CN107881182A - 一种利用卤醇脱卤酶工程菌制备r‑苯基缩水甘油醚的方法 - Google Patents

一种利用卤醇脱卤酶工程菌制备r‑苯基缩水甘油醚的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用卤醇脱卤酶工程菌制备R‑苯基缩水甘油醚的方法，涉及手性药物中间体R‑苯基缩水甘油醚制备领域。本发明公开的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R‑苯基缩水甘油醚的方法，该方法以含有卤醇脱卤酶基因的工程菌菌体作为催化剂，催化苯基缩水甘油醚底物转化得到R‑苯基缩水甘油醚，其具有良好的对映体选择性和很高的催化活力，生产过程中对环境友好。

Description

一种利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法
技术领域
本发明涉及手性药物中间体R-苯基缩水甘油醚制备领域，具体而言，涉及一种利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法。
背景技术
手性环氧化物是有机合成中非常重要的手性合成砌块，它含有至少一个手性碳原子，通过选择性开环可以合成许多生物活性的重要化合物。光学纯的芳基缩水甘油醚是合成手性氨基醇和β-阻断剂的重要中间体。因此，光学活性环氧化物的合成己成为当今一个研究热点。
卤醇脱卤酶(简称HHDH)，又叫卤代醇环氧酶或卤醇-卤化氢裂解酶，其在有机卤化物的降解过程中发挥着至关重要的作用，该酶可通过微生物代谢获得。HHDH可催化邻卤醇脱卤，得到环氧化物和卤化氢。HHDH还可以在非自然亲核试剂(N3 -、NO2 -等)介导下，使环氧底物的β-碳氧键断裂开环生成手性环氧化物及光学纯的β-取代醇。
然而迄今为止，用卤醇脱卤酶酶促拆分以制备手性环氧化物的报道还很少。这主要是由于野生型整细胞或重组卤醇脱卤酶的活性或对映选择性较低。另一方面，但目前还没文献报道卤醇脱卤酶优先催化(S)-芳基缩水甘油醚水解。因此，寻找高活性和对映选择性的卤醇脱卤酶，开发高效的手性苯基缩水甘油醚的酶法合成工艺具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备R-苯基缩水甘油醚的核酸分子，该核酸分子编码卤醇脱卤酶，转化该核酸分子的重组工程菌可以作为催化剂，催化苯基缩水甘油醚底物，形成R-苯基缩水甘油醚。
本发明的另一目的在于提供含有上述核酸分子的载体。
本发明的另一目的在于提供含有上述载体的重组菌或重组细胞。
本发明的另一目的在于提供上述核酸分子、载体、重组菌或重组细胞在制备R-苯基缩水甘油醚中的应用。
本发明的另一目的在于提供利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，该方法以含有卤醇脱卤酶基因的工程菌菌体作为催化剂，催化苯基缩水甘油醚底物转化得到R-苯基缩水甘油醚。
本发明是这样实现的：
一种用于制备R-苯基缩水甘油醚的核酸分子，其编码卤醇脱卤酶，上述核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
含有上述核酸分子的载体。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述载体为克隆载体或表达载体；优选地，在本发明的一些实施方案中，表达载体为pET28a。
含有上述载体的重组菌或重组细胞。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述重组菌为大肠杆菌；优选地，在本发明的一些实施方案中，上述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
上述核酸分子、上述载体、上述重组菌或重组细胞在制备R-苯基缩水甘油醚中的应用。
一种利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，其包括：
以卤醇脱卤酶工程菌菌体作为催化剂，以苯基缩水甘油醚为底物，以叠氮化钠为亲核试剂，以pH为5.0-8.0的缓冲液为反应介质，在20-40℃温度条件下进行转化反应，获得含R-苯基缩水甘油醚的混合液；
将上述混合液分离纯化，获得R-苯基缩水甘油醚；
其中，上述卤醇脱卤酶工程菌含有可表达卤醇脱卤酶基因的载体，上述卤醇脱卤酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，在发明的一些实施方案中，底物在反应体系中的浓度为10-100mmol/L。
优选地，在发明的一些实施方案中，底物在反应体系中的浓度为20mmol/L。
进一步地，在发明的一些实施方案中，卤醇脱卤酶工程菌菌体在反应体系中的浓度为5-40g/L。
优选地，在发明的一些实施方案中，卤醇脱卤酶工程菌菌体在反应体系中的浓度为10g/L。
进一步地，在发明的一些实施方案中，上述缓冲液为Tris-SO4缓冲液，pH为7.4-7.6。
优选地，在发明的一些实施方案中，上述缓冲液为Tris-SO4缓冲液，pH为7.5。
优选地，在发明的一些实施方案中，转化反应的温度为30℃。
进一步地，在发明的一些实施方案中，上述卤醇脱卤酶工程菌通过如下方法制备：
将含上述卤醇脱卤酶基因的工程菌接种至含终浓度40-60mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，36-38℃，180-200rpm培养8-10h，获得种子培养液；
将种子培养液以体积浓度2％的接种量接种至含终浓度40-60mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，36-38℃、180-200rpm培养至培养液的OD600为0.6-0.8，向培养液中加入终浓度为0.1-0.2mM的IPTG，27-29℃、180-200rpm诱导培养9-11h，将培养液离心，沉淀用Tris-SO4润洗，获得作为催化剂的卤醇脱卤酶工程菌菌体。
进一步地，在发明的一些实施方案中，LB液体培养基包括：8-12g/L蛋白胨，4.5-5.5g/L酵母提取物，9-11g/L氯化钠，pH值为6.8-7.2。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的用于制备R-苯基缩水甘油醚的核酸分子，其编码卤醇脱卤酶，碱基序列如SEQ ID NO.2所示；转化该核酸分子的重组工程菌可以作为催化剂，催化苯基缩水甘油醚底物，形成R-苯基缩水甘油醚；
本发明提供的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，该方法以含有卤醇脱卤酶基因的工程菌菌体作为催化剂，催化苯基缩水甘油醚底物转化得到R-苯基缩水甘油醚，其具有良好的对映体选择性和很高的催化活力，生产过程中对环境友好。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
以下实施例所用主要实验材料来源为：
大肠杆菌宿主菌株E.coli BL21(DE3)购自Invitrogen公司，表达载体pET-28a(+)购自Novagen公司，限制性内切酶Nco I和Xho I购自Fermentas公司，T4DNA连接酶和卡那霉素均购自大连宝生生物有限公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)为Promega公司产品。DNAMarker和染色剂Gold View购自TakaRa公司；Axygen DNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒购自爱思进生物技术有限公司。
实施例1
卤醇脱卤酶基因的合成
通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成SEQ ID NO.2所示的卤醇脱卤酶基因序列HHDHAb，该基因编码的卤醇脱卤酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
实施例2
卤醇脱卤酶基因表达载体及其重组转化子的构建
合成的卤醇脱卤酶基因与pET28a都分别用NcoI和Xho I进行双酶切，大约酶切5h后，回收酶切产物，利用T4连接酶在16℃下连接16h，得到重组表达质粒pET28a-HHDHAb。
将表达载体pET28a-HHDHAb转化至E.coli BL21(DE3)受体菌，涂布于含卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜后，平板上长出菌落。
随机挑取单克隆，培养后提取质粒进行测序，测序结果表明得到阳性克隆E.coliBL21(DE3)/pET28b-HHDHAb。
实施例3
卤醇脱卤酶的表达
将实施例2中得到的重组转化子E.coli BL21(DE3)/pET28a-HHDHAb接种到LB液体培养基中，37℃，150rpm培养10-12h；
然后按体积浓度2％的接种量接种至含有卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB液体培养基进行扩大培养，37℃，150rpm培养至培养液的OD600为0.6-0.8之间，加入IPTG至终浓度为0.1mM，28℃，180rpm诱导培养10h，培养液离心收集菌体，用生理盐水清洗2次得到湿菌体。
实施例4
卤醇脱卤酶的活力验证
对实施例3中得到的湿菌体进行静息细胞催化反应，以验证卤醇脱卤酶对于苯基缩水甘油醚的活力。
实验方法：称取0.4g湿菌体(终浓度40g/L)悬浮于10ml Tris-SO4缓冲液体系中(pH＝7.5，100mM)，加入13.5μl苯基缩水甘油醚甲醇(底物终浓度10mM)，20mM NaN3，35℃恒温水浴反应2min。
反应完成后，取1ml反应液，加入2ml乙酸乙酯，震荡后静置10min，取出1毫升乙酸乙酯，用0.22um的有机膜过滤后，萃取液中加入无水硫酸钠干燥。
样品用高效液相色谱(C18柱)进行分析。高效液相色谱的分析条件为：流动相为甲醇：水＝75：25，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长270nm。一个酶活力单位定义为分析条件下，每分钟催化1μmol苯基缩水甘油醚水解所需的酶量。
表1以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHAb为酶源测定的卤醇脱卤酶不对称拆分活力验证结果
菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells))
大肠杆菌BL21 0
大肠杆菌BL21/pET28a 0
大肠杆菌BL21/pET28a-HHDHAb未诱导 0
大肠杆菌BL21/pET28a-HHDHAb诱导 426
表1看出，经诱导表达后的大肠杆菌BL21/pET28a-HHDHAb具有酶活。
实施例5
本实施例提供的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，如下：
称取0.15g实施例3中得到的湿菌体悬浮于10ml含20mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH＝7.5，100mM)，加入27μl的苯基缩水甘油醚甲醇溶液(底物终浓度为20mM)，30℃恒温水浴反应2min。
反应完成后，取1ml反应液，加入2ml乙酸乙酯，震荡后静置10min，取出1毫升乙酸乙酯，用0.22um的有机膜过滤后，萃取液中加入无水硫酸钠干燥。
样品用高效液相色谱(OD-H柱)进行分析。高效液相色谱的分析条件为：手性柱Chiralcel OD-H(0.46cm×25cm)，流动相为：正己烷和异丙醇(体积比80:20)，检测波长为：220nm，流速为0.8mL/min。结果：卤醇脱卤酶HHDHAb优先水解S-苯基缩水甘油醚，剩余R-苯基缩水甘油醚的ee值为99.3％，收率为25.6％。
实施例6
本实施例提供的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，如下：
称取0.35g实施例3中得到的湿菌体悬浮于10ml含100mM NaN3的Tris-SO4缓冲液体系中(pH＝7.5，100mM)，加入81μl的苯基缩水甘油醚(底物终浓度60mM)，30℃恒温水浴反应12min。
反应完成后，取1ml反应液，加入2ml乙酸乙酯，震荡后静置10min，取出1毫升乙酸乙酯，用0.22um的有机膜过滤后，萃取液中加入无水硫酸钠干燥。
样品用高效液相色谱(OD-H柱)进行分析。高效液相色谱的分析条件为：手性柱Chiralcel OD-H(0.46cm×25cm)，流动相为：正己烷和异丙醇(体积比80:20)，检测波长为：220nm，流速为0.8mL/min。结果：R-苯基缩水甘油醚的ee值为99.1％，收率为24.7％。
实施例7
本实施例提供的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，如下：
称取0.2g实施例3中得到的湿菌体悬浮于10ml含20mM NaNO2的Tris-SO4缓冲液体系中(pH＝7.5，100mM)，加入27μl的苯基缩水甘油醚(20mM，溶解于甲醇)，30℃恒温水浴反应2min。
反应完成后，取1ml反应液，加入2ml乙酸乙酯，震荡后静置10min，取出1毫升乙酸乙酯，用0.22um的有机膜过滤后，萃取液中加入无水硫酸钠干燥。
样品用高效液相色谱(OD-H柱)进行分析。高效液相色谱的分析条件为：手性柱Chiralcel OD-H(0.46cm×25cm)，流动相为：正己烷和异丙醇(体积比80:20)，检测波长为：220nm，流速为0.8mL/min。结果：在亚硝酸钠作为亲核试剂时，卤醇脱卤酶HHDHAb优先水解R-苯基缩水甘油醚，最终剩余的S-苯基缩水甘油醚的ee值为98.2％，收率为24.0％。
对比例1
本对比例的提供的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，与实施例5基本相同，不同的是湿菌体的用量为：0.5g，在反应体系中的浓度为50g/L。
检测方法同实施例5。
结果：反应0.8min，R-苯基缩水甘油醚的ee值达到最高为98.4％，收率为21.1％。
对比例2
本对比例的提供的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，与实施例5基本相同，不同的是湿菌体的用量为：0.03g。在反应体系中的浓度为3g/L。
检测方法同实施例5。
结果：反应10min，R-苯基缩水甘油醚的ee值最高为90.2％，收率为20.3％。
对比例3
本对比例的提供的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，与实施例5基本相同，不同的是底物苯基缩水甘油醚在反应体系中的浓度为150mM。
检测方法同实施例5。
结果：反应75min,R-苯基缩水甘油醚的ee值最高为61.4％，收率为22.5％。
对比例4
本对比例的提供的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，与实施例5基本相同，不同的是底物苯基缩水甘油醚在反应体系中的浓度为5mM。
检测方法同实施例5。
结果：反应30s，R-苯基缩水甘油醚的ee值最高为98.3％，收率为19.4％。
对比例5
本对比例的提供的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，与实施例5基本相同，不同的是：湿菌体反应体系中的浓度为4g/L，底物苯基缩水甘油醚在反应体系中的浓度为120mM。
检测方法同实施例5。
结果：反应100min，R-苯基缩水甘油醚的ee值最高为48.3％，收率为34.6％。
综上，本发明实施例提供的利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，该方法以含有卤醇脱卤酶基因的工程菌菌体作为催化剂，催化苯基缩水甘油醚底物转化得到R-苯基缩水甘油醚，其具有良好的对映体选择性和很高的催化活力，生产过程中对环境友好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 盐城工学院
<120> 一种利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Leu Lys Asn Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Ala Thr His Phe Val
1 5 10 15
Gly Lys Pro Gly Ala Ser Val Leu Ile Arg Glu Gly Ala Thr Val Phe
20 25 30
Ala Gln Asp Ala Ser Phe Val Asp Glu Asn Ala Arg Leu Ala Phe Ser
35 40 45
Glu Leu Val Pro Gly Val Thr Pro Leu Ala Glu Gln Asp Pro Glu Glu
50 55 60
Val Leu Lys Ala Val Leu Ala Ile Ala Gly His Leu Asp Val Leu Val
65 70 75 80
Asn Asn Asp Ala Tyr Pro Ala Ile Arg Ala Ser Ile Asp Glu Ala Asp
85 90 95
Ile Glu Asp Phe Arg Asn Thr Leu Asp Ala Leu Leu Val Arg Gly Phe
100 105 110
Thr Tyr Ala Lys Tyr Val Ala Ala His Met Lys Lys Arg Gly Ser Gly
115 120 125
Lys Ile Ile Phe Ile Ser Ser Ala Val Pro Lys His Gly Leu Pro Asn
130 135 140
Tyr Ser Met Tyr Val Ala Ala Arg Gly Gly Ala Asn Ala Leu Ala Val
145 150 155 160
Thr Leu Ala Lys Glu Leu Gly Lys Ser Gly Ile Gln Val Asn Ser Leu
165 170 175
Ala Pro Asn Phe Ile Glu Ser Pro Thr Tyr Phe Pro Lys Glu Leu Leu
180 185 190
Glu Asn Glu Glu Thr Leu Lys Lys Ile Thr Lys Pro Ile Pro Leu Gly
195 200 205
Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Leu Ala Phe Leu Ser
210 215 220
Ser Asp Lys Ser Asp Tyr Ile Thr Gly Gln Val Leu Tyr Phe Ala Gly
225 230 235 240
Gly Trp Ala
<210> 2
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgctgaaaa acaaaaacat cctgatcacc gacgctaccc acttcgttgg taaaccgggt 60
gcttctgttc tgatccgtga aggtgctacc gttttcgctc aggacgcttc tttcgttgac 120
gaaaacgctc gtctggcttt ctctgaactg gttccgggtg ttaccccgct ggctgaacag 180
gacccggaag aagttctgaa agctgttctg gctatcgctg gtcacctgga cgttctggtt 240
aacaacgacg cttacccggc tatccgtgct tctatcgacg aagctgacat cgaagacttc 300
cgtaacaccc tggacgctct gctggttcgt ggtttcacct acgctaaata cgttgctgct 360
cacatgaaaa aacgtggttc tggtaaaatc atcttcatct cttctgctgt tccgaaacac 420
ggtctgccga actactctat gtacgttgct gctcgtggtg gtgctaacgc tctggctgtt 480
accctggcta aagaactggg taaatctggt atccaggtta actctctggc tccgaacttc 540
atcgaatctc cgacctactt cccgaaagaa ctgctggaaa acgaagaaac cctgaaaaaa 600
atcaccaaac cgatcccgct gggtcgtctg ggtaaaccgg aagaagctgg tgaatacctg 660
gctttcctgt cttctgacaa atctgactac atcaccggtc aggttctgta cttcgctggt 720
ggttgggctt aa 732

Claims (10)

1.一种用于制备R-苯基缩水甘油醚的核酸分子，其特征在于，其编码卤醇脱卤酶，所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
2.含有权利要求1所述的核酸分子的载体。
3.含有权利要求2所述的载体的重组菌或重组细胞。
4.权利要求1所述的核酸分子、权利要求2所述的载体、权利要求3所述的重组菌或重组细胞在制备R-苯基缩水甘油醚中的应用。
5.一种利用卤醇脱卤酶工程菌制备R-苯基缩水甘油醚的方法，其特征在于，其包括：
以卤醇脱卤酶工程菌菌体作为催化剂，以苯基缩水甘油醚为底物，以叠氮化钠为亲核试剂，以pH为5.0-8.0的缓冲液为反应介质，在20-40℃温度条件下进行转化反应，获得含R-苯基缩水甘油醚的混合液；
将所述混合液分离纯化，获得R-苯基缩水甘油醚；
其中，所述卤醇脱卤酶工程菌含有可表达卤醇脱卤酶基因的载体，所述卤醇脱卤酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5任一项所述的方法，其特征在于，所述底物在反应体系中的浓度为10-100mmol/L。
7.根据权利要求5-6任一项所述的方法，其特征在于，所述卤醇脱卤酶工程菌在反应体系中的浓度为5-40g/L。
8.根据权利要求5-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-SO4缓冲液，pH为7.4-7.6。
9.根据权利要求5-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述卤醇脱卤酶工程菌通过如下方法制备：
将含所述卤醇脱卤酶基因的工程菌接种至含终浓度48-52mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，36-38℃，180-200rpm培养8-10h，获得种子培养液；
将种子培养液以体积浓度2％的接种量接种至含终浓度40-60mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，36-38℃、180-200rpm培养至培养液的OD600为0.6-0.8，向培养液中加入终浓度为0.1-0.2mM的IPTG，27-29℃、180-200rpm诱导培养9-11h，将培养液离心，沉淀用Tris-SO4润洗，获得作为催化剂的卤醇脱卤酶工程菌菌体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，LB液体培养基包括：8-12g/L蛋白胨，4.5-5.5g/L酵母提取物，9-11g/L氯化钠，pH值为6.8-7.2。
CN201711170007.8A 2017-11-21 2017-11-21 一种利用卤醇脱卤酶工程菌制备r-苯基缩水甘油醚的方法 Active CN107881182B (zh)

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