은 임피던스 또는 전도성과 같은 양을 측정하며, 예를 들어, 생물반응기(1)에서 실현되는 광 신호를 방출하는 광학 시스템을 사용할 수 있다. 검출기는 예를 들어, 전방-산란 광(FSC), 측-산란 광(SSC), 및 염료-특이 형광 신호들의 아날로그 측정치들을 제어 유닛(13)에 의해 처리가능한 디지털 신호들로 변환하는 아날로그-투-디지털(analog-to-digital) 변환(ADC) 시스템을 포함할 수 있다. 증폭 유닛은 예를 들어, 선형 또는 대수적으로(logarithmic) 구현될 수 있다.
따라서, 이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기는 제1 단계에서 배양할 세포의 세포 특성에 기초한 최적의 생물학적 배양 창을 검출함으로써 생물반응기에서 산업적 배양 공정에 대한 최적의 처리 파라미터의 신뢰성 있고 제어 가능한 검출을 제공한다. 제2 단계에서, 기술적 처리가 최적화되며, 즉 적용될 처리의 작동 파라미터에 대한 최적의 처리 창이 자동으로 검출된다. 이러한 제1 단계는 전체 처리 동안 계속될 수 있으며, 이에 따라, 제2 단계가 공정 효율을 정량화하여 배양/성장 효율의 백분율 증가를 검출하고, 이에 따라, 또한 공정 실행시간의 예측을 가능하게 하는 동안 처리 중지를 식별하는 역할을 할 수 있다. 따라서, 세포 배양물(51)의 위상각(2224)은 예를 들어, 생체 임피던스 측정(22)에 의해 측정될 수 있으며, 여기서, 위상각(2224)은 세포 생존율과 상관되며, 측정 위상각(2224)이 증가하면 처리(31)가 적용되는 반면, 측정 위상각(2224)이 감소하면, 처리(31)가 중지된다. 처리 성능은 예를 들어, 측정된 제2 센서 파라미터 값(322)에 기초하여 생물반응기(1)에서 배양 공정(21)의 가속 및/또는 목표 생물학적 성장이 측정되면 최적화되도록 검출되거나 측정될 수 있다.
마지막으로, 추가의 적합한 구현예 4의 변형으로서, 제어 유닛(13)은 예를 들어, 유전체 분광법(3211)에 의해 측정된, 측정된 처리 성능(341) 및/또는 유동 세포계(3212)에 의해 측정된, 측정된 처리 성능(341)을 캡처하는 기계학습 또는 인공-지능 기반 유닛(132)을 포함할 수 있다. 이 구현예 변형에서, 작동 제1 파라미터(1311) 및/또는 작동 제2 파라미터(1312)는 제어 유닛(13)에 의해 자동으로 적응되고, 여기서, 적어도 제1 및 제2 센서 파라미터(222/322)는 기계학습 또는 인공-지능 기반 유닛(132)에 입력 값으로서 적용되며, 기계학습 또는 인공-지능 기반 유닛(132)의 출력은 적용된 처리 공정(32)으로 목표 배양 성능(242)에 도달할 때까지 작동 제1 파라미터(1311) 및/또는 작동 제2 파라미터(1312)의 조정을 촉발한다. 이미 전술한 바와 같이, 기계학습 모듈은 예를 들어, 감독 또는 비감독 학습 구조에 기초할 수 있다. 예로서, 기계학습 모듈은 예를 들어, 가변 숨겨진 마르코프 모델 파라미터로 기계학습 모듈의 다차원 데이터 구조의 훈련을 위한 최대 우도 파라미터 추정을 적용하여 측정된 제1 및/또는 제2 센서 파라미터를 할당된 이진 입력 코드의 시퀀스로 변환하고 할당된 이진 입력 코드의 시퀀스를 처리할 수 있고, 여기서, 마르코프 체인의 저장 가능한 파라미터 상태 시퀀스의 요소는 서로의 독립적인 측정치로 가정되며, 다차원 데이터 구조의 훈련된 모델 파라미터를 얻기 위해 확률의 곱셈 값을 최대화함으로써 다차원 데이터 구조의 모델 파라미터가 가변된다. 다차원 데이터 구조의 모델 파라미터는 예를 들어, 사전 정의된 수렴 임계치가 촉발될 때까지 반복적으로 변화될 수 있다. 작동 제1 및/또는 제2 작동 파라미터의 최적화를 위한 측정치를 나타내거나 제공하는 점수의 상기 임계값을 결정하기 위해, 평균화 공정은 예를 들어, 식별된 시간 프레임의 센서 및/또는 측정 데이터의 제1 및/또는 제2 센서 파라미터의 상이한 패턴에 기초하여 적용될 수 있다. 일 구현예 변형에서, 선택된 작동 파라미터의 민감도는 예를 들어, 임계값의 동적 조정에 기초하여 자동으로 조정될 수 있다. 이러한 실시예 변형은 특히 다차원 데이터 구조의 가변 숨겨진 마르코프 모델 파라미터를 훈련함으로써 수렴 속도가 최적화될 수 있다는 이점을 갖는다. 구현예 변형은 특히, 세포 배양물의 배양에 영향을 미치는 제1 및 제2 작동 파라미터 및 산업용 생물반응기에 사용되는 적용된 처리에 대한 최적화된 설정의 자동화된 검출, 측정 및 촉발을 위한 새로운 방법 및 생물반응기를 제공한다는 이점을 갖는다. 이는 전형적으로 다루기 어려운 (예를 들어, 배양육 생산에 사용되는) 소규모 내지 대규모 산업용 생물반응기의 제어 및 모니터링을 위한 효율적인 자동화된 시스템을 제공한다. 추가로, 이러한 구현예 변형은 특히 시스템이 실제/목표 비교에 의해 그 자체를 최적화하므로, AI 통합이 또한 생물반응기의 제1 및/또는 제2 작동 파라미터에 대한 적절한 설정을 실증적으로 평가하지 않고 완전히 알려지지 않은 유기체를 최종적으로 처리하는 역할을 할 수 있게 한다는 이점을 갖는다.
1
산업용 생물반응기
11 영양 배지
111 액체 배지
112 기질
12 반응기 용기
121 기질 용기
122 처리 영역/처리 챔버
123 펄스 전기장 유닛
1231 펄스 생성기
12311 신호 생성기
12312 제어기
12313 축전기
12314 스위칭 회로
1232 전기 펄스
12321 전기 펄스 형상
12322 전기 펄스 주파수
12323 전기장 강도
1233 전원 공급 장치
1234 전극
13 제어 유닛
131 작동 파라미터
1311 작동 제1 파라미터
1312 작동 제2 파라미터
132 기계학습 또는 인공 지능 기반 유닛
14 센서 장치/센서
141 센서 파라미터
1411 물리적 센서 파라미터
14111 온도
1412 화학적 센서 파라미터
141121 pH-값
141122 산소
141123 영양 배지의 조성
141124 영양 배지의 농도
1413 생물학적 센서 파라미터
141131 세포 농도
1451132 멸균율(예를 들어, 십진 감소 시간
D-값)
15 펌프
2 배양 최적화 주기
21 배양 공정
22 제1 센서 데이터의 측정
221 제1 센서 장치
2211 생체 임피던스 측정 장치
222 제1 센서 파라미터
2221 세포 수
2222 세포 크기
2223 세포 생존율
2224 위상각
23 분석기
24 배양 성능 목표/실제 조정
241 실제 배양 성능
242 목표 배양 성능
25 임계값/촉발에 도달하지 않음
26 임계값/촉발에 도달함
3 처리 최적화 주기
31 처리 공정
311 처리 장치
3111 생체-기반 PEF 처리 장치
3112 전극
3113 펄스 전기장(PEF)
31131 펄스 형상
31132 펄스 주파수
31133 장 강도
32 제2 센서 데이터의 측정
321 제2 센서 장치
3211 유전체 분광계
3212 유동 세포계
322 제2 센서 파라미터
33 분석기
34 제2 목표/실제 조정(목표/성능 분석)
35 임계값/촉발에 도달하지 않음
36 임계값/촉발에 도달함
4 공정 중지
5 바이오매스
51 세포/세포 배양물
511 세포 유형
512 세포 성분
52 세포 배양의 대사 산물
11 영양 배지
111 액체 배지
112 기질
12 반응기 용기
121 기질 용기
122 처리 영역/처리 챔버
123 펄스 전기장 유닛
1231 펄스 생성기
12311 신호 생성기
12312 제어기
12313 축전기
12314 스위칭 회로
1232 전기 펄스
12321 전기 펄스 형상
12322 전기 펄스 주파수
12323 전기장 강도
1233 전원 공급 장치
1234 전극
13 제어 유닛
131 작동 파라미터
1311 작동 제1 파라미터
1312 작동 제2 파라미터
132 기계학습 또는 인공 지능 기반 유닛
14 센서 장치/센서
141 센서 파라미터
1411 물리적 센서 파라미터
14111 온도
1412 화학적 센서 파라미터
141121 pH-값
141122 산소
141123 영양 배지의 조성
141124 영양 배지의 농도
1413 생물학적 센서 파라미터
141131 세포 농도
1451132 멸균율(예를 들어, 십진 감소 시간
D-값)
15 펌프
2 배양 최적화 주기
21 배양 공정
22 제1 센서 데이터의 측정
221 제1 센서 장치
2211 생체 임피던스 측정 장치
222 제1 센서 파라미터
2221 세포 수
2222 세포 크기
2223 세포 생존율
2224 위상각
23 분석기
24 배양 성능 목표/실제 조정
241 실제 배양 성능
242 목표 배양 성능
25 임계값/촉발에 도달하지 않음
26 임계값/촉발에 도달함
3 처리 최적화 주기
31 처리 공정
311 처리 장치
3111 생체-기반 PEF 처리 장치
3112 전극
3113 펄스 전기장(PEF)
31131 펄스 형상
31132 펄스 주파수
31133 장 강도
32 제2 센서 데이터의 측정
321 제2 센서 장치
3211 유전체 분광계
3212 유동 세포계
322 제2 센서 파라미터
33 분석기
34 제2 목표/실제 조정(목표/성능 분석)
35 임계값/촉발에 도달하지 않음
36 임계값/촉발에 도달함
4 공정 중지
5 바이오매스
51 세포/세포 배양물
511 세포 유형
512 세포 성분
52 세포 배양의 대사 산물
Claims (16)
- 영양 배지(11)에서 세포 배양물(5/51), 세포 성분(5/512) 또는 세포의 대사 생성물(5/52)에 대해 최적화된 배양 공정(21)을 제공하는 이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1)로서, 상기 생물반응기는 배양 공정(21)에 대한 제어된 생물반응기 조건을 제공하는 반응기 용기(12), 및 적어도 영양 배지(11)의 조성(1411) 및/또는 영양 배지(11)의 농도(1412) 및/또는 산소(1413) 및/또는 온도(1413) 및/또는 pH-값(1415) 및/또는 멸균(1416)에 대한 측정치를 포함하는 센서 파라미터(141) 값을 측정하는 센서 장치(14)에 연결된 제어 유닛(13)을 포함하고, 상기 제어 유닛(13)은 측정된 센서 파라미터(141) 값에 영향을 미치는 생물반응기(1)의 작동 파라미터를 조정함으로써 배양 공정(21)을 제어 및/또는 조종(steer)하고,
상기 이중 주기-제어된 최적화 공정은 배양 및/또는 처리를 위해 생물학적으로 최적화된 창(window)을 식별하는 생물반응기(1)의 작동 제1 파라미터(1311)를 조절하여 배양 공정(21)의 배양 성능(241)을 최적화하는 배양 최적화 주기(2)와, 생물반응기(1)의 작동 제2 파라미터(1312)를 적용하여 최적화된 처리 창 내에서 배양 공정(21) 동안 세포 배양물(51)에 적용되는 처리 공정(32)을 최적화하는 처리 최적화 주기(3)를 포함하고,
상기 배양 최적화 주기(2)는 배양 공정(21)의 배양 성능(241)을 캡처하는 센서 장치(14)의 제1 센서 장치(221)에 의해 제1 센서 파라미터(222)를 측정하는 것(22)을 포함하고, 상기 제1 센서 파라미터(222)는 목표 배양 성능(242)과 측정된 배양 성능(241) 사이를 조정하는 제1 분석기(23)로 전달되고, 상기 목표 배양 성능(242)이 충족되지 않으면 작동 제1 파라미터(1311)이 조정되고 측정(22) 및 조정(24)이 반복되고,
상기 제1 센서 파라미터(222)에 의해 배양 공정(21)의 배양 성능(241)을 측정하는 제1 센서 장치(221)는 전기 여기(electric excitation)에 대한 이들의 반응을 검출하는 전기 측정을 위한 측정 장치(2211)를 포함하고, 여기서, 전극에 의해 전류 또는 전위 기반의 여기 신호가 세포 배양에 적용되고 상기 반응이 전하를 이온 전하로 전환하고, 그 반대로(vice versa) 적어도 세포(51)의 세포 수(2221) 및/또는 세포 크기(2222) 및/또는 세포 생존율(2223)의 검출을 제공하여 측정되고,
상기 목표 배양 성능(242)이 충족되면, 배양 성능(241)의 처리 유도 편차를 측정하여 처리 공정(31)의 처리 성능(341)을 캡처하는 센서 장치(14)의 제2 센서 장치(321)에 의해 제2 센서 파라미터(322)를 측정하는 것(32)을 포함하는, 상기 처리 최적화 주기(3)가 촉발되고, 상기 제2 센서 파라미터(322)는 목표 처리 성능(342)과 측정된 처리 성능(341) 사이를 조정하는 제2 분석기(33)로 전달되고, 상기 목표 처리 성능(342)이 충족되지 않으면, 작동 제2 파라미터(1312)가 조정되고 측정(32) 및 조정(34)이 반복되며, 그렇지 않으면 이중 주기-제어된 최적화 공정이 완료되는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제1항에 있어서,
상기 전기 측정이 생체 임피던스 측정이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제2항에 있어서,
상기 세포 배양물(51)의 위상각(2224)이 대안적으로 생체 임피던스 측정(22)에 의해 측정되고, 상기 위상각(2224)이 세포 생존율과 상관되며, 측정 위상각(2224)이 증가하면 처리(31)가 적용되는 반면, 측정 위상각(2224)이 감소하면, 처리(31)가 중지되는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 처리 공정(31)이 적어도 2개의 인가된 전극(3112)을 사용하여 세포 배양물에 나노초 펄스 전기장(nsPEF)(3113)을 인가하는 것을 포함하고, 상기 전기장(3113)은 하나의 전극(3112)을 더 높은 전압에 커플링하고 하나의 전극(3112)을 접지 또는 더 낮은 전압에 커플링하여 인가되고, 상기 펄스 전기장은 정의 가능한 형상(31131) 및/또는 주파수(31132) 및/또는 강도(31133)를 갖는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제4항에 있어서,
상기 제어 유닛(13)이 각각의 가능한 세포 유형(511)에 대한 미리 정의된 기본 나노초 펄스 전기장(3113) 설정을 포함하는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 처리 성능(341)이 주파수의 함수로서 세포(51)의 유전체 특성을 측정하는 유전체 분광계(3211)에 의해 측정되고, 주파수의 목표 범위에서의 주파수-의존 유전율이 측정되며, 측정된 진폭 또는 신호 세기가 처리의 성능에 대한 측정된 목표 파라미터 값으로 작용하는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제6항에 있어서,
상기 목표 범위가 0.1 내지 30 MHz를 갖는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 처리 성능(341)이 형광 분석, 형광 염료의 변환 및 처리의 성능에 대한 측정된 목표 파라미터 값으로 작용하는 신호 세기에 기초하여 대사 활성을 측정하는 적어도 하나의 제2 센서 장치(321)로서 유동 세포계(3212)에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제8항에 있어서,
상기 형광 분석이 플루오레신 디아세테이트(FDA)인 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 유동 세포계(3212)가 적어도 측정 시스템 및 검출기 및 증폭 유닛을 포함하고, 상기 유동 세포계는 측정 신호에 연결되고 전송된 신호의 분석을 위해 측정 신호를 제어 유닛(13)으로 전달하는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제10항에 있어서,
상기 측정 시스템이 광 신호를 방출하는 광학 시스템을 사용하여 임피던스 및/또는 전도성 및/또는 pH를 측정하는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제10항 또는 제11항에 있어서,
상기 검출기가 전방-산란 광(FSC), 측-산란 광(SSC), 및 염료-특이 형광 신호들의 아날로그 측정치들을 제어 유닛(13)에 의해 처리가능한 디지털 신호들로 변환하는 아날로그-투-디지털(analog-to-digital) 변환(ADC) 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 증폭 유닛이 선형 또는 대수적(logarithmic) 증폭기로 구현되는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
측정된 제2 센서 파라미터 값(322)에 기초하여 상기 생물반응기(1)에서 배양 공정(21)의 가속 및/또는 목표 생물학적 성장이 측정되면 상기 처리 성능이 최적화되는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물반응기(1)가 종자 발아 적용의 경우 발효기 및/또는 발아 박스로서도 구현되는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제어 유닛(13)이 유전체 분광계(3211)에 의해 측정된, 측정된 처리 성능(341) 및/또는 유동 세포계(3212)에 의해 측정된, 측정된 처리 성능(341)을 캡쳐하는 기계학습 또는 인공지능 기반 유닛(132)을 포함하고, 상기 작동 제1 파라미터(1311) 및/또는 작동 제2 파라미터(1312)는 제어 유닛(13)에 의해 자동으로 적응되며, 적어도 상기 제1 및 제2 센서 파라미터(222/322)는 상기 기계학습 또는 인공지능 기반 유닛(132)에 입력 값으로 적용되며, 상기 기계학습 또는 인공지능 기반 유닛(132)의 출력은 적용된 처리 공정(32)으로 목표 배양 성능(242)에 도달할 때까지 상기 작동 제1 파라미터(1311) 및/또는 작동 제2 파라미터(1312)의 조정을 촉발하는 것을 특징으로 하는,
이중 주기-제어된 최적화 공정을 갖는 산업용 생물반응기(1).
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH00600/21 | 2021-05-27 | ||
| CH6002021 | 2021-05-27 | ||
| EP21179569.5A EP4095626A1 (en) | 2021-05-27 | 2021-06-15 | Optimized industrial bioreactor and method thereof, with mutually dependent, coupled process control loops |
| EP21179569.5 | 2021-06-15 | ||
| PCT/EP2022/064285 WO2022248594A1 (en) | 2021-05-27 | 2022-05-25 | Optimized industrial bioreactor and method thereof, with mutually dependent, coupled process control loops |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230170045A true KR20230170045A (ko) | 2023-12-18 |
Family
ID=82067663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237038808A KR20230170045A (ko) | 2021-05-27 | 2022-05-25 | 상호 의존적 결합 공정 제어 루프를 갖는 최적화된 산업용 생물반응기 및 이의 방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20230170045A (ko) |
| AU (1) | AU2022283577A1 (ko) |
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