CN103901197A - 一种癌胚抗原含量检测方法及装置 - Google Patents

一种癌胚抗原含量检测方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种癌胚抗原的检测方法与装置：方法包括以下步骤：（1）将荧光物质和连接剂均匀混合，再与癌胚抗原适配体溶液混合；（2）将混合液与氧化石墨烯溶液均匀混合，使得荧光淬灭，得到癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液；（3）将待测样品与癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混合均匀恢复荧光；（4）进行毛细管电泳，距阳极为毛细管总长的1/2-2/3处进行荧光检测，测定癌胚抗原浓度。装置包括毛细管电泳装置和荧光检验装置，毛细管电泳装置其毛细管总长50-100cm，内径为50-100μm，距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的1/2-2/3处设有检测窗口，荧光检测装置设置在毛细管检测窗口处。本发明灵敏度高，检出限低，检测效率高，可应用于癌症早期筛查。

Description

一种癌胚抗原含量检测方法及装置
技术领域
本发明属于生物医学分析检测领域，更具体地，涉及一种癌胚抗原含量检测方法及装置。
背景技术
癌胚抗原(CEA)是一种广谱性的肿瘤标记物，其对大肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌等多种肿瘤的诊断和筛查方面具有重要的参考意义，对术后的疗效判断、病情发展、检测和预后估计是一个较好的标记物。因此对其进行高灵敏度高特异性的检测对临床医学有着非常重要的意义。
目前，检测癌胚抗原含量的方法有免疫分析法，如色度免疫法、荧光免疫法、电化学免疫分析法、化学发光免疫分析法、电化学发光免疫分析法等，还有基于癌胚抗原适配体和荧光共振能量转移（FRET）原理的传感检测技术。其中基于癌胚抗原适配体和FRET的检测方法，由于适配体特异性识别靶分子的特点，可以特异性地分析检测癌胚抗原。
然而对因为常规的FRET测量方法，由于被靶分子从猝灭剂上特异性竞争下来的荧光供体，其荧光仍然可以被溶液中存在的猝灭剂不同程度的猝灭，低浓度的靶分子不能产生有效的荧光恢复，因此目前基于适配体和FRET的癌胚抗原检测的检测灵敏度较低，不足以满足癌症早期低浓度癌胚抗原的检测要求。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种癌胚抗原检测方法及装置，其目的在于结合毛细管电泳分离的手段和适配体/氧化石墨烯传感技术，检测低含量的癌胚抗原，由此解决目前癌胚抗原检测的技术灵敏度低，不能检测早期癌症的问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种癌胚抗原的检测方法，包括以下步骤：
（1）制备癌胚抗原适配体-荧光物：将浓度为10-7M-10-5M荧光物质和连接剂溶液均匀混合，再将该混合液与癌胚抗原适配体的缓冲溶液混合均匀，使得荧光物质、连接剂、癌胚抗原适配体的摩尔比在1：200～1000：5～20，荧光物质的最终浓度在10-8M至10-5M，连接剂的最终浓度在0.025mg/ml至0.05mg/ml，癌胚抗原适配体的最终浓度在5×10-8M至2×10-4M；荧光物和适配体之间发生缩合反应，除去过量的癌胚抗原适配体，得到含癌胚抗原适配体-荧光物的缓冲液；
（2）制备癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液：将步骤（1）中制备的含癌胚抗原适配体-荧光物的缓冲液与氧化石墨烯溶液均匀混合，反应1至8小时，氧化石墨烯使得癌胚抗原适配体-荧光物荧光淬灭，得到癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液；
（3）制备毛细管电泳样品：将待测样品与步骤（2）中制备的癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混合均匀，反应2至8小时从而恢复荧光，得到毛细管电泳样品；
（4）检测恢复荧光强度：将毛细管电泳样品进行毛细管电泳，距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的1/2-2/3处进行荧光检测，获得恢复荧光强度，根据恢复荧光强度，按照荧光强度标准曲线，测定癌胚抗原浓度。
优选地，所述癌胚抗原的检测方法，其步骤（1）中荧光物质、连接剂与癌胚抗原适配体的摩尔比为1：200：5。
优选地，所述癌胚抗原的检测方法，其步骤（1）所述荧光物质为有机荧光染料或无机荧光纳米颗粒，常用为硒化镉、碲化镉、硫化镉、硫化锌、硒化锌、碲化锌、硫化汞、硒化汞、碲化汞、砷化镓、砷化铟、碳化硅、硒化铅、硒化镁、硫化锌包被硒化镉核壳型（CdSe/ZnS）、硫化锌包碲化镉核壳型（CdTe/ZnS）、碳点、纳米金簇、纳米银簇、荧光石墨烯或复合荧光二氧化硅纳米粒子，优选为半导体量子点。
优选地，所述癌胚抗原的检测方法，其步骤（1）所述连接剂为1-乙基-3-（3-二甲胺基丙基）碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的混合物，其中按照摩尔比，N-羟基硫代琥珀酰亚胺不超过50%。
优选地，所述癌胚抗原的检测方法，其所述步骤（2）其氧化石墨烯溶液浓度为40-60μg/mL。
优选地，所述癌胚抗原的检测方法，其步骤（4）毛细管电泳使用的毛细管为内径在50-100μm之间的弹性聚酰亚胺涂层熔融石英管。
优选地，所述癌胚抗原的检测方法，其步骤（4）毛细管电泳其电场强度在150-400V/cm间，电泳温度恒定在20-30℃间，阳极、阴极及电泳缓冲液为pH8.4-9.2的Na2B4O7-H3BO3溶液，虹吸进样高度15cm、时间15-35s。
优选地，所述癌胚抗原的检测方法，其步骤（4）距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的7/12处进行荧光检测。
按照本发明的另一方面，提供了一种癌胚抗原检测装置，其特征在于，包括毛细管电泳装置和荧光检验装置，所述毛细管电泳装置，其毛细管总长50-100cm，内径为50-100μm，进样口高于毛细管15cm，所述毛细管上距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的1/2-2/3处设有检测窗口，荧光检测装置设置在毛细管检测窗口处。
优选地，所述癌胚抗原检测装置，其毛细管为弹性聚酰亚胺涂层熔融石英管。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
（1）由于采用毛细管电泳技术，可使氧化石墨烯淬灭剂与适配体荧光物质逐渐分离，从而减小淬灭剂对恢复荧光的影响，能更准确真实的获得恢复荧光强度，得到更准确的癌胚抗原检测结果。
（2）毛细管电泳技术，还能分离癌胚抗原和样品中其他血清蛋白，因此本检测方法噪声小，信噪比高。
（3）本发明提供的检测方法，通过合理选择荧光检测窗口的位置，兼顾了分离效果和分离时间，检测结果可靠，检测效率高。
（4）本发明提供的检测方法，结合了毛细管电泳和癌胚抗原适配体/氧化石墨烯传感技术，特异性高，检出限低，检出限为5pg/ml，相对于现有技术，检测性能提高了100至1000倍。因此本发明可应用于癌症早期筛查。
（4）本发明提供的检测装置，需要的检测样品量小，制造简单，检测灵敏。同时本装置高度模块化，维护简单。
附图说明
图1是本发明提供的癌胚抗原检测方法流程图；
图2是本发明提供的癌胚抗原检测装置结构示意图。
在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1为高压电源，2为铂电极，3为阳极电解液池，4为阴极电解液池，5为毛细管，6为进样口，7为荧光显微镜，8为光电转换器。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的癌胚抗原检测方法，如图1所示，包括以下步骤：
（1）制备癌胚抗原适配体-荧光物：将浓度为10-7M-10-5M荧光物质和连接剂混合，将该混合液与癌胚抗原适配体的缓冲溶液混合均匀，使得荧光物质、连接剂和癌胚抗原适配体的摩尔比为1:200～1000:5～20，优选为1:200:5，荧光物质的最终浓度在10-8M至10-5M，连接剂的最终浓度在0.025mg/ml至0.05mg/ml，癌胚抗原适配体的最终浓度在5×10-8M至2×10-4M。荧光物和癌胚抗原适配体发生缩合反应，反应2到4小时后，将混合液离心超滤，除去过量的癌胚抗原适配体，得到含癌胚抗原适配体-荧光物的缓冲液。
所述癌胚抗原适配体是一段能与癌胚抗原特异性结合的单链DNA片段，获取方法参“DNA Aptamers Selected as Molecular Probes for CancereousCells”(Word Applied Sciences Journal8,Special Issue of Biotechnology&Genetic Engineering:16-21,2010)。所述荧光物质为有机荧光染料或无机荧光纳米颗粒，常用为硒化镉、碲化镉、硫化镉、硫化锌、硒化锌、碲化锌、硫化汞、硒化汞、碲化汞、砷化镓、砷化铟、碳化硅、硒化铅、硒化镁、硫化锌包被硒化镉核壳型（CdSe/ZnS）、硫化锌包碲化镉核壳型（CdTe/ZnS）、碳点、纳米金簇、纳米银簇、荧光石墨烯、复合荧光二氧化硅纳米粒子等，优选为半导体量子点。所述连接剂为1-乙基-3-（3-二甲胺基丙基）碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的混合物，其中按照摩尔比，N-羟基硫代琥珀酰亚胺不超过50%。所述缓冲溶液优选为0.2M的磷酸盐缓冲溶液，其pH值在7.4至8.4之间。
（2）制备癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液：将步骤（1）中制备的含癌胚抗原适配体-荧光物的缓冲液与浓度为40-60μg/mL的氧化石墨烯溶液，均匀混合，反应1至8小时，优选为4小时，使得癌胚抗原适配体-荧光物荧光淬灭，刚好猝灭适配体-荧光物的荧光所需氧化石墨烯的量为最佳浓度，得到癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液。
（3）制备毛细管电泳样品：将采集的生物样品经0.22μm滤膜过滤后，稀释1至50倍，使得样品中癌胚抗原浓度落在检出范围之内制得待检测样品，将待检测样品与步骤（2）中制备的癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混合均匀，反应2至8小时，优选为4小时，得到毛细管电泳样品。
（4）检测恢复荧光强度：将毛细管电泳样品进行毛细管电泳，距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的1/2-2/3处，优选为7/12处，进行荧光检测，获得恢复荧光强度，癌胚抗原适配体-荧光物的最大激发波长和最大发射波长选作检测用的激发波长和发射波长，根据恢复荧光强度，按照荧光强度标准曲线，测定癌胚抗原浓度。
所述毛细管电泳使用内径为50-100μm的熔融石英管，分离有效长度在35-60cm间，电场强度在150-400V/cm间，电泳温度恒定在20-30℃间，阳极、阴极及电泳缓冲液为pH在8.4至9.2之间的Na2B4O7-H3BO3溶液，虹吸进样高度15cm、时间15-35s。
所述荧光强度标准曲线，体现了癌胚抗原标准溶液（浓度0.257～12.9ng/mL）按照本方法检测到的荧光恢复强度和癌胚抗原浓度的对数之间的线性关系，通过测定样品按照本方法检测得到的荧光强度和癌胚抗原标准溶液做出的标准曲线，标定待测样品中癌胚抗原浓度。
所述标准曲线按照如下方法制作：
（a1）配制癌胚抗原标准溶液，其浓度呈现N个梯度，N≥10；
（a2）按照与按胚抗原检测方法相同的步骤用癌胚抗原标准溶液，代替待检测样品与所述癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混反应，制得N份标准品毛细管电泳样品。
（a3）将步骤（a2）中制得的N份标准品毛细管电泳样品，按照与按胚抗原检测方法相同的参数进行毛细管电泳和荧光检测，得到N份标准品毛细管电泳样品的荧光强度，即恢复荧光强度；
（a4）以癌胚抗原标准溶液相应的毛细管电泳样品的荧光强度及癌胚抗原标准溶液的对数为纵横坐标，根据所述N分标准品的检测结果，采用线性回归算法获取以癌胚抗原溶液的恢复荧光强度与癌胚抗原溶液浓度的对数的响应函数。
对于本发明提供的癌胚抗原方法，检测背景噪声，具体步骤为：以不含癌胚抗原的标准品溶液作为噪声检测溶液，按照所述癌胚抗原检测方法，检测噪声检测溶液的恢复荧光强度，从而测得背景噪声。按照检出限为3倍于背景噪声的原则，计算得到本发明提供的癌胚抗原将测方法，检出限为5pg/ml，远低于目前的癌胚抗原检测方法，相对于现有技术灵敏度显著提高。
本发明提供的癌胚抗原检测装置，如图2所示，包括毛细管电泳装置和荧光检验装置，所述毛细管电泳装置包括高压电源1，包含铂电极2的阳极缓冲液池3，包含铂电极2的阴极缓冲液池4，毛细管5；其毛细管总长50-100cm，内径为50-100μm，所述毛细管一端为进样口6置于阳极缓冲池3内，其另一端置于阴极缓冲液池4内，所述毛细管上距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的1/2-2/3处设有检测窗口，优选为7/12处；阳极缓冲液池3内盛有没过铂电极2的电解液，通过铂电极2与高压电源1的正极相连，阴极缓冲液池4内盛有没过铂电极2的电解液，通过铂电极2与高压电源1的负极相连；所述荧光检验装置，包括荧光显微镜7和光电转换器8；所述荧光显微镜设置在所述毛细管检测窗口处，与光电转换器8连接，光电转换器8将荧光显微镜收集到的荧光信号转换成电信号。优选地，荧光检测装置为倒置荧光显微镜检测平台，毛细管检测窗口位于显微镜物镜的上方，高压汞灯作为激发光源。
工作时，电泳采用虹吸法进样，进样时，将样机缓冲池3内的缓冲溶液换成待检测样品溶液，进样高度15cm,进样时间15-35s，进样的同时，记录光电转换器输出的电信号。
以下为实施例：
实施例1
一种癌胚抗原检测方法，包括以下步骤：
（1）制备癌胚抗原适配体-荧光物：将浓度为10-5M、30μL巯基乙酸钠修饰的半导体硫化锌包被硒化镉核壳型（CdSe/ZnS）量子点和连接剂混合，所述连接剂为1-乙基-3-（3-二甲胺基丙基）碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺摩尔比5:1混合物，将该混合液与50μL、120μM的癌胚抗原适配体缓冲溶液混合均匀，所述缓冲溶液为0.2M的磷酸盐缓冲溶液，pH值为8.4，使得荧光物质、连接剂和癌胚抗原适配体的摩尔比为1:1000:20，使荧光物和适配体之间发生缩合反应，反应3小时后，将混合液离心超滤，除去过量的癌胚抗原适配体，得到含癌胚抗原适配体-荧光物，加入100μLpH值为8.4、0.2M的磷酸盐缓冲溶液溶解。最终荧光物质、连接剂和癌胚抗原适配体浓度分别为3.0×10-6M、3.0×10-3M、6.0×10-5M。
（2）制备癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液：将步骤（1）中制备的含癌胚抗原适配体-荧光物的缓冲液与浓度为45μg/mL的氧化石墨烯溶液，均匀混合，反应8小时，使得癌胚抗原适配体-荧光物荧光淬灭；
（3）制备毛细管电泳样品：将采集的血液样品经0.22μm滤膜过滤后，稀释50倍得到待测样品，将待检测样品与步骤（2）中制备的癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混合均匀，反应4小时，得到毛细管电泳样品；
（4）检测恢复荧光强度：将毛细管电泳样品进行毛细管电泳，距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的7/12处进行荧光检测，获得恢复荧光强度，荧光激发波长为460nm，发射波长为半导体量子点的荧光最大发射波长630nm，根据恢复荧光强度，按照荧光强度标准曲线，测定癌胚抗原浓度。
所述毛细管电泳使用内径为75μm的弹性聚酰亚胺涂层熔融石英管，分离有效长度在35至60cm间，总长60cm，电场强度为400V/cm，电泳温度恒定在30℃，阳极、阴极及电泳缓冲液为pH8.7的Na2B4O7-H3BO3溶液，虹吸进样高度15cm、时间35s。
所述标准曲线按照如下方法制作：
（a1）配制癌胚抗原标准溶液，其浓度呈现N个梯度，N=10；
（a2）按照与按胚抗原检测方法相同的步骤用癌胚抗原标准溶液，代替待检测样品与所述癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混反应，制得N份标准品毛细管电泳样品。
（a3）将步骤（a2）中制得的N份标准品毛细管电泳样品，按照与按胚抗原检测方法相同的参数进行毛细管电泳和荧光检测，得到N份标准品毛细管电泳样品的荧光强度，即恢复荧光强度；
（a4）以癌胚抗原标准溶液相应的毛细管电泳样品的荧光强度及癌胚抗原标准溶液的对数为纵横坐标，根据所述N分标准品的检测结果，采用线性回归算法获取以癌胚抗原溶液的恢复荧光强度与癌胚抗原溶液浓度的对数的响应函数。
检测结果如表1所示。
实施例2
一种癌胚抗原检测方法，包括以下步骤：
（1）制备癌胚抗原适配体-荧光物：将浓度为10-7M、30μL牛血清蛋白修饰的荧光纳米金簇和连接剂混合，所述连接剂为1-乙基-3-（3-二甲胺基丙基）碳二亚胺盐酸盐的水溶液，将该混合液与50μL、6×10-7μM的癌胚抗原适配体缓冲溶液混合均匀，所述缓冲溶液为0.2M的磷酸盐缓冲溶液，pH值为8.0，使得荧光物质、连接剂和癌胚抗原适配体的摩尔比为1:500:10，使荧光物和适配体之间发生缩合反应，反应2小时后，将混合液离心超滤，除去过量的癌胚抗原适配体，得到含癌胚抗原适配体-荧光物加入100μL pH值为8.0、0.2M的磷酸盐缓冲溶液溶解。最终荧光物质、连接剂和癌胚抗原适配体浓度分别为3.0×10-8M、1.5×10-5M、3.0×10-7M。
（2）制备癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液：将步骤（1）中制备的含癌胚抗原适配体-荧光物的缓冲液与浓度为40μg/mL的氧化石墨烯溶液，均匀混合，反应4小时，使得癌胚抗原适配体-荧光物荧光淬灭；
（3）制备毛细管电泳样品：将采集的血液样品经0.22μm滤膜过滤后，稀释20倍得到待测样品，将待检测样品与步骤（2）中制备的癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混合均匀，反应8小时，得到毛细管电泳样品；
（4）检测恢复荧光强度：将毛细管电泳样品进行毛细管电泳，距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的2/3处进行荧光检测，获得恢复荧光强度，荧光激发波长为320nm，发射波长为荧光纳米金簇的最大发射波长430nm，根据恢复荧光强度，按照荧光强度标准曲线，测定癌胚抗原浓度。
所述毛细管电泳使用内径为100μm的弹性熔融石英管，分离有效长度为33cm，总长50cm，电场强度为150V/cm，电泳温度恒定在20℃，阳极、阴极及电泳缓冲液为pH9.2的Na2B4O7-H3BO3溶液，虹吸进样高度15cm、时间20s。
所述标准曲线按照如下方法制作：
（a1）配制癌胚抗原标准溶液，其浓度呈现N个梯度，N=12；
（a2）按照与按胚抗原检测方法相同的步骤用癌胚抗原标准溶液，代替待检测样品与所述癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混反应，制得N份标准品毛细管电泳样品。
（a3）将步骤（a2）中制得的N份标准品毛细管电泳样品，按照与按胚抗原检测方法相同的参数进行毛细管电泳和荧光检测，得到N份标准品毛细管电泳样品的荧光强度，即恢复荧光强度；
（a4）以癌胚抗原标准溶液相应的毛细管电泳样品的荧光强度及癌胚抗原标准溶液的对数为纵横坐标，根据所述N分标准品的检测结果，采用线性回归算法获取以癌胚抗原溶液的恢复荧光强度与癌胚抗原溶液浓度的对数的响应函数。
检测结果如表1所示。
实施例3
一种癌胚抗原检测方法，包括以下步骤：
（1）制备癌胚抗原适配体-荧光物：将浓度为10-6M、30μL荧光纳米银簇和连接剂混合，所述连接剂为1-乙基-3-（3-二甲胺基丙基）碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺1:1的混合物，将该混合液与50μL、3μM的癌胚抗原适配体缓冲溶液混合均匀，所述缓冲溶液为0.2M的磷酸盐缓冲溶液，pH值为7.4，使得荧光物质、连接剂和癌胚抗原适配体的摩尔比为1:200:5，使荧光物和适配体之间发生缩合反应，反应4小时后，将混合液离心超滤，除去过量的癌胚抗原适配体，得到含癌胚抗原适配体-荧光物加入100μL pH值为7.4、0.2M的磷酸盐缓冲溶液溶解。最终荧光物质、连接剂和癌胚抗原适配体浓度分别为3.0×10-7M、6.0×10-5M、1.5×10-6M。
（2）制备癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液：将步骤（1）中制备的含癌胚抗原适配体-荧光物的缓冲液与浓度为60μg/mL的氧化石墨烯溶液，均匀混合，反应1小时，使得癌胚抗原适配体-荧光物荧光淬灭；
（3）制备毛细管电泳样品：将采集的血液样品经0.22μm滤膜过滤后，稀释10倍得到待测样品，将待检测样品与步骤（2）中制备的癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混合均匀，反应2小时，得到毛细管电泳样品；
（4）检测恢复荧光强度：将毛细管电泳样品进行毛细管电泳，距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的1/2处进行荧光检测，获得恢复荧光强度，荧光激发波长为435nm，发射波长为纳米银的荧光最大发射波长500nm，根据恢复荧光强度，按照荧光强度标准曲线，测定癌胚抗原浓度。
所述毛细管电泳使用内径为50μm的弹性聚酰亚胺涂层熔融石英管，分离有效长度为50cm，总长100cm，电场强度为200V/cm，电泳温度恒定在25℃，阳极、阴极及电泳缓冲液为pH8.4的Na2B4O7-H3BO3溶液，虹吸进样高度15cm、时间15s。
所述标准曲线按照如下方法制作：
（a1）配制癌胚抗原标准溶液，其浓度呈现N个梯度，N=15；
（a2）按照与按胚抗原检测方法相同的步骤用癌胚抗原标准溶液，代替待检测样品与所述癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混反应，制得N份标准品毛细管电泳样品。
（a3）将步骤（a2）中制得的N份标准品毛细管电泳样品，按照与按胚抗原检测方法相同的参数进行毛细管电泳和荧光检测，得到N份标准品毛细管电泳样品的荧光强度，即恢复荧光强度；
（a4）以癌胚抗原标准溶液相应的毛细管电泳样品的荧光强度及癌胚抗原标准溶液的对数为纵横坐标，根据所述N分标准品的检测结果，采用线性回归算法获取以癌胚抗原溶液的恢复荧光强度与癌胚抗原溶液浓度的对数的响应函数。
检测结果如表1所示。
表1人血清样品中癌胚抗原含量的检测结果
实施例 对照结果(ng/mL) 检测结果(ng/mL)
1 130.8 130.9±2.8
2 74.2 73.3±1.9
3 未检出 1.57±0.05
其中对照结果，是通过DiaSorin癌胚抗原试剂盒检测得到的样品中癌胚抗原含量，检测结果是按照相应实施例中的操作步骤，每个样品检测三次得到癌胚抗原含量的最终结果。
实施例4
本发明提供的癌胚抗原检测装置，包括毛细管电泳装置和荧光检验装置，所述毛细管电泳装置包括高压电源1，包含铂电极2的阳极缓冲液池3，包含铂电极2的阴极缓冲液池4，毛细管5；其毛细管总长75cm，内径为75μm，所述毛细管一端为进样口6置于阳极缓冲池3内，其另一端置于阴极缓冲液池4内，所述毛细管上距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的7/12处设有检测窗口；阳极缓冲液池3内盛有没过铂电极2的电解液，通过铂电极2与高压电源1的正极相连，阴极缓冲液池4内盛有没过铂电极2的电解液，通过铂电极2与高压电源1的负极相连；所述荧光检验装置，包括荧光显微镜7和光电转换器8；所述荧光显微镜设置在所述毛细管检测窗口处，与光电转换器8连接，光电转换器8将荧光显微镜收集到的荧光信号转换成电信号。荧光检测装置为倒置荧光显微镜检测平台，毛细管检测窗口位于显微镜物镜的上方，高压汞灯作为激发光源。
工作时，电泳采用虹吸法进样，进样时，将阳极缓冲池3内的缓冲溶液换成待检测样品溶液，进样高度15cm,进样时间15-35s，进样的同时，记录光电转换器输出的电信号。
实施例5
本发明提供的癌胚抗原检测装置，包括毛细管电泳装置和荧光检验装置，所述毛细管电泳装置包括高压电源1，包含铂电极2的阳极缓冲液池3，包含铂电极2的阴极缓冲液池4，毛细管5；其毛细管总长50cm，内径为100μm，所述毛细管一端为进样口6置于阳极缓冲池3内，其另一端置于阴极缓冲液池4内，所述毛细管上距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的2/3处设有检测窗口；阳极缓冲液池3内盛有没过铂电极2的电解液，通过铂电极2与高压电源1的正极相连，阴极缓冲液池4内盛有没过铂电极2的电解液，通过铂电极2与高压电源1的负极相连；所述荧光检验装置，包括荧光显微镜7和光电转换器8；所述荧光显微镜设置在所述毛细管检测窗口处，与光电转换器8连接，光电转换器8将荧光显微镜收集到的荧光信号转换成电信号。
工作时，电泳采用虹吸法进样，进样时，将阳极缓冲池3内的缓冲溶液换成待检测样品溶液，进样高度15cm,进样时间15-35s，进样的同时，记录光电转换器输出的电信号。
实施例6
本发明提供的癌胚抗原检测装置，包括毛细管电泳装置和荧光检验装置，所述毛细管电泳装置包括高压电源1，包含铂电极2的阳极缓冲液池3，包含铂电极2的阴极缓冲液池4，毛细管5；其毛细管总长100cm，内径为50μm，所述毛细管一端为进样口6置于阳极缓冲池3内，其另一端置于阴极缓冲液池4内，所述毛细管上距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的1/2处设有检测窗口；阳极缓冲液池3内盛有没过铂电极2的电解液，通过铂电极2与高压电源1的正极相连，阴极缓冲液池4内盛有没过铂电极2的电解液，通过铂电极2与高压电源1的负极相连；所述荧光检验装置，包括荧光显微镜7和光电转换器8；所述荧光显微镜设置在所述毛细管检测窗口处，与光电转换器8连接，光电转换器8将荧光显微镜收集到的荧光信号转换成电信号。荧光检测装置为倒置荧光显微镜检测平台，毛细管检测窗口位于显微镜物镜的上方，高压汞灯作为激发光源。
工作时，电泳采用虹吸法进样，进样时，将阳极缓冲池3内的缓冲溶液换成待检测样品溶液，进样高度15cm,进样时间15-35s，进样的同时，记录光电转换器输出的电信号。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种癌胚抗原的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备癌胚抗原适配体-荧光物：将浓度为10-7M-10-5M荧光物质和连接剂溶液均匀混合，再将该混合液与癌胚抗原适配体的缓冲溶液混合均匀，使得荧光物质、连接剂、癌胚抗原适配体的摩尔比在1：200～1000：5～20，荧光物质的最终浓度在10-8M至10-5M，连接剂的最终浓度在0.025mg/ml至0.05mg/ml，癌胚抗原适配体的最终浓度在5×10-8M至2×10-4M；荧光物和癌胚抗原适配体发生缩合反应，除去过量的癌胚抗原适配体，得到含癌胚抗原适配体-荧光物的缓冲液；
（2）制备癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液：将步骤（1）中制备的含癌胚抗原适配体-荧光物的缓冲液与氧化石墨烯溶液均匀混合，反应1至8小时，氧化石墨烯使得癌胚抗原适配体-荧光物荧光淬灭，得到癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液；
（3）制备毛细管电泳样品：将待测样品与步骤（2）中制备的癌胚抗原适配体-荧光物/氧化石墨烯溶液混合均匀，反应2至8小时从而恢复荧光，得到毛细管电泳样品；
（4）检测恢复荧光强度：将毛细管电泳样品进行毛细管电泳，距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的1/2-2/3处进行荧光检测，获得恢复荧光强度，根据恢复荧光强度，按照荧光强度标准曲线，测定癌胚抗原浓度。
2.如权利要求1所述的癌胚抗原的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）其荧光物质、连接剂与癌胚抗原适配体的摩尔比为1:200:5。
3.如权利要求1所述的癌胚抗原的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述荧光物质为有机荧光染料或无机荧光纳米颗粒，常用为硒化镉、碲化镉、硫化镉、硫化锌、硒化锌、碲化锌、硫化汞、硒化汞、碲化汞、砷化镓、砷化铟、碳化硅、硒化铅、硒化镁、硫化锌包被硒化镉核壳型（CdSe/ZnS）、硫化锌包碲化镉核壳型（CdTe/ZnS）、碳点、纳米金簇、纳米银簇、荧光石墨烯或复合荧光二氧化硅纳米粒子，优选为半导体量子点。
4.如权利要求1所述的癌胚抗原的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述连接剂为1-乙基-3-（3-二甲胺基丙基）碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的混合物，其中按照摩尔比，N-羟基硫代琥珀酰亚胺不超过50%。
5.如权利要求1所述的癌胚抗原的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）其氧化石墨烯溶液浓度为40-60μg/mL。
6.如权利要求1所述的癌胚抗原的检测方法，其特征在于，步骤（4）毛细管电泳使用的毛细管为内径在50-100μm之间的熔融石英管。
7.如权利要求1所述的癌胚抗原的检测方法，其特征在于，步骤（4）毛细管电泳其电场强度在150-400V/cm间，电泳温度恒定在20-30℃间，阳极、阴极及电泳缓冲液为pH8.4-9.2的Na2B4O7-H3BO3溶液。
8.如权利要求7所述的癌胚抗原的检测方法，其特征在于，步骤（4）距阳极缓冲液池的距离为毛细管总长的7/12处进行荧光检测。
9.一种癌胚抗原检测装置，其特征在于，包括毛细管电泳装置和荧光检验装置，所述毛细管电泳装置，其毛细管（5）总长50-100cm，内径为50-100μm，所述毛细管上距阳极缓冲液池（3）的距离为毛细管总长的1/2-2/3处设有检测窗口，荧光检测装置设置在毛细管检测窗口处。
10.如权利要求9所述的癌胚抗原检测装置，其特征在于，所述毛细管为弹性聚酰亚胺涂层熔融石英管。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104977292A (zh) * 2015-06-15 2015-10-14 吉林大学 多元电致化学发光dna传感器及用于病毒的检测
CN105527433A (zh) * 2015-12-18 2016-04-27 南京邮电大学 一种检测肿瘤标志物的荧光方法
CN106771204A (zh) * 2017-01-18 2017-05-31 中南大学 一种癌胚抗原浓度的检测方法
CN107202881A (zh) * 2017-05-27 2017-09-26 山东农业大学 量子点标记仿生免疫分析‑毛细管电泳检测敌百虫方法
CN107831152A (zh) * 2017-10-31 2018-03-23 天津大学 一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒及检测的方法
CN110108876A (zh) * 2019-03-19 2019-08-09 青岛科技大学 一种基于dna碳点-硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法
CN110221085A (zh) * 2019-05-31 2019-09-10 江苏大学 一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂及应用
CN110308289A (zh) * 2019-06-19 2019-10-08 江苏大学 氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂及应用
CN110426524A (zh) * 2019-08-21 2019-11-08 安邦（厦门）生物科技有限公司 一种abo血型双判读反定型检测系统和检测方法
WO2021189522A1 (zh) * 2020-03-27 2021-09-30 暨南大学 基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5730850A (en) * 1993-04-23 1998-03-24 Hitachi, Ltd. Capillary array electrophoresis system
CN1719244A (zh) * 2004-07-09 2006-01-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种毛细管电泳多维装置
CN101788479A (zh) * 2010-01-22 2010-07-28 华中科技大学 对基于量子点的荧光共振能量转移进行高灵敏度检测的方法
CN102879365A (zh) * 2012-09-21 2013-01-16 常州大学 一种毛细管电泳荧光检测装置
CN203310753U (zh) * 2013-05-24 2013-11-27 南开大学 多波长毛细管电泳荧光激发器
CN103529005A (zh) * 2013-10-16 2014-01-22 江苏禾尔思生物科技有限公司 高效毛细管电泳－激光诱导荧光检测设备及诊断的试剂盒在乳腺癌症早期诊断的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5730850A (en) * 1993-04-23 1998-03-24 Hitachi, Ltd. Capillary array electrophoresis system
CN1719244A (zh) * 2004-07-09 2006-01-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种毛细管电泳多维装置
CN101788479A (zh) * 2010-01-22 2010-07-28 华中科技大学 对基于量子点的荧光共振能量转移进行高灵敏度检测的方法
CN102879365A (zh) * 2012-09-21 2013-01-16 常州大学 一种毛细管电泳荧光检测装置
CN203310753U (zh) * 2013-05-24 2013-11-27 南开大学 多波长毛细管电泳荧光激发器
CN103529005A (zh) * 2013-10-16 2014-01-22 江苏禾尔思生物科技有限公司 高效毛细管电泳－激光诱导荧光检测设备及诊断的试剂盒在乳腺癌症早期诊断的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZI-MING ZHOU ET AL.: "Carcino-embryonic antigen detection based on fluorescence resonance energy transfer between quantum dots and grapheme oxide", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》, vol. 59, 8 April 2014 (2014-04-08) *
张月侠等: "基于适配体亲和毛细管电泳-激光诱导荧光检测的凝血酶分析", 《色谱》, vol. 27, no. 03, 31 May 2009 (2009-05-31), pages 333 - 336 *
黎源倩等: "毛细管电泳-激光诱导荧光检测装置的研制及应用", 《四川大学学报(医学版)》, vol. 35, no. 01, 31 December 2004 (2004-12-31) *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104977292A (zh) * 2015-06-15 2015-10-14 吉林大学 多元电致化学发光dna传感器及用于病毒的检测
CN104977292B (zh) * 2015-06-15 2017-08-11 吉林大学 多元电致化学发光dna传感器及用于病毒的检测
CN105527433A (zh) * 2015-12-18 2016-04-27 南京邮电大学 一种检测肿瘤标志物的荧光方法
CN106771204A (zh) * 2017-01-18 2017-05-31 中南大学 一种癌胚抗原浓度的检测方法
CN106771204B (zh) * 2017-01-18 2018-12-14 中南大学 一种癌胚抗原浓度的检测方法
CN107202881B (zh) * 2017-05-27 2018-09-25 山东农业大学 量子点标记仿生免疫分析-毛细管电泳检测敌百虫方法
CN107202881A (zh) * 2017-05-27 2017-09-26 山东农业大学 量子点标记仿生免疫分析‑毛细管电泳检测敌百虫方法
CN107831152A (zh) * 2017-10-31 2018-03-23 天津大学 一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒及检测的方法
CN107831152B (zh) * 2017-10-31 2019-08-30 天津大学 三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法
CN110108876A (zh) * 2019-03-19 2019-08-09 青岛科技大学 一种基于dna碳点-硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法
CN110108876B (zh) * 2019-03-19 2022-06-17 青岛科技大学 Dna碳点-硅纳米水凝胶材料在制备荧光检测血清中癌胚抗原的试剂中的应用
CN110221085A (zh) * 2019-05-31 2019-09-10 江苏大学 一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂及应用
CN110308289A (zh) * 2019-06-19 2019-10-08 江苏大学 氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂及应用
CN110426524A (zh) * 2019-08-21 2019-11-08 安邦（厦门）生物科技有限公司 一种abo血型双判读反定型检测系统和检测方法
WO2021189522A1 (zh) * 2020-03-27 2021-09-30 暨南大学 基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法

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