CN107916268A

CN107916268A - 聚半乳糖醛酸裂解酶基因、重组表达载体、菌株、聚半乳糖醛酸裂解酶及其制备方法

Info

Publication number: CN107916268A
Application number: CN201710934708.8A
Authority: CN
Inventors: 杨江科; 彭小波
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2017-09-30
Filing date: 2017-09-30
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2037-09-30
Also published as: CN107916268B

Abstract

本发明公开一种聚半乳糖醛酸裂解酶基因、重组表达载体、菌株、聚半乳糖醛酸裂解酶及其制备方法，所述聚半乳糖醛酸裂解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明旨在解决现有技术中聚半乳糖醛酸裂解酶的耐高温性差、表达量低、酶活低的问题。

Description

聚半乳糖醛酸裂解酶基因、重组表达载体、菌株、聚半乳糖醛酸裂解酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种聚半乳糖醛酸裂解酶基因、重组表达载体、菌株、聚半乳糖醛酸裂解酶及其制备方法。

背景技术

果胶广泛存在于植物的根茎叶中，是含量非常丰富，且结构复杂的多糖。在植物细胞壁中，果胶起到黏合作用。果胶是α-1,4糖苷键连接而成的聚半乳糖醛酸，其羧基可以不同程度的甲酯化，在其侧链含有各种杂多糖。果胶酶是一类能够水解果胶的酶的总称。广泛应用于果酒澄清、果蔬汁加工、造纸纺织、制药、废水处理等。如在饲料工业中，在饲料中添加果胶酶可有效的降解饲料中的抗营养因子，降低食物糜黏度，减少胀气、消化不良等症状，提高饲料的营养利用率。碱性耐热果胶酶由于其碱适性，耐高温的特点在生物制浆、麻类脱胶等工业应用上具有重要作用，加之条件温和、成本低廉、绿色环保、能耗低、效率高使其具有广泛应用前景。聚半乳糖醛酸裂解酶 (Polygalacturonate lyase)，也称果胶裂解酶，是一种糖苷酶，能够催化裂解以α-1,4糖苷键结合的果胶的主链。

另外在果胶酶的工业应用中，如酶液的喷雾干燥，饲料的制粒、膨化，造纸原料的脱胶等生产加工中常常伴随着高温出现，会影响酶的应用效果。因此在工业应用中需要耐高温、高酶活的果胶酶。

果胶酶一般是从自然界产聚半乳糖醛酸裂解酶的微生物中筛选菌株，然后对菌株进行改良，或者对发酵工艺进行优化。但这样筛选的聚半乳糖醛酸裂解酶的酶活和蛋白表达量一般不高，且会出现传代丢失等问题。采用基因工程手段，如通过PCR技术从相关产聚半乳糖醛酸裂解酶的微生物中扩增出聚半乳糖醛酸裂解酶的基因，连接到表达载体中，再导入相关表达宿主，表达聚半乳糖醛酸裂解酶，是目前获得果胶酶高产菌株的主要方法。但是这样获得的聚半乳糖醛酸裂解酶一般酶学性质普通，蛋白的表达量较少，工业应用限制较大。

毕赤酵母表达系统是目前广泛使用的真核生物表达体系。它具有生物安全性好、遗传元件稳定、高密度发酵工艺成熟以及目的蛋白分离纯化简便等优点，是异源蛋白质工业化生产的理想宿主。

然而，由于受到毕赤酵母对异源基因密码子使用偏好性、mRNA二级结构的复杂性、基因中富含A/T或G/C区段、蛋白酶切割位点以及基因在宿主中的丰度等因素影响，异源基因在毕赤酵母中难以获得高效表达。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种聚半乳糖醛酸裂解酶基因、重组表达载体、菌株、聚半乳糖醛酸裂解酶及其制备方法，旨在解决现有技术中聚半乳糖醛酸裂解酶的耐高温性差、表达量低、酶活低的问题。

为实现上述目的，本发明提出的一种聚半乳糖醛酸裂解酶基因，其适于编码聚半乳糖醛酸裂解酶，所述聚半乳糖醛酸裂解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

基于同样的发明构思，本申请还提供一种聚半乳糖醛酸裂解酶，所述聚半乳糖醛酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

基于同样的发明构思，本申请还提供一种重组表达载体，包括如权利要求1所述的聚半乳糖醛酸裂解酶基因。

优选的，所述聚半乳糖醛酸裂解酶基因的拷贝数为多个。

基于同样的发明构思，本申请还提供一种菌株，包括上述的聚半乳糖醛酸裂解酶基因。

优选的，所述菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

基于同样的发明构思，本申请还提供一种聚半乳糖醛酸裂解酶的制备方法，培养上述的菌株，得到聚半乳糖醛酸裂解酶。

本发明提供的聚半乳糖醛酸裂解酶基因(SEQ ID NO:1)，采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了聚半乳糖醛酸裂解酶基因转录出的mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，并通过对次高频密码子的选用消除了基因中富含AT或GC的区域以及聚半乳糖醛酸裂解酶中的蛋白酶作用位点，大大地提高了该聚半乳糖醛酸裂解酶基因在毕赤酵母细胞中的表达量，且将含有该聚半乳糖醛酸裂解酶基因的载体转入毕赤酵母菌株后得到的聚半乳糖醛酸裂解酶具有生物酶活性，该聚半乳糖醛酸裂解酶具有最适pH为9.6、最适温度为 55℃的特性，其能够将聚半乳糖醛酸水解成寡聚的半乳糖醛酸。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明中提供的pAO815表达载体的图谱；

图2为本发明中提供的单拷贝的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达载体的图谱；

图3为本发明提供的两拷贝的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达载体的图谱；

图4为本发明提供的三拷贝的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达载体的图谱；

图5为本发明实施例1提供的单拷贝、两拷贝、三拷贝的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达载体的双酶切检验结果图；

图6为本发明提供的多拷贝重组表达菌株在摇瓶发酵不同诱导时间上清液的SDS-PEGE结果；

图7为本发明提供的三拷贝重组表达菌株高密度发酵上清液的SDS-PEGE 结果；

图8为本发明提供的三拷贝重组表达菌株高密度发酵上清液，测出的温度和pH曲线。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

本发明提供一种聚半乳糖醛酸裂解酶基因、重组表达载体、菌株、聚半乳糖醛酸裂解酶及其制备方法，旨在解决现有技术中聚半乳糖醛酸裂解酶的耐高温性差、表达量低、酶活低的问题。

单拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因表达载体的构建

1.1合成聚半乳糖醛酸裂解酶的基因片段

根据现有的聚半乳糖醛酸裂解酶的基因(来源于枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)，人工合成聚半乳糖醛酸裂解酶的基因片段，命名为 Pel A，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。人工合成的聚半乳糖醛酸裂解酶对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明人工合成聚半乳糖醛酸裂解酶的基因序列设计主要考虑了如下几点：

1)通过采用巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中的高频密码子替换原有的低频密码子；

2)降低了mRNA的自由能；

3)通过对次高频密码子的选用消除了基因中富含AT或GC的区域；

4)消除聚半乳糖醛酸裂解酶中的蛋白酶作用位点。

经过本发明人工合成聚半乳糖醛酸裂解酶的基因序列，有效提高了含量较高氨基酸密码子的使用频率；有效降低了聚半乳糖醛酸裂解酶的基因转录出的mRNA二级结构的复杂性，有利于提高聚半乳糖醛酸裂解酶的表达量。

1.2单拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达载体

本发明的聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的表达载体优选地选择可用于毕赤酵母中表达的载体，本发明的载体优选商品化的毕赤酵母中使用的载体如pPIC、pPICZ、PAO、pGAP或pGAPZ等一系列的载体。本发明下面以pAO815为例来说明，pAO815的结构如图1所示。

1.2.1在合成的聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的两端加上酶切位点EcoR I，经过EcoR I酶切后，连接至经过EcoR I酶切后的中间载体 pUC57载体上，得到pUC-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因载体。

1.2.2将pUC-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因载体和pAO815载体分别用EcoR I酶切。

本发明采用的酶切体系：30μL的载体、2μL的EcoR I、10μL的 10×Buffer、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h左右。

1.2.3电泳、胶回收聚半乳糖醛酸裂解酶的基因片段和pAO815片段，将得到的聚半乳糖醛酸裂解酶的基因片段和pAO815片段用T4 DNA连接酶，得到pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的表达载体。

具体的，对步骤1.2.2中EcoR I酶切后得到的基因片段和pAO815 片段采用电泳、胶回收。并通过T4 DNA连接酶催化电泳、胶回收得到的基因片段和pAO815片段结合。

其中连接体系具体为：1μL的T4buffer、1μL的T4DNA连接酶、5.5μL 的pel A基因片段、2.5μL的pAO815片段、ddH₂O补齐至10μL；在16℃条件下连接8-10h后，转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有单拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的重组质粒pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因表达载体，其结构如图2所示，聚半乳糖醛酸裂解酶的基因由AOX1 甲醇诱导型启动子驱动，由AOX1(TT)终止子终止表达。

1.2.4将pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的表达载体转化入巴斯德毕赤酵母中，然后在YPD平板上筛选得到正确的阳性转化子。

在本实施例中通过电转仪将pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的表达载体转化入巴斯德毕赤酵母中。

在本实施例中采用的巴斯德毕赤酵母(Pichi pastoris GS115)，在其他实施例中也可以为其他的毕赤酵母菌株。

其中正确的阳性转化子为经PCR验证为正确的阳性转化子。

提取质粒载体，使用EcoR I和XbaI进行双酶切验证，结果如图 5所示，其中图5中M为DL5000 DNA Marker，1泳道表示没有酶切的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因重组表达载体；2泳道表示双酶切后的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因重组表达载体；3泳道表示双酶切后的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因重组表达载体，在图5 中条带大小位置，说明聚半乳糖醛酸裂解酶的基因成功连接至pAO815 表达载体上。

单拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的菌株的构建

根据上述得到的单拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的表达载体转到毕赤酵母感受态细胞中，筛选得到阳性克隆子，可获得含单拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的单拷贝表达菌株。

多拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的重组表达载体的构建

本发明以两拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的重组表达载体来详细说明构建原理。

2.1构建两拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的重组表达载体

2.1.1获得含聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达盒片段

含聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达盒片段即含有聚半乳糖醛酸裂解酶基因目的基因的片段，通过同尾酶双酶切法获得含聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达盒片段。

步骤2.1.1具体的为：将上述“单拷贝菌株的构建”中得到的pAO815- 聚半乳糖醛酸裂解酶的基因重组表达载体用Bgl II和BamH I双酶切后，胶回收大片段得到含聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达盒片段，该酶切体系具体为：

30μL的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因表达载体、1.5μL的 BamH I、1.5μL的Bgl II、20μL的10×Buffer K、20μL的BSA、20μL 的Triton X-100、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下，酶切4h左右。

2.1.2取新的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因重组表达载体，用BamH I单酶切，并将步骤2.1.1中得到的含聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达盒片段与其重组质粒，即得到两拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的重组表达载体，也即两拷贝的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因表达载体。请参阅图2至图4，分别为单拷贝、两拷贝、三拷贝的 pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达载体的图谱。

如需要构建三拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的重组表达载体，则将两拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的重组表达载体作为上述步骤 2.1.2中新的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因重组表达载体，将步骤2.1.1中得到的含聚半乳糖醛酸裂解酶基因的表达盒片段与其重组质粒，得到三拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的重组表达载体。

以此类推，若要得到四拷贝，则将三拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的重组表达载体作为步骤2.1.2中新的pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因重组表达载体，……，故，在此不再详述。

含多拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的多拷贝重组表达菌株的构建

根据上述得到的多拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶的基因的重组表达载体转到毕赤酵母感受态细胞中，筛选得到阳性克隆子，可获得含多拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的多拷贝重组表达菌株。

下面将对获得的多拷贝重组表达菌株的表达量、酶活验证。

(1)对多拷贝重组表达菌株摇瓶发酵培养，取上清，进行 SDS-PEGE检测，检测结果如图6所示。图6中：1、2、3、4为发酵 24h、48h、72h、96h)，1-2、1-4含单拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的单拷贝重组表达菌株；2-2、2-4、2-6为含两拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的两拷贝重组表达菌株；3-3、3-4、3-6为含三拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的三拷贝重组表达菌株，三拷贝重组表达菌株(图中3-3、 3-4)的上清液中的聚半乳糖醛酸裂解酶含量较高，这也说明三拷贝的 pAO815-聚半乳糖醛酸裂解酶的基因表达载体的聚半乳糖醛酸裂解酶的表达量较高。

(2)对聚半乳糖醛酸裂解酶的酶活测定，DNS法测聚半乳糖醛酸裂解酶酶活。

取0.5mL适当稀释的上清液(步骤2.1.5得到的)，加入到0.5mL 0.33％聚半乳糖醛酸和1mL pH9.6甘氨酸-氢氧化钠缓冲液混合液中；

55℃水浴反应10min，用2mL DNS(3，5-二硝基水杨酸)终止反应；

置于沸水浴中5min，加水定容到25mL；对照组加入沸水浴灭活的酶，其它不变；

测量OD₅₂₀吸光值，并对照葡萄糖标准曲线算出还原糖的浓度，根据下述酶活公式计算出聚半乳糖醛酸裂解酶酶活；

每分钟水解聚半乳糖醛酸形成1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。酶活(U/mL)计算公式：U＝(N×D×V1)/(V2×T)，其中， N：酶液稀释倍数；D为根据OD₅₂₀吸光值得到的葡萄糖的摩尔浓度 (μmol/mL)；V1为反应定容体积(mL)；V2为加入酶液的体积；T为反应时间(min)。

经过上述计算得到的各重组毕赤酵母菌种细胞呈白色球形，为好氧型酵母菌，生长过程中温度为28℃，产聚半乳糖醛酸裂解酶需要以甲醇为碳源进行诱导且最适温度为25℃。

本发明通过选择毕赤酵母偏好密码子等手段进行基因优化后，将合成的聚半乳糖醛酸裂解酶基因(SEQ ID NO:1)与pAO815表达载体连接后，转入毕赤酵母GS115中表达，三拷贝重组表达菌株小摇瓶发酵上清的最高酶活达到66.4U/mL，聚半乳糖醛酸裂解酶的最适pH为 9.6，最适温度为55℃。两拷贝的重组表达菌株的酶活达到63U/mL，一拷贝的重组表达菌株的酶活达到61U/mL。在14L发酵罐中发酵 117h的发酵上清液在pH9.6，55℃，酶活达到11300U/mL。

生产聚半乳糖醛酸裂解酶的方法

本发明提供的生产聚半乳糖醛酸裂解酶的方法，下面以含两拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的两拷贝重组表达菌株培养得到聚半乳糖醛酸裂解酶的方法为例，对含两拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的两拷贝重组表达菌株进行发酵培养。该方法包括：

步骤S311，将含两拷贝聚半乳糖醛酸裂解酶基因的两拷贝重组表达菌株接种至发酵培养基的发酵罐中。

所述步骤S311中的两拷贝重组表达菌株取400ml种子液，所述发酵培养基取7L。其中发酵培养基的成分比例选取如下：

KH₂PO₄：350g；CaSO₄：7g；(NH₄)₂SO₄：40g；MgSO₄：50g；K₂SO₄：120 g；甘油：560g；蒸馏水：定容至7L。

步骤S312，控制发酵罐中的条件，具体的条件为发酵罐内的温度为28℃，pH 6.0左右，转速200-500rpm，通气量2.0-5.5L/min，发酵时间20h。

步骤S313，待按步骤S312中的条件发酵后，流加甘油和葡萄糖的混合溶液(各50％)，开度20％，补充营养，发酵参数不变，持续2h。

步骤S314，待步骤S313结束后流加甲醇。

待步骤S313结束后发酵罐溶氧会不断上升，逐渐降低通气量和转速。

其中，步骤S314中流加甲醇分为三个阶段：

第一阶段，控制发酵罐内2h内使甲醇含量达到0.5％，温度降到 25℃。

第二阶段，待第一阶段结束后，调节转速和通气使溶氧维持在30％左右，温度25℃，pH 5.5左右，甲醇流速为4.0mL/L/h。

此时，酵母适应甲醇后，溶氧开始下降。

第三阶段，发酵到后期，溶氧波动较大，此时减少甲醇流速至2.5 mL/L/h，使溶氧维持在20％左右。当发酵液pH迅速增加时表明酵母细胞开始大量衰亡，此时结束发酵，得到含聚半乳糖醛酸裂解酶的发酵上清液。

步骤S315，对发酵上清液提纯后可得到聚半乳糖醛酸裂解酶。

其中，发酵过程中，可在不同发酵的时间点(24h、48h、72h、96h) 取发酵液上清，进行SDS-PEGE，如图7所示，由图7可以看出在发酵 96h时，聚半乳糖醛酸裂解酶的产量最高。

如图8所示，测得发酵液酶活在最适温度55℃和pH为9.6，酶活为11300U/mL。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

<110> 武汉轻工大学

<120> 聚半乳糖醛酸裂解酶基因、重组表达载体、菌株、聚半乳糖醛酸裂解酶及其制备方法

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaagaagg ttatgttggc tactgctttg tttttgggtt tgactccagc tggtgctaac 60

gctgctgatt tgggtcatca aactttgggt tctaacgatg gttggggtgc ttactctact 120

ggtactactg gtggttctaa ggcttcttct tctaacgttt acactgtttc taacagaaac 180

caattggttt ctgctttggg taaggaaact aacactactc caaagattat ttacattaag 240

ggtactattg atatgaacgt tgatgataac ttgaagccat tgggtttgaa cgattacaag 300

gatccagaat acgatttgga taagtacttg aaggcttacg atccatctac ttggggtaag 360

aaggaaccat ctggtactca agaagaagct agagctagat ctcaaaagaa ccaaaaggct 420

agagttatgg ttgatattcc agctaacact actattgttg gttctggtac taacgctaag 480

gttgttggtg gtaactttca aattaagtct gataacgtta ttattagaaa cattgaattt 540

caagatgctt acgattactt tccacaatgg gatccaactg atggttcttc tggtaactgg 600

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acttttaacg atggttctag accagattct acttctccaa agtactacgg tagaaagtac 720

caacatcatg atggtcaaac tgatgcttct aacggtgcta actacattac tatgtcttac 780

aactactacc atgatcatga taagtcttct atttttggtt cttctgattc taagacttct 840

gatgatggta agttgaagat tactttgcat cataacagat acaagaacat tgttcaaaga 900

gctccaagag ttagatttgg tcaagttcat gtttacaaca actactacga aggttctact 960

tcttcttctt cttacccatt ttcttacgct tggggtattg gtaagtcttc taagatttac 1020

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tctgctgcta acggtttgtc ttcttctgtt ggttggactc catctttgca tggttctatt 1200

gatgcttctg ctaacgttaa gtctaacgtt attaaccaag ctggtgctgg taagttgaac 1260

taa 1263

<110> 武汉轻工大学

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 420

<212> PRT

<213> 人工基因

<400> 2

Met Lys Lys Val Met Leu Ala Thr Ala Leu Phe Leu Gly Leu Thr Pro

1 5 10 15

Ala Gly Ala Asn Ala Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Gly Ser Asn

20 25 30

Asp Gly Trp Gly Ala Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala

35 40 45

Ser Ser Ser Asn Val Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser

50 55 60

Ala Leu Gly Lys Glu Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys

65 70 75 80

Gly Thr Ile Asp Met Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu

85 90 95

Asn Asp Tyr Lys Asp Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala

100 105 110

Tyr Asp Pro Ser Thr Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Gln Glu

115 120 125

Glu Ala Arg Ala Arg Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val

130 135 140

Asp Ile Pro Ala Asn Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys

145 150 155 160

Val Val Gly Gly Asn Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg

165 170 175

Asn Ile Glu Phe Gln Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro

180 185 190

Thr Asp Gly Ser Ser Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr

195 200 205

Ile Asn Gly Gly Thr His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp

210 215 220

Gly Ser Arg Pro Asp Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Tyr Gly Arg Lys Tyr

225 230 235 240

Gln His His Asp Gly Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile

245 250 255

Thr Met Ser Tyr Asn Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe

260 265 270

Gly Ser Ser Asp Ser Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr

275 280 285

Leu His His Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val

290 295 300

Arg Phe Gly Gln Val His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr

305 310 315 320

Ser Ser Ser Ser Tyr Pro Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser

325 330 335

Ser Lys Ile Tyr Ala Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser

340 345 350

Ala Ala Lys Thr Ile Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp

355 360 365

Ser Gly Thr Leu Leu Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn

370 375 380

Gly Leu Ser Ser Ser Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Ser Ile

385 390 395 400

Asp Ala Ser Ala Asn Val Lys Ser Asn Val Ile Asn Gln Ala Gly Ala

405 410 415

Gly Lys Leu Asn

420

Claims

1.一种聚半乳糖醛酸裂解酶基因，其适于编码聚半乳糖醛酸裂解酶，其特征在于，所述聚半乳糖醛酸裂解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种聚半乳糖醛酸裂解酶，其特征在于，所述聚半乳糖醛酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求1所述的聚半乳糖醛酸裂解酶基因。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述聚半乳糖醛酸裂解酶基因的拷贝数为多个。

5.一种菌株，其特征在于，包括如权利要求1所述的聚半乳糖醛酸裂解酶基因。

6.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

7.一种聚半乳糖醛酸裂解酶的制备方法，其特征在于，培养如权利要求5或6所述的菌株，得到聚半乳糖醛酸裂解酶。