CN107864858A - 利用茶叶愈伤组织悬浮培养提取制备花青素的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用茶叶愈伤组织悬浮培养提取制备花青素的方法，该方法取生长旺盛的茶树新梢上第3片展开叶，灭菌后切成小块，于愈伤组织培养基中培养，每2周更换一次愈伤组织培养基，待培养出现红色愈伤组织并长大时切碎，转入悬浮培养基中振动培养，再转入诱导培养基中震荡培养，收集悬浮培养细胞，干燥粉碎，然后用盐酸乙醇溶液超声提取，最后真空浓缩直至溶剂全部挥干，得到花青素产品。本发明首次建立了富含花青素的茶叶愈伤组织诱导方法、悬浮组织培养方法及从茶叶悬浮培养细胞中花青素的提取方法；获得了花青素含量＞6％以上的生物组织，远远高于目前报道的任何材料。

Description

利用茶叶愈伤组织悬浮培养提取制备花青素的方法
技术领域
本发明涉及花青素的提取制备方法，具体涉及一种利用茶叶愈伤组织悬浮培养以提取制备花青素的方法。
背景技术
花青素(Anthocyanin)，又称花色苷，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属类黄酮化合物。花青素在人体内有较好的生物利用度，对结缔组织亲和力强，在酸性环境下稳定，半衰期长，可达功效持久。花青素是一种强有力的抗氧化剂，能够保护人体免受一种叫做自由基的有害物质的损伤，能改善循环系统和增进皮肤的光滑度；有助于预防多种与自由基有关的疾病，包括癌症、心脏病，增强动脉、静脉和毛细血管弹性；缓解花粉病和其它过敏症；作为保护脑细胞的一道屏障，防止淀粉样β蛋白的形成、谷氨酸盐的毒性和自由基的攻击，从而预防阿尔茨海默氏病；可以促进视网膜细胞中的视紫质再生，预防近视、增进视力等。花青素是迄今为止所发现的最有效的天然水溶性自由基清除剂，其淬灭自由基的能力是的维生素C的20倍、维生素E的50倍，其体内活性更是其他抗氧化剂无法比拟的。花青素作为保健品、饮料的主要原料，市场潜力巨大。近年来花青素的全球销售额每年超过1亿美金，市场份额基本保持在3％以上增长，市场的容量还在进一步扩大。随着我们国家人们生活水平的提高及对合成添加剂毒副作用认知的加深，天然、绿色的生活理念深入人心，国内市场对天然色素及食品添加剂产品需求强劲。花青素在国内主要应用于保健品、化妆品、饮料、糕点等，市场潜力巨大，特别是保健品和功能性饮料市场日趋增大。据分析2015年中国居民保健食品的消费额已达5000多亿元，而且正以15％～30％的速度增长，远高于发达国家的12％。预计到2017年，市场规模将达到约9000亿元。
花青素类色素广泛存在于所有深红色、紫色或蓝色的蔬菜水果，比如紫甘薯、欧洲越橘、黑果腺肋花楸、黑加仑、蓝莓、黑(红)米、接骨木、蔓越橘、蓝靛果、桑葚、黑豆等植物的组织中。
目前花青素的生产主要是从紫甘薯、越橘、黑加仑、蓝靛果、桑椹、黑米、接骨木、黑果腺肋花楸等植物中提取，但是这些植物中的花青素含量较低，导致生产成本高，且产品中花青素含量很难满足进一步利用的需要。随着现代生物技术的发展，采用悬浮培养等生物技术手段来生产花青素成为一种新的趋势。目前已有玫瑰茄细胞悬浮培养生产花青素和葡萄细胞悬浮培养生产花青素等。杜金华等人采用玫瑰茄愈伤组织悬浮培养诱导花青素。杜金华等人研究表明，只要培养条件适宜，玫瑰茄愈伤组织就能表达其亲本植物所具有的性状——生产花青素。内含1mg/L 2,4-D、0.2mg/L KT、pH5.8的B5培养基最适宜玫瑰茄愈伤组织生长及积累花青素。玫瑰茄愈伤组织的着色与非着色细胞中均有色素小体存在，花青素可能在细胞内特定的细胞器(花青素小体，其在细胞中呈现桔黄、桔红、粉红、红、紫红等色)中生产、积累，然后释放到液泡中去。筛选是获得高产花青素玫瑰茄愈伤组织的有效途径，小细胞团法可以在较短的时间内选出高产愈伤组织。虽然悬浮培养技术在几种植物中得到了应用，并在一定程度上提高了花青素生产的效率，但是尚未能满足市场需求。
综上所述，花青素的市场前景非常广阔，然而目前花青素的生产成本过高，阻碍了花青素产品的进一步开发。
发明内容
本发明的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种利用茶叶愈伤组织悬浮培养提取制备花青素的方法，该新的花青素制备方法显著提高了花青素的制备效率，降低了花青素的生产成本。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种利用茶叶愈伤组织悬浮培养提取制备花青素的方法，结合参见图1，该方法包括如下步骤：
A、选生长旺盛的茶树，取新梢上第3片展开叶，灭菌后切成小块；
B、将切得的小块叶片转入愈伤组织培养基中培养，每2周更换一次愈伤组织培养基(即每2周转入新的同样成分的愈伤组织培养基中进行继代培养)；其中，愈伤组织培养基的组成为：2.2g/L MS盐+0.05-0.2mg/L TDZ(噻苯隆)+0.05-0.10mg/L IBA(吲哚丁酸)+0.10-0.20mg/L GA3(赤霉素)+20.0g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，培养条件为：21℃，10小时光照、14小时黑暗，光照强度1200lux，相对湿度70-85％；
C、待培养出现红色愈伤组织并长到体积为0.8-1.2立方厘米时，将其切碎成边长为0.08-0.12毫米的小方块，按愈伤组织：悬浮培养基为1：100的体积比，将愈伤组织转入悬浮培养基中振动培养4周；其中，悬浮培养基的组成为：4.4g/L MS盐+0.05-0.2mg/L TDZ+0.05-0.10mg/L IBA+0.10-0.20mg/L GA3(赤霉素)+25.0g/L蔗糖，培养条件为：29℃，16小时光照、8小时黑暗，光照强度3000lux，相对湿度为70-85％，振动速度100-110rpm/min；
D、悬浮培养后，转入诱导培养基中震荡培养1周；其中，诱导培养基的组成为：1.1g/L MS盐+0.12mg/L噻苯隆+0.08mg/L吲哚丁酸+15.0g/L蔗糖+0.8-1.2g/L二氢杨梅素；培养条件为：20℃，12小时光照、12小时黑暗，光照强度4000lux，相对湿度70-85％，振动速度90-100rpm/min。
E、诱导培养后收集悬浮培养细胞，干燥后粉碎至100mu，然后于悬浮培养细胞中加入0.7-1.5％体积浓度的盐酸乙醇溶液于55-65℃超声提取2-3次，每次提取条件为：超声功率200-300w，时间30-50min，每1g悬浮培养细胞加20-50ml盐酸乙醇溶液；合并提取液，真空浓缩直至溶剂全部挥干，得到花青素产品。
上述提及的茶树品种为尖波黄、碧香早或福鼎大白。
上述步骤A中的灭菌是指将茶叶以1％体积浓度的次氯酸钠水溶液浸泡18-20min，取出，用灭菌水冲洗干净后用无菌风吹干，无菌条件下将叶片切成小块(小块面积以0.8-1.2平方厘米为宜)。
上述提及的MS盐为市购产品。
本发明的优点是：①首次建立了富含花青素的茶叶愈伤组织诱导方法；②首次建立了富含花青素的茶叶悬浮组织培养方法；③首次建立了茶叶悬浮培养细胞中花青素的提取方法；④获得了花青素含量＞6％以上的生物组织，远远高于目前报道的任何材料。
附图说明
图1是“尖波黄”茶叶愈伤组织悬浮培养制备花青素图。
其中：A-愈伤组织培养；B-悬浮培养液；C-悬浮培养物；D-花青素提取液；E-定性分析时提取液随pH值的改变颜色发生变化，从左到右pH值分别为4、7、10、13，提取液的颜色由浅变深，即红色、深红色、紫色、紫黑色。
具体实施方式
下面，本发明将以实施例进行进一步地说明，但是本发明并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1
选生长旺盛的“尖波黄”茶树，在同一棵茶树上取每个新梢上第3片展开叶共5片，用1％体积浓度的次氯酸钠水溶液浸泡18min后取出，用灭菌水冲洗干净次氯酸钠溶液，无菌风吹干，无菌条件下将叶片切成面积为0.8-1.2平方厘米的小块；将小块叶片转入愈伤组织培养基(2.2g/L MS盐+0.05mg/L TDZ+0.05mg/L IBA+0.10mg/L GA3+20.0g/L蔗糖+6g/L琼脂粉)中培养，每个培养皿放10个小块茶叶，共培养10个培养皿，培养条件为：21℃，10小时光照、14小时黑暗，光照强度1200lux，相对湿度70％，每2周转入新的同样成分的愈伤组织培养基继代培养；第四周开始出现红色愈伤组织，待红色愈伤组织长到体积为0.8-1.2立方厘米时，将其切碎成边长为0.08-0.12毫米的小方块，取10mL愈伤组织，转入1L悬浮培养基(4.4g/L MS盐+0.05mg/L TDZ+0.05mg/L IBA+0.10mg/L GA3+25.0g/L蔗糖)中振动培养，培养条件为：29℃，16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000lux，相对湿度70％，振动速度为110rpm/min；悬浮培养四周后，转入诱导培养基(1.1g/L MS盐+0.12mg/L TDZ+0.08mg/LIBA+15.0g/L蔗糖+0.8g/L二氢杨梅素)中震荡培养，培养条件为：20℃，12小时光照，12小时黑暗，光照强度4000lux，相对湿度70％，振动速度90rpm/min。诱导培养1周后，收集悬浮培养组织，干燥后获得7.55g干燥悬浮培养组织，粉碎至100mu，然后于干燥悬浮培养组织中加入0.7％体积浓度的盐酸乙醇溶液超声进行提取，提取条件为：超声功率200w，温度55℃，时间30min，每1g干燥悬浮培养组织加20ml盐酸乙醇溶液，提取次数2次。合并提取液，45℃真空浓缩，得到0.86g产品。花青素的制备过程结合参见图1，产品中花青素的检测方法为：准确称取0.02g干燥样品，加入2mL 1％体积浓度的酸性乙醇溶液，70℃加热溶解，于2500r/min离心5min，取上清液，在535nm波长测定吸光度，1％体积浓度的酸性乙醇做空白对照。以矢车菊素为标准品制作标准曲线，根据标准曲线计算样品中总花青素含量。检测结果显示产品中总花青素含量为67％，干燥的悬浮培养组织中花青素含量为7.6％。
实施例2
选生长旺盛的“尖波黄”茶树，在同一棵茶树上取每个新梢上第3片展开叶共5片，用1％体积浓度的次氯酸钠水溶液浸泡20min后取出，用灭菌水冲洗干净次氯酸钠溶液，无菌风吹干，无菌条件下将叶片切成面积为0.8-1.2平方厘米的小块；将小块叶片转入愈伤组织培养基(2.2g/L MS盐+0.2mg/L TDZ+0.10mg/L IBA+0.20mg/L GA3+20.0g/L蔗糖+6g/L琼脂粉)中培养，每个培养皿放10个小块茶叶，共培养10个培养皿，培养条件为：21℃，10小时光照、14小时黑暗，光照强度1200lux，相对湿度85％，每2周转入新的同样成分的愈伤组织培养基进行继代培养；第四周开始出现红色愈伤组织，待红色愈伤组织长到体积为0.8-1.2立方厘米时，将其切碎成边长为0.08-0.12毫米的小方块，取100mL愈伤组织，转入10L悬浮培养基(4.4g/L MS盐+0.2mg/L TDZ+0.10mg/L IBA+0.20mg/L GA3+25.0g/L蔗糖)中振动培养，培养条件为：29℃，16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000lux，相对湿度85％，振动速度100rpm/min；悬浮培养四周后，转入诱导培养基(1.1g/L MS盐+0.12mg/L TDZ+0.08mg/LIBA+15.0g/L蔗糖+1.2g/L二氢杨梅素)中震荡培养，培养条件为：20℃，12小时光照，12小时黑暗，光照强度4000lux，相对湿度85％，振动速度100rpm/min。诱导培养1周后，收集悬浮培养组织，干燥后获得70.19干燥的悬浮培养组织，粉碎至100mu，然后于干燥悬浮培养组织中加入1.5％体积浓度的盐酸乙醇溶液超声进行提取，提取条件为：超声功率300w，温度65℃，时间50min，每1g干燥悬浮培养组织加50ml盐酸乙醇溶液，提取次数2次。合并提取液，45℃真空浓缩，得到产品9.43g。采用与实施例1相同的方法检测花青素的含量，产品中花青素含量为59％，干燥的悬浮细胞组织花青素含量为7.93％。
实施例3
选生长旺盛的“尖波黄”茶树，在同一棵茶树上取每个新梢上第3片展开叶共5片，用1％体积浓度的次氯酸钠水溶液浸泡19min后取出，用灭菌水冲洗干净次氯酸钠溶液，无菌风吹干，无菌条件下将叶片切成面积为0.8-1.2平方厘米的小块；将小块叶片转入愈伤组织培养基(2.2g/L MS盐+0.15mg/L TDZ+0.08mg/L IBA+0.15mg/L GA3+20.0g/L蔗糖+6g/L琼脂粉)中培养，每个培养皿放10个小块茶叶，共培养10个培养皿，培养条件为：21℃，10小时光照，14小时黑暗，光照强度1200lux，相对湿度80％，每2周转入新的同样成分的愈伤组织培养基进行继代培养；第四周开始出现红色愈伤组织，待红色愈伤组织长到体积为0.8-1.2立方厘米时，将其切碎成边长为0.08-0.12毫米的小方块，取100mL愈伤组织，转入10L悬浮培养基(4.4g/L MS盐+0.1mg/L TDZ+0.08mg/L IBA+0.15mg/L GA3+25.0g/L蔗糖)中振动培养，培养条件为：29℃，16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000lux，相对湿度80％，振动速度105rpm/min；悬浮培养4周后，转入诱导培养基(1.1g/L MS盐+0.12mg/L TDZ+0.08mg/LIBA+15.0g/L蔗糖+1g/L二氢杨梅素)中震荡培养，培养条件为：20℃，12小时光照，12小时黑暗，光照强度4000lux，相对湿度80％，振动速度95rpm/min。诱导培养1周后，收集悬浮培养组织，干燥后得到76.21g干燥的悬浮细胞组织，粉碎至100mu，然后于干燥悬浮培养组织中加入1％体积浓度的盐酸乙醇溶液超声进行提取，提取条件为：超声功率250w，温度60℃，时间45min，每1g干燥悬浮培养组织加40ml盐酸乙醇溶液，提取次数3次。合并提取溶液，45℃真空浓缩，得到10.08g产品。采用与实施例1相同的方法检测花青素的含量，产品中花青素含量为61％，干燥的悬浮细胞组织花青素含量为8.07％。
实施例4
选生长旺盛的“碧香早”茶树，在同一棵茶树上取每个新梢上第3片展开叶共5片，用1％体积浓度的次氯酸钠水溶液浸泡18min后取出，用灭菌水冲洗干净次氯酸钠溶液，无菌风吹干，无菌条件下将叶片切成面积为0.8-1.2平方厘米的小块；将小块叶片转入愈伤组织培养基(2.2g/L MS盐+0.05mg/L TDZ+0.05mg/L IBA+0.10mg/L GA3+20.0g/L蔗糖+6g/L琼脂粉)中培养，每个培养皿放10个小块茶叶，共培养10个培养皿，培养条件为：21℃，10小时光照，14小时黑暗，光照强度1200lux，相对湿度85％，每2周转入新的同样成分的愈伤组织培养基中继代培养；第四周开始出现红色愈伤组织，待红色愈伤组织长到体积为0.8-1.2立方厘米时，将其切碎成边长为0.08-0.12毫米的小方块，取100mL愈伤组织，转入10L悬浮培养基(4.4g/L MS盐+0.05mg/L TDZ+0.05mg/L IBA+0.10mg/L GA3+25.0g/L蔗糖)中振动培养，培养条件为：29℃，16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000lux，相对湿度70％，振动速度100rpm/min；悬浮培养4周后，转入诱导培养基(1.1g/L MS盐+0.12mg/L TDZ+0.08mg/LIBA+15.0g/L蔗糖+1g/L二氢杨梅素)中震荡培养，培养条件为：20℃，12小时光照，12小时黑暗，光照强度4000lux，相对湿度70％，振动速度90rpm/min。诱导培养1周后，收集悬浮培养组织，干燥后得到56.82g干燥的悬浮细胞组织，粉碎至100mu，然后于干燥悬浮培养组织中加入0.7％体积浓度的盐酸乙醇溶液超声进行提取，提取条件为：超声功率200w，温度55℃，时间30min，每1g干燥悬浮培养组织加40ml盐酸乙醇溶液，提取次数3次。合并提取液，45℃真空浓缩，得到产品7.29g。采用与实施例1相同的方法检测花青素的含量，产品中花青素含量为47％，干燥的悬浮细胞组织花青素含量为6.03％。
实施例5
选生长旺盛的“碧香早”茶树，在同一棵茶树上取每个新梢上第3片展开叶共5片，用1％体积浓度的次氯酸钠水溶液浸泡20min后取出，用灭菌水冲洗干净次氯酸钠溶液，无菌风吹干，无菌条件下将叶片切成面积为0.8-1.2平方厘米的小块；将小块叶片转入愈伤组织培养基(2.2g/L MS盐+0.2mg/L TDZ+0.10mg/L IBA+0.20mg/L GA3+20.0g/L蔗糖+6g/L琼脂粉)中培养，每个培养皿放10个小块茶叶，共培养10个培养皿，培养条件为：21℃，10小时光照，14小时黑暗，光照强度1200lux，相对湿度70％，每2周转入新的同样成分的愈伤组织培养基中继代培养；第四周开始出现红色愈伤组织，待红色愈伤组织长到体积0.8-1.2立方厘米时，将其切碎成边长约0.08-0.12毫米的小方块，取100mL愈伤组织，转入10L悬浮培养基(4.4g/L MS盐+0.15mg/L TDZ+0.06mg/L IBA+0.18mg/L GA3+25.0g/L蔗糖)中振动培养，培养条件为：29℃，16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000lux，相对湿度75％，振动速度108rpm/min；悬浮培养四周后，转入诱导培养基(1.1g/L MS盐+0.12mg/L TDZ+0.08mg/LIBA+15.0g/L蔗糖+0.9g/L二氢杨梅素)中震荡培养，培养条件为：20℃，12小时光照，12小时黑暗，光照强度4000lux，相对湿度72％，振动速度为95rpm/min；诱导培养一周后，收集悬浮培养组织，干燥后得到60.19g干燥的悬浮细胞组织，粉碎至100mu，然后于干燥悬浮培养组织中加入0.9％体积浓度的盐酸乙醇溶液超声进行提取，提取条件为：超声功率230w，温度58℃，时间40min，每1g干燥悬浮培养组织加30ml盐酸乙醇溶液，提取次数3次。合并提取溶液，45℃真空浓缩，得到产品8.18g。采用与实施例1相同方法检测花青素的含量，产品中花青素含量为61％，干燥的悬浮细胞组织花青素含量为6.25％。
实施例6
选生长旺盛的“福鼎大白”茶树，在同一棵茶树上取每个新梢上第3片展开叶共5片，用1％体积浓度的次氯酸钠水溶液浸泡18min后取出，用灭菌水冲洗干净次氯酸钠溶液，无菌风吹干，无菌条件下将叶片切成面积为0.8-1.2平方厘米的小块；将小块叶片转入愈伤组织培养基(2.2g/L MS盐+0.12mg/L TDZ+0.06mg/L IBA+0.12mg/L GA3+20.0g/L蔗糖+6g/L琼脂粉)中培养，每个培养皿放10个小块茶叶，共培养10个培养皿，培养条件为：21℃，10小时光照，14小时黑暗，光照强度1200lux，相对湿度82％，每2周转入新的同样成分的愈伤组织培养基中进行培养；第四周开始出现红色愈伤组织，待红色愈伤组织长到体积为0.8-1.2立方厘米时，将其切碎成边长为0.08-0.12毫米的小方块，取100mL愈伤组织，转入10L悬浮培养基(4.4g/L MS盐+0.1mg/L TDZ+0.08mg/L IBA+0.15mg/L GA3+25.0g/L蔗糖)中振动培养，培养条件为：29℃，16小时光照，8小时黑暗，光照强度3000lux，相对湿度80％，振动速度为105rpm/min；悬浮培养四周后，转入诱导培养基(1.1g/L MS盐+0.12mg/L TDZ+0.08mg/LIBA+15.0g/L蔗糖+1.1g/L二氢杨梅素)中震荡培养，培养条件为：20℃，12小时光照，12小时黑暗，光照强度4000lux，相对湿度82％，振动速度108rpm/min。诱导培养一周后，收集悬浮培养组织，干燥后得到55.37g干燥的悬浮细胞组织，粉碎至100mu，然后于干燥悬浮培养组织中加入1.2％体积浓度的盐酸乙醇溶液超声进行提取，提取条件为：超声功率280w，温度63℃，时间42min，每1g干燥悬浮培养组织加45ml盐酸乙醇溶液，提取次数3次。合并提取溶液，45℃真空浓缩，得到产品3.36g。采用与实施例1相同的方法检测花青素的含量，产品中花青素含量为66％，干燥的悬浮细胞组织花青素含量为6.07％。

Claims (3)

1.一种利用茶叶愈伤组织悬浮培养提取制备花青素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
A、选生长旺盛的茶树，取新梢上第3片展开叶，灭菌后切成小块；
B、将切得的小块叶片转入愈伤组织培养基中培养，每2周更换一次愈伤组织培养基；其中，愈伤组织培养基的组成为：2.2g/L MS盐+0.05-0.2mg/L噻苯隆+0.05-0.10mg/L吲哚丁酸+0.10-0.20mg/L赤霉素+20.0g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，培养条件为：21℃，10小时光照、14小时黑暗，光照强度1200lux，相对湿度70-85％；
C、待培养出现红色愈伤组织并长到体积为0.8-1.2立方厘米时，将其切碎成边长为0.08-0.12毫米的小方块，按愈伤组织：悬浮培养基为1：100的体积比，将愈伤组织转入悬浮培养基中振动培养4周；其中，悬浮培养基的组成为：4.4g/L MS盐+0.05-0.2mg/L噻苯隆+0.05-0.10mg/L吲哚丁酸+0.10-0.20mg/L赤霉素+25.0g/L蔗糖，培养条件为：29℃，16小时光照、8小时黑暗，光照强度3000lux，相对湿度为70-85％，振动速度100-110rpm/min；
D、悬浮培养后，转入诱导培养基中震荡培养1周；其中，诱导培养基的组成为：1.1g/LMS盐+0.12mg/L噻苯隆+0.08mg/L吲哚丁酸+15.0g/L蔗糖+0.8-1.2g/L二氢杨梅素；培养条件为：20℃，12小时光照、12小时黑暗，光照强度4000lux，相对湿度70-85％，振动速度90-100rpm/min。
E、诱导培养后收集悬浮培养细胞，干燥后粉碎至100mu，然后于悬浮培养细胞中加入0.7-1.5％体积浓度的盐酸乙醇溶液于55-65℃超声提取2-3次，每次提取条件为：超声功率200-300w，时间30-50min，每1g悬浮培养细胞加20-50ml盐酸乙醇溶液；合并提取液，真空浓缩直至溶剂全部挥干，得到花青素产品。
2.如权利要求1所述的利用茶叶愈伤组织悬浮培养提取制备花青素的方法，其特征在于，所述步骤A中的茶树品种为尖波黄、碧香早或福鼎大白。
3.如权利要求1所述的利用茶叶愈伤组织悬浮培养提取制备花青素的方法，其特征在于，所述步骤A中的灭菌是指将茶叶以1％体积浓度的次氯酸钠水溶液浸泡18-20min，取出，用灭菌水冲洗干净后用无菌风吹干，无菌条件下将叶片切成小块。
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