CN107920582B - 烟草的处理 - Google Patents

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Abstract

本文描述了改变烟草材料的烟草特异性亚硝胺含量的方法。一个示例性的方法包括：使烟草材料与包含盐、糖、酶、乳酸菌、酵母或其组合的组合物接触，以减少总细菌含量；烘焙所述烟草材料；和使所述烟草材料在一种或多种微生物的存在下发酵。所述方法可提供这样的发酵的烟草材料，该发酵的烟草材料的烟草特异性亚硝胺含量低于未经本文公开方法步骤处理的发酵的烟草材料的烟草特异性亚硝胺含量。在某些实施方式中，发酵的烟草材料中的烟草特异性亚硝胺含量不高于烘培的烟草材料。还提供包含所述处理的烟草材料的含烟草产品。

Description

烟草的处理
发明领域
本发明涉及对植物(例如烟草)的生长和收获方法进行改性，涉及对用于制备源自植物的产品(例如烟草产品)的收获的植物和植物材料的处置和处理方法；具体地，涉及与加工烟草相关的那些方法，所述加工烟草被认为是经受所谓的发酵加工条件。更具体来说，本发明涉及与由烟草制得或者源自烟草(或者，以其他方式结合烟草或烟草组分)并且旨在用于人类消费的产品的制造相关的技术。
背景技术
提出了烟草的许多用途。例如，在烟斗中吸食烟草，并且烟草还被结合到烟草燃烧吸烟制品(例如，香烟和雪茄)中。参见例如Davis等人编著的Tobacco Production,Chemistry and Technology(烟草生产、化学性质和技术)(1999)，其通过引用纳入本文。还提出了各种方式来提供许多吸烟的感觉，但是没有给出由于燃烧烟草而产生大量的不完全燃烧和热解产物。参见例如，Borschke等人的美国专利第7,753,056号和Robinson等人的美国专利第7,726,320号；Chang等人的美国专利公开第2014/0060555号和DePiano等人的美国专利申请第2014/0270730号；以及Ademe等人于2013年12月6日提交的美国专利申请系列第14/098137号的背景技术所述；其通过引用结合入本文。也可以以所谓的“无烟”形式享受烟草。参见例如Mua等人的美国专利公开第2014/0271952号和Byrd等人的美国专利公开第2012/0272976号的背景技术所述，其通过引用结合于此。
多年来，已经提出了各种处理方法和添加剂来改变烟草产品中使用的烟草材料的整体特性或性质。例如，用添加剂处理烟草材料，控制这些烟草材料处理过程中所使用的处理条件，从而改变由此类烟草材料生产的无烟药草产品的化学或感官性质，以及在可吸烟草材料的情况下，改变由于吸食结合了此类烟草材料的制品所产生的主流烟气的化学或感官性质。参见例如Moldoveanu等人的美国专利公开第2014/0299136号所述的出于对用于对烟草的化学构成进行调节的目的，在该烟草处理过程中酶和微生物(例如，细菌、真菌和酵母)类型的采用和/或控制，其通过引用结合入本文。
会希望提供其他方法来改变植物组分的特性或性质，从而提供可用于人类消费的植物基组合物和制剂。具体地，会希望提供经过加工的烟草，特别是经过加工的烟草用于生产无烟烟草产品，其是由具有控制或改变这些经过加工烟草的化学组成的能力的工艺得到的。
发明内容
本公开提供了对植物或其部分进行处理的方法，从而改变(例如，增加和/或减少)其中存在的某些细菌的量。具体来说，所揭示的方法可用于烟草植物和材料，并且在一些实施方式中，可以得到与烟草植物或材料相关的细菌总含量的下降和/或与烟草植物或材料相关的乳酸杆菌(Lactobacillus)细菌含量的增加。
在一些实施方式中，本发明提供了具有改变了某些细菌水平的植物、植物组分和植物材料，以及对未烘焙或部分烘焙(cured)(例如，生)植物、植物组分和植物材料进行处理的方法，从而提供此类经改变的细菌水平。在一些实施方式中，本发明提供了经发酵的植物、植物组分和植物材料，它们改变了各种化合物(例如，烟草特有亚硝胺，TSNA)的水平。本发明还提供了对植物、植物组分和植物材料进行发酵的方法，从而实现此类各种化合物的水平改变。例如，在一些实施方式中，植物、植物组分和植物材料在存在一种或多种处于外来量(exogenous amount)的微生物的情况下，经受发酵，从而在经过处理的烟草材料中获得此类各种化合物的水平改变。
在本发明的一个方面，提供了改变烟草材料的烟草特有亚硝胺含量的方法，其包括：使烟草材料(例如，包括但不限于未收获的烟草材料)与处理组合物接触，其中，所述处理组合物包括盐、糖、酶、乳酸菌、酵母或者这些中的两种或更多种的组合，其中，所述接触提供了在收获之后总细菌含量下降的经处理的烟草材料；对经处理的烟草材料进行烘焙，以得到经烘焙的烟草材料；以及在存在一种或多种微生物的情况下，对经烘焙的烟草材料进行发酵，其中，所述一种或多种微生物相对于经烘焙的烟草材料以外来量存在，从而提供经发酵的烟草材料，其烟草特有亚硝胺含量相对于未与处理组合物接触且未在存在所述微生物的情况下发酵的经发酵的烟草材料是下降的。
经受此类处理的烟草材料可以是不同的，以及在一些实施方式中，可以选自下组：烟草种子、烟草幼苗、未成熟的活植物、成熟的活植物，或其部分。在一些实施方式中，具体的烟草材料可以包括选自下组的烟草：Black Mammoth(黑猛犸象)、Greenwood(绿木)、Little Wood(幼木)、Improved Madole(改进型马朵儿)、TR Madole(TR马朵儿)、LittleCrittendon(小克里滕登)、DF 911、KY 160、KY 171、KY 180、KY 190、KY 309、KY VA 312、VA355、VA 359、DF 485、TN D94、TN D950，及其组合。在一些实施方式中，处理组合物可以包括含氯化物盐(例如，NaCl或KCl)。
在一些实施方式中，用于本文所揭示方法的微生物可以是不促进硝酸盐向亚硝酸盐转化的微生物。在某些实施方式中，所述微生物能够与一种或多种天然的烟草硝酸盐还原性微生物进行生长竞争。在一些实施方式中，所述微生物是减少亚硝酸盐的(nitritesink)。某些示例性微生物包括亚硝酸盐还原酶基因。微生物可以是例如，细菌(例如，乳酸菌)和/或耐盐酵母。可以用于一些实施方式的一种具体微生物是嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)。在某些实施方式中，用于本文所揭示的方法的所述一种或多种微生物可以包括基因改性的微生物(例如，细菌)。例如，在一些实施方式中，此类微生物(包括但不限于四倍体细菌)可以包括插入编码亚硝酸盐还原酶的基因。
在本文所揭示的某些方法之后，经发酵的烟草材料中的烟草特有亚硝胺(TSNA)含量可以相对于未与处理组合物接触且未在存在所述微生物的情况下进行发酵的经发酵的烟草材料发生各种水平的下降。例如，TSNA含量可以下降大于或等于约10％、大于或等于约20％、或者大于或等于约50％。在一些实施方式中，经发酵的烟草材料的TSNA含量不超过经烘焙的烟草材料的TSNA含量。在某些实施方式中，例如由于使用盐处理预收割，经发酵烟草材料的氯含量可能相对于未经处理的烟草材料是提升的。例如，在一些实施方式中，根据本文所揭示方法提供的经发酵的烟草材料的氯含量是约为0.5％(以干重计)至约3％(以干重计)。
在一些实施方式中，除了上文所述的方法步骤之外，方法还可包括：对经发酵的烟草材料进行加工，以提供处于具有适用于结合到烟草产品中的形式的经加工的烟草材料；以及将经加工的烟草材料结合到无烟烟草产品中。经加工的烟草材料可以是例如，烟草掺混物的形式。在某些实施方式中，本公开还提供了根据本文所揭示方法制备的无烟烟草产品。
在另一个方面，本发明提供了改变烟草材料的烟草特有亚硝胺含量的方法，其包括：将收获的烟草材料调节至所需的水分水平；从收获的烟草材料分离茎，以得到去茎烟草材料；对去茎烟草材料进行切割，以提供经切割的去茎烟草材料；使经切割的去茎烟草材料与盐接触，并加热所得到的混合物；在存在一种或多种微生物的情况下对混合物进行发酵，其中，所述一种或多种微生物相对于混合物以外来量存在，从而提供经发酵的烟草材料，其烟草特有亚硝胺含量相对于在发酵之前未与盐接触且未在存在所述微生物的情况下发酵的经发酵的烟草材料是下降的。在某些优选实施方式中，在此类实施方式中的经发酵的烟草材料的烟草特有亚硝胺含量不超过紧接发酵之前的烟草材料(即，经切割的去茎烟草材料)的烟草特有亚硝胺含量。
在一些实施方式中，接触步骤还可以包括对混合物进行巴氏杀菌。在一些实施方式中，调节步骤包括将烟草材料调节至约为20-25％的水分水平。在某些实施方式中，在固态发酵容器中进行接触和发酵步骤。在一些实施方式中，发酵步骤还可以包括控制温度、水平和氧水平，或其任意组合。在某些实施方式中，用于该方法的所述一种或多种微生物包括不同量的嗜盐四联球菌(例如，包括但不限于，约106CFU)。
在某些实施方式中，该方法还可包括使得经发酵的烟草材料经受提升的温度。在一些实施方式中，方法还可包括向经发酵的烟草材料添加一种或多种组分，其中，所述一种或多种组分包括选自下组的组分：盐、防腐剂、壳混合物(casing mixture)和水分。在某些实施方式中，该方法还可包括对经发酵的烟草材料的水分水平进行调节。
本发明包括但不限于以下实施方式。
实施方式1：一种改变烟草材料的烟草特有亚硝胺含量的方法，其包括：使烟草材料与处理组合物接触，其中，所述处理组合物包括盐、糖、酶、乳酸菌、酵母或者这些中的两种或更多种的组合，其中，所述接触提供了总细菌含量下降的经处理的烟草材料；对经处理的烟草材料进行烘焙，以得到经烘焙的烟草材料；以及在存在一种或多种微生物的情况下，对经烘焙的烟草材料进行发酵，其中，所述一种或多种微生物相对于经烘焙的烟草材料以外来量存在，从而提供经发酵的烟草材料，其烟草特有亚硝胺含量相对于未与处理组合物接触且未在存在所述微生物的情况下发酵的经发酵的烟草材料是下降的。
实施方式2：任意前述或后续实施方式的方法，其中，烟草材料选自下组：烟草种子、烟草幼苗、未成熟的活植物、成熟的活植物，或其部分。
实施方式3：任意前述或后续实施方式的方法，其中，处理组合物包括含氯化物盐。
实施方式4：任意前述或后续实施方式的方法，其中，处理组合物包括NaCl或KCl。
实施方式5：任意前述或后续实施方式的方法，其中，烟草材料包括选自下组的烟草：Black Mammoth(黑猛犸象)、Greenwood(绿木)、Little Wood(幼木)、Improved Madole(改进型马朵儿)、TR Madole(TR马朵儿)、Little Crittendon(小克里滕登)、DF 911、KY160、KY 171、KY 180、KY 190、KY 309、KY VA 312、VA 355、VA 359、DF 485、TN D94、TND950，及其组合。
实施方式6：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物不促进硝酸盐向亚硝酸盐的转化。
实施方式7：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物能够与一种或多种天然的烟草硝酸盐还原性微生物进行生长竞争。
实施方式8：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物是减少亚硝酸盐的。
实施方式9：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物包括编码亚硝酸盐还原酶的基因。
实施方式10：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物包括细菌。
实施方式11：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物包括嗜盐四联球菌。
实施方式12：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物包括基因改性的细菌。
实施方式13：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物包括基因改性的细菌，其包括插入编码亚硝酸盐还原酶的基因。
实施方式14：任意前述或后续实施方式的方法，其中，烟草特有亚硝胺减少约10％或更多。
实施方式15：任意前述或后续实施方式的方法，其中，烟草特有亚硝胺减少约20％或更多。
实施方式16：任意前述或后续实施方式的方法，其中，烟草特有亚硝胺含量减少约50％或更多。
实施方式17：任意前述或后续实施方式的方法，其中，经发酵的烟草材料的烟草特有亚硝胺含量不超过经烘焙的烟草材料的烟草特有亚硝胺含量。
实施方式18：任意前述或后续实施方式的方法，其中，经发酵的烟草材料的氯含量约为0.5-3重量％。
实施方式19：任意前述或后续实施方式的方法，其还包括：对经发酵的烟草材料进行加工，以提供处于具有适用于结合到烟草产品中的形式的经加工的烟草材料；以及将经加工的烟草材料结合到无烟烟草产品中。
实施方式20：任意前述或后续实施方式的方法，其中，经加工的烟草材料是烟草掺混物的形式。
实施方式21：根据任意前述或后续实施方式的方法制备的无烟烟草产品。
实施方式22：任意前述或后续实施方式的方法，其还包括：将收获的烟草材料调节至所需的水分水平；从收获的烟草材料分离茎，以得到去茎烟草材料；以及对去茎烟草材料进行切割，以提供经切割的去茎烟草材料形式的烟草材料；其中，接触步骤包括使经切割的去茎烟草材料与盐接触，并加热所得到的混合物。
实施方式23：任意前述或后续实施方式的方法，其中，接触步骤还包括对混合物进行巴氏杀菌。
实施方式24：任意前述或后续实施方式的方法，其中，调节步骤包括将烟草材料调节至约为20-25％的水分水平。
实施方式25：任意前述或后续实施方式的方法，其中，水分水平约为22％。
实施方式26：任意前述或后续实施方式的方法，其中，接触和发酵步骤是在固态发酵容器中进行的。
实施方式27：任意前述或后续实施方式的方法，其中，发酵步骤还包括控制温度、水平、氧水平，或其任意组合。
实施方式28：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物包括嗜盐四联球菌。
实施方式29：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物包括嗜盐四联球菌，以及其中，嗜盐四联球菌存在的量约为106CFU。
实施方式30：任意前述或后续实施方式的方法，其中，所述一种或多种微生物包括基因改性的嗜盐四联球菌，其包括插入编码亚硝酸盐还原酶的基因。
实施方式31：任意前述或后续实施方式的方法，其还包括使经发酵的烟草材料经受提升的温度。
实施方式32：任意前述或后续实施方式的方法，其还包括向经发酵的烟草材料添加一种或多种组分，其中，所述一种或多种组分包括选自下组的组分：盐、防腐剂、壳混合物(casing mixture)和水分。
实施方式33：任意前述或后续实施方式的方法，其还包括调节经发酵烟草材料的水分水平。
实施方式34：任意前述或后续实施方式的方法，其中，经发酵的烟草材料的烟草特有亚硝胺含量小于或等于经切割的去茎烟草材料中的烟草特有亚硝胺含量。
本公开的这些和其他特征、方面和优势将通过阅读以下详细描述是显而易见的。本发明包括上述实施方式的两个、三个、四个或更多个的任意组合，以及本公开所述的任意两个、三个、四个或更多个特征或元素的组合，而不论此类特征或元素是否在本文所述的一个具体实施方式中所阐述。本公开旨在从整体上进行阅读，从而使得所公开本发明的任何可分离的特征或要素在其各个方面和实施方式中的任意都应视为可以组合，除非上下文另有明确规定。阅读以下内容就会明白本发明的其他方面和优点。
具体实施方式
下面对本发明进行更详细的描述。但是，本发明可用于许多不同形式，并且不应理解为限于本文所述的实施方式；相反地，提供这些实施方式是出于透彻性和完整性考虑，并向本领域技术人员完整转达本发明概念的范围。在本说明书和权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。对于“干重百分比”或者“以干重计”，指的是基于干成分(即，除了水之外的所有成分)的重量。
根据本发明生长、收获和/或加工的示例性植物选自烟草物质。烟草物质的植物选择会是不同的，并且更优选是表征为烟草类型的植物。参见例如，Lawson等人的美国专利第7,025,066号和Marshall等人的美国专利第8,186,360号，以及Mua等人的美国专利公开第2014/0271951号和Dube等人的美国专利公开第2015/0034109号，其通过引用结合入本文。可以根据本发明进行加工和使用的烟草的优选示例性类型包括如下这些，被称作BlackMammoth(黑猛犸象)、Greenwood(绿木)、Little Wood(幼木)、Improved Madole(改进型马朵儿)、TR Madole(TR马朵儿)、Little Crittendon(小克里滕登)、DF 911、KY 160、KY 171、KY 180、KY 190、KY 309、KY VA 312、VA 355、VA 359、DF 485、TN D94、TN D950。还优选的是，这些示例性烟草类型是在所谓的绿河(Green River)和单吸盘(One Sucker)生长区域生长的。
在某些实施方式中，当植物是未收获形式和/或在烘焙的发黄/变棕色阶段(即，在烟草完全烘焙之前)时，可以用处理组合物处理植物，如本文下面所述。在本文中，这段时间会被统称为“烘焙前”，以及用此类处理组合物处理的烟草在本文中会被统称为“未烘焙或部分烘焙”烟草。本文所揭示的第一烘焙前处理方法大致包括通过如下方式处理此类烟草：使得烟草与含盐和/或含糖组合物、含乳酸菌组合物和/或含酶组合物(本文统称为“处理组合物”)接触，例如，采用Moldoveanu等人的美国专利公开第2014/0299136号所述的处理组合物和方法类型，其通过引用结合入本文。
在某些实施方式中，处理组合物包括盐(例如，含盐溶液的形式)。各种类型植物的盐处理是已知的，参见例如，Li等人的美国专利第8,353,300号和第8,905,041号，和Hempffing等人的美国专利第6,755,200号，以及Li等人的美国专利申请公开第2008/0202538号和Marshall等人的美国专利申请公开第2012/0279510号，其通过引用结合入本文。出于该目的，可以使用任意盐，但是食品等级的盐是特别优选的。示例性盐包括但不限于：含氯化物盐，例如，氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)、氯化钾(KCl)、氯化铵，及其组合。因此，在一些实施方式中，处理组合物包括氯或氯化物。注意到的是，通常来说，避免烟草的氯化物(包括含氯化物盐)的处理，因为注意到其对于结合了经过处理的烟草的吸烟产品的口味具有负面影响。但是，在某些实施方式中，对于各种应用(包括但不限于，用于无烟烟草产品和电子烟类型产品)，存在氯化物不是不合乎希望的。事实上，在一些实施方式中，存在氯化物可以提供有益的效果，包括但不限于，在烘焙和后续发酵之后，相比于未经处理的植物，减少了经处理的植物中的TSNA浓度。可用于该内容的某些类型的盐组合物的其他细节参见例如Moldoveanu等人的美国专利申请公开第2014/0299136号，其通过引用结合入本文。
在某些实施方式中，处理组合物包括糖(例如，含糖溶液的形式)。出于该目的，可以使用任何糖(包括食品等级的糖)，例如包括但不限于：蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖和乳糖、鼠李糖、木糖，及其组合。可用于该内容的某些类型的糖溶液的其他细节参见例如Moldoveanu等人的美国专利申请公开第2014/0299136号，其通过引用结合入本文。在一些实施方式中，处理组合物可以同时包括盐和糖。
在一些实施方式中，处理组合物包括一种或多种益生菌或者一种或多种乳酸菌。此类组合物的制备和使用可参见例如Marshall等人的美国专利申请公开第2013/0269719号和Moldoveanu等人的美国专利申请公开第2014/0299136号所述，其通过引用结合入本文。这些参考文献还给出了可用于此类处理的细菌类型的鉴定，所使用的具体细菌，细菌用量和此类细菌所提供的具体性质。在一些实施方式中，处理组合物包括一种或多种酶。此类组合物的制备和使用可参见例如Moldoveanu等人的美国专利申请公开第2014/0020694号和第2014/0299136号所述，其通过引用结合入本文。这些参考文献还给出了可用于此类处理的酶类型的鉴定，所使用的具体酶，酶用量和此类酶所提供的具体性质。
在某些实施方式中，处理组合物包括一种或多种酵母物质。虽然并不旨在作为限制性，但是一种示意性酵母是具有亚硝酸盐还原酶能力的汉逊德巴利酵母。在优选实施方式中，单独采用了一种或多种耐盐酵母或者一种或多种耐盐酵母与本文所揭示的其他处理组合物中的一种组合使用。
烘焙前处理组合物可以是各种形式。例如，在一些实施方式中，处理组合物可以是液体形式(例如，溶液，分散液，乳液等，在本文中称为“处理溶液”)。这样的处理溶液的浓度(例如，固体含量)可以变化。在一些实施方式中，处理组合物可以是固体形式(例如，粉末或颗粒形式)。在一些实施方式中，该组合物包括各种其他组分。
所述的烘焙前处理组合物可以多种方式在多个时间施用。一般而言，处理组合物可局部施用于植物(例如，使得组合物的一种或多种组分通过叶、茎、花等提供给植物)或可被施用，使得一种或多种组分通过根系提供给植物。可通过，例如，喷雾，雾化，或浸渍待处理的植物或其部分(例如，叶部施用)或植物周围的土壤(土壤施用)来施用液体形式。固体形式的处理组合物也可直接施用于植物或其部分，或可施用于植物周围的土壤(例如，喷洒于土壤表面上和/或掺合到土壤，如“侧施”形式)。在某些实施方式中，可以肥料组合物(例如，含氯肥料组合物)的形式施用处理组合物。本文公开的处理组合物可单独施用或与其他试剂一起，例如，与其他肥料、杀虫剂、除草剂等一起施用。
在特别优选的实施方式中，用至少两种不同的处理组合物和/或在烘焙前的至少两种不同阶段处理烟草。多个处理可依次(例如，紧密连续或在明显不同的时间点)或同时(例如，通过向烟草分开施用两种或更多种不同的组合物或通过混合组合物以提供包含两种或更多种不同的活性成分的单一处理组合物并向烟草施用该单一处理组合物)进行。在组合物在至少两个不同阶段施用的情况中，可在烟草植物生命周期的不同点施用它们(例如，一个施用于在田里生长的植物并且一个在收获后施用，或者一个施用于种子并且一个施用于田里生长的植物)。多个处理可包括用相同处理组合物或不同处理组合物在至少2个不同阶段处理植物。在一个具体实施方式中，烟草在烘焙前用含盐组合物处理至少一次并且在烘焙前用含乳酸菌组合物处理至少一次。在Moldoveanu等的美国专利申请公开号2014/0299136中提供了关于施用的时机和方法的其他详细内容，其通过引用纳入本文。
在该阶段用处理组合物的处理可优选提供多种益处。具体地，已知烟草植物天然具有各种水平的与其相关的细菌(参见，例如，Larsson L.等，Tobacco Induced Diseases(烟草引起的疾病),4:4(2008)和Huang J.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.(微生物生物技术)88(2):553(2010)，其通过引用纳入本文)；并且本文所述的烘焙前处理组合物的施用可提供烟草植物，植物组分，和植物材料，其具有改变水平的某些与其相关的细菌。在一些实施方式中，如本文所述处理未烘焙或部分烘焙的植物，植物组分，或植物材料产生具有改变的总细菌计数，改变的肠细菌计数，改变的革兰氏阴性细菌计数，和/或改变的乳杆菌计数的处理的烟草植物材料。在Moldoveanu等的美国专利申请公开号2014/0299136中公开了可达到的改变的计数和测定这类计数的方法，其通过引用纳入本文。
不同的处理可能对于烟草植物材料内存在的各种细菌的水平有不同的影响。如上所述，本文所述的处理可影响处理的烟草的性质并且对于烘焙(包括发酵)处理的烟草前改变某些细菌的含量而言是特别有益的。在一些实施方式中，本文所述的烘焙前处理对于之后的加工步骤可能有其他意义。例如，处理可向之后对烟草材料进行烘焙、老化、和/或发酵的步骤提供多种益处。
在进行烘焙前处理同时烟草植物或其部分是活的形式的情况中，通常收获烟草(如果在烘焙前处理之前还未收获)并经过烘焙。可如，例如，Coleman,III等的美国专利申请公开号2011/0174323和Dube等的美国专利申请公开号2012/0192880中所示采用收获烟草植物的常规技术。特别优选的是，已经按照本发明长成，收获并加工的收获的烟草经过烘焙工艺，该工艺的特征是提供所谓的晾烟或深色烤烟。参见，例如，《烟草生产，化学和技术》(Tobacco Production,Chemistry and Technology)，Davis等(编)(1999)；Roton等，Beitrage Tabakforsch Int.,21,305-320(2005)；Staaf等，Beitrage Tabakforsch Int.,21,321-330(2005)和Beinhart的美国专利号1,327,692；Heljo的美国专利号2,758,603；Martin的美国专利号5,676,164；Hempfling等的美国专利号6,755,200；Perfetti等的美国专利号7,293,564；Groves等的美国专利号7,650,892；Li等的美国专利号8,353,300；以及Marshall等的美国专利申请公开号2010/0116281和2012/0279510，和Moldoveanu等的美国专利申请公开号2014/0299136中所示的这类烘焙工艺类型，其全部通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，用本文公开的处理组合物烘焙前处理的烘焙和/或老化的烟草可提供具有与未处理的烘焙/老化的烟草材料相比改变水平的某些化合物，例如，烟草特异性亚硝胺(TSNA)的烟草材料。在Moldoveanu等的美国专利申请公开号2014/0299136中提供了通过这类方法可达到的TSNA减少的量的类型的其他信息，其通过引用纳入本文。
在某些实施方式中(例如，其中制备烟草材料用于某些无烟烟草产品的情况)，烘焙的烟草材料(任选通过如上述详细公开的在烘焙前用处理组合物处理进行处理)然后经发酵。发酵一般需要使烟草材料经历水(例如，湿度)和热。发酵工艺可以在其中可控制温度和含水量的腔室中进行。由于烟草在发酵工艺期间暴露于升高的温度和含水量，可从烟草中有效去除某些组分(例如，氨)。在某些实施方式中，发酵是细菌过程，其中某些细菌产生酶，该酶在发酵中的烟草材料中发生反应以产生风味前体。参见，例如，S.Gilliland编，《食品用细菌起始培养物》(Bacterial Starter Cultures for Foods)，CRC出版公司(佛罗里达州博卡拉顿(Boca Raton,FL))，第97-118页，其通过引用纳入本文。
Brenik等的美国专利号2,927,188；Sensabaugh等的美国专利号4,660,577；Sensabaugh等的美国专利号4,528,993；和Roth等的美国专利号5,327,149中提供了烟草的示例性发酵工艺，其通过引用纳入本文。理解通过存在，例如，乳杆菌来增强发酵；因此，在一些实施方式中，改变与给定样品相关的乳杆菌的量(例如，通过上文公开的乳酸菌处理组合物的手段)可影响该样品的发酵。在处理的烟草随后经过发酵的情况中，在一些实施方式中，可通过存在更大量的乳杆菌来增强发酵。“增强”表示发酵过程进行得，例如，更快和/或更均匀。因此，本文公开的用处理组合物处理未烘焙或部分烘焙的烟草植物，植物组分，或植物材料的方法可通过与未处理的发酵中的烟草相比改变发酵中的烟草的细菌类型和/或计数在一定程度上影响发酵过程。
在本公开的某些实施方式中，可通过在即将发酵之前或在发酵期间用一种或多种微生物(例如，细菌，酵母，真菌等)处理烟草来进一步改变发酵期间烟草的细菌类型和/或计数。在即将发酵之前或在发酵期间用这种方式处理的烟草可优选是之前已用一种或多种本文所述的处理组合物(即，包含盐、糖、乳酸菌、酵母和/或酶)处理的烟草。然而，可如本文所述在即将发酵之前或在发酵期间处理的烟草不受限制；在其他实施方式中，在即将发酵之前或在发酵期间处理的烟草可以是之前还未用上述的处理组合物处理的烟草。
在这种情况中用一种或多种微生物处理一般包括向烟草材料施用一种或多种微生物以改变与发酵中的烟草相关的微生物(例如，细菌，酵母，真菌等)的量和/或类型。这类处理步骤中采用的微生物的类型可改变，但优选是能够促进发酵反应但对硝酸盐有很低或没有亲和性的微生物。已知某些微生物(例如，特定细菌菌株或特定真菌)特别能够促进硝酸盐转化成亚硝酸盐(一般通过产生硝酸盐还原酶，但并不限于此)。进一步认识到在烟草发酵期间由这类细菌促进的硝酸盐向亚硝酸盐的转化生成了前体，该前体可导致在发酵的烟草材料中形成某些TSNA。根据本公开，优选在发酵过程期间最小化(例如，部分或完全消除)这种硝酸盐向亚硝酸盐的转化。
如此，优选地，在某些实施方式中，在即将发酵前或在发酵期间用一种或多种微生物处理烟草可提供在发酵后显示改变(例如，降低)水平的TSNA的烟草。具体地，可通过在即将发酵前或在发酵期间用一种或多种特定类型的微生物处理烟草来实现降低水平的TSNA，在本文中将对此进行更详细地描述。
优选地，按照本文公开的方法使用不显著促进硝酸盐向亚硝酸盐转化(即，对硝酸盐有低亲和性或没有亲和性)的微生物(例如，细菌，酵母，和/或真菌)；用作“亚硝酸盐减少(nitrite sink)”的微生物；和/或具有亚硝酸盐还原酶基因的微生物。因此，在某些实施方式中，在发酵步骤期间特别有用的本发明的微生物提供了与一般情况(未发酵处理的材料)相比发酵材料中降低的亚硝酸盐浓度。这种添加的微生物对于烟草材料可能是天然的或者对于烟草材料可能是非天然的。一般而言，在该阶段向烟草材料中添加的微生物以外源性的量添加，即，添加它们以提供与一般在未处理的烟草上存在的水平相比改变的，即增加水平的这类微生物。
本发明所考虑的微生物的类型包括能够与一种或多种与烟草相关的硝酸盐还原微生物竞争生长的微生物。参见Fisher等，Food and Chem(食品与化学).Tox.50(3-4),2012，第942-948页，其通过引用纳入本文。硝酸盐还原微生物与烟草的相关性，在一些实施方式中，可以是烟草上残留的微生物群的结果(即，天然微生物)，可以是加工条件的结果(例如，在通过与其上存在这类微生物的设备接触向烟草材料中引入微生物)或者可以是先前处理步骤的结果(例如，其中烘焙前已经用包含乳酸菌的处理组合物处理烟草)。示例性的硝酸盐还原微生物对于某些类型的烟草而言是天然的，其在某些实施方式中被有效最小化，其包括但不限于产气肠杆菌属和/或泛菌属的细菌。
可在发酵期间添加到烟草中的示例性微生物可包括，但不限于，属于黄色单胞菌属(例如，栖稻黄色单胞菌(Flavomonas oryzihabitans))，如Koga的美国专利号7,549,425所述；少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobills)或荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，如Koga的WO 2003/094639所述，短小芽孢杆菌(bacillus pumilis)，酵母(例如，酵母株汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)TOB-Y7，如Vigliotta等，Appl.Microbiol.Biotechnol(微生物生物技术应用).2007,75:633-645中所述)，并且含亚硝酸盐还原酶基因的微生物包括，但不限于假单胞菌属，博德特氏菌属，产碱菌属，和无色杆菌属的微生物。参见，例如，Yoshie等，Appl.Environ.Microbiol(环境微生物应用).70(5):3152-3157(2004)，Song等，FEMS Microbiology Ecology(FEMS微生物生态学)43:349-357(2003)，和Takahashi等，Plant Physiology(植物生理学)126(2):731-741(2001)。可在发酵期间添加的另一种示例性的微生物是嗜卤四联球菌(Tetragenococcus halophilus)。之前描述各种微生物的文件通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，可采用小噬菌体(例如，细菌噬菌体)来减少与烟草材料相关的细菌的量，如Xu等的美国专利申请公开号2014/0261478中所示，其通过引用纳入本文。
在某些实施方式中，微生物可以是遗传修饰的微生物，例如，包括但不限于，遗传修饰的四球菌。遗传修饰，例如，可包括在微生物的DNA中插入编码亚硝酸盐还原酶的基因。因此，在一些实施方式中，在本文公开的方法中使用微生物(例如，细菌)，其中该微生物已经遗传修饰以使得它们能够产生亚硝酸盐还原酶(包括，在某些实施方式中，经修饰以包括亚硝酸盐还原酶基因的四球菌)。
注意虽然在发酵的内容中描述这些微生物(即，在即将发酵之前或在发酵期间)，并非旨在限制该时机。例如，在一些实施方式中，可能有限在烟草处理的其他阶段使用这类微生物(例如，在即将收获之前，在烘焙的早期阶段期间，在烘焙期间，刚好在烘焙之后，和/或在制备烟草材料用于储存期间)。
在一些实施方式中，优选选择用于该处理步骤的一种或多种微生物的类型受到采用的烘焙前处理组合物(如果存在)的类型的影响。例如，在用盐(例如，盐酸盐)在烘焙前处理烟草的情况中，选择在这类盐条件下有良好功能的微生物可能是重要的。
一般而言，添加的微生物的量，特定微生物的特定株(或株的组合)可改变(例如，可采用四球菌的各种菌株，单独，或与两种或更多种菌株的混合物)，加工方法可改变，和向发酵混合物中添加的其他成分也可改变。优选地，可根据需要改变这类参数以减少亚硝酸盐的存在，最小化烟草特异性亚硝胺的产生，并影响烟草材料的风味特征。
在即将进行发酵步骤之前或在发酵步骤期间添加的微生物一般以足够促进发酵过程的量添加。参见，例如，S.Gilliland编，《食品用细菌起始培养物》(Bacterial StarterCultures for Foods)，CRC出版公司(佛罗里达州博卡拉顿(Boca Raton,FL))，第97-118页中所示的关于细菌促进的发酵的讨论，其通过引用纳入本文。根据本发明，在一些实施方式中，微生物可优选以足以(至少一定程度上)与它们施用于的烟草中或其上存在的天然微生物竞争的量添加。待添加的微生物的一般量是至少约1×103CFU(例如，约1×103CFU至约1×1010CFU，如约1×103CFU至约1×109CFU或约1×103CFU至约1×108CFU的量。在一些实施方式中，以较高的浓度提供微生物可显著增加发酵速率；然而，在一些实施方式中，观察到很少的增加。在一些实施方式中，微生物是抗噬菌体的并且可在发酵过程期间滚动采用多个物种。优选地，在某些实施方式中，与烟草相关的内源性细菌，酵母和/或真菌保持相对恒定并且在发酵期间可被热杀伤和/或被噬菌体竞争性抑制。在某些实施方式中，这类内源性微生物可针对使用合适的处理条件(例如，内源性微生物没有竞争的pH和/或盐浓度水平)进行选择。
在即将发酵之前或在发酵期间添加微生物的方法也可变化。例如，在一些实施方式中，可用微生物的溶液或悬液(例如，在水中)喷洒烟草材料或者可用含有微生物的粉末接触烟草材料。
进行发酵的具体条件可变化，并且，在一些实施方式中，这类条件的选择可影响发酵的烟草产品的性质。例如，在某些实施方式中，具体条件(例如，温度，时间，水分水平，氧水平，pH，曝气时间，其他添加剂)可影响产生的TSNA的量。如此，可优选选择这类条件，以最小化产生的TSNA的量。至少部分基于使用的具体微生物来确定发酵的合适条件。例如，已知微生物在不同条件下表现不同。例如，以下微生物在某些pH值，盐浓度，和温度下比其他微生物有更好的表现。因此，特定微生物的选择在某些实施方式中可限制可进行发酵的条件。应注意，在一些实施方式中，可调整条件以提供针对一种或多种给定的微生物而言合适的条件。例如，在烟草材料的pH低并且微生物已知仅在较高pH值下功能良好的情况下，可调整烟草材料的pH(例如，通过添加碱)。改变发酵条件的方法已知描述于，例如，Brinkley等的美国专利号7,946,295，其通过引用纳入本文。可进行发酵，以实现对烟草材料的完全或部分发酵。例如，在某些实施方式中，可检测发酵过程(例如，通过监测苹果酸转化)并且可在给定的苹果酸转化百分比下进一步加工烟草。
在某些实施方式中，按照下文所述的详细具体过程来处理并发酵烟草。接收烟草材料并且可任选地在给定水分水平(例如，约13-18％水分)下储存给定的时间，如至少约1年，例如，约1至约3年。一般用水分处理烟草材料以使烟草材料的水分水平达到给定的水分范围内(例如，至少约15％，至少约20％，约15％至约30％，或约20％至约25％，如约22％水分，在一个实施方式中)在给定温度下(例如，在约100°F或更大的温度下，约110°F或更大的温度下，约120°F或更大的温度下，或约130°F或更大的温度下，如约120°F至约150°F，或约130°F至约150°F的范围内，如约140°F，在一个实施方式中)。注意到特别有益的值可取决于处理的烟草的类型，并且因此，可调整这些值。
虽然并不旨在限制，在具体实施方式中，可在直筒调节单元上对烟草进行调节。在调节之后，调节的烟草一般被分成部分(例如，从烟草材料的剩余部分中去除茎)。例如，可使用空气分离脱粒机来实现这种分离。可用于该目的的示例性设备可由，例如，Cardwell机械公司(弗吉尼亚州里士满(Richmond,VA))或MacTavish机械制造公司(弗吉尼亚州切斯特菲尔德(Chesterfield,VA))提供。分离的烟草材料，优选其中去除茎，可直接经过发酵，或者，在一些实施方式中，可运输至例如预混合筒仓中。一般而言，不同类型的烟草被分开处理并且各类型被运输至不同的预混合筒仓中。
对于一些应用，可能希望将两种或更多种类型的烟草合并。因此，在一些实施方式中，烟草可以所需的比例从两个或更多个来源(例如，2个或更多个预混合筒仓)合并。例如，在某些实施方式中，来自预混合筒仓的烟草可通过称量带从预混合筒仓运出以合并(例如，在混合仓中)。在一些实施方式中，然后可将烟草材料(本文所述的单一类型的烟草或混合形式)卸下并切割以提供具有期望长度和宽度的烟草材料条。这样的长度和宽度可变化，例如，一般命名为“细切”，“长切”等的长度和宽度。
这种切割的烟草经过发酵，例如，一般如本文所述。在一些实施方式中，优选在固态发酵(SSF)容器，如混合器，例如Plow混合器(例如，来自LittlefordDay公司(肯塔基州佛罗伦萨(Florence,KY))内进行发酵。在发酵容器内，可对包括水分水平，盐度和温度的参数进行有益改变。例如，在一些实施方式中，烟草的水分水平经初始改变以确保至少约10％，至少约20％，或至少约30％，如约20％至约50％或者约30％至约45％的水分水平。在一些实施方式中，初始改变烟草的盐度以确保基于干重至少约1％，如约1％至约6％的盐度。
通常增加容器内的温度至第一升高的温度，以导致与烟草材料相关的任何休眠孢子形成细菌(即，杆菌种)的至少一部分的孢子形成。第一升高的温度可改变，但一般是至少约80°F或至少约85°F，如在约85°F至约105°F的范围内。该第一升高的温度保持足够的时间段以允许发生孢子形成(例如，至少约5分钟，至少约10分钟，至少约15分钟，或至少约30分钟，如约5至约60分钟)。在一些实施方式中，然后温度进一步升高至第二升高的温度，以热杀灭营养细菌。第二升高的温度可改变，但一般是至少约150°F或至少约160°F，如在约160°F至约212°F的范围内。该温度可维持足够的时间段以提供活营养细菌数量的减少(例如，至少约5分钟，至少约10分钟，至少约15分钟，或至少约30分钟)。然而，在某些实施方式中，优选控制该时间段以确保不发生明显的烟草特异性亚硝胺形成。例如，在一些实施方式中，该时间段可以是约5分钟至约60分钟。
烟草材料可随后冷却至，例如，约100°F或更低，如约85°F至约100°F。由这些加热过程步骤实现的细菌敲减可变化。在一些实施方式中，以这种方式处理烟草材料可提供期望的细菌敲减水平。在其他实施方式中，一个这类加热处理步骤的循环不足以实现期望的细菌敲减。因此，在一些实施方式中，这类加热过程步骤中的一个或两个可根据需要独立重复或组合两次或更多次以实现期望的细菌敲减。期望的细菌敲减一般是足以显著防止发酵过程期间TSNA形成的量。实现该目的所需的具体值可依赖于多种因素，如pH，接种率，水活性等。在一些实施方式中，可能需要>log 1，>log 2，>log 3，或>log 5的敲减。在一些实施方式中，需要<log 1的残留内源性细菌水平。
然后用本文所述的一种或多种微生物来处理具有降低的细菌水平的烟草材料。在一些实施方式中，首先用缓冲溶液来处理烟草材料以提供具有特定pH的烟草材料。在一些实施方式中，pH优选为约7至约8(例如，约7.4)。缓冲液可变化，并且在一些实施方式中，可包括碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵或其组合的水溶液。在某些实施方式中，可在混合罐中制备该缓冲溶液，该混合罐与盛放烟草材料的容器耦合。可然后将缓冲溶液通过泵送系统施用于烟草材料。将缓冲溶液施用于烟草材料的其他方法是已知的并且也旨在包括在本文中。优选地，例如，通过采用混合器确保合烟草材料和缓冲液之间适且均匀的混合来使缓冲液与烟草材料充分混合。
然后将本文公开的一种或多种微生物施用于缓冲的材料。例如，可以溶液形式施用微生物或可以与缓冲溶液相似的方式施用微生物。相关微生物包括上述引用的那些，包括但不限于，非硝酸盐还原细菌和/或酵母，例如，嗜卤四联球菌(Tetragenococcushalophilus)。接种率可变化，但代表性的接种率为约103CFU至约109CFU。在引入微生物后并且在后续的接种过程期间，在一些实施方式中，可在整个发酵中调整烟草材料的水分。在整个发酵中，发酵中的烟草的水分优选维持在约35％水分至约50％水分的范围内，并且理想地在约40％至约45％的范围内。
类似地，优选在整个发酵过程中控制(例如，维持)发酵中的烟草的温度。烟草材料所维持的示例性温度在约80°F至约95°F的范围内。控制温度的方法一般是已知的。在一些实施方式中，可通过与进行发酵的SSF容器相关的加热/冷却套来控制温度。也有益地在整个发酵中控制发酵中的烟草的氧水平。控制容器内氧含量的方法是已知的，并且包括但不限于使用高效微粒过滤器(HEPA)，空气可通过其进入容器，和/或通过搅拌或在发酵期间移动烟草材料(例如，通过转动混合容器中的叉，如每周1次或更多次，例如，每周约1至约3次)。
烟草材料在这些条件下保留的时间可变化。通常使烟草材料在这些条件下保持直至达到所需发酵水平。在一些实施方式中，可通过评估例如在发酵过程中耗尽的苹果酸和柠檬酸的水平来监测发酵。尽管不意在限制，示例性的发酵时间可以是至少约2周或至少约3周，例如，约3-约4周。例如，这些值可根据，诸如接种率、水分、温度、pH、盐度和通风等参数而变化。成功发酵后的最终pH应为约7.6-7.9。
当发酵完成至所需程度时，发酵的烟草材料通常用热处理。在一些实施方式中，该热处理可足以停止发酵并且热杀伤任何活性的、植物微生物。例如，该发酵后热处理可以与上文关于发酵前热处理所描述的那样类似的方式进行。在一些实施方式中，随后可向该热处理的发酵的烟草材料添加各种组分。例如，可通过向热处理的发酵的烟草材料添加合适组分(例如，向发酵罐直接添加此类组分)来调节防腐剂、壳(casing)、水分，和盐度。或者，在一些实施方式中某些组分可在发酵之前添加，此时有利于在发酵之前调节试剂汇集物。在某些实施方式中，在上述方法之后，可使热处理的烟草材料干燥(例如，干燥至约15％-约20％的含水量，例如，约18％含水量)，以供贮存和运输。所述热处理的烟草材料可经后续处理，例如，调节其最终盐度、防腐剂、壳和水分含量。
本文所述的多种处理类型可独立地进行，或本文所述的多种处理可联合进行。例如，本文所述的预烘培处理方法可在烘焙过程末尾之前应用一次、两次、三次或更多次。所述处理可应用相同或不同处理组合物。在一些实施方式中，烟草材料在烘焙完成之前用盐和一种或多种乳酸菌两者处理。类似地，本文公开的发酵处理可在发酵过程中进行一次或多次(即，通过在发酵过程中向烟草材料一次或多次添加一种或多种类型的微生物)。如果在发酵过程中多次添加微生物，则所添加的微生物的类型可相同或不同。
在一个具体实施方式中，烟草植物在收获前用盐(例如，NaCl或KCl)处理，然后用一种或多种乳酸菌或盐耐受性酵母预烘培处理(例如，在烘焙的早期阶段过程中)，然后在发酵过程中用一种或多种微生物处理。在某些实施方式中，预烘培盐处理可导致整个烘焙和发酵过程中，烟草材料中存在氯化物，而在一些实施方式中，认为氯化物会减缓发酵过程不希望的硝酸盐的减少和/或减缓不需要的TSNA的形成。
按照本文所述的方式对烟草进行处理，能够提供经处理的烟草材料，在一些实施方式中，其具有与初始烟草材料(例如，收获时的材料)相比相当的TSNA水平。有利地，烟草可按本文所述处理并发酵，以提供经发酵的烟草材料，其TSNA水平不高于经历发酵的烟草材料的TSNA水平。换言之，在某些实施方式中，按本文所述控制发酵过程，从而确保几乎没有TSNA(包括没有TSNA和基本上没有TSNA)在发酵过程中形成。在一些实施方式中，烟草可经处理和发酵以提供发酵的烟草材料，其TSNA水平不高于收获时烟草的TSNA水平。
在一些实施方式中，本文所述的一个或多个步骤可导致相较于未处理的烟草的降低的TSNA水平(包括显著降低的TSNA水平)。例如，在某些实施方式中，相较于(未处理的)发酵的烟草中通常所含的量，按本文所述处理的烟草中的TSNA的量可以是约75％或更少，约50％或更少，约25％或更少，约10％或更少，约5％或更少，约2％或更少，或约1％或更少。例如，在某些实施方式中，发酵的烟草材料中TSNA的量可以是约20μg或更少，约15μg或更少，约12μg或更少，或约10μg或更少。希望发酵前烟草中的TSNA的量达到最小(例如，落在上文所述范围内)，并且，发酵后烟草中的TSNA的量不显著较高(例如，发酵的烟草中的TSNA的量等于或少于临发酵前烟草中的TSNA的量)。
在一些实施方式中，本文所述的处理方法可提供具有较高盐(在一些实施方式中，包括较高氯化物)含量的处理的烟草材料。有利地，按本文所述处理的烟草材料的氯化物含量是0％-约4％，例如，约0.1％-约3％，或约0.5％-约3重量％，以干重为基准计。在某些优选实施方式中，按本文所述处理的烟草材料的氯化物含量少于约4重量％，少于约3重量％，或少于约2重量％。尽管在一些应用中，增加的盐/氯化物含量可能是不利的，但在一些实施方式中，增加的盐/氯化物的存在并非不利，且在某些实施方式中，是希望的。例如，此类经处理的材料可能不那么希望用于其中发生烟草材料的燃烧的香烟制品。在一些实施方式中，在其中烟草材料不燃烧的一些应用(例如，无烟烟草产品和/或电子烟制品)中可能更易接受和/或更加希望增加的盐/氯化物含量，如下文将更详细地描述的那样。
注意到本文所述的处理类型可具有其它益处。例如，在某些实施方式中，相较于不存在微生物处理的情况下经历发酵的烟草的性质，在微生物的存在下，可在发酵的不同阶段获得改变的风味和/或芳香性质。
本公开提供的处理的烟草材料可经进一步处理并以本领域一般知晓的方式使用。参见例如，美国专利申请公开号2012/0272976(Byrd等)和2014/0299136(Moldoveanu等)，其通过引用纳入本文。在不同的实施方式中，处理的烟草可应用于香烟制品、无烟烟草产品，和电子烟制品。本文所述的某些处理的烟草材料可应用于，例如，其中盐和/或氯化物含量不会对产品性质造成负面影响的，其中使TSNA含量有利地最小化的，和/或其中有益地应用经发酵的材料的产品。
特别感兴趣的是包含按本文所述处理的烟草材料的无烟烟草产品，其组成可不同。参见例如，那些代表性组分，组分的组合，那些组分和成分相对于烟草的相对量，以及应用那些组分的方式和方法，示于美国专利号8,061,362(Mua等)和美国专利公开号2007/0062549(Holton,Jr.等)；2007/0186941(Holton,Jr.等)；和2008/0029110(Dube等)，其各自通过引用纳入本文。
在某些实施方式中，提供包含本文公开的经处理的烟草材料类型的湿鼻烟(snus)或鼻烟(snuff)型产品(例如，填装在密封烟袋中的研磨的烟草材料)例如，包括但不限于，经处理的发酵的烟草材料(单独或联合其它类型的烟草材料)。所述湿鼻烟产品的示例性实施方式说明并描述于，例如，美国专利申请公开号20120279510(Marshall等)，其通过引用纳入本文。对于湿鼻烟产品的不同组分及其组分的描述也可见于美国专利公开号2004/0118422(Lundin等)，其通过引用纳入本文。还参见例如，美国专利号4,607,479(Linden)；4,631,899(Nielsen)；5,346,734(Wydick等)；和6,162,516(Derr)；和美国专利公开号2005/0061339(Hansson等)和2010/0018539(Brinkley等)，其各自通过引用纳入本文。
应注意，尽管本文讨论的内容大量集中于烟草的处理，许多其它植物(包括水果、蔬菜、花卉及其组分)也可根据本文所述的方法进行处理，以提供具有与其相关联的某些化合物的改变的水平的植物、植物组分，和由其产生的材料和产品。
实验部分
以下实施例更详细地显示了本发明，用来对本发明进行具体说明，本发明不限于此。除非另有说明，所有部分和百分比均以重量计，并且，所有重量百分比以基于干重的方式表达，这意味着排除了水含量。
实施例1：预烘培的烟草用处理溶液处理
深色风干烘培的烟草在收获之前用益生菌细菌溶液、酶溶液和/或3％氯化钠盐溶液中的一种或多种处理5小时。溶液用背包式喷雾机施用。溶液基于100加仑溶液/英亩，采用如下提供的推荐的植物间隔和剂量/植物。收获经处理的烟草，并分析中段茎叶样品的总细菌计数、肠细菌计数和乳杆菌(Lactobacillus)计数。10g各经处理的烟草样品置于Butterfields磷酸盐缓冲液中，并用水稀释10-2至10-8倍。经处理的烟草样品稀释物施加至平板计数琼脂(PCA)以供总需氧细菌计数，施加至结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)以供革兰氏阴性细菌计数，以及施加至MRS以供厌氧(乳杆菌)计数。对在放大倍数下所观察到的细菌集落数量进行计数，以估计集落形成单位/克(CFU/g)总数。
用可获自CVS的益生菌溶液(溶液经制备以提供6.00×109CFU/植物)处理的烟草显示处理后的91％的总细菌减少，处理后40％的肠细菌减少，和处理后46％的乳杆菌减少(均基于处理前和处理后的总细菌计数)。
用可获自Walgreens的益生菌溶液(溶液经制备以提供6.40×109CFU/植物)处理的烟草显示处理后的96％的总细菌减少，处理后58％的肠细菌减少，和处理后42％的乳杆菌减少(均基于处理前和处理后的总细菌计数)。
用可获自CVS的益生菌溶液(溶液经制备以提供6.00×109CFU/植物)联合表面活性剂(来自Drexel化学公司的Surf-
Figure GDA0002587709700000211
)处理的烟草显示处理后的95％的总细菌减少，处理后66％的肠细菌减少，和处理后57％的乳杆菌增加(均基于处理前和处理后的总细菌计数)。
用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)益生菌溶液(溶液经制备以提供6.64×1010CFU/植物)处理的烟草显示处理后的95％的总细菌减少，处理后75％的肠细菌减少，和处理后43％的乳杆菌增加(均基于处理前和处理后的总细菌计数)。
用嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)益生菌溶液(溶液经制备以提供2.72×1010CFU/植物)处理的烟草显示处理后的93％的总细菌减少，处理后20％的肠细菌减少，和处理后33％的乳杆菌减少(均基于处理前和处理后的总细菌计数)。
用乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)益生菌溶液(溶液经制备以提供4.16×1010CFU/植物)处理的烟草显示处理后的82％的总细菌减少，处理后25％的肠细菌减少，和处理后16％的乳杆菌减少(均基于处理前和处理后的总细菌计数)。
用瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)益生菌溶液(溶液经制备以提供5.20×109CFU/植物)处理的烟草显示处理后的97％的总细菌减少，处理后39％的肠细菌减少，和处理后大于400％的乳杆菌均增加(基于处理前和处理后的总细菌计数)。
用PreventASeTM酶溶液(溶液经制备以提供3.2mL天冬酰胺酶/植物)处理的烟草显示处理后的88％的总细菌减少，处理后75％的肠细菌减少，和处理后43％的乳杆菌减少(均基于处理前和处理后的总细菌计数)。
用3％NaCl溶液处理的烟草显示处理后的94％的总细菌减少，处理后76％的肠细菌减少，和处理后大于400％的乳杆菌均增加(基于处理前和处理后的总细菌计数)。
数据说明，所有处理溶液均提供与经处理的烟草材料相关联的总细菌的减少(相较于处理前的烟草材料)。盐(NaCl)-处理的烟草材料显示所需的乳杆菌细菌的显著增加。该发现结果可能会使所述NaCl(和其它盐)-处理的烟草材料更加特别适于进一步发酵过程，以及将所述经发酵的烟草材料纳入无烟烟草产品。此外，瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)处理的烟草材料显示处理后乳杆菌(Lactobacillus)细菌的显著增加。尽管一些增加可能因处理溶液中乳杆菌细菌的存在而已被预期，该增加远高于其它乳杆菌益生菌溶液处理的烟草材料中所注意到的结果(例如，用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)处理的烟草显示乳杆菌细菌的仅43％增加，而用嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)处理的烟草显示乳杆菌细菌的33％减少)。因此，瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)处理的烟草材料可能特别适于进一步发酵过程，以及将所述发酵的烟草材料也纳入无烟烟草产品。
实施例2：烟草用微生物处理
烟草(例如，通过上文实施例1中所示的任意方法处理的烟草)通过润湿该烟草(例如，通过使该烟草经历潮湿条件)而经历发酵。在发酵过程中通过选择并维持合适的水活性、pH、盐度和温度条件来控制内源性细菌、酵母和真菌，以提供供于起始物培养或所需内源性微生物来发酵烟草并防止TSNA前体形成的合适条件。单独或联合酵母的细菌(例如，嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus))溶液施加至发酵中的烟草，并且使烟草在该条件下发酵约1-6周。观察到该烟草中TSNA含量减小，相对于实施例1中处理的但在发酵过程中未用嗜盐四联球菌处理的发酵的烟草。
通过阅读以上说明书，本领域技术人员可以想到本发明的许多改变和其它的实施方式。因此，应当理解本发明不仅限于本文所述的具体实施方式，各种改变和其它的实施方式也包括在所附权利要求书限定的范围之内。尽管在本文中使用了具体的术语，但是这些术语仅以通用和描述性意义使用，而不用于对本文构成限制。

Claims (27)

1.一种改变烟草材料的烟草特有亚硝胺含量的方法，其包括：
使烟草材料与处理组合物接触，其中，所述处理组合物包括：盐、糖、酶、乳酸菌、酵母或者这些中的两种或更多种的组合，其中，所述接触提供了总细菌含量下降的经处理的烟草材料；
烘焙所述经处理的烟草材料，以得到经烘焙的烟草材料；
向所述经烘焙的烟草材料添加一种或多种微生物，其中，所述一种或多种微生物相对于所述经烘焙的烟草材料以外来量存在；以及
对所述经烘焙的烟草材料进行发酵，以提供经发酵的烟草材料，其烟草特有亚硝胺含量相对于未与处理组合物接触且未在存在所述微生物的情况下发酵的经发酵的烟草材料是下降的，
其中，所述一种或多种微生物包括嗜盐四联球菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草材料选自下组：烟草种子、未成熟的植物、成熟的植物，或其部分。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述处理组合物包含含氯化物盐。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述处理组合物包含NaCl或KCl。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草材料包括选自下组的烟草：黑猛犸象、绿木、幼木、改进型马朵儿、TR马朵儿、小克里滕登、DF 911、KY 160、KY 171、KY 180、KY190、KY 309、KY VA 312、VA 355、VA 359、DF 485、TN D94、TN D950，及其组合。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嗜盐四联球菌包括基因改性的细菌。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因改性的细菌包括插入编码亚硝酸盐还原酶的基因。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草特有亚硝胺减少10％或更多。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草特有亚硝胺减少20％或更多。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草特有亚硝胺含量减少50％或更多。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经发酵的烟草材料的烟草特有亚硝胺含量不超过所述经烘焙的烟草材料的烟草特有亚硝胺含量。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经发酵的烟草材料的氯含量为0.5-3重量％。
13.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
对所述经发酵的烟草材料进行加工，以提供处于具有适用于结合到烟草产品中的形式的经加工的烟草材料；以及
将所述经加工的烟草材料结合到无烟烟草产品中。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述经加工的烟草材料是烟草掺混物的形式。
15.一种无烟烟草产品，其根据权利要求13所述的方法制备。
16.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
将收获的烟草材料调节至所需的水分水平；
从收获的烟草材料分离茎，以得到去茎烟草材料；以及
对所述去茎烟草材料进行切割，以提供经切割的去茎烟草材料形式的烟草材料；
其中，接触步骤包括使经切割的去茎烟草材料与盐接触，并加热所得到的混合物。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，接触步骤还包括对混合物进行巴氏杀菌。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，调节步骤包括将烟草材料调节至为20-25％的水分水平。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，水分水平为22％。
20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在固态发酵容器中进行接触和发酵步骤。
21.如权利要求16所述的方法，其特征在于，发酵步骤还包括控制温度、水分、氧水平，或其任意组合。
22.如权利要求16所述的方法，其特征在于，嗜盐四联球菌存在的量为106CFU。
23.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述一种或多种微生物包括基因改性的嗜盐四联球菌，其包括插入编码亚硝酸盐还原酶的基因。
24.如权利要求16所述的方法，该方法还包括使得经发酵的烟草材料经受提升的温度。
25.如权利要求16所述的方法，该方法还包括向经发酵的烟草材料添加一种或多种组分，其中，所述一种或多种组分包括选自下组的组分：盐、防腐剂、壳混合物和水分。
26.如权利要求16所述的方法，该方法还包括对经发酵的烟草材料的水分水平进行调节。
27.如权利要求16所述的方法，其特征在于，经发酵的烟草材料的烟草特有亚硝胺含量小于或等于经切割的去茎烟草材料中的烟草特有亚硝胺含量。
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