CN107922481A - 抗甲型h1n1流感病毒中和抗体 - Google Patents

抗甲型h1n1流感病毒中和抗体 Download PDF

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Abstract

一种抗甲型H1N1流感病毒的抗体或其结合片段，其包含一重链可变区及一轻链可变区，其中所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)；及其中轻链可变区包含具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)。一种抗体或其结合片段在制备用以治疗或预防甲型H1N1流感病毒感染的药物的应用。

Description

抗甲型H1N1流感病毒中和抗体
技术领域
本发明涉及使用抗体或其片段作为治疗及预防流感病毒感染的领域。具体而言，本发明涉及单克隆抗体用于诊断、预防及治疗甲型H1N1流感病毒感染的研制。
背景技术
传染病爆发时，即时找到有效的治疗或预防方法是控制疾病扩散的关键。近期的流感爆发，例如2009年甲型H1N1流感爆发，凸显了找寻有效治疗方式的急迫性。
2009年甲型H1N1流感的爆发导致超过6千万名病患被感染，且超过250万名被感染的病患须住院。2009年甲型H1N1流感爆发的主要流行病毒，世界卫生组织(WHO)称之为A(H1N1)pdm09，此毒株不成比例地对幼童及老年人造成严重的综合症。
由于甲型H1N1流感病毒具有高度感染性，因此促使大量研发转而积极投入找寻防止疾病扩散的疫苗。在研发积极投入之下，有效的甲型H1N1流感疫苗，PANFLU1，于流感爆发5个月后产生。此疫苗对于90％的介于12至60岁的民众，能有效引起免疫反应。然而，此疫苗对于幼童、老年人及免疫系统较差的人，效果不佳。
为了有效对抗流感爆发，须有被动免疫疗法(passive immunotherapy)作为立即的保护。同时，被动免疫疗法也可用于治疗受感染的病患。被动免疫疗法须使用能有效对抗感染源的抗体。该抗体可通过不同技术产生，一般而言是利用病毒衍生的抗原或去活化的病毒，诱导抗体产生。而且，该抗体可从受感染且痊愈的病患体内中分离。
举例而言，Hao Wang等人在细胞与分子免疫学(Cellular&MolecularImmunology),(2013)10,403-412文献中揭露一种自施打过2009年甲型H1N1流感疫苗PANFLU1的人，筛选具有中和病毒能力的单克隆抗体(mAbs)的方法。具体而言，该方法系将施打过疫苗者的B细胞分离并以Epstein-Barr virus(EBV病毒)予以永生化。再从EBV病毒永生化的记忆B细胞进行筛选。筛选过程中，找到7个具有高度中和病毒能力且对2009年甲型H1N1流感病毒具有血凝抑制活性的单克隆抗体。上述单克隆抗体可使用在治疗感染者的被动免疫疗法。
即使能从施打过疫苗者的记忆B细胞，筛选有用的抗甲型H1N1流感病毒的单克隆抗体，本领域仍须开发更好的抗体以预防及治疗流感(例如甲型H1N1流感)。
发明内容
本发明数个实施例涉及抗甲型H1N1流感病毒的抗体或其结合片段。所述抗体的结合片段可包含Fab、scFv片段或F(ab’)2等片段。本发明部分实施例涉及表达上述抗体或其结合片段的载体或宿主细胞。本发明部分实施例涉及制备用以治疗或预防甲型H1N1流感病毒感染的药物的应用。
本发明其中一个方面涉及抗甲型H1N1流感病毒的抗体或其结合片段。依据本发明其中一个实施例所述抗体或其结合片段，其包含一重链可变区及一轻链可变区，其中所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)；及其中所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)。依据前述任一个实施例，所述抗体可包含具有如SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的重链，及具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链。依据前述任一个实施例，所述甲型H1N1流感病毒为2009年的毒株或2009年以后的毒株。
本发明另一个方面涉及用于表达本发明数个实施例所述抗体的表达载体。本发明其中一个实施例所述表达载体，其包含能够编码一抗体或其结合片段的一多核苷酸序列，其中所述抗体的重链可变区包含具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)；及其中所述抗体的轻链可变区包含具有SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)。
依据前述任一个实施例所述表达载体，其中所述多核苷酸序列包含一能够编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的抗体重链的第一多核苷酸编码区，以及能够编码具有SEQID NO:4所示氨基酸序列的抗体轻链的第二多核苷酸编码区。
依据前述任一个实施例所述表达载体，其中所述第一多核苷酸编码区包含如SEQID NO:1所示序列；其中所述第二多核苷酸编码区包含如SEQ ID NO:3所示序列。
依据前述任一个实施例所述表达载体，其中所述多核苷酸序列与一编码谷氨酰胺合成酶(glutamine synthase)的谷氨酰胺合成酶基因相连结。
本发明另一个方面涉及宿主细胞。本发明所述的宿主细胞可包含任一前述的表达载体。所述宿主细胞可能是一哺乳类动物细胞、一酵母菌细胞或一昆虫细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、毕氏(Pichia)酵母菌细胞或sf9昆虫细胞。
本发明另一个方面涉及制备用以治疗或预防甲型H1N1流感病毒感染的药物的应用。
本发明另一个方面涉及侦测甲型H1N1流感病毒的方法。本发明实施例所述侦测甲型H1N1流感病毒的方法，其包含将一测试样本与前述任一抗体或其结合片段接触；以及判断所述抗体或其结合片段是否与所述测试样本进行结合，若进行结合则表示测试样本中存在有甲型H1N1流感病毒。
参照本发明附图及本发明内容，本领域的技术人员将能轻易得知本发明的其他方面。
附图说明
依据本发明其中一个实施例，图1例示从记忆B细胞分离抗体的流程图。
依据本发明数个实施例，图2(A)及图2(B)分别例示分离的32D6抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及免疫印迹(Western Blot)结果。依据本发明数个实施例，图2(C)例示以Biacore方法测定32D6抗体与血凝素蛋白(HA)结合的结果。
图3(A)例示对照组细胞，图3(B)例示被甲型H1N1流感病毒感染的细胞，依据本发明数个实施例，图3(C)例示32D6抗体中和病毒感染细胞的能力。
依据本发明数个实施例，图4(A)例示32D6抗体中和病毒感染细胞的活性与抗体浓度的相关性。依据本发明数个实施例，图4(B)例示将32D6抗体中和病毒感染细胞的活性与另一个抗体43G3相比较的结果。图4(C)显示32D6抗体对于甲型H1N1流感病毒的特异性。图4(D)例示32D6抗体不具有中和H5N1及H7N9病毒感染的活性。图4(E)例示32D6抗体有效中和甲型H1N1流感病毒2009年疫情以后毒株的活性。图4(F)例示32D6抗体不具有中和甲型H1N1流感病毒2009年疫情以前毒株的活性。
图5(A)例示编码32D6抗体重链的核酸序列，其中编码CDR的区域以底线标示。图5(B)例示32D6抗体重链的氨基酸序列，其中CDR的区域以底线标示。图5(C)例示编码32D6抗体轻链的核酸序列，其中编码CDR的区域以底线标示。图5(D)例示32D6抗体轻链的氨基酸序列，其中CDR的区域以底线标示。图5E例示32D6抗体的CDR序列。
依据本发明其中一个实施例，图6例示pXC-17.4表达载体的地图。
依据本发明其中一个实施例，图7(A)例示32D6抗体在小鼠动物模型中具有预防甲型H1N1流感病毒感染的效果。依据本发明其中一个实施例，图7(B)例示32D6抗体在小鼠动物模型中具有治疗甲型H1N1流感病毒感染的效果。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域的技术人员所通常理解的含义。而且，除非另有情境要求，单数用语可包含复数且复数用语可包含单数。以下是本文使用的缩写的清单：Ab:抗体；CDRs：互补决定区；CH：重链恒定区；CL：轻链恒定区；PBS：磷酸盐缓冲生理盐水；PCR：聚合酶链式反应；scFv：单链抗体；VL：轻链可变区；VH：重链可变区；HA血凝素蛋白；HAI：血凝抑制活性；mAb：单克隆抗体；hmAb：人类单克隆抗体。
可使用本领域的技术人员已知的常规技术完成重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养及转化(例如：电穿孔法、脂质体转染)。酶反应及纯化技术是依制造商提供的说明、依常规技术完成或依本文所述方法完成。前述技术与方法，系依本领域熟知的常规方法，或依本文提及一般或较特定的文献所描述的方法完成。参见例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(第三版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(2001))。
如本文所用，“抗体”一词是概括且广泛的指免疫球蛋白、单克隆抗体及多克隆抗体，以及其有活性的片段。片段之所以具有活性，是指该片段与相对应的抗原(例如HA或一种病毒)相结合。
如本文所用，“人类抗体”一词是指一种抗体，其蛋白质实质上每一部分在人体中不会引起实质上的免疫反应，相较于自然存在的人类抗体，其无或仅有少量氨基酸序列的改变或变异。
抗原结合位通常是由重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)的免疫球结构域所组成，其中抗原结合接口是由6个表面多胜肽圈环(polypepetide loops)形成，称之为互补决定区。每一重链可变区包含3个互补决定区(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且每一轻链可变区亦包含3个互补决定区(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其间或其周围散布有框架区(framework regions)。
“CDR区域”或”CDR”是指重链或轻链的高度变异区，如Kabat等人于文献“免疫学感兴趣的蛋白质的序列”((Sequence of Proteins of Immunological Interest)(1991),第5版，美国卫生与人类服务部，公共服务,NIH,华盛顿)所定义。一个抗体通常包含3个重链CDRs以及3个轻链CDRs。
本发明的抗体结合片段可以是Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv片段。抗体结合片段可利用不同方式取得，包含利用酶分解完整的抗体，例如利用胃蛋白酶(pepsin)(用以制造F(ab’)2片段)或利用木瓜蛋白酶(papain)(用以制造Fab片段，或重头合成(de novosynthesis)。抗体片段也可以利用DNA重组技术合成。参见，例如Fundamental Immunology(Paul ed.,第4版，1999)；Bird等人,Science 242-423(1988)；以及Huston等人,Proc.Nattl.Acad.Sci.USA85:5879(1988)。
本发明的具体实施例是关于抗甲型H1N1流感病毒抗体或其片段。本发明的抗体可以利用分子生物技术产生，自健康捐赠者并经永生化的记忆B细胞筛选，该名健康捐赠者无须事先施打疫苗。这些抗体的片段可包含Fab、scFv、F(ab’)2等。本发明的抗体具有极佳的病毒中和效果。
依据本发明的具体实施例，抗甲型H1N1流感病毒的中和抗体可以藉由图1所示技术获得，该技术类似于前述Hao Wang等人所使用的方法。然而本技术所使用的记忆B细胞，可自无须事先施打PANFLU1疫苗的健康捐赠者分离。如图所示，步骤11涉及从捐赠者分离记忆B细胞。这些捐赠者可能曾经接触或未曾接触过甲型H1N1流感病毒或其疫苗。接着以EBV病毒将分离的记忆B细胞予以永生化(步骤12)。接着，将经过EBV病毒永生化的B细胞进行筛选，测试其是否分泌与HA结合或抑制HA活性(例如血凝活性)的抗体(步骤13)。最后，将步骤13筛选出的记忆B细胞进一步筛选，测试其是否分泌中和病毒的抗体(步骤14)。
采用上述技术，以大量(20160个单一B细胞克隆)经过永生化的记忆B细胞进行筛选。筛选结果显示，找到数个能够与HA结合及/或抑制HA活性的克隆。其中，一个人类单克隆抗体(32D6抗体)对HA具有良好的结合亲和力、具有良好的病毒中和活性，且对2009年甲型H1N1流感病毒具有良好的血凝抑制活性。依据世界卫生组织(WHO)的建议，2009年甲型H1N1流感爆发的主要流行病毒统一命名为A(H1N1)pdm09。
将筛选出的永生化记忆B细胞所分泌的32D6人类单克隆抗体进行纯化，并通过SDS-PAGE以鉴定抗体的纯度。如图2(A)所示，考马斯蓝染色结果显示重组抗体具有相对高的纯度，且其分子量近似于人类IgG(hIgG)。图2(B)则例示以Western Blot分析32D6hmAb纯度的结果。Western Blot分析是使用羊源抗人类IgG的抗体片段(取自Jackson Lab公司的F(ab’)2)，其经过亲和纯化。此F(ab’)2对于人类IgG具有特异性，且缀合有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)。
以表面等离子共振(Biacore T200)的技术测定32D6hmAb与HA结合亲和力。简言之，将hmAb 32D6抗体固定于CM5芯片，抗体的密度能够使Rmax的范围控制在0-500反应单位(Response Units)之间。在此实例中，动力学测定参数设定如下：资料采集率1赫兹；双测定模式；温度：25℃；及浓缩单位：nm。HA系以缓冲液连续稀释的方式流入系统与hmAb 32D6抗体相结合。如此可获得结合动力学相关参数。接着，将流动缓冲液加入系统洗涤HA-抗体复合体，以获得解离动力学相关参数。
通过BIAcoreT200评估软件将上述实验结果进行分析。进行结合反应结果的校正，以排除缓冲液的效应，具体做法是将空白流动槽的反应结果予以扣除。采用1:1Langmuirfitting模式推测ka或kon(结合率)以及kd或koff(解离率)。解离平衡常数KD(或Kd)可从kon和koff的比率获得(例如KD＝koff/kon)。
如图2(C)所示，32D6抗体对HA具有极高的结合亲和力。本例中，32D6抗体KD测定结果落在10-10的范围或更佳的范围。找到的其他克隆则具有较低的结合亲和力。
hmAb 32D6抗体能有效中和甲型H1N1流感病毒的活性。如图3(A)至(D)所示，在每孔2,000PFU的条件下(每孔1x 104MDCK细胞，使用的384孔盘来自greiner公司，德国)，甲型H1N1流感病毒能高效感染细胞(图3(B))。然而，在含有每孔0.01μg hmAb 32D6抗体的情况下，每孔2,000PFU甲型H1N1流感病毒对细胞的感染(图3(C))能够完全被防止。图3(A)显示不含病毒或不含抗体的细胞作为对照组。上述实验结果显示，hmAb 32D6抗体对中和甲型H1N1流感病毒非常有效，即使是在抗体浓度很低(每孔0.01μg)的情况下。
为进行hmAb 32D6抗体中和甲型H1N1流感病毒效果的定量，使用不同浓度的hmAb32D6抗体与2,000PFU甲型H1N1流感病毒于上述MDCK细胞中进行细胞侵袭测定(cellinvasion assay)。采用未加入hmAb 32D6抗体的病毒作为对照组。如图4(A)所示，hmAb32D6抗体在每孔0.003μg的浓度下，能完全防止甲型H1N1流感病毒的感染。基于上述不同浓度的hmAb 32D6抗体中和病毒的实验结果，IC50值预估为每孔0.001μg左右。相较于此，另一株单株抗体克隆43G3对甲型H1N1流感病毒，即便在高浓度的情况下，也只有些微中和效果(图4(B))。
本hmAb 32D6抗体对甲型H1N1流感病毒具有特异性。如图4(C)及图4(D)，32D6抗体对中和甲型H1N1流感病毒非常有效。然而该抗体对甲型H3N2流感病毒(图4(C))、甲型H5N1流感病毒或甲型H7N9流感病毒(图4(D))均无中和效果。上述特异性显示，本抗体可能辨识甲型H1N1流感病毒所独有的位于HA的抗原表位。
本hmAb 32D6抗体不仅能非常有效的中和甲型H1N1流感病毒2009年疫情的毒株，对于2009年疫情后的毒株也具有高度特异性(图4(E))。相较于此，hmAb 32D6抗体对甲型H1N1流感病毒2009年疫情前的毒株则无中和效果。即使知道用于筛选的重组HA蛋白衍生自甲型H1N1流感毒株A/Sichuan/1/2009HA基因编码HA外部区域的DNA片段，前述抗体显著的选择性是最初没有料到的。
选殖出hmAb 32D6抗体原始的人类抗体基因(8B4)并予以定序。图5(A)及图5(B)分别显示编码8B4基因抗体重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)及抗体重链的氨基酸序列(SEQID NO:2)。图5(C)及图5(D)分别显示编码8B4基因抗体轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)及抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。前述序列中，以底线标示各互补决定区。32D6抗体的6个互补决定区序列分别显示于图5(E):SEQ ID NOS:5-10。
可利用8B4基因序列构筑表达载体。本领域的技术人员应当理解，可使用任何适合的表达载体。例如可将Lonza GS System pXC17.4质体(Lonza Group，巴塞尔，瑞士)与谷氨酰胺合成酶(GS)剔除的宿主细胞搭配使用。重组的人类单克隆抗体(rhmAb)(8B4)是使用pXC17.4质体以及来自于Lonza的GS中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株所获得。
例如，图6例示可用于表达本发明抗体的pXC17.4载体。再者，本发明任一表达载体都可被转染至适合的宿主细胞，例如哺乳类动物细胞、酵母菌细胞或昆虫细胞。
前述重组的人类单克隆抗体(rhmAb)确认具有与原始hmAb(32D6)抗体相同的特性，这些特性是指结合亲和力、病毒中和活性以及血凝抑制活性。前述结果显示，32D6抗体与病毒结合及中和病毒的功能不受CHO细胞内醣基化(或不同醣基化)的影响。
本领域的技术人员应当理解，只要CDR序列被保留，抗体的活性就可以维持。因此，除了32D6抗体，任何抗体(例如重组抗体)或其结合片段将具有相同结合特异性及相似亲和力。换言之，有功能的抗体不限于32D6抗体本身，也可以包含具有相同结合能力的其他抗体或其结合片段(例如Fab片段、F(ab’)2片段或scFv片段等)。例如，这些包含相同CDR序列的片段有可能具有相同结合能力。32D6抗体的互补决定区序列列于图5(E)的表格，其序列分别列于SEQ ID NOs:5-10。
本hmAb 32D6抗体与HA具有紧密的结合能力，且对甲型H1N1流感病毒具有高度中和活性。因此本hmAb应该有助于预防或治疗甲型H1N1流感病毒的感染。32D6抗体对于预防或治疗甲型H1N1流感病毒感染的有效性，已在活体内(in vivo)实验被验证。
通过动物模型进行药物动力学(pharmacodynamics)评估，以32D6抗体进行被动免疫的实验，显示该抗体能有效保护小鼠免于甲型H1N1流感病毒的致命感染，无论是预防性或治疗性的保护皆有效。因此对产生严重呼吸道综合症的受感染病患而言，特别是小孩、老年人或免疫系统有缺陷者，32D6抗体在被动免疫疗法中具有重要的临床应用价值。
本发明通过下列包含具体实验步骤的实施例进一步说明。本领域中的技术人员应当理解，这些实施例是用于示范而非限制保护范围的目的。
实施例
细胞培养与病毒制备
以含有L-谷氨酰胺(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，USA)、10％小牛血清(FetalCalf Serum，FCS)以及青霉素/链霉素(Caisson公司)的RPMI1640培养基在37℃以及5％CO2的加湿环境下对绒猴B淋巴母细胞株(marmoset B-lymphoblastoid)B95-8及293T细胞进行培养。以补充有10％FCS的DMEM培养基(Invitrogen公司)对长耳短尾猎犬肾细胞(Mardin-Darby canine kidney，MDCK)进行继代培养。以Sf-900II SFM培养基(Invitrogen公司)对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)细胞进行培养。
甲型H1N1流感病毒由Medigen Vaccine Biologics Co.公司(MVC公司，台湾)所制备。甲型流感病毒A/Carlifornia/7/2009NYMCX-179A(H1N1)是建议用于研制疫苗的疫情疫苗株。其他临床甲型流感病毒株获自台湾的疾病管制署(CDC)，用于本专利说明书所描述的中和活性测试，2013-80813(A/Taiwan/80813/2013(H1N1))、2013-INF-152(2013-00586；A/California/07/2009)、2013-INF-153(2013-01141；A/California/07/2009)、2014-INF-36(2014-03006；A/California/07/2009)、2014-INF-37(2014-04001；A/California/07/2009)、2006-INF-00923(925；A/Solomon_Islands/3e/2006)、2007-INF-00125(A/Brisbane/59/2007)、2007-INF-01180(A/NEW_CALEDONIA/20/99)、2009-INF-00480(A/Brisbane/59/2007)、2007-INF-00481(180；B/Malaysia/2506/2004)、2009-INF-00479(A/Brisbane/59/2007)、2009-INF-00447(A/Brisbane/59/2007)。其他用于中和活性测试的流感病毒株如下：疫苗株NIBRG-14M6(H5N1)、疫苗株NIBRG-268(H7N9)以及获自台湾CDC的临床株2013-INF-00723(2013-02803；A/Victoria/361/2011(H3N2))。在MDCK细胞中，培养临床流感病毒株并依据Reed-Muench,H.的方法计算50％组织培养感染剂量(TCID50)。
人类记忆B细胞的纯化
如A.Henn等人于文献“利用CpG DNA,CD40L,IL-21以及细胞分裂调制人类记忆B细胞分泌单细胞IgG的频率和速率(Modulation of single-cell IgG secretion frequencyand rates in human memory B cells by CpG DNA,CD40L,IL-21,and cell division,”J.Immunol.),(2009),183:3177–3187所述的方法，通过磁力分离套件(Miltenyi公司,贝尔吉施格拉德巴赫,德国)分离周边血液中的记忆B细胞。简言之，自健康捐赠者，包含曾施打过疫苗及未施打过疫苗的健康捐赠者，分离周边血液单核细胞(PBMC)。使用抗CD2,CD14,CD16,CD36,CD43及CD235a(血型糖蛋白A)的生物素化的抗体，再结合以抗生物素的微珠，将PBMC中的非记忆B细胞(例如T细胞、自然杀手细胞、单核细胞、树突细胞、中性粒细胞、血小板及红血球细胞)去除。除去非记忆B细胞后，可先将记忆B细胞以CD27微珠进行磁化标志，再将磁化标志过的细胞加以分离，完成记忆B细胞的分离。
可以用本领域已知的方法测定上述记忆B细胞的纯度的识别特征，例如使用流式细胞仪。例如，可使用表面染色的抗体，像是缀合FITC的CD27抗体或缀合PE的CD19抗体(Miltenyi Biotech公司)，将CD19+与CD27+的记忆B细胞予以标示。以流式细胞仪分析染色后的细胞。获得的讯息可用任何合适的程序予以分析，例如使用CellQuest软件(BD公司，美国)。
EBV病毒的制备与周边血记忆B细胞的永生化
用以永生化人类B淋巴细胞的EBV病毒是从B95-8细胞制备，如E.James等人于文献“在无血清培养基中使B95-8细胞成长并且表达EBV病毒裂解期(Growth of B95-8cellsand expression of Epstein–Barr Virus lytic phase in serum-free medium),”J.Virol.(1987)61:4033–4037所述。例如，以含有10％小牛血清(Fetal Calf Serum，FCS)的RPMI 1640培养基在37℃以及5％CO2的环境下，以每毫升(ml)106细胞的密度对B95-8细胞进行培养。收集上清液并通过无菌滤网(0.45μm；Millipore公司，Billercia，MA，美国)予以过滤。细胞可以少量分装储存于液态氮。
以E.Traggiai等人于文献“一种从记忆B细胞制造人类单克隆抗体的高效方法:有效中和SARS冠状病毒(An efficient method to make human monoclonal antibodiesfrom memory B cells:potent neutralization of SARS coronavirus,)”Nat.Med.(2004)10:871–875所描述的实验步骤，将周边血记忆B细胞以EBV病毒转化。
简言之，以35Grey Co60照射无血清RPMI 1640培养基内的异体单核细胞(每毫升5x105细胞)并以30％FBS于96孔培养盘予以培养。这些被照射的细胞是作为滋养层细胞。再将记忆B细胞分为每孔单一个细胞，培养在含有滋养层细胞的96孔培养盘，再加入含有48μlEBV病毒悬浮液、1μl环孢素A溶液(最终浓度为400ng/ml)及1μl CpG 2006(最终浓度为2.5μg/ml)的50μl混和液。以EBV病毒转化后，将永生化的记忆B细胞克隆培养28天，每3-5天更换培养基。取每一克隆的上清液(100μl)，从中筛选对甲型H1N1流感病毒2009疫情毒株的HA具有特异性的抗体。
重组HA蛋白质(rHAs)的表达
以杆状病毒/昆虫细胞系统(BD Biosciences公司，圣地亚哥，SA，美国)表达并纯化重组血凝素蛋白(rHAs)，方法如Z.Li等人于文献“被中国高致病性甲型H5N1禽流感病毒感染的人类与鸟类的血清学交叉反应(Serologic cross-reactivity among humans andbirds infected with highly pathogenic avian influenza A subtype H5N1virusesin China,)”Immunol.Lett.(2011)135:59–63所述。简言之，将甲型H1N1流感毒株A/Sichuan/1/2009HA基因编码HA外部区域的DNA片段转殖至FastBac载体(Invitrogen公司)。将重组杆状病毒的基因体转染至Sf9细胞，以获得重组的杆状病毒。于感染72小时后，收集病毒上清液。取得三次感染后表达的重组血凝素蛋白，藉由Ni-NTA镍管柱色谱法(GEHealthcare公司,匹兹堡,PA,美国)予以纯化。使用抗His标签或抗HA的抗体，以WesternBlot法确认重组血凝素蛋白的表达与纯化。
ELISA测定
使用96孔培养盘(Maxisorb,Nunc)进行ELISA测定，以测定捐赠者血清或来自永生化后的记忆B细胞的人类单克隆抗体对HA的结合活性，实验方法如Z.Li等人于文献“被中国高致病性甲型H5N1禽流感病毒感染的人类与鸟类的血清学交叉反应(Serologic cross-reactivity among humans and birds infected with highly pathogenic avianinfluenza A subtype H5N1viruses in China),”Immunol.Lett.(2011)135:59–63所述。简言之，使用下列反应物进行ELISA测定：(1)MVC公司所制备的去活化的完整甲型H1N1流感病毒(稀释至10μg/ml)；(2)连续稀释过的单克隆抗体；(3)与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(γ链特异性)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,INC.公司，美国)；以及(4)TMB受质(3,3',5,5'-四甲基联苯胺,Sigma公司)。聚苯乙烯培养盘上以去活化的甲型H1N1流感病毒涂覆，并在4℃静置整夜，再以5％小牛血清蛋白(Invitrogen公司)在37℃下进行阻隔作用2小时。在培养盘每一孔加入不同稀释浓度的捐赠者/B细胞的血清/上清液，在37℃下作用2小时。充分的洗涤后，加入侦测用抗体，HRP缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(稀释1:5,000倍)，在37℃下作用1小时。加入TMB/H2O2以呈色并加入50μL的H2SO4以停止反应。以ELISA读取仪器(SpectraMax公司，MD，美国)使用410nm及630nm的吸光值以测定发色物质产生的量。以上述ELISA测定获得与去活化的甲型H1N1流感病毒结合的克隆，再使用重组血凝素蛋白(rHA)进行第二次ELISA测定作为确认。
以高内涵成像分析系统进行中和活性测定
使用本领域技术人员已知的方法并使用从已知实验步骤改良的方法进行血清或人类单克隆抗体的中和活性测定，参见Z.Li Z等人文献“决定禽流感物种特异性的高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白氨基酸的鉴定(Identification of amino acids inhighly pathogenic avian influenza H5N1virus hemagglutinin that determineavian influenza species specificity),”Arch.Virol.(2011),156:1803–1812。简言之，进行中和活性测定前，先以含有1％P/S、1％BSA、25nMHEPES缓冲液及每毫升2μg TPCK-胰蛋白酶的无血清DMEM做为基底的培养基，对MDCK细胞进行培养。将连续稀释后的血清、细胞培养的上清液或纯化过的32D6/8B4人类单克隆抗体与甲型H1N1流感病毒(A/Taiwan/80813/2013(H1N1)在37℃下培养2小时，再将前述混合物加入培养在每孔含有1x104细胞的396孔培养盘(Grainer公司，德国)的MDCK细胞。共同培养60分钟后，以PBS缓冲液洗涤细胞，以除去含有游离抗体或病毒的上清液，再以含有10％FBS以DMEM为基底的完整培养基，在37℃温度下培养16小时。其后，以4％多聚甲醛(PFA)将MDCK细胞固定，并以缀合HRP的抗核蛋白(NP)抗体(Millipore公司MAB8257F)以及DAPI染剂(SIGMA-B2261)将细胞内及细胞核同时染色。感染效率是使用高内涵成像系统(ImageXpress Micro,Molecular Device公司,森尼韦尔,CA,美国)加以定量并分析。依据下列公式测定人类单克隆抗体的中和活性：(A–B)/A×100％，其中“A”代表只含有甲型H1N1流感病毒或其他病毒株且呈现阳性反应的孔内细胞数，及“B”代表含有待测血清样本与甲型H1N1流感病毒或其他病毒株相混合的孔内数值。
表达载体的构筑
将编码人类单克隆抗体32D6的重链与轻链的核苷酸序列进行转殖，其序列分别对应到SEQ ID NO:1和3，其来自于分离的记忆B细胞。将上述核苷酸序列插入适合的克隆载体，以便再将核苷酸序列转殖到带有限制酶切位的表达载体。
为了表达抗体，使用限制酶(例如HindIII和EcoRI限制酶)分解带有抗体基因的克隆载体，以转殖基因至表达载体。可使用任何适合的表达载体，例如Lonza GS System pXC-17.4质体(Lonza Group公司，巴塞尔，瑞士)。上述适合的载体可能带有启动子(例如病毒来源的启动子，mCMV)，并包含经过基因优化的抗体恒定区。此外，上述适合的载体可包含筛选标志。例如，pXC-17.4表达载体将外来蛋白质的表达与氨酰胺合成酶(GS)的基因相连结。可在氨酰胺合成酶基因剔除的细胞中使用pXC-17.4载体，以利进行转染细胞的筛选。
当抗体基因片段转殖至pXC-17.4载体，筛选个别细菌菌落进行序列分析。使用位于抗体基因ORF外部的引子，确认质体上基因的序列及方位是否正确。基于上述获得的讯息，挑选单一克隆进行扩增并制备够多的质体以进行CHO细胞的转染。
本发明实验使用GS中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株，由于该细胞株的两份GS基因均发生突变，因此需要表达位于pXC-17.4表达载体上的GS，才能在缺少谷氨酰胺(生长所必需的一种氨基酸)的环境中生长。将GS CHO细胞于适合且无筛选效果的培养基(例如含有L-谷氨酰胺)内解冻。在含有5％CO2以及37℃的培养箱中培养CHO细胞。
使用电穿孔的技术，将GS CHO细胞与pXC-17.4表达载体进行转染。例如，将细胞电穿孔时，给予300V、900uF且阻力值设为无限的单一脉冲。电穿孔后立即将细胞加入装有适合的培养基的烧瓶。于细胞培养箱中，将细胞轻微混合并隔夜培养。次日，将细胞离心以除去含有质体的培养基。
当细胞量达到约每毫升0.6x106的数量，以具有筛选效果的培养基予以培养。经过二周的筛选后，挑出能在transwell培养盘生长的个别CHO细胞落。细胞扩增的过程中，分析个别细胞落的生长与产出特性。
可使用蛋白质A亲合色谱法分析产物的质量及完整性，并通过280nm吸光值测定、ELISA测定或SDS-PAGE方法予以监控。
宿主细胞
本发明具体实施例所使用的表达载体可以在任何适合的宿主细胞中表达。如前所述，使用pXC-17.4表达载体时，GS基因剔除宿主细胞的使用将使转染细胞的筛选较为便利。CHOK1SV GS基因剔除(KO)宿主细胞(来自Lonza公司)衍生自Lonza公司适应悬浮培养的CHOK1SV宿主细胞。上述新的GS KO细胞株，其谷氨酰胺合成酶基因的原生的两个等位基因都被剔除，导致该细胞株的培养需要外加谷氨酰胺。
32D6/8B4抗体的纯化与Western Blot实验
重组血凝素蛋白(rHA)及纯化过的32D6/8B4单克隆抗体，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过电转移到硝酸纤维素薄膜。以5％BSA进行阻隔作用后，以抗HIS标签的小鼠单克隆抗体探测含有rHA的墨渍，在室温下反应1小时。充分洗涤后，加入HRP缀合抗小鼠IgG抗体，并于室温反应0.5小时，再以West Pico Chemiluminescent受质(ThermoScientific公司,罗克福德,IL,美国)侦测rHA蛋白。直接以HRP缀合抗小鼠IgG抗体(γ链特异性)(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，美国)探测含有32D6/8B4的墨渍，再以West Pico Chemiluminescent受质侦测之。
活体内(in vivo)保护的实验
所有动物实验系依据适当的动物照护及使用委员会所核定的合乎道德的实验步骤及政策进行。将DBA/1小鼠(平均体重为20克)随机分配至不同组别：一组对照组(5只小鼠)与三组治疗组(每组7只小鼠)。通过腹腔注射异氟醚将小鼠麻醉并以病毒(H1N1-TW80813)进行感染。
为评估单克隆抗体32D6的预防效果，将PBS缓冲液(对照组)或该单克隆抗体32D6以静脉注射方式给予小鼠。给予每只对照组的小鼠相同体积(例如每只小鼠给予50μl)的PBS缓冲液，并依组别分别给予每只治疗组的小鼠10mpk(mg/Kg体重)32D6抗体、2.5mpk32D6抗体或1mpk 32D6抗体。接着，通过鼻腔内注射或吸入的方式以病毒(H1N1-TW80813；每只小鼠1.3x104PFU/50μl)进行感染。感染后，每天记录小鼠的死亡率、发病率、体重及脸部表情，持续到感染后14天。
如图7(A)所示，病毒感染3天内，对照组的小鼠全数死亡。相较于此，给予10mpk以及2.5mpk 32D6抗体的小鼠于14天后依然全数存活。给予1mpk32D6抗体的治疗组当中，一只小鼠于3天内死亡，其余5只小鼠于14天后依然存活。上述实验结果清楚显示32D6抗体能有效预防甲型H1N1流感病毒的感染。
为评估单克隆抗体的治疗效果，通过腹腔注射异氟醚将小鼠麻醉后，再藉由鼻腔内注射或吸入的方式以病毒(H1N1-TW8081；每只小鼠1.3x104PFU/50μl)进行感染。24小时后，给予每只对照组的小鼠相同体积(例如每只小鼠给予50μl)的PBS缓冲液，并依组别分别给予每只治疗组的小鼠25mpk(mg/Kg体重)32D6抗体、10mpk 32D6抗体或2.5mpk 32D6抗体。感染后，每天记录小鼠的死亡率、发病率、体重及脸部表情，持续到感染后14天。
如图7(B)所示，对照组的小鼠于6天内全数死亡。相较于此，在分别给予25mpk以及10mpk 32D6抗体的治疗组当中，2只小鼠于14天后依然存活，在给予10mpk 32D6抗体的治疗组当中，则有1只小鼠于14天后依然存活。上述实验结果清楚显示本发明的32D6抗体能有效治疗甲型H1N1流感病毒的感染。
统计分析
统计存活率的方式，是将给予特定单克隆抗体的小鼠存活率与对照组别相比，以费雪精确检定(Fisher’s exact test)计算器率。
本发明实施例的优点包含以下所述的一项或各项。本发明实施例可以使用任何捐赠者的记忆B细胞，无论该捐赠者是否曾被感染或曾施打过疫苗。由于捐赠者不限于曾施打过疫苗者，或曾被病毒感染并于其后恢复者，因此得应用本发明实施例的捐赠者族群较为多元。从一个较多元的B细胞族群开始，本发明实施例比较有机会获得具有初始免疫系统(immune repertoire)中最佳且无偏差的序列的抗体。再者，因为不需要等待疫苗的开发或等待被感染的捐赠者出现，本发明实施例可在任何病毒疫情爆发时，应用于获得被动免疫治疗所需要的抗体。
相较于此，先前技术需仰赖施打于捐赠者的疫苗出现，或仰赖被病毒感染的患者。先前技术所揭示的方法无法于疫情爆发后立即使用。再者，依赖曾被感染或曾施打过疫苗的捐赠者，将获得范围有限的记忆B细胞族群。有限的记忆B细胞族群可能因为特定捐赠者免疫反应的个体变异，导致偏差产生。
即使本发明藉由数量有限的实施例予以描述，本领域中的技术人员，根据本公开内容，应当理解许多变化可以在所公开的具体实施例中产生，且不脱离本发明的精神和范围。基此，本发明的范围应只受权利要求书的限制。
序列表
<110> 基亚生物科技股份有限公司
<120> 抗甲型H1N1流感病毒中和抗
<130> 18349/002001
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atgaaacacc cgtggttctt cctcctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60
gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120
tgcactgtct ctggtggctc cgtcaacact ggcagttact actggagctg gatccggcag 180
cccccaggga agggactgga gtggattgcg tattcctctg tcagtgggac ctccaactac 240
aatccctccc tcaagagtcg agtcaccctg acagtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 300
ctgagcgtga ggtctgtgac cgctgcggac acggccgtat atttctgtgc gagactaaat 360
tacgatattt tgactggtta ttacttcttt gacttctggg gccagggaac cctggtcatc 420
gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480
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acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600
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agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422
<210> 2
<211> 473
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Lys His Pro Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val
35 40 45
Asn Thr Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Ala Tyr Ser Ser Val Ser Gly Thr Ser Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Phe Ser Leu Ser Val Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Asn Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr
115 120 125
Phe Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Ala Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Ser Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
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<211> 711
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
atggcttgga ccccactcct cttcctcacc ctcctcctcc actgcacagg gtctctctcc 60
caggttgagc tgactcaatc gccctctgcc tctgcctccc tgggaacctc ggtcaagctc 120
acctgcactt tgagtagtgg gcacagcacc tacgccatcg cgtggcatca gcagcggcca 180
gggaagggcc cccggtacct gatgaatctt agcagtggag gcagacacac caggggggac 240
gggatccctg atcgcttctc gggctccagc tctggggctg accgctacct catcatctcc 300
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<211> 236
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
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Ser Leu Gly Thr Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His
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Gln Thr Trp Asp Ala Gly Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
115 120 125
Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile
145 150 155 160
Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser
165 170 175
Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser
180 185 190
Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln
195 200 205
Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser
210 215 220
Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230 235
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Gly Gly Ser Val Asn Thr Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Tyr Ser Ser Val Ser Gly Thr Ser Asn
1 5
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Leu Asn Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Phe Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Thr Tyr Ala Ile Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Leu Met Asn Leu Ser Ser Gly
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Gln Thr Trp Asp Ala Gly Met Val
1 5

Claims (17)

1.一种抗甲型H1N1流感病毒的抗体或其结合片段，其包含一重链可变区及一轻链可变区，
其中所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)；及
其中所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)。
2.如权利要求1所述的抗体或其结合片段，其中所述抗体包含一重链以及一轻链；其中所述重链具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；所述轻链具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体或其结合片段，其中所述甲型H1N1流感病毒为2009年的毒株或2009年以后的毒株。
4.如权利要求1所述的抗体或其结合片段，其中所述结合片段为Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv片段。
5.一种表达载体，其包含能够编码一抗体或其结合片段的一多核苷酸序列，其中所述抗体的重链可变区包含具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)；以及所述抗体的轻链可变区包含具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQID NO:10所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)。
6.如权利要求5所述的表达载体，其中所述多核苷酸序列包含一能够编码具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的抗体重链的第一多核苷酸编码区，以及能够编码具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的抗体轻链的第二多核苷酸编码区。
7.如权利要求6所述的表达载体，其中所述第一多核苷酸编码区包含如SEQ ID NO:1所示序列；其中所述第二多核苷酸编码区包含如SEQ ID NO:3所示序列。
8.如权利要求5所述的表达载体，其中所述多核苷酸序列与一编码谷氨酰胺合成酶的谷氨酰胺合成酶基因相连结。
9.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的表达载体。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸序列包含一能够编码具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的抗体重链的第一多核苷酸编码区，以及能够编码具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的抗体轻链的第二多核苷酸编码区。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，其中所述第一多核苷酸编码区包含如SEQ ID NO:1所示序列；其中所述第二多核苷酸编码区包含如SEQ ID NO:3所示序列。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为一谷氨酰胺合成酶剔除细胞，所述宿主细胞的谷氨酰胺合成酶基因的两个等位基因都被剔除。
13.一种如权利要求1的抗体或其结合片段在制备用以治疗或预防甲型H1N1流感病毒感染的药物的应用。
14.如权利要求13所述的应用，其中所述抗体包含一重链以及一轻链；所述重链具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；所述轻链具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
15.如权利要求13所述的应用，其中所述甲型H1N1流感病毒为2009年的毒株或2009年以后的毒株。
16.如权利要求13所述的应用，其中所述结合片段为Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv片段。
17.一种侦测甲型H1N1流感病毒的方法，其包含：
将一测试样本与权利要求1所述的抗体或其结合片段接触；以及
判断所述抗体或其结合片段是否与所述测试样本结合，若结合则表示测试样本中存在甲型H1N1流感病毒。
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