CN107892679A - 一种从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法 - Google Patents

一种从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法 Download PDF

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Abstract

一种从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法，包括以下步骤：粉碎蛇葡萄属植物茎叶，水提法提取获得二氢杨梅素粗提物；用无水乙醇‑纯化水重结晶纯化二氢杨梅素粗提物，获得二氢杨梅素纯品。本发明方法，仅需要一步水提法即可获得二氢杨梅素粗提物(75.1％)，而二氢杨梅素粗提物(75.1％)只需经一次重结晶就可纯化得到纯度为98.3％的二氢杨梅素，且纯化得率为60％左右，使得二氢杨梅素工业化生产成为可能。

Description

一种从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法
技术领域
本发明属于天然药物领域，具体涉及一种从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法。
背景技术
蛇葡萄(Amplopsisgrossedentata(HandMazz.)W.T.Wang)系葡萄科蛇葡萄属，主要产于闽、赣、湘、粤、黔、贵等海拔约为200～1000m的山地丘陵，民间茶饮的实践及科研结果显示，蛇葡萄具有抗菌消炎、清热解毒、降糖降脂、解酒保肝等功效，且具有抗癌、抗氧化等活性。蛇葡萄叶中的黄酮含量颇高，其中(2R,3R)-3，5，7-三羟基-2-(3，4，5)-三羟基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮，Dihydromyricetin)二氢杨梅素约占总黄酮含量的80％，基于药用价值较好，具有很高的开发价值。涉及二氢杨梅素的提取、纯化专利有 13项：微波法提取二氢杨梅素及其组合物200410027782.4，一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法CN200510032918.5，一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法CN200510102129.4，二氢杨梅素新制备方法、药物制剂及其用途 CN200910066518.4，一种二氢杨梅素的纯化方法CN201010167579.2，从藤茶中提取二氢杨梅素、藤茶多糖和藤茶多酚的方法CN201010284838.X，一种从藤茶中提取二氢杨梅素的方法CN201010149014.1，从蛇葡萄属植物中同时分离二氢杨梅素和杨梅素的方法CN201110458347.7，藤茶中二氢杨梅素的制备方法CN201110093346.7，一种从藤茶中提取二氢杨梅素和藤茶多糖的方法CN20121022999.1.1，一种从显齿蛇葡萄中提取高含量二氢杨梅素的工艺方法CN201210401620.7，一种快速提取显齿蛇葡萄叶中高纯度二氢杨梅素的方法CN201310536277.1，提高显齿蛇葡萄中二氢杨梅素得率的方法 CN201510528522.3。采用60％乙醇作为溶剂体系，5℃/h的降温速率进行温度梯度结晶，5次重结晶后产品纯度可达98％，结晶产率30.01±1.26％(林淑英.显齿蛇葡萄中二氢杨梅素的提取纯化及抗氧化活性研究[D]博士论文， 2004，P78)。
现有技术采用水提或有机溶剂回流提取的方法，结合重结晶、柱层析等方法进行纯化，步骤繁琐，且粗提物的杂质含量较高(多糖、蛋白质等)，采用柱层析的纯化方法比较费时费力，成本相对较高；另外，产物得率较低，不适合工业化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法，包括以下步骤：
1)、粉碎蛇葡萄属植物茎叶，水提法提取获得二氢杨梅素粗提物；
2)用无水乙醇-纯化水重结晶纯化二氢杨梅素粗提物，获得二氢杨梅素纯品。
优选地，本发明所述的从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法中，所述步骤1)中的水提法提取为使用沸水提取。
优选地，本发明所述的从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法中，所述步骤1)中的沸水提取为两次提取。
优选地，本发明所述的从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法中，所述步骤2)无水乙醇-纯化水重结晶纯化二氢杨梅素粗提物为先将二氢杨梅素粗提物溶于无水乙醇，再经微孔滤膜过滤器过滤，然后再向滤液中加入纯化水。
优选地，本发明所述的从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法中，所述步骤2中无水乙醇与纯化水的体积比例为1:2～1:6。
优选地，本发明所述的从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法中，所述微孔滤膜过滤器为有机系微滤膜过滤器。
优选地，本发明所述的从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法中，所述微孔滤膜过滤器的微滤膜孔径为0.45um。
优选地，本发明所述的从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法中，所述步骤2)中重结晶条件为0～4℃环境中静置10小时。
本发明的另一方面为提供上述方法提取获得的二氢杨梅素纯品。
优选地，本发明所述二氢杨梅素纯品的纯度大于等于93％，产品收率大于55％。
与现有技术相比，本发明方法，仅需要一步水提法即可获得二氢杨梅素粗提物(75.1％)，而二氢杨梅素粗提物(75.1％)只需经一次重结晶就可纯化得到纯度为98.3％的二氢杨梅素，且纯化得率为60％左右，使得二氢杨梅素工业化生产成为可能。
附图说明
图1为用HPLC进行含量检测的色谱图。
具体实施方式
在本发明的一个实施例中，提供了从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法，包括以下步骤：
1)、粗碎蛇葡萄属植物茎叶，水提法提取获得二氢杨梅素粗提物；
2)用无水乙醇-纯化水重结晶纯化二氢杨梅素粗提物，获得二氢杨梅素纯品。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤1)中的水提法提取为使用沸水提取；更优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤1)中的沸水提取为两次提取。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤2)无水乙醇-纯化水重结晶纯化二氢杨梅素粗提物为先将二氢杨梅素粗提物溶于无水乙醇，再经有机微孔滤膜过滤器过滤，然后再向滤液中加入纯化水；
更优选地，所述步骤2)中无水乙醇与纯化水的体积比例为1:2～1:6。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述微孔滤膜过滤器为有机系微滤膜过滤器；更优选地，所述微孔滤膜过滤器的微滤膜孔径为0.45um。
优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤2)中重结晶条件为0～4℃环境中静置10小时。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.显齿蛇葡萄(Ampelopsis-grossedentada(Hand-Mazz)W.T.Wang)中总黄酮的提取
称取干燥粗粉碎(20目～40目)显齿蛇葡萄茎叶样品500g，分两次沸水提取，第一次加水7500mL，加热煮沸30分钟，倾出煎煮液，再加入5000mL 左右水，加热煮沸20分钟，合并提取液，趁热滤布过滤，滤液在0～4℃静置析出白色沉淀，抽滤，45℃真空干燥箱中干燥滤沉淀得总黄酮150g左右(其中，粗提物中二氢杨梅素含量75.1％)。
2、重结晶纯化二氢杨梅素
称取5份上述提取得到的总黄酮各2g，分别溶于20mL无水乙醇中，置于有机微孔滤膜过滤器(孔径0.45um)中抽滤，收集滤液。向滤液中分别加入40mL、60mL、80mL、100mL、120mL纯化水，摇匀。室温静置析出灰白色沉淀，将其收集并于45℃真空干燥箱中进行干燥。平行重复上述实验三次，取平均值。
灰白色沉淀经MS、1HNMR及13CNMR鉴定为二氢杨梅素。即浅白色无定形粉末(甲醇)，mp 239～241℃；UVλMeOHmax:292，208nm；IR(νKBrmax): 3293，1638，1516，1467，1351cm-1；ESI-MS m/z 319[M-H]-，分子式为C15H12O8。 1H-NMR(400MHz，CD3OD)δH:6.61(2H，s，H-2'，6')，5.98(1H，d，J＝2.0 Hz，H-8)，5.88(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，4.95(1H，d，J＝11.6Hz，H-2)， 4.55(1H，d，J＝11.6Hz，H-3)；13C-NMR(100MHz，CD3OD)δC:198.1(C＝ O)，168.2(C-7)，165.2(C-9)，164.3(C-5)，146.8(C-3'，5')，134.8(C-4')， 129.1(C-1')，108.1(C-2'，6')，101.7(C-10)，97.3(C-6)，96.3(C-8)， 85.1(C-2)，73.6(C-3)。以上数据与现有文献[高美华等]报道的(2R，3R)- 二氢杨梅素[(2R，3R)-dihydro-myricitin]的数据相一致，所以鉴定该化合物为(2R，3R)-二氢杨梅素。
用HPLC进行含量检测(色谱图见附图1)，当无水乙醇与纯化水的比例为 1：4时，纯化效果最好，由此方法得到的二氢杨梅素纯度为98.3％。具体结果见下表
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法，包括以下步骤：
1)、粉碎蛇葡萄属植物茎叶，水提法提取获得二氢杨梅素粗提物；
2)用无水乙醇-纯化水重结晶纯化二氢杨梅素粗提物，获得二氢杨梅素纯品。
2.根据权利要求1所述的从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法，其特征在于，所述步骤1)中的水提法提取为使用沸水提取。
3.根据权利要求2所述的从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法，其特征在于，所述步骤1)中的沸水提取为两次提取。
4.根据权利要求1所述的从蛇葡萄属植物中分离纯化高纯度二氢杨梅素的方法，其特征在于，所述步骤2)无水乙醇-纯化水重结晶纯化二氢杨梅素粗提物为先将二氢杨梅素粗提物溶于无水乙醇，再经微孔滤膜过滤器过滤，然后再向滤液中加入纯化水。
5.根据权利要求4所述的分离纯化二氢杨梅素的方法，其特征在于，所述步骤2中无水乙醇与纯化水的体积比例为1:2～1:6。
6.根据权利要求4所述的分离纯化二氢杨梅素的方法，其特征在于，所述微孔滤膜过滤器为有机系微滤膜过滤器。
7.根据权利要求4所述的分离纯化二氢杨梅素的方法，其特征在于，所述微孔滤膜过滤器的微滤膜孔径为0.45um。
8.根据权利要求所述的分离纯化二氢杨梅素的方法，其特征在于，所述步骤2)中重结晶条件为0～4℃环境中静置10小时。
9.一种如权利要求1～8任意一项方法提取获得的二氢杨梅素纯品。
10.根据权利要求9所述的二氢杨梅素纯品，其特征在于，所述二氢杨梅素纯品的纯度大于等于93％。
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