CN107831152A - 一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒及检测的方法 - Google Patents

一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒及检测的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107831152A
CN107831152A CN201711042462.XA CN201711042462A CN107831152A CN 107831152 A CN107831152 A CN 107831152A CN 201711042462 A CN201711042462 A CN 201711042462A CN 107831152 A CN107831152 A CN 107831152A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liquid
kinds
antibody
fluorescence
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711042462.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN107831152B (zh
Inventor
樊爱萍
杨洪丽
于晓倩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN201711042462.XA priority Critical patent/CN107831152B/zh
Publication of CN107831152A publication Critical patent/CN107831152A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107831152B publication Critical patent/CN107831152B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法，具体涉及一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒及检测的方法。一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，所述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，所述试剂盒包括10种溶液，分别为G1液，G2液，G3液，Q1液，Q2液，Q3液；本发明相对于现有技术的优点在于：本发明可通过切换不同最大发射波长，实现三种乳腺癌标志物的同时检测。

Description

一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒 及检测的方法
技术领域：
本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法，具体涉及一种用 于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒及检测的方法。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全球每年发病人数超过 115万，每年约有41万人死于乳腺癌，在我国京、津、沪等大城市， 乳腺癌发病率已经上升为女性恶性肿瘤的第一位，死亡率占第四位， 成为妇女健康的最大威胁之一。尽管目前诊断治疗水平比以往有所提 高，但是乳腺癌病人的死亡率仍然居高不下，咎其原因是乳腺癌早期 症状不明显，病人多以乳块就诊，待明确诊断时已属中晚期，大多数 患者有不同程度的转移，虽经手术，化疗，放疗，很多乳腺癌患者疗 效并不满意。乳腺癌早期发现、早期诊断、早期治疗具有重要意义， 是提高乳癌患者生存率，延长乳腺癌患者生命的关键所在。
目前，临床常用的乳腺癌检测方法包括：超声检查，钼靶摄片检 查，近红外线扫描检查，磁共振技术(MRI)、纤维管内窥镜和微创 活检等。钼靶摄片检查是目前乳腺筛查的首选，具有痛苦相对较小， 简单易行的优点，但对40岁以下女性人群其胸腺腺体密度大，乳房X 线钼靶筛查易产生假阴性结果。超声检查和近红外线扫描也同样具有 检查方法灵敏度有限，假阳性和假阴性率高的问题。MRI技术具有较 高的分辨率，但价格昂贵，且它需要向血管内注射造影剂，属于一种 创伤性的检查措施，因此不适于大规模的人群普查。活检被认为目前 乳癌确诊的金标准，但和纤维管内窥镜技术一样，属于创伤性诊断方 式，对患者身体和组织具有一定程度的创伤，且具有一定人群局限性。 随着对乳腺癌研究的不断深入，肿瘤血清标志物已成为乳癌早期诊断 的研究热点。这些物质正常人体内缺乏或含量极低，但通常在肿瘤发 生的早期即产生，并随着疾病发展和治疗而发生变化，因此监测其含量对肿瘤早期诊断、指导治疗、监测复发、转移及判断预后均具有重 要意义。对肿瘤血清标志物的检测属于生物化学诊断，方法具有创伤 小、简单、可重复性等优点。
各国研究学者一致认为：一种肿瘤标志物单独检测特异性不强， 对早期肿瘤的检出率低。多种标志物联合分析能够大大地弥补这些不 足，而实现疾病的早期诊断通常需要3-4种标志物同时检测。现阶段 临床上多采用酶联免疫法分别测定每种标志物，联合分析以提高疾病 诊断的准确率和阳性率，每种标志物需要一种试剂盒，直接导致这些 多组分检测方法普遍存在所需血清用量大、检测时间长、诊断费用高、 操作复杂等不足。发展一种血清用量小、检测时间快、诊断费用低、 操作简单、适合推广的多组分同时检测新技术，是目前乳腺癌早期诊 断技术能够取得重大突破的正确方向之一。
氧化石墨烯(GO)是由氧化石墨剥离而来，含有丰富的含氧功能 基团(-O-，-OH，和-COOH)，其表面的含氧功能团使其具有两亲性， 增加了其在水溶液中的稳定性。GO在光学、电化学等方面具有独特的 优越性。在光学方面，GO对荧光具有较好的淬灭的作用，吸附于其表 面的荧光分子的荧光可通过荧光能量转移被淬灭。荧光量子点是 2-10nm的无机纳米晶体，具有独特的光学和化学特性，其光学属性可 通过材料成分，粒径大小，粒度分布，表面化学等得到控制，并且具 有量子产率高，激发光谱宽，发射光谱窄且对称性好特点。激发光谱 宽和发射光谱窄这一特点，使不同粒径的荧光量子点可被同一波长激 发，发射不同波长的荧光，为其在多组分肿瘤标志物同时测定中提供 了优势。
但是单一肿瘤标志物检测存在特异性不强，检测时间长等缺陷， 存在较大的误差。
发明内容：
本发明针对单一肿瘤标志物检测特异性不强，检测时间长等问 题，利用氧化石墨烯对量子点荧光的淬灭作用，发展了能用于三种乳 腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，涉及的三种乳腺癌肿瘤 标志物分别为CEA，CA125，以及CA153。
技术方案具体如下：
一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，所 述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，所述试剂盒包 括6种溶液，分别为G1液，G2液，G3液，Q1液，Q2液，Q3液；
所述G1液为标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL-1； 所述G2液为标记了CA153抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为10μg mL-1； G3液为标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为100μgmL-1；所 述三种氧化石墨烯表面具有羧基基团，所述羧基基团与对应的CEA抗 原、CA153抗原、CA125抗原分别偶联；
所述Q1液为标记了CEA抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM， 最大发射波长为620nm；所述Q2为标记了CA153抗体的荧光量子点 溶液，浓度为9.6μM,最大发射波长为540nm；Q3为标记了CA125抗 体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为460nm；所述三 种荧光量子点为经过表面修饰使其带有羧基的荧光亮子点；所述羧基 基团与对应的CEA抗体、CA153抗体、CA125抗体分别偶联。
作为优选方案之一，所述G1液，G2液，G3液是分别将CEA抗原、 CA153抗原、CA125抗原直接标记在氧化石墨烯上形成的。具体的实 现过程可以为：所述G1液、G2液、G3液是分别使用第一活化试剂将 氧化石墨烯进行活化处理，离心去除上清液后用PBS重悬，再加入抗原进行反应，经离心分离，洗涤，BSA封闭，得到；其中第一活化试 剂为EDC和NHS的混合物，二者的摩尔比为1:1。
作为优选方案之二，所述Q1液、Q2液、Q3液是分别将抗体直接 标记在羧基修饰的荧光量子点上形成的；具体的实现过程可以为：所 述Q1液、Q2液、Q3液是分别使用第二活化试剂将羧基修饰的荧光量 子点进行活化处理，再加入抗体进行反应，经BSA封闭，离心洗涤， PBS重悬得到抗体标记的荧光量子点溶液；其中第二活化试剂为EDC。
三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，所述三种乳腺癌肿瘤标 志物分别为CEA、CA153、CA125，过程包括：
步骤1：将标记了CEA抗体的荧光量子点溶液、标记了CA153抗 体的荧光量子点溶液、标记了CA125抗体的荧光量子点溶液加入96 微孔板中；
步骤2：向步骤1中加入待测血液样品；
步骤3：然后分别加入标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液、标记 了CA153抗原的氧化石墨烯溶液、标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶 液；
步骤4：进行温育，温度为37摄氏度，温育时间为60-120min
步骤5：将混合溶液放入酶标仪中检测荧光信号，荧光激发波长 应为400nm以下，发射波长应选460nm，540nm和620nm；
步骤6：将上述血液样品所产生的荧光信号与采用三种乳腺癌标 志物标准品进行测试所得出的标准曲线进行对照，即可获得本样本中 三种乳腺癌标志物的含量；扣空白荧光信号强度与CEA含量之间线 性范围为1.5fg-15ng，回归方程为y1＝2.0195lg(x1)+16.817，其中 y1为扣空白荧光信号值，x1为CEA的含量，x1的单位为fg；扣空 白荧光信号强度与CA153含量之间线性范围为1nUmL-1-10μUmL-1， 回归方程为y 2＝4.5201lg(x2)+19.767，y2为扣空白荧光信号值，x2 为CA153的含量，x2的单位为nUmL-1；扣空白荧光信号强度与CA125 含量之间线性范围为1μUmL-1-1mUmL-1，回归方程为y3＝5.275lg(x3) +10.987，其中y3为扣空白荧光信号值，x3为CA125含量。
作为检测方法的优选方案之一，所述G1液为标记了CEA抗原的 氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL-1；所述G2液为标记了CA153抗原 的氧化石墨烯溶液，浓度为10μg mL-1；G3液为标记了CA125抗原的 氧化石墨烯溶液，浓度为100μgmL-1；所述三种氧化石墨烯表面具有羧基基团，所述羧基基团与对应的CEA抗原、CA153抗原、CA125抗 原分别偶联；
作为检测方法的优选方案之二，所述Q1液为标记了CEA抗体的 荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为620nm；所述Q2为 标记了CA153抗体的荧光量子点溶液，浓度为9.6μM,最大发射波长 为540nm；Q3为标记了CA125抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM， 最大发射波长为460nm；所述三种荧光量子点为经过表面修饰使其带 有羧基的荧光亮子点；所述羧基基团与对应的CEA抗体、CA153抗体、 CA125抗体分别偶联。
作为检测方法的优选方案之三，所述G1液，G2液，G3液是分别 将CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原直接标记在氧化石墨烯上形成 的；所述Q1液、Q2液、Q3液是分别将抗体直接标记在羧基修饰的荧 光量子点上形成的。
作为检测方法的优选方案之三的进一步优选方案之一，所述G1 液、G2液、G3液是分别使用第一活化试剂将氧化石墨烯进行活化处 理，离心去除上清液后用PBS重悬，再加入抗原进行反应，经离心分 离，洗涤，BSA封闭，得到；其中第一活化试剂为EDC和NHS的混合物，二者的摩尔比为1:1。
作为检测方法的优选方案之三的进一步优选方案之二，所述Q1 液、Q2液、Q3液是分别使用第二活化试剂将羧基修饰的荧光量子点 进行活化处理，再加入抗体进行反应，经BSA封闭，离心洗涤，PBS 重悬得到抗体标记的荧光量子点溶液；其中第二活化试剂为EDC。
所述G1液的其中一个制备过程包括：制备0.5mg mL-1氧化石墨 烯水溶液100μL；将其转移到小玻璃瓶中，加入1.92mgEDC·HCl 和1.1mgNHS，室温下剧烈搅拌活化4h；将活化好的氧化石墨烯水 溶液于12000rpm离心10min，去除上清液，沉淀用1mL PBS重悬； 取0.1mL上述重悬液，快速加入3.3μL0.1mg mL-1CEA，室温搅拌 反应24h后，用PBS离心洗涤两次，所得沉淀用1mL含5％BSA的 PBS重悬，4℃保存备用，得到浓度为5μgmL-1的CEA修饰的氧化石 墨烯水溶液。
所述G2液的其中一个制备过程包括：取0.5mgmL-1氧化石墨烯水 溶液200μL，将其转移到小玻璃瓶中，加入3.84mgEDC·HCl和 2.3mgNHS，室温下剧烈搅拌活化4h；将活化好的氧化石墨烯水溶液 于12000rpm离心10min，去除上清液，沉淀用1mL PBS重悬；取 0.1mL上述重悬液，并快速加入13.5μL0.5kUmL-1CA153，室温搅拌 反应24h后，用PBS离心洗涤两次，所得沉淀用1mL含5％BSA的 PBS重悬，4℃保存备用，得到终浓度为10μg mL-1的CA153修饰的 氧化石墨烯水溶液。
所述G3液的其中一个制备过程包括：取0.5mgmL-1氧化石墨烯 水溶液2mL，将其转移到小玻璃瓶中，加入38.4mg EDC·HCl和23mg NHS，室温下剧烈搅拌活化4h；将活化好的氧化石墨烯水溶液于12000 rpm离心10min，去除上清液，沉淀用1mL PBS重悬；取0.1mL上述重悬液，并快速加入67μL1kUmL-1CA125，室温搅拌反应24h后， 用PBS离心洗涤两次，所得沉淀用1mL含5％BSA的PBS重悬，4℃ 保存备用，得到终浓度为100μg mL-1的CA125修饰的氧化石墨烯水 溶液。
所述Q1液的其中一个制备过程包括：取最大发射波长位于619nm 处的量子点，向125μL2μM的荧光量子点的氯仿溶液中加入50μL 巯基丙酸；室温搅拌4h，12000rpm离心10min去上清，离心洗涤 3次后加入250μL水使沉淀重悬，得到1μM的羧基修饰的619nm 发射的荧光量子点溶液；在以上溶液中加入20mg mL-1EDC·HCl2.5μL， 室温下搅拌活化15min后，迅速加入1mg mL-1CEA抗体46μL，继 续搅拌反应6h后，加入BSA使其终浓度为1％，封闭1h后离心洗涤 三次，用250μLPBS重悬，即得浓度为1μM的CEA抗体标记的荧光 量子点溶液，其最大发射波长位于619nm。
所述Q2液的其中一个制备过程包括：取最大发射波长位于540nm 处的量子点，向200μL 12μM的荧光量子点的氯仿溶液中加入 480μL巯基丙酸；室温搅拌4h，12000rpm离心10min去上清，离 心洗涤3次后加入200μL水使沉淀重悬，得到12μM的羧基修饰 的540nm发射的荧光量子点溶液；在其中加入20mg mL-1EDC· HCl24μL，室温搅拌活化15min后加入1mgmL-1CA153抗体37μL， 继续搅拌30min后补加20mg mL-1EDC·HCl10μL，室温搅拌反应6h 后，加入BSA使其终浓度为1％，搅拌封闭1h；最后将反应物离心洗 涤三次，所得沉淀用250μLPBS重悬，于冰箱4℃保存备用，其终 浓度为9.6μM CA153抗体标记的荧光量子点溶液，其最大发射波长 位于540nm。
所述Q3液的其中一个制备过程包括：取最大波长位于460nm处 的量子点，向125μL2μM的荧光量子点的氯仿溶液中加入50μL 巯基丙酸；室温搅拌4h，12000rpm离心10min去上清，离心洗涤 3次后加入250μL水使沉淀重悬，得到1μM的羧基修饰的460nm 发射的荧光量子点溶液；在其中加入20mg mL-1EDC·HCl2.5μL，室 温搅拌活化15min后，加入1mg mL- 1CA125抗体37.5μL,继续搅 拌30min后补加20mg mL-1EDC·HCl10μL，室温搅拌反应6h后，加入BSA使其终浓度为1％，继续搅拌封闭1h；最后将产物离心洗涤 3次后，沉淀用250μLPBS重悬，于冰箱4℃保存备用，其终浓度为 1μM CA125抗体标记的荧光量子点溶液，其最大发射波长位于460 nm。
本发明相对于现有技术的优点在于：
(一)在本发明提供的试剂盒中，按照氧化石墨烯淬灭量子点荧 光的原理和竞争法的原理对试剂盒进行配置，其检测原理是在竞争法 中氧化石墨烯标记的抗原与待测抗原竞争荧光量子点标记的抗体，由 于空间位阻的原因，标记了量子点的抗体更倾向于与样品中待测抗原 结合，从而降低了其与氧化石墨烯标记的抗原结合，荧光恢复。并且 随待测样品中抗原含量增加，所得荧光信号越强。
(二)本发明通过荧光淬灭原理检测三种乳腺癌标志物，检测过 程中无需任何洗涤步骤，避免样品的损失，减小误差，操作简单。
(三)本发明采用竞争法，即使标记了抗原的氧化石墨烯与待测 抗原竞争标记了抗体的荧光量子点，利用结合速率的差异，提高低浓 度抗原的检测灵敏度。
(四)本发明可通过切换不同最大发射波长，实现三种乳腺癌标 志物的同时检测。
附图说明：
图1是实施例1的CEA浓度和荧光强度的拟合图；其中，横坐标 代表CEA的含量，单位为fg，纵坐标代表扣空白荧光信号强度；扣空 白荧光信号强度与CEA含量之间呈良好的线性关系，线性范围为1.5 fg-15ng，R2＝0.9949，回归方程为y＝2.0195lg(x)+16.817，其中 y为扣空白荧光信号值，x为CEA的含量；该荧光免疫分析法对CEA 的检测限为1.09fg(3σ)，之后考察了CEA测定的精密度；采用所 建立方法测定0.15ngCEA7次，计算其相对标准偏差为2.0％。
图2是实施例2的CA153浓度和荧光强度的拟合图；其中，横坐 标代表CA153含量，单位为nUmL-1，纵坐标代表扣空白荧光信号强 度；扣空白荧光信号强度与CA153含量之间呈良好的对数关系，线性 范围为1nUmL-1-10μU mL-1，R2＝0.9986，回归方程为y＝4.5201lg(x)+19.767，其中y为扣空白荧光信号值，x为CA153含量；通过三倍 信号标准偏差值算出的检测限值为0.2nU mL-1；之后本实验还对该 体系的精密度进行了考察，当CA153浓度为1μUmL-1时，采用建立 的方法重复测定7次，计算其相对标准偏差为1.8％。
图3是实施例3的CA125浓度和荧光强度的拟合图；横坐标代表 CA125含量，单位为μUmL-1，纵坐标代表扣空白荧光信号强度；扣 空白荧光信号强度与CA125含量的对数值呈良好的线性关系，线性范 围为1μUmL-1-1mUmL-1，线性相关系数为R2＝0.9972，回归方程为y＝5.275lg(x)+10.987，其中y为扣空白荧光信号值，x为CA125含 量；通过三倍信号标准偏差值算出的检测限值为0.3mUmL-1；对0.1U mL-1的CA125重复测定7次，其相对标准偏差为2.0％。
图4是实施例4的CEA，CA153和CA125混合样品测定的荧光强 度柱形图；在酶标仪中通过切换三种不同检测波长比较含三种肿瘤标 志物的混合样品与单组份样品测定时的荧光信号；结果表明，当组份 中含有三种肿瘤标志物时，其荧光信号与单组份测定时的荧光信号相 当；结果表明，所发展的试剂盒可实现三种乳腺癌标志物的同时检测。
具体实施方式：
以下实施例以下实施例采用塞默飞生产的酶标仪进行检测；CEA， CA125，CA153抗原，抗体均购自北京京科宏达生物有限公司；量子 点来源：北京中科物源生物技术有限公司。
实施例1：
一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，所 述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，所述试剂盒包 括10种溶液，分别为G1液，G2液，G3液，Q1液，Q2液，Q3液；
所述G1液为标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL-1； 所述G2液为标记了CA153抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为10μg mL-1； G3液为标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为100μgmL-1；所 述三种氧化石墨烯表面具有羧基基团，所述羧基基团与对应的CEA抗 原、CA153抗原、CA125抗原分别偶联；
所述Q1液为标记了CEA抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM， 最大发射波长为620nm；所述Q2为标记了CA153抗体的荧光量子点 溶液，浓度为9.6μM,最大发射波长为540nm；Q3为标记了CA125抗 体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为460nm；所述三 种荧光量子点为经过表面修饰使其带有羧基的荧光亮子点；所述羧基 基团与对应的CEA抗体、CA153抗体、CA125抗体分别偶联；
所述G1液，G2液，G3液是分别将CEA抗原、CA153抗原、CA125 抗原直接标记在氧化石墨烯上形成的。具体的实现过程为：所述G1 液、G2液、G3液是分别使用第一活化试剂将氧化石墨烯进行活化处 理，离心去除上清液后用PBS重悬，再加入抗原进行反应，经离心分离，洗涤，BSA封闭，得到；其中第一活化试剂为EDC和NHS的混合 物，二者的摩尔比为1:1。
所述Q1液、Q2液、Q3液是分别将抗体直接标记在羧基修饰的荧 光量子点上形成的；具体的实现过程为：所述Q1液、Q2液、Q3液是 分别使用第二活化试剂将羧基修饰的荧光量子点进行活化处理，再加 入抗体进行反应，经BSA封闭，离心洗涤，PBS重悬得到抗体标记的 荧光量子点溶液；其中第二活化试剂为EDC。
利用上述试剂盒进行乳腺癌肿瘤标志物CEA检测的方法，
步骤1：将Q1液，Q2液，和Q3液按照1:1:1体积比混合均匀， 得A混合液；将G1液，G2液，和G3液按照1:1:1体积比混合均， 得B混合液；
步骤2：S1采用H液进行稀释，在96微孔板中分别加入量为1.5 fg，15fg，0.15pg，1.5pg，15pg，150pg，1.5ng，以及15ng 的S1 15μL；
步骤3：然后加入A混合液15μL，B混合液60μL；
步骤4：进行温育，温度为37摄氏度，温育时间为120min；
步骤5：将混合溶液放入酶标仪中检测荧光信号，荧光激发波长 应为400nm以下，分别测定各孔在460nm，540nm和619nm处的荧光 强度；
步骤6：扣空白荧光信号强度与CEA含量之间线性范围为1.5 fg-15ng，回归方程为y1＝2.0195lg(x1)+16.817，其中y1为扣空白 荧光信号值，x1为CEA的含量，x1的单位为fg；
上述步骤中，S1为1μg mL-1CEA标准溶液，H液为10mM PBS 缓冲溶液，其pH值为7.4。
实施例2：
试剂盒部分与实施例1相同。利用上述试剂盒进行乳腺癌肿瘤标 志物CA153检测的方法，
步骤1：将Q1液，Q2液，和Q3液按照1:1:1体积比混合均匀， 得A混合液；将G1液，G2液，和G3液按照1:1:1体积比混合均， 得B混合液；
步骤2：S2采用H液进行稀释，在96微孔板中分别加入量为1, 10,100,1000,10000nU mL-1的S2 15μL；
步骤3：然后加入A混合液15μL，B混合液60μL；
步骤4：进行温育，温度为37摄氏度，温育时间为120min；
步骤5：将混合溶液放入酶标仪中检测荧光信号，荧光激发波长 应为400nm以下，分别测定各孔在460nm，540nm和619nm处的荧光 强度；
步骤6：扣空白荧光信号强度与CA153含量之间线性范围为 1nUmL-1-10μUmL-1，回归方程为y2＝4.5201lg(x2)+19.767，y2为扣 空白荧光信号值，x2为CA153的含量，x2的单位为nUmL-1；
所述S2液为100KU mL-CA153标准溶液，H液为10mM PBS缓 冲溶液，其pH值为7.4。
实施例3：
试剂盒部分与实施例1相同。利用上述试剂盒进行乳腺癌肿瘤标 志物CA125检测的方法，
步骤1：将Q1液，Q2液，和Q3液按照1:1:1体积比混合均匀， 得A混合液；将G1液，G2液，和G3液按照1:1:1体积比混合均， 得B混合液；
步骤2：S3采用H液进行稀释，在96微孔板中分别加入量为1, 5,10,100,1000μUmL-1的S3 15μL；
步骤3：然后加入A混合液15μL，B混合液60μL；
步骤4：进行温育，温度为37摄氏度，温育时间为120min；
步骤5：将混合溶液放入酶标仪中检测荧光信号，荧光激发波长 应为400nm以下，分别测定各孔在460nm，540nm和619nm处的荧光 强度；
步骤6：扣空白荧光信号强度与CA125含量之间线性范围为1 μUmL-1-1mUmL-1，回归方程为y3＝5.275lg(x3)+10.987，其中y3为 扣空白荧光信号值，x3为CA125含量，x3单位为μUmL-1；
所述S3液为10U mL-1CA125标准溶液，H液为10mM PBS缓冲 溶液，其pH值为7.4。
实施例4：
试剂盒部分与实施例1相同。利用上述试剂盒进行乳腺癌肿瘤标 志物CEA、CA153、CA125检测的方法，包括如下过程
步骤1：将Q1液，Q2液，和Q3液按照1:1:1体积比混合均匀， 得A混合液；将G1液，G2液，和G3液按照1:1:1体积比混合均， 得B混合液；
步骤2：将S1，S2，及S3分别采用PBS稀释，分别加入200倍 稀释的健康人血清中，得到含75fg S1,5nU mL-1S2和6μU mL-1S3 血样1，含750fg S1,50nU mL-1S2和20μU mL-1S3血样2，含7500 fg S1,500nU mL-1S2和125μU mL-1S3血样3；在微孔板的三个孔 中分别加入血样1，血样2，血样3各15μL；
步骤3：然后在各孔中加入A混合液15μL，B混合液60μL；
步骤4：进行温育，温度为37摄氏度，温育时间为120min；
步骤5：将混合溶液放入酶标仪中检测荧光信号，荧光激发波长 应为400nm以下，分别测定各孔在460nm，540nm和619nm处的荧光 强度；
步骤6：将上述血液样品所产生的荧光信号与采用三种乳腺癌标 志物标准品进行测试所得出的标准曲线进行对照，即可获得本样本中 三种乳腺癌标志物的含量；扣空白荧光信号强度与CEA含量之间线 性范围为1.5fg-15ng，回归方程为y1＝2.0195lg(x1)+16.817，其中 y1为扣空白荧光信号值，x1为CEA的含量，x1的单位为fg；扣空 白荧光信号强度与CA153含量之间线性范围为1nUmL-1-10μUmL-1， 回归方程为y 2＝4.5201lg(x2)+19.767，y2为扣空白荧光信号值，x2 为CA153的含量，x2的单位为nUmL-1；扣空白荧光信号强度与CA125 含量之间线性范围为1μUmL-1-1mUmL-1，回归方程为y3＝5.275lg(x3) +10.987，其中y3为扣空白荧光信号值，x3为CA125含量，x3单位 为μUmL-1。
上述S1液为1μg mL-1CEA标准溶液，S2液为100KU mL-CA153 标准溶液，S3液为10UmL-1CA125标准溶液。计算得到的回收率如 下表1所示。
表1血清中三种肿瘤标志物检测回收率结果
注：表格中CEA(S1)的单位为fg，CA153(S2)的单位为nU mL-1，CA125 (S3)的单位为μU mL-1。

Claims (16)

1.一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，所述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，其特征在于，所述试剂盒包括6种溶液，分别为G1液，G2液，G3液，Q1液，Q2液，Q3液；
所述G1液为标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL-1；所述G2液为标记了CA153抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为10μg mL-1；G3液为标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为100μgmL-1；所述三种氧化石墨烯表面具有羧基基团，所述羧基基团与对应的CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原分别偶联；
所述Q1液为标记了CEA抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为620nm；所述Q2为标记了CA153抗体的荧光量子点溶液，浓度为9.6μM,最大发射波长为540nm；Q3为标记了CA125抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为460nm；所述三种荧光量子点为经过表面修饰使其带有羧基的荧光亮子点；所述羧基基团与对应的CEA抗体、CA153抗体、CA125抗体分别偶联。
2.根据权利要求1所述一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述G1液，G2液，G3液是分别将CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原直接标记在氧化石墨烯上形成的。
3.根据权利要求2所述一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述G1液、G2液、G3液是分别使用第一活化试剂将氧化石墨烯进行活化处理，离心去除上清液后用PBS重悬，再加入抗原进行反应，经离心分离，洗涤，BSA封闭，得到；其中第一活化试剂为EDC和NHS的混合物，二者的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求1所述一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述Q1液、Q2液、Q3液是分别将抗体直接标记在羧基修饰的荧光量子点上形成的。
5.根据权利要求4所述一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述Q1液、Q2液、Q3液是分别使用第二活化试剂将羧基修饰的荧光量子点进行活化处理，再加入抗体进行反应，经BSA封闭，离心洗涤，PBS重悬得到抗体标记的荧光量子点溶液；其中第二活化试剂为EDC。
6.三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，所述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，其特征在于，
需要用到的液体包括：G1液、G2液、G3液、Q1液、Q2液、Q3液；所述G1液为标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL-1；所述G2液为标记了CA153抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为10μg mL-1；G3液为标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为100μgmL-1；所述三种氧化石墨烯表面具有羧基基团，所述羧基基团与对应的CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原分别偶联；所述Q1液为标记了CEA抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为620nm；所述Q2为标记了CA153抗体的荧光量子点溶液，浓度为9.6μM,最大发射波长为540nm；Q3为标记了CA125抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为460nm；所述三种荧光量子点为经过表面修饰使其带有羧基的荧光亮子点；所述羧基基团与对应的CEA抗体、CA153抗体、CA125抗体分别偶联；过程包括：
步骤1：将Q1液，Q2液，和Q3液按照1:1:1体积比混合均匀，得A混合液；将G1液，G2液，和G3液按照1:1:1体积比混合均，得B混合液；
步骤2：将200倍稀释的待测血清加入96微孔板中；
步骤3：然后加入与稀释后待测血清体积相同的A混合液、体积为稀释后待测血清体积4倍的B混合液；
步骤4：进行温育，温度为37摄氏度，温育时间为60-120min
步骤5：将混合溶液放入酶标仪中检测荧光信号，荧光激发波长应为400nm以下，分别测定各孔在460nm，540nm和619nm处的荧光强度；
步骤6：将上述血液样品所产生的荧光信号与采用三种乳腺癌标志物标准品进行测试所得出的标准曲线进行对照，即可获得本样本中三种乳腺癌标志物的含量；扣空白荧光信号强度与CEA含量之间线性范围为1.5fg-15ng，回归方程为y1＝2.0195lg(x1)+16.817，其中y1为扣空白荧光信号值，x1为CEA的含量，x1的单位为fg；扣空白荧光信号强度与CA153含量之间线性范围为1nUmL-1-10μUmL-1，回归方程为y2＝4.5201lg(x2)+19.767，y2为扣空白荧光信号值，x2为CA153的含量，x2的单位为nUmL-1；扣空白荧光信号强度与CA125含量之间线性范围为1μUmL-1-1mUmL-1，回归方程为y3＝5.275lg(x3)+10.987，其中y3为扣空白荧光信号值，x3为CA125含量，x3单位为μUmL-1。
7.根据权利要求6所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，
所述G1液为标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL-1；所述G2液为标记了CA153抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为10μg mL-1；G3液为标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为100μgmL-1；所述三种氧化石墨烯表面具有羧基基团，所述羧基基团与对应的CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原分别偶联；
所述Q1液为标记了CEA抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为620nm；所述Q2为标记了CA153抗体的荧光量子点溶液，浓度为9.6μM,最大发射波长为540nm；Q3为标记了CA125抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为460nm；所述三种荧光量子点为经过表面修饰使其带有羧基的荧光亮子点；所述羧基基团与对应的CEA抗体、CA153抗体、CA125抗体分别偶联。
8.根据权利要求6所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，所述G1液，G2液，G3液是分别将CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原直接标记在氧化石墨烯上形成的；所述Q1液、Q2液、Q3液是分别将抗体直接标记在羧基修饰的荧光量子点上形成的。
9.根据权利要求8所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，所述G1液、G2液、G3液是分别使用第一活化试剂将氧化石墨烯进行活化处理，离心去除上清液后用PBS重悬，再加入抗原进行反应，经离心分离，洗涤，BSA封闭，得到；其中第一活化试剂为EDC和NHS的混合物，二者的摩尔比为1:1。
10.根据权利要求8所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，所述Q1液、Q2液、Q3液是分别使用第二活化试剂将羧基修饰的荧光量子点进行活化处理，再加入抗体进行反应，经BSA封闭，离心洗涤，PBS重悬得到抗体标记的荧光量子点溶液；其中第二活化试剂为EDC。
11.根据权利要求6-10任何一项所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，所述G1液制备过程包括：
制备0.5mg mL-1氧化石墨烯水溶液100μL；将其转移到小玻璃瓶中，加入1.92mgEDC·HCl和1.1mgNHS，室温下剧烈搅拌活化4h；将活化好的氧化石墨烯水溶液于12000rpm离心10min，去除上清液，沉淀用1mL PBS重悬；取0.1mL上述重悬液，快速加入3.3μL0.1mg mL- 1CEA，室温搅拌反应24h后，用PBS离心洗涤两次，所得沉淀用1mL含5％BSA的PBS重悬，4℃保存备用，得到浓度为5μgmL-1的CEA修饰的氧化石墨烯水溶液。
12.根据权利要求6-10任何一项所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，所述G2液制备过程包括：
取0.5mgmL-1氧化石墨烯水溶液200μL，将其转移到小玻璃瓶中，加入3.84mgEDC·HCl和2.3mgNHS，室温下剧烈搅拌活化4h；将活化好的氧化石墨烯水溶液于12000rpm离心10min，去除上清液，沉淀用1mL PBS重悬；取0.1mL上述重悬液，并快速加入13.5μL0.5kUmL-1CA153，室温搅拌反应24h后，用PBS离心洗涤两次，所得沉淀用1mL含5％BSA的PBS重悬，4℃保存备用，得到终浓度为10μg mL-1的CA153修饰的氧化石墨烯水溶液。
13.根据权利要求6-10任何一项所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，所述G3液制备过程包括：
取0.5mgmL-1氧化石墨烯水溶液2mL，将其转移到小玻璃瓶中，加入38.4mg EDC·HCl和23mg NHS，室温下剧烈搅拌活化4h；将活化好的氧化石墨烯水溶液于12000rpm离心10min，去除上清液，沉淀用1mL PBS重悬；取0.1mL上述重悬液，并快速加入67μL1kUmL-1CA125，室温搅拌反应24h后，用PBS离心洗涤两次，所得沉淀用1mL含5％BSA的PBS重悬，4℃保存备用，得到终浓度为100μg mL-1的CA125修饰的氧化石墨烯水溶液。
14.根据权利要求6-10任何一项所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，所述Q1液制备过程包括：
取最大发射波长位于619nm处的量子点，向125μL2μM的荧光量子点的氯仿溶液中加入50μL巯基丙酸；室温搅拌4h，12000rpm离心10min去上清，离心洗涤3次后加入250μL水使沉淀重悬，得到1μM的羧基修饰的619nm发射的荧光量子点溶液；在以上溶液中加入20mg mL- 1EDC·HCl2.5μL，室温下搅拌活化15min后，迅速加入1mg mL-1CEA抗体46μL，继续搅拌反应6h后，加入BSA使其终浓度为1％，封闭1h后离心洗涤三次，用250μLPBS重悬，即得浓度为1μM的CEA抗体标记的荧光量子点溶液，其最大发射波长位于619nm。
15.根据权利要求6-10任何一项所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，所述Q2液制备过程包括：
取最大发射波长位于540nm处的量子点，向200μL 12μM的荧光量子点的氯仿溶液中加入480μL巯基丙酸；室温搅拌4h，12000rpm离心10min去上清，离心洗涤3次后加入200μL水使沉淀重悬，得到12μM的羧基修饰的540nm发射的荧光量子点溶液；在其中加入20mg mL- 1EDC·HCl24μL，室温搅拌活化15min后加入1mg mL-1CA153抗体37μL，继续搅拌30min后补加20mg mL-1EDC·HCl10μL，室温搅拌反应6h后，加入BSA使其终浓度为1％，搅拌封闭1h；最后将反应物离心洗涤三次，所得沉淀用250μL PBS重悬，于冰箱4℃保存备用，其终浓度为9.6μM CA153抗体标记的荧光量子点溶液，其最大发射波长位于540nm。
16.根据权利要求6-10任何一项所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，所述Q3液制备过程包括：
取最大波长位于460nm处的量子点，向125μL 2μM的荧光量子点的氯仿溶液中加入50μL巯基丙酸；室温搅拌4h，12000rpm离心10min去上清，离心洗涤3次后加入250μL水使沉淀重悬，得到1μM的羧基修饰的460nm发射的荧光量子点溶液；在其中加入20mg mL-1EDC·HCl2.5μL，室温搅拌活化15min后，加入1mg mL-1CA125抗体37.5μL,继续搅拌30min后补加20mg mL-1EDC·HCl10μL，室温搅拌反应6h后，加入BSA使其终浓度为1％，继续搅拌封闭1h；最后将产物离心洗涤3次后，沉淀用250μLPBS重悬，于冰箱4℃保存备用，其终浓度为1μM CA125抗体标记的荧光量子点溶液，其最大发射波长位于460nm。
CN201711042462.XA 2017-10-31 2017-10-31 三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法 Expired - Fee Related CN107831152B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711042462.XA CN107831152B (zh) 2017-10-31 2017-10-31 三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711042462.XA CN107831152B (zh) 2017-10-31 2017-10-31 三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107831152A true CN107831152A (zh) 2018-03-23
CN107831152B CN107831152B (zh) 2019-08-30

Family

ID=61651114

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711042462.XA Expired - Fee Related CN107831152B (zh) 2017-10-31 2017-10-31 三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107831152B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102967708A (zh) * 2012-10-31 2013-03-13 武汉大学 一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法
CN103235021A (zh) * 2013-04-19 2013-08-07 济南大学 同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法及应用
CN103901197A (zh) * 2014-04-10 2014-07-02 华中科技大学 一种癌胚抗原含量检测方法及装置

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102967708A (zh) * 2012-10-31 2013-03-13 武汉大学 一种基于均相免疫同步荧光检测多个疾病标志物的方法
CN103235021A (zh) * 2013-04-19 2013-08-07 济南大学 同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法及应用
CN103901197A (zh) * 2014-04-10 2014-07-02 华中科技大学 一种癌胚抗原含量检测方法及装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙勇民等: "《微生物技术及应用》", 30 November 2014, 武汉：华中科技大学出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107831152B (zh) 2019-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yuan et al. A FRET probe with AIEgen as the energy quencher: dual signal turn-on for self-validated caspase detection
CN110275023A (zh) 基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法
CN110982513B (zh) 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用
Sun et al. Silver-amplified fluorescence immunoassay via aggregation-induced emission for detection of disease biomarker
CN104568923A (zh) 电化学发光检测外周血循环肿瘤细胞抗原的方法及试剂盒
CN109632765A (zh) 一种外泌体表面蛋白检测方法
CN111118004A (zh) 一种靶向转移性人大肠癌细胞的核酸适配体分子信标探针及其应用
CN110095444A (zh) 利用碳量子点检测溶液中葡萄糖浓度的方法
CN110128414A (zh) 一种基于半花菁染料的缺氧荧光探针的制备和应用
Dai et al. Detection of tyrosinase in living cells using an Enteromorpha Prolifera based fluorescent probe
CN101446591A (zh) P16INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒
CN105503768B (zh) alpha‑酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法及其在生物样本中的应用
Liang et al. Ratiometric fluorescence enzyme-linked immunosorbent assay based on carbon dots@ SiO 2@ CdTe quantum dots with dual functionalities for alpha-fetoprotein
Bai et al. The preparation of MnO2/BSA/CdTe quantum dots complex for ratiometric fluorescence/T1-weighted MRI detection of H2O2
CN114675026A (zh) 一种溶解增强长余辉发光检测方法
CN110187111A (zh) 一种用于早期贲门癌筛查elisa试剂盒
CN112899231B (zh) 一种可视化肿瘤细胞检测试剂、试剂盒及其制备方法与应用
Le et al. Current smartphone-assisted point-of-care cancer detection: Towards supporting personalized cancer monitoring
Wu et al. Preparation of bimetal–polydopamine organic frameworks with core–shell structure and their application in HER2 detection
CN112710709A (zh) 用于目标dna检测的硫化镉量子点玻碳电极及其制备方法、电化学发光传感器系统与应用
CN107831152A (zh) 一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒及检测的方法
CN112083160A (zh) 一种宫颈癌检测量子点免疫荧光试剂盒的制备及应用
CN104849449B (zh) 酶标抗体‑金纳米探针在二氨基联苯胺催化显色及暗场成像的应用
CN109470690A (zh) 基于电位分辨电化学发光的抗原检测方法
CN109254152A (zh) 一种肝癌标志物gp73检测探针的制备及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190830

Termination date: 20211031

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee