CN104977292B - 多元电致化学发光dna传感器及用于病毒的检测 - Google Patents
多元电致化学发光dna传感器及用于病毒的检测 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104977292B CN104977292B CN201510330078.4A CN201510330078A CN104977292B CN 104977292 B CN104977292 B CN 104977292B CN 201510330078 A CN201510330078 A CN 201510330078A CN 104977292 B CN104977292 B CN 104977292B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- hepatitis
- marks
- virus
- gce
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Abstract
本发明属于量子点和石墨烯应用技术领域，具体涉及一种基于双色CdTe量子点、石墨烯和金纳米粒子(Au NPs)构建的多元电致化学发光DNA传感器及用于同时检测俩种病毒目标DNA。该方法基于Au NPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE构建一种新型的和高灵敏的多元电致化学发光DNA传感器。与其他传感器相比，这个多元电致化学发光DNA传感器提供了一个简单、便捷、低成本和高灵敏的方法来同时检测人血清中乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的含量。其具备良好的灵敏性、选择性、重复性和稳定性，可广泛应用于病毒目标DNA的检测。
Description
技术领域
本发明属于量子点和石墨烯应用技术领域，具体涉及一种基于双色CdTe量子点、石墨烯和金纳米粒子(Au NPs)构建的多元电致化学发光DNA传感器及用于同时检测两种病毒目标DNA，本发明以检测乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA为例。
背景技术
半导体纳米粒子又叫量子点(Quantum dots，QDs)，由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成，也可由两种或两种以上的半导体材料组成核壳型量子点。通常包含几百到几千个原子，一般为球形或类球形，粒径为1～10nm。与传统的有机染料和荧光蛋白相比，量子点在许多方面拥有着独特的优势：可调变的荧光性、高的量子产率、较宽的激发波长范围、对称的发射峰且半峰宽较窄、以及良好的光化学稳定性等。与传统的荧光染料比较，量子点作为一种新型的发光体具有许多良好的光学特性：
(1)发射光谱可调。量子点的发射波长的大小可通过在合成过程中控制试剂的组成和合成的时间来调解。通过改变量子点的种类和量子点粒径的大小，可产生一系列的发射波长和颜色分明的量子点。
(2)吸收光谱很宽，发射光谱很窄。量子点的有效激发的波段很宽。利用同一个激发光源，就可激发不同尺寸、不同种类的量子点。
(3)荧光寿命长，稳定性好。量子点的荧光寿命很长，即使连续激发，荧光强度也不会有明显的下降。量子点即使在激光的高强度和长时间的照射下，光学特性也不会有明显变化。它的稳定性远远高于寻常的荧光染料，可进行对标记物长时间的动态观察。
(4)生物相容性好。表面修饰后的量子点可以特异性联接，细胞毒性小，可用于活体标记。
(5)具有空间兼容性。一个量子点可偶联两种或两种以上的生物分子或配体。
量子点作为一种新型的纳米材料，在过去的十年里，吸引了许多关注。作为一个优良的光学材料，量子点已被广泛用于检测分析领域中的各种物质，比如：小分子、蛋白质和DNA。量子点优异的光学和电学特性，令量子点在生物分析中应用广泛，并具有很强的竞争力。尺寸可控的性质令量子点在多组分生物分析中大放异彩。
电致化学发光(Electrochemiluminescence，简称ECL)，是一种将电能转化为辐射能量的方法。电致化学发光是指对电极施加电压或电流，反应物或反应产物与体系中其它组分之间发生电化学反应，使发光体激发产生激发态，当激发态返回基态时，以光辐射的形式释放能量而产生的化学发光的现象。电致化学发光是在化学发光和电化学的基础上发展的一种新型的产物。
量子点的ECL现象是在本世纪初才发展起来的。量子点作为新型的ECL发光体，其ECL的产生是在电极上施加电压后，产生氧化型空穴和还原型电子分别通过电化学氧化还原反应注入到量子点的表面或者中心导带，产生了激发态量子点，当激发态量子点跃迁回到基发态时就产生了电致化学发光。量子点的电致化学发光的发光机理同时遵循湮灭型电致化学发光和共反应剂参与的电致化学发光的发光机理。量子点的常用共反应剂有S2O8 2-、H2O2、溶解氧及C2O4 2-等。量子点的电致化学发光不要求小尺寸的纳米粒子，因而不需要苛刻的合成条件来控制量子点的粒径大小。目前除了理论研究外，量子点作为ECL标记物，在传感分析方面也已拓展到生物小分子、免疫分析、核酸分析以及细胞分析等领域。水相合成的量子点可直接通过表面修饰来制备电致化学发光生物传感器分析检测生物分子已经报道了很多，但有关电致化学发光DNA传感器的报道还很少。探索一种基于双色CdTe量子点构建多元电致化学发光DNA传感器的方法，对降低成本以及提高其在生物医学领域的实际应用价值有着重要的作用。
发明内容
本发明针对一元电致化学发光DNA传感器，提出了一种新颖的基于双色CdTe量子点、石墨烯和金纳米粒子(Au NPs)构建的多元电致化学发光DNA传感器。
本发明所述的多元电致化学发光DNA传感器提供了一种简单、便捷、低成本和高灵敏的方法来同时检测乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA。并且，本发明所述的电致化学发光DNA传感器已经成功地应用到同时检测人血清中乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的含量，并取得了满意的结果。
本发明所述的一种多元电致化学发光DNA传感器，其特征在于是由如下步骤制备得到：
1)首先，使用1.0μm～0.05μm纳米氧化铝粉末(α-Al2O3)将玻碳电极(GCE)抛光，抛光后的玻碳电极用蒸馏水、乙醇和蒸馏水超声清洗去除吸附的物质，然后纯氮气环境下吹干，得到表面抛光的玻碳电极；
2)将10～30μL、0.10～0.3mg·mL-1氧化石墨烯(GO)水溶液滴到步骤1)制备的玻碳电极表面，20～30℃下干燥，在GCE表面得到GO薄膜，记为GO/GCE；
3)在0V到-1.5V的电位下、0.1V s-1～0.5V s-1的扫描速率下、pH＝7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，以玻碳电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，连续扫描步骤2)得到的GO/GCE 10～20个周期，氧化石墨烯(GO)经过电化学还原得到石墨烯片层(GNs)，从而在GCE表面得到GNs薄膜，记为GNs/GCE；
4)将5～10μL、530～550nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA和5～10μL、600～620nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA溶液一同滴到步骤3)制备的GNs/GCE表面，20～30℃下干燥，在GCE表面得到CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs复合薄膜，记为CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE；
5)将步骤4)制备的CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE浸到与其碱基互补的乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的混合溶液中，90～95℃下混合5～10min，然后快速冷却到20～30℃，在GCE表面得到病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs复合薄膜，记为病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE；
6)将步骤5)制备的病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE进一步浸到与病毒捕获DNA碱基互补的Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA的混合溶液中，90～95℃下混合5～10min，然后快速冷却到20～30℃，在GCE表面得到Au NPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs复合薄膜，记为Au NPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE；从而得到基于Au NPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE构建的一种新型的多元电致化学发光DNA传感器。
上述步骤中所述的530～550nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA和600～620nmCdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA，是由如下骤制备得到：
1)通过以巯基丙酸(MPA)为稳定剂的回流冷却水热合成方法(WANG C,MA Q,SUX.Synthesis of CdTe Nanocrystals with Mercaptosuccinic Acid as Stabilizer[J].J.Nanosci.Nanotechnol.,2008,8,4408-4414)合成发射波长为530～550nm的CdTe QDs和600～620nm的CdTe QDs水溶液；
2)分别在3～5mL的发射波长为530～550nm的CdTe QDs和600～620nm的CdTe QDs水溶液中加入0.45～0.75mL、1～5μmol·L-11-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液和0.18～0.30mL、1～5μmol·L-1N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)水溶液，搅拌0.5～1h来活化CdTe量子点上的羧基；
3)然后，向步骤2)制备的活化后的发射波长为530～550nm的CdTe QDs水溶液中加入90～110μL、5～10μmol·L-1的乙肝病毒捕获DNA；向步骤2制备的活化后的发射波长为600～620nm的CdTe QDs水溶液中加入90～110μL、5～10μmol·L-1的丙肝病毒捕获DNA；分别继续搅拌3～4h；通过CdTe量子点上的羧基和病毒捕获DNA上的氨基结合形成稳定的酰胺键来制备发射波长为530～550nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA和发射波长为600～620nmCdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA；
4)接着，分别向步骤3)制备的两种溶液中加入2～5mL的异丙醇来沉淀CdTe QDs标记的病毒捕获DNA，未反应的试剂通过高速离心10～20min去除(转速为10000～15000rpm)；
5)最后分别用3～5mL、5～10mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液溶解530～550nm CdTeQDs标记的乙肝病毒捕获DNA和600～620nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA，之后放在4～5℃冰箱里储存备用；
上述步骤中所述的Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA，是由如下步骤制备得到：
1)、通过柠檬酸盐还原氯金酸(HAuC14)来合成金纳米粒子(AuNPs)。(GAO F,CUIP,CHEN X,et al.A DNA hybridization detection based on fluorescence resonanceenergy transfer between dye-doped core-shell silica nanoparticles and goldnanoparticles[J].Analyst,2011,136,3973-3980)；再分别使用300～400μL、1～5μmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液来溶解乙肝病毒探针DNA和丙肝病毒探针DNA；
2)、将步骤1)制备的溶解后的乙肝病毒探针DNA和丙肝病毒探针DNA溶液分别与3～5mL的Au NPs溶液混合，并避光过夜静置；然后每隔30～40min分别向混合物中重复2～3次缓慢地加入50～60μL、3～4mol·L-1NaCl水溶液来调节盐浓度为300～400mmol·L-1；
3)、经过避光过夜静置后，分别在10000～15000rpm转速下离心30～40min来去除没有反应的试剂。接着用10～15mmol·L-1Tris-HCl(pH＝7.0～7.5)缓冲溶液分别洗涤制备的Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA2～3次。
4)、然后将步骤3)制备的Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA分别溶解在3～5mL的10～15mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液里。最终，把通过静电力结合来制备Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA保存在4～5℃冰箱中储存备用。
本发明基于Au NPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE构建一种新型的和高灵敏的多元电致化学发光DNA传感器来同时检测乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA。这个电致化学发光DNA传感器具有良好的灵敏性、选择性、重复性和稳定性，利用此传感器同时检测人血清样品中的乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的含量得到了满意的结果。
附图说明
图1：氧化石墨烯修饰玻碳电极的循环伏安曲线。
图2：(A)发射波长为551nm的CdTe QDs(a)和551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA(b)的紫外-可见吸收光谱；发射波长为551nm的CdTe QDs(c)和551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA(d)的荧光发射光谱。(B)发射波长为607nm的CdTe QDs(a)和607nm CdTeQDs标记的丙肝病毒捕获DNA(b)的紫外-可见吸收光谱；发射波长为607nm的CdTe QDs(c)和607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA(d)的荧光发射光谱。
图3：Au NPs(a)，Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA(b)和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA(c)的紫外-可见吸收光谱。
图4：GCE(a)，GNs/GCE(b)，CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE(c)，病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE(d)，CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GCE(e)，AuNPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE(f)的电化学阻抗谱。包含2.5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1M KCl水溶液作为支持电解质溶液，频率范围为0.01Hz-100kHz，振幅为5mV。
图5：K2S2O8的浓度对多元电致化学发光DNA传感器的电致化学发光强度的影响。
图6：磷酸缓冲溶液的pH值对多元电致化学发光DNA传感器的电致化学发光强度的影响。
图7：扫描速率对多元电致化学发光DNA传感器的电致化学发光强度的影响。
图8：(A)551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA/GCE(a)，551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(b)，0.5nmol·L-1乙肝病毒目标DNA/551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(c)，Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA/551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(d)，Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA/0.1nmol·L-1乙肝病毒目标DNA/551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(e)，Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA/0.5nmol·L-1乙肝病毒目标DNA/551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(f)的电致化学发光曲线。
(B)607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA/玻碳电极(a)，607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(b)，0.5nmol·L-1丙肝病毒目标DNA/607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(c)，Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA/607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(d)，Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA/0.1nmol·L-1丙肝病毒目标DNA/607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(e)，Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA/0.5nmol·L-1丙肝病毒目标DNA/607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(f)的电致化学发光曲线。
图9：多元电致化学发光DNA传感器在不同时间间隔下的稳定性曲线。
图10：多元电致化学发光DNA传感器的连续电致化学发光曲线(A)Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA/0.3nmol·L-1乙肝病毒目标DNA/551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE(B)Au NPs标记的丙肝病毒探DNA/0.3nmol·L-1丙肝病毒目标DNA/607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE。
图11：Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA/不同浓度的乙肝病毒目标DNA/551nm CdTeQDs标记的乙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE复合薄膜的电致化学发光曲线，乙肝病毒目标DNA的浓度(a-f)(nmol·L-1)为：(a)0.0005，(b)0.001，(c)0.01，(d)0.1，(e)0.3，and(f)0.5；内插图为乙肝病毒目标DNA的标准线性曲线。
图12：Au NPs标记的丙肝病毒探DNA/不同浓度的丙肝病毒目标DNA/607nm CdTeQDs标记的丙肝病毒捕获DNA/GNs/GCE复合薄膜的电致化学发光曲线，丙肝病毒目标DNA的浓度(a-f)(nmol·L-1)为：(a)0.001，(b)0.01，(c)0.1，(d)0.3，(e)0.5，(f)0.8，and(g)1.0；内插图为丙肝病毒目标DNA的标准线性曲线。
图13：(A)电致化学发光强度比ΔI/I0(ΔI＝I-I0)：(a)互补的乙肝病毒目标DNA；(b)只有一个错配的碱基的乙肝病毒目标DNA。(B)电致化学发光强度比ΔI/I0(ΔI＝I-I0)：(c)互补的丙肝病毒目标DNA；(d)只有一个错配的碱基的丙肝病毒目标DNA。I和I0分别代表了电致化学发光强度存在和缺少病毒目标DNA或只有一个错配的碱基的病毒目标DNA。所有病毒目标DNA或只有一个错配的碱基的病毒目标DNA的浓度为0.3nmol·L-1。
具体实施方式
实施例1
首先，使用1.0μm和0.05μm纳米氧化铝粉末(α-Al2O3)将玻碳电极(GCE)抛光，抛光后的玻碳电极用蒸馏水、乙醇和蒸馏水超声清洗去除吸附的物质，然后纯氮气环境下吹干，得到表面抛光的玻碳电极；将10μL的0.12mg·mL-1氧化石墨烯(GO)水溶液滴到玻碳电极表面，25℃下干燥，在GCE表面得到GO薄膜，记为GO/GCE；在0V到-1.5V的电位下，扫描速率为0.1V s-1、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，三电极模式下(玻碳电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极)，连续扫描GCE表面的GO薄膜10个周期，氧化石墨烯经过电化学还原得到石墨烯片层(GNs)，在GCE表面得到GNs薄膜，记为GNs/GCE；
将10μL的551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA和10μL的607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA溶液一同滴到GNs/GCE表面，25℃下干燥，在GCE表面得到CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs复合薄膜，记为CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE；将CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE浸到与其碱基互补的乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的混合溶液中，90℃下混合5min，然后快速冷却到25℃，在GCE表面得到病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs复合薄膜，记为病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE；
将病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE进一步浸到与病毒捕获DNA碱基互补的Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA的混合溶液中，90℃下混合5min，然后快速冷却到25℃，在GCE表面得到Au NPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs复合薄膜，记为Au NPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE；从而得到基于Au NPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE构建的一种新型的多元电致化学发光DNA传感器。
最终，将这个电致化学发光DNA传感器储存在pH＝7.0的0.1mol·L-1PBS溶液里，放在4℃冰箱中备用。所有的电致化学发光测量都是在一个自制的玻璃容器里，磷酸缓冲溶液(PBS)为0.1mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4-Na3PO4包含0.1mol·L-1KCl和0.08mol·L-1K2S2O8,pH＝7.4作为支持电解质，其中，K2S2O8为CdTe QDs电致化学发光的共反应物。将传统三电极：玻碳电极(GCE)作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极插入支持电解质溶液进行测量，扫描电位设为从0.0V到-2.5V。
实施例2
首先，通过以巯基丙酸(MPA)为稳定剂的回流冷却水热合成方法合成发射波长为551nm的CdTe QDs和607nm的CdTe QDs水溶液；之后，分别在3mL的发射波长为551nm的CdTeQDs和607nm的CdTe QDs水溶液中加入0.45mL、1μmol·L-11-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液和0.18mL、1μmol·L-1N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)水溶液，搅拌0.5h来活化CdTe量子点上的羧基。
然后，向活化后的发射波长为551nm的CdTe QDs水溶液中加入100μL、10μmol·L-1的乙肝病毒捕获DNA；向活化后的发射波长为607nm的CdTe QDs水溶液中加入100μL、10μmol·L-1的丙肝病毒捕获DNA；分别继续搅拌3h；通过CdTe量子点上的羧基和病毒捕获DNA上的氨基结合形成稳定的酰胺键来制备发射波长为551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA和发射波长为607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA；接着，分别向两种溶液中加入2mL的异丙醇来沉淀CdTe QDs标记的病毒捕获DNA，未反应的试剂通过高速离心10min去除(转速为10000rpm)；
最后，分别用3mL、10mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液溶解551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA和607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA，之后放在4℃冰箱里储存备用；
实施例3
首先，通过柠檬酸盐还原氯金酸(HAuC14)来合成金纳米粒子(AuNPs)。再分别使用300μL、1μmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液来溶解乙肝病毒探针DNA和丙肝病毒探针DNA；将溶解后的乙肝病毒探针DNA和丙肝病毒探针DNA溶液分别与3mL的Au NPs溶液混合，并避光过夜静置；然后每隔30min分别向混合物中重复3次缓慢地加入50μL、3mol·L-1NaCl水溶液来调节盐浓度为300mmol·L-1；
经过避光过夜静置后，分别在15000rpm转速下离心30min来去除没有反应的试剂。接着用10mmol·L-1Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液分别洗涤制备的AuNPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA2次。
然后将Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA分别溶解在3mL的10mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液里。最终，把通过静电力结合来制备Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA保存在4℃冰箱中。
实施例4
氧化石墨烯修饰在玻碳电极上后在在0V到-1.5V的电位下和pH＝7.0的0.1mol·L-1磷酸盐缓冲溶液中扫描循环伏安曲线。附图1中的循环伏安曲线可以说明石墨烯在玻碳电极上的形成过程，由于表面含氧基团的还原，图中显示了一个很大的阴极电流峰。在随后的周期中，在负电位上的还原电流明显减弱，而后在剩余的电位扫描中消失。这说明氧化石墨烯表面的含氧基团的还原是快速地和不可逆地，并且剥离的氧化石墨烯可以直接在负电位下发生电化学还原形成石墨烯片层。
实施例5
附图2A表征了发射波长为551nm的CdTe QDs和551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱。551nm的CdTe QDs和551nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA的紫外最大吸收波长分别为491nm和492nm，荧光发射峰分别为551nm和556nm。
如附图2B所示，发射波长为607nm的CdTe QDs和607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱；发射波长为607nm的CdTe QDs和607nmCdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA的紫外最大吸收波长分别为557nm和554nm，荧光发射峰分别为607nm和592nm。
如附图3，Au NPs，Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA的紫外-可见吸收光谱。对比Au NPs的紫外吸收波长为518nm，Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA的紫外最大吸收波长分别为530nm和535nm，分别红移了12nm与17nm。这说明乙肝病毒探针DNA和丙肝病毒探针DNA已经成功地连接到Au NPs的表面。
实施例6
附图4中的电化学阻抗谱(EIS)证明了电极的修饰步骤。在更高频率上的半圆直径对应着电子转换阻力(Ret)，在较低频率上的直线部分对应着扩散过程。由附图4可以看出GCE的EIS显示了较低的电子转换阻力，即Ret＝99.5Ω，它的特征是大规模的扩散限制过程(附图4a)。玻碳电极修饰上电化学还原的石墨烯以后(GNs/GCE)，电子转换阻力(Ret)增加到244.5Ω(附图4b)。随着进一步将CdTe QDs标记的捕获DNA涂到GNs/GCE上，电子转换阻力(Ret)增加到289.6Ω(附图4c)。当在CdTe QDs标记的捕获DNA/GNs/GCE上固定上病毒目标DNA以后，电子转换阻力(Ret)明显地增加到818.3Ω(附图4d)。当CdTe QDs标记的捕获DNA单独修饰到GCE上时，电子转换阻力(Ret)增加到1024Ω(附图4e)。显而易见，蛋白质的非导体的性质阻碍了电子传递，导致电阻增强。对比CdTe QDs标记的捕获DNA/GCE，GNs/GCE或病毒目标DNA/CdTe QDs标记的捕获DNA/GNs/GCE的电化学阻抗谱上的半圆形的直径显著减小。这说明了半导体CdTe量子点对导电性具有阻碍作用，也进一步证明GNs的存在能够促进电子转移。当在病毒目标DNA/CdTe QDs标记的捕获DNA/GNs/GCE上固定上Au NPs标记的探针DNA以后，电子转换阻力(Ret)减小到521.7Ω(附图4f)。电化学阻抗谱上的半圆形的直径的减小,表明Au NPs的存在能够促进导电性。
实施例7
我们分别研究了共反应物K2S2O8的浓度、pH值和扫描速率对多元电致化学发光DNA传感器的电致化学发光强度的影响。附图5研究了共反应物K2S2O8的浓度对电致化学发光强度的影响。如附图5所示，随着共反应物K2S2O8的浓度的增大，多元电致化学发光DNA传感器的电致化学发光强度也同时随着增强，直到浓度为0.08mol·L-1时，电致化学发光强度达到最高值。由于共反应物K2S2O8的浓度越大，达到最高电致化学发光强度时所需要的时间也就越短。因此，0.08mol·L-1的K2S2O8浓度选作最佳浓度。
包含0.1mol·L-1KCl和0.08mol·L-1K2S2O8的PBS水溶液的pH值对DNA传感器的电致化学发光反应有较强的影响。如附图6所示，随着pH值从5.0增加到7.4，多元电致化学发光DNA传感器的电致化学发光强度也随着增强。当pH值高于7.4时，电致化学发光信号开始减弱。所以，pH＝7.4的PBS包含0.08mol·L-1K2S2O8和0.1mol·L-1KCl的水溶液被用作电致化学发光DNA传感器的电解质溶液。
电致化学发光效率明显依靠激发态量子点的产生和湮没的比率。从附图7我们可以看出，多元电致化学发光DNA传感器的电致化学发光强度随着扫描速率的增快而增强。直到扫描速率为0.1V s-1时，电致化学发光强度达到最高值。这是因为在很短的时间内会形成更多的激发态量子点。快速的扫描速率可以在很短的时间内丰富激发态量子点从而增强电致化学发光强度。当扫描速率高于0.1V s-1时，由于电化学过程是不可逆的，所以电致化学发光强度趋向于减弱。这说明快速的扫描速率不利于CdTe量子点发生电化学反应。为了获得最大的电致化学发光强度，0.1V s-1的扫描速率被选作最佳扫描速率。
实施例8
附图8证明了多元电致化学发光DNA传感器来同时检测乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的原理。如附图8A(a,b)和B(a,b)所示，对比CdTe QDs标记的捕获DNA单独修饰GCE的薄膜，CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE的电致化学发光强度显著性增强。这证明GNs的存在促进了551nm CdTe QDs，607nm CdTe QDs和电极之间的电子转移，明显放大了551nm CdTe QDs和607nm CdTe QDs的电致化学发光信号。如附图8A(b,c)和B(b,c)所示，随着0.5nmol·L-1乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的加入，对比CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE，电致化学发光强度没有明显变化。说明乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA对CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE的电致化学发光强度没有影响。如附图8A(b,d)和B(b,d)所示，当Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA连接到CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE上，由于内滤作用，电致化学发光强度明显地降低。如果没有乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的加入，所有在CdTe量子点表面的捕获DNA会与互补的Au NPs标记的探针DNA完全杂交。当加入乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA以后，一些在CdTe量子点表面的病毒捕获DNA会与互补的病毒目标DNA杂交，未反应的病毒捕获DNA会与互补的Au NPs标记的病毒探针DNA杂交。加入的病毒目标DNA越多，CdTe量子点表面未反应的病毒捕获DNA就越少。与病毒捕获DNA杂交的Au NPs标记的病毒探针DNA就越少，电致化学发光信号就越强。如附图8A(e,f)和B(e,f)，双色CdTe量子点的电致化学发光信号随着乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的加入而增强。
实施例9
多元电致化学发光DNA传感器的稳定性可以通过监测电致化学发光信号的响应来进行评估。如附图9所示，当多元电致化学发光DNA传感器浸在PBS水溶液里储存在4℃冰箱3天以后，检测0.3nmol·L-1乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的电致化学发光强度分别是初始值的99％和98％。当储存10天以后，电致化学发光强度分别保持初始值的96％和93％。15天以后，电致化学发光强度分别都降到初始值的92％。这些结果表明这个多元电致化学发光DNA传感器具有良好的储存稳定性。如附图10A和B，当多元电致化学发光DNA传感器浸在PBS水溶液里储存在4℃冰箱10天以后，连续扫描了电致化学发光信号与时间的曲线10个周期。电致化学发光响应没有表现明显的变化，同时也表明了本发明的多元电致化学发光DNA传感器是非常稳定的。
实施例10
在最优条件下，我们同时记录了杂交体系杂交上不同浓度的乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的电致化学发光强度变化。从附图11可以看到，随着乙肝病毒目标DNA浓度的增加，电致化学发光强度随之增强。附图11的插图展示了电致化学发光强度与乙肝病毒目标DNA的浓度范围为0.0005-0.5nmol·L-1成线性关系，线性回归方程为I＝(6652.59±172.39)+(15243.48±713.66)C(nmol·L-1)，I和C分别为电致化学发光强度和乙肝病毒目标DNA的浓度，相关系数为R2＝0.9956，检出限(S/N＝3)为0.082pmol·L-1。附图11还表明了测定乙肝病毒目标DNA标准曲线的电致化学发光信号具有很好的重复性和稳定性。
从附图12可以看到，随着丙肝病毒目标DNA浓度的增加，电致化学发光强度随之增强。附图12的插图展示了电致化学发光强度与丙肝病毒目标DNA浓度范围为0.001-1.0nmol·L-1成线性关系，线性回归方程为I＝(9579.84±176.99)+(13013.61±215.25)C(nmol·L-1)，I和C分别为电致化学发光强度和丙肝病毒目标DNA的浓度，相关系数为R2＝0.9993，检出限(S/N＝3)为0.34pmol·L-1。附图12也表明了测定丙肝病毒目标DNA标准曲线的电致化学发光信号具有很好的重复性和稳定性。
实施例11
选择性是评估一个新型的多元电致化学发光DNA传感器性能的最重要的参数。我们用一个碱基错配的乙肝病毒目标DNA和一个碱基错配的丙肝病毒目标DNA的序列来研究该杂交体系的选择性。附图13A显示了不同情况下乙肝病毒目标DNA检测时的电致化学发光强度比(ΔI/I0)：(a)完全互补的乙肝病毒目标DNA；(b)一个碱基错配的乙肝病毒目标DNA。附图13B显示了不同情况下丙肝病毒目标DNA检测时的相对荧光强度(ΔI/I0)：(c)完全互补的丙肝病毒目标DNA；(b)一个碱基错配的丙肝病毒目标DNA。ΔI＝I-I0，I和I0指的是分别存在和缺少两种病毒目标DNA或碱基错配的病毒目标DNA条件下DNA传感器的电致化学发光强度。可以看出，在两种病毒目标DNA或碱基错配的病毒目标DNA的浓度均为0.3nmol·L-1时，一个碱基错配的乙肝病毒目标DNA与一个碱基错配的丙肝病毒目标DNA分别和551nmCdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA，607nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA杂交后，其ΔI/I0值分别为加入同浓度的乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的2.5％和3.5％。这些结果表明这两种碱基错配的病毒目标DNA和病毒目标DNA相比，具有很低的杂交能力，也进一步证明这个多元电致化学发光DNA传感器对同时检测乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA有良好的选择性。
实施例12
为了评价我们的发明在实际样品检测中的可行性，我们用本发明设计的多元电致化学发光DNA传感器来同时检测人血清样品中的乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA。通过标准加入法(KOSCIELNIAK P,HERMAN M.Simple flow system for calibration by thestandard addition method[J].Chemia Analityczna,1999,44,773-784.)测定的检测结果列于表2中。从表2可以看出，乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的回收率的范围为95～102％，相对标准偏差(RSD)低于2.22％。这些结果说明新型的多元电致化学发光DNA传感器可以准确检测人血清样品中的乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA。
表1：本发明使用的所有寡核苷酸序列
表2 基于多元电致化学发光DNA传感器来同时检测人血清中乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA含量的结果
Claims (5)
1.一种多元电致化学发光DNA传感器，其特征在于：是由如下步骤制备得到：
1)首先，使用1.0μm～0.05μm纳米氧化铝粉末α-Al2O3将玻碳电极GCE抛光，抛光后的玻碳电极用蒸馏水、乙醇和蒸馏水超声清洗去除吸附的物质，然后纯氮气环境下吹干，得到表面抛光的玻碳电极；
2)将10～30μL、0.10～0.3mg·mL-1氧化石墨烯GO水溶液滴到步骤1)制备的玻碳电极表面，20～30℃下干燥，在GCE表面得到GO薄膜，记为GO/GCE；
3)在0V到-1.5V的电位下、0.1V s-1～0.5V s-1的扫描速率下、pH＝7.0～7.5的磷酸盐缓冲溶液PBS中，以玻碳电极作为工作电极、铂丝电极作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极，连续扫描步骤2)得到的GO/GCE10～20个周期，氧化石墨烯GO经过电化学还原得到石墨烯片层GNs，从而在GCE表面得到GNs薄膜，记为GNs/GCE；
4)将5～10μL、530～550nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA和5～10μL、600～620nmCdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA溶液一同滴到步骤3)制备的GNs/GCE表面，20～30℃下干燥，在GCE表面得到CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs复合薄膜，记为CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE；
5)将步骤4)制备的CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE浸到与其碱基互补的乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的混合溶液中，90～95℃下混合5～10min，然后快速冷却到20～30℃，在GCE表面得到病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs复合薄膜，记为病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE；
6)将步骤5)制备的病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE进一步浸到与病毒捕获DNA碱基互补的Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA的混合溶液中，90～95℃下混合5～10min，然后快速冷却到20～30℃，在GCE表面得到AuNPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs复合薄膜，记为AuNPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE；从而得到结构为Au NPs标记的病毒探针DNA/病毒目标DNA/CdTe QDs标记的病毒捕获DNA/GNs/GCE的多元电致化学发光DNA传感器。
2.如权利要求1所述的一种多元电致化学发光DNA传感器，其特征在于：步骤4)所述的530～550nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA和600～620nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA，是由如下步骤制备得到，
1)通过以巯基丙酸MPA为稳定剂的回流冷却水热合成方法合成发射波长为530～550nm的CdTe QDs和600～620nm的CdTe QDs水溶液；
2)分别在3～5mL的发射波长为530～550nm的CdTe QDs和600～620nm的CdTe QDs水溶液中加入0.45～0.75mL、1～5μmol·L-1 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC水溶液和0.18～0.30mL、1～5μmol·L-1N-羟基硫代琥珀酰亚胺Sulfo-NHS水溶液，搅拌0.5～1h来活化CdTe量子点上的羧基；
3)然后，向步骤2)制备的活化后的发射波长为530～550nm的CdTe QDs水溶液中加入90～110μL、5～10μmol·L-1的乙肝病毒捕获DNA；向步骤2)制备的活化后的发射波长为600～620nm的CdTe QDs水溶液中加入90～110μL、5～10μmol·L-1的丙肝病毒捕获DNA；分别继续搅拌3～4h；通过CdTe量子点上的羧基和病毒捕获DNA上的氨基结合形成稳定的酰胺键来制备发射波长为530～550nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA和发射波长为600～620nmCdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA；
4)接着，分别向步骤3)制备的两种溶液中加入2～5mL的异丙醇来沉淀CdTe QDs标记的病毒捕获DNA，未反应的试剂通过高速离心10～20min去除；
5)最后分别用3～5mL、5～10mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液溶解530～550nm CdTe QDs标记的乙肝病毒捕获DNA和600～620nm CdTe QDs标记的丙肝病毒捕获DNA，之后放在4～5℃冰箱里储存备用。
3.如权利要求1所述的一种多元电致化学发光DNA传感器，其特征在于：步骤6)中所述的Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA，是由如下步骤制备得到，
1)通过柠檬酸盐还原氯金酸HAuC14来合成金纳米粒子AuNPs；再分别使用300～400μL、1～5μmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液来溶解乙肝病毒探针DNA和丙肝病毒探针DNA；
2)将步骤1)制备的溶解后的乙肝病毒探针DNA和丙肝病毒探针DNA溶液分别与3～5mL的Au NPs溶液混合，并避光过夜静置；然后每隔30～40min分别向混合物中重复2～3次缓慢地加入50～60μL、3～4mol·L-1NaCl水溶液来调节盐浓度为300～400mmol·L-1；
3)经过避光过夜静置后，分别在10000～15000rpm转速下离心30～40min来去除没有反应的试剂；接着用pH＝7.0～7.5、10～15mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液分别洗涤制备的AuNPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA2～3次；
4)然后将步骤3)制备的Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA分别溶解在3～5mL的10～15mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液里；最终，把通过静电力结合来制备Au NPs标记的乙肝病毒探针DNA和Au NPs标记的丙肝病毒探针DNA保存在4～5℃冰箱中储存备用。
4.权利要求1～3任何一项所述的多元电致化学发光DNA传感器在病毒检测方面的应用。
5.如权利要求4所述的多元电致化学发光DNA传感器在病毒检测方面的应用，其特征在于：用于检测乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510330078.4A CN104977292B (zh) | 2015-06-15 | 2015-06-15 | 多元电致化学发光dna传感器及用于病毒的检测 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510330078.4A CN104977292B (zh) | 2015-06-15 | 2015-06-15 | 多元电致化学发光dna传感器及用于病毒的检测 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104977292A CN104977292A (zh) | 2015-10-14 |
| CN104977292B true CN104977292B (zh) | 2017-08-11 |
Family
ID=54274009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510330078.4A Expired - Fee Related CN104977292B (zh) | 2015-06-15 | 2015-06-15 | 多元电致化学发光dna传感器及用于病毒的检测 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104977292B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107556510B (zh) * | 2017-08-29 | 2020-06-05 | 浙江理工大学 | 一种柔性传感器电极的制备方法 |
| CN109444117A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-03-08 | 青岛科技大学 | 一种基于银纳米簇猝灭效应和多重放大技术的电化学发光生物传感器及其应用 |
| CN109852390B (zh) * | 2019-03-15 | 2022-03-01 | 苏州科技大学 | 基于碲化镉量子点/氧化还原石墨烯复合物的电致化学发光材料及其制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103674922A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-03-26 | 北京科技大学 | 一种量子点功能化的纳米纤维检测癌细胞的传感器及制备方法 |
| CN103760201A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-04-30 | 天津工业大学 | 一种基于复合量子点的电化学dna传感器的制备方法 |
| CN103901197A (zh) * | 2014-04-10 | 2014-07-02 | 华中科技大学 | 一种癌胚抗原含量检测方法及装置 |
-
2015
- 2015-06-15 CN CN201510330078.4A patent/CN104977292B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103760201A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-04-30 | 天津工业大学 | 一种基于复合量子点的电化学dna传感器的制备方法 |
| CN103674922A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-03-26 | 北京科技大学 | 一种量子点功能化的纳米纤维检测癌细胞的传感器及制备方法 |
| CN103901197A (zh) * | 2014-04-10 | 2014-07-02 | 华中科技大学 | 一种癌胚抗原含量检测方法及装置 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Graphene Oxide Amplified Electrogenerated Chemiluminescence of Quantum Dots and Its Selective Sensing for Glutathione from Thiol-Containing Compounds;Ying Wang等;《Analytical Chemistry》;20091201;第81卷(第23期);全文 * |
| Multiplex electrochemiluminescence DNA sensor for determination of hepatitis B virus and hepatitis C virus based on multicolor quantum dots and Au nanoparticles;Linlin Liu;《Analytica Chimica Acta》;20160222;第916卷;全文 * |
| Using Graphene-Based Plasmonic Nanocomposites to Quench Energy from Quantum Dots for Signal-On Photoelectrochemical Aptasensing;Xianxiang Zeng等;《analytical chemistry》;20131120;第85卷;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104977292A (zh) | 2015-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yu et al. | The construction of a FRET assembly by using gold nanoclusters and carbon dots and their application as a ratiometric probe for cysteine detection | |
| US7829772B2 (en) | Fluorescent carbon nanoparticles | |
| Sun et al. | Electrochemiluminescent resonance energy transfer of polymer dots for aptasensing | |
| CN104977292B (zh) | 多元电致化学发光dna传感器及用于病毒的检测 | |
| CN101982774B (zh) | 一种生物功能化的金纳米棒分子探针及其制备方法和应用 | |
| Liu et al. | A novel electrochemiluminescent immunosensor based on CdS-coated ZnO nanorod arrays for HepG2 cell detection | |
| Zhang et al. | Fluorescence resonance energy transfer between NaYF4: Yb, Tm upconversion nanoparticles and gold nanorods: Near-infrared responsive biosensor for streptavidin | |
| JP2002536285A (ja) | ＣｄＳナノ粒子の発光分光特性 | |
| US11041857B2 (en) | Method for preparing upconversion-luminescence flexible hybrid membrane for visual detection of tumor marker | |
| CN101487046B (zh) | 一种dna荧光探针及其制备方法 | |
| CN109490523A (zh) | 用于标记的纳米材料、核酸探针及核酸与纳米材料偶联的方法 | |
| CN106442690A (zh) | 基于卟啉与dna双螺旋的沟槽镶嵌作用的无标记dna的ecl检测方法 | |
| CN106066324A (zh) | 一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法及应用 | |
| CN110554027A (zh) | 一种基于氧化铁阵列共反应促进金纳米簇电致发光响应的免疫传感器的制备方法及应用 | |
| CN104961754A (zh) | 一种基于能量转移原理制备红色发光鸟苷酸/稀土配位聚合物的方法 | |
| Jia et al. | An electrostatic self-assembly route to prepare C-dots/gold nanoclusters for dual-emission ratiometric optical thermometry in living cells | |
| CN102604637A (zh) | 生物素修饰稀土掺杂无机荧光纳米颗粒的制备方法 | |
| CN108410949A (zh) | 一种检测核酸外切酶i活性的探针及其制备方法和应用 | |
| Wang et al. | Target-induced quenching for highly sensitive detection of nucleic acids based on label-free luminescent supersandwich DNA/silver nanoclusters | |
| CN103954613A (zh) | 一种生物相容性好的电化学发光系统 | |
| CN110274948A (zh) | 一种基于三螺旋分子开关超灵敏测定lps双放大ecl生物传感器及其应用 | |
| CN105372307A (zh) | 一种检测转基因CaMV35S启动子的电极的制备方法及用途 | |
| CN112725414B (zh) | 长余辉分子信标探针、其构建方法及应用 | |
| CN109097027A (zh) | 吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子在次氯酸根离子检测中的应用 | |
| CN114656951A (zh) | 一种水相有机发光材料、制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170811 Termination date: 20200615 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |