CN107828813A - 一种来源于光帽鳞伞的抗肿瘤活性蛋白的重组表达和纯化方法 - Google Patents

一种来源于光帽鳞伞的抗肿瘤活性蛋白的重组表达和纯化方法 Download PDF

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刘金福
李昀
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Abstract

本发明公开了一种来源于光帽鳞伞的抗肿瘤活性蛋白的重组表达和纯化方法。本发明的抗肿瘤活性蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。将本发明的抗肿瘤活性蛋白基因克隆于原核表达载体pET‑MBP构建重组质粒pET‑MBP‑PNAP，转化大肠杆菌BL21（DE3），异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白His‑MBP‑PNAP，采用烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶处理切除His‑MBP标签，麦芽糖亲和色谱层析和凝胶过滤层析纯化获得重组蛋白PNAP。与来源于光帽鳞伞的天然抗肿瘤活性蛋白相比，本发明的重组蛋白PNAP对乳腺癌MCF7细胞的抗增殖活性更强，而且制备工艺简单、生产成本低、产量高，适于工业化生产。

Description

一种来源于光帽鳞伞的抗肿瘤活性蛋白的重组表达和纯化 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于光帽鳞伞的抗肿瘤活性蛋白的重组表达和纯化方法。
背景技术
光帽鳞伞，俗称滑菇，因其菌盖、菌柄表面有一层黏液，食用时黏滑可口而得名。滑菇不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、糖类等营养成分，还含有多种维生素，以及钙、磷、铁等微量元素，可以提高机体免疫力，增进智力，提高耐力，开发前景广阔。
国内研究人员对滑菇进行了大量研究，涉及菌丝生物学特性、深层培养和栽培技术、营养成分测定与分析等方面。目前，滑菇活性成分的研究主要集中在多糖的提取分析，对其他成分的研究较少，如河北师范大学王立安等以滑菇子实体为原料，对粘液的成分及功能进行了研究，发现其具有免疫促进作用；天津科技大学王昌禄等研究了滑菇蛋白质提取液的凝集素活性，等等。
有关滑菇的专利主要涉及培养和栽培技术，如滑菇生料发酵栽培培养料配方及栽培方法（专利号201133381.2）、一种滑菇栽培方法（专利号201210117341.8）、滑菇设施化栽培基质配方及其生产工艺（专利号201010248894.8）等。对于活性成分的研究，仅有来自菌类的生理活性物质EEM-S、其制造方法和药物（专利号01806435.3）和滑菇多糖提取物的制备方法（专利号201010234664.6）等。
申请人从滑菇子实体中分离到一种具有抗肿瘤活性的功能蛋白，未见相关报道，因此申请专利：一种从光帽鳞伞中提取的抗肿瘤蛋白及其制备方法（专利号201310064869.8）。但是，从光帽鳞伞子实体中直接提取获得抗肿瘤活性蛋白的产量低，不适于工业化生产。
发明内容
为解决上述问题，本发明利用分子生物学技术手段，将抗肿瘤活性蛋白基因克隆入原核表达载体构建重组质粒，在大肠杆菌中实现融合蛋白的重组表达，通过麦芽糖亲和色谱层析和凝胶过滤层析纯化获得重组蛋白。
本发明所述的来源于光帽鳞伞的抗肿瘤活性蛋白基因，具有序列表中SEQ ID NO1 (555bp)所示的核苷酸序列，其编码蛋白具有序列表中SEQ ID NO 2 (185氨基酸)所示的的氨基酸序列。
本发明所述的抗肿瘤活性蛋白基因以光帽鳞伞总RNA为模板，根据抗肿瘤活性蛋白的末端氨基酸序列合成简并引物，利用反转录PCR获得。
本发明所述的抗肿瘤活性蛋白的重组表达和纯化方法包括以下步骤：将本发明的抗肿瘤活性蛋白基因克隆于原核表达载体pET-MBP构建重组质粒pET-MBP-PNAP，转化大肠杆菌BL21（DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白His-MBP-PNAP，采用TEV酶处理切除His-MBP标签，通过麦芽糖亲和色谱层析和凝胶过滤层析纯化获得重组蛋白PNAP。
本发明所述的原核表达载体pET-MBP，具有序列表中SEQ ID NO 3 (6480bp)所示的核苷酸序列。
本发明所述的融合表达载体pET-MBP-PNAP，具有序列表中SEQ ID NO 4 (7042bp)所示的核苷酸序列。
本发明所述的融合蛋白His-MBP-PNAP，具有序列表中SEQ ID NO 5(582氨基酸)所示的氨基酸序列。
本发明所述的重组蛋白PNAP，具有序列表中SEQ ID NO 6（187氨基酸）所示的氨基酸序列。
本发明具有的优点和有益效果：
与来源于光帽鳞伞的天然抗肿瘤活性蛋白相比，本发明的重组抗肿瘤活性蛋白对乳腺癌MCF7细胞抗增殖活性更强；本发明的重组抗肿瘤活性蛋白制备工艺简单，生产成本低，产量高，适于工业化生产。
附图说明
图1 本发明融合蛋白His-MBP-PNAP的凝胶色谱层析图和SDS-PAGE图
图2 本发明重组蛋白PNAP的凝胶色谱层析图和SDS-PAGE图。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1 光帽鳞伞总RNA的提取
（1）取新鲜光帽鳞伞，将其洗净剪碎后直接在Trizol中研磨，每100mg使用1mL Trizol；
（2）匀浆样品在20°C放置5min后，4°C、12000rpm离心10min，取上清；
（3）每使用1mL Trizol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡30sec，10°C放置5min；
（4）4°C、12000rpm离心10min，将水相转移到新的离心管中；
（5）加入500μl异丙醇，20°C放置30min；
（6）4°C、12000rpm离心10min，弃上清；
（7）加入1.0mL 75%乙醇洗涤沉淀；
（8）4°C、5000rpm离心5min，倒出液体；
（9）室温放置晾干，加入50μl RNase-Free ddH2O，充分溶解RNA。
实施例2 反转录PCR获得基因
（1）反转录合成cDNA第一链
PCR反应液：总RNA 0.5μl、5×RT MasterMix 4μl、*Oligo(dT)引物1μl、H2O补足至20μl；PCR程序：42°C 1h，95°C 5min；
（2）根据测定的抗肿瘤活性蛋白基因的N端氨基酸序列AGRTFIGYNG和C端氨基酸序列KEFLMKSWVR合成简并引物F：5’-TACTTCCAATCCAATGCYGGNAGNACNTTYATHGGNTAYAAYGGN-3’和R：5’-TTATCCACTTCCAATGCTANCGRACCCANGAYTTCATNAGRAAYTCYTT-3’，其中R=A+G，Y=T+C，H=A+C+T，N=T+C+A+G；
（3）通过聚合酶链式反应对cDNA第一链进行扩增
PCR反应液：Tag Plus Polymerase Buffer 5μl、dNTP Mix 3μl，F 2μl，R 2μl，cDNA0.2μl，Tag Plus Polymerase 1μl，H2O 补足至50μl ；PCR程序：94°C 5min；94°C 40s, 55°C 40s, 72°C 60s，30个循环；72°C 10min。
实施例3 融合表达载体pET-MBP-PNAP的构建
（1）载体pET-MBP的SspI单酶切处理
酶切反应体系：载体17μl、SspI 1μl、SspI 缓冲液 2μl；37°C酶切3h。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的条带。
（2）载体SspI单酶切产物和PCR产物的T4 聚合酶处理与连接
载体SspI单酶切产物的T4反应体系：载体15μl、T4 聚合酶缓冲液 2μl、T4 聚合酶 0.5μl、dGTP 1μl、DTT 1μl、BSA 0.5μl；反应条件：22°C 30min；75°C 20min。
PCR 产物的T4反应体系：PCR 产物15μl、T4 聚合酶缓冲液 2μl、T4 聚合酶 0.5μl、dCTP 1μl、DTT 1μl、BSA 0.5μl；反应条件：22°C 30min；75°C 20min。
取T4 聚合酶处理过的载体1μl 和PCR 产物9μl 混合，22°C连接15min，加入1μl25mM EDTA，22°C 继续连接15min。
（3）连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10
将连接好的产物，加入100μl 的Top10 感受态细胞，冰浴20min，42°C热激90s，冰浴5min，加入500μl LB 培养基，于37°C、200 rpm 摇床中复苏50min。4500rpm 离心，用100μlLB 培养基重悬细胞，涂于含有50μg/ml 卡那霉素的培养基上，37°C恒温过夜培养。
（4）阳性克隆的鉴定
从培养皿中挑取单克隆，接入3ml 含50μg/ml 卡那霉素的LB 液体培养基中，37°C、200rpm 摇床培养8h。收集菌体，提取质粒，测序验证。
实施例4融合蛋白His-MBP-PNAP的表达和纯化
（1）将鉴定好的pET-MBP-PNAP/BL21（DE3)接种于液体LB培养基，37°C震荡培养，OD值=0.6时加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导表达16h；
（2）5000rpm离心15min，收集菌体沉淀；
（3）将菌体沉淀用50 mM Tris、500mM NaCl、pH8.0的Tris缓冲液溶解，超声破碎后，18000rpm离心40min，分别收集沉淀和上清；
（4）用50mM Tris、500mM NaCl，pH8.0的Tris 缓冲液平衡麦芽糖亲和色谱柱，上清反复上样2次，用50mM Tris、500mM NaCl、10 mM maltose、pH7.4的Tris 缓冲液洗脱，收集洗脱组份；
（5）将洗脱组份上样凝胶层析柱，用50mM Tris、500mM NaCl，pH8.0的Tris 缓冲液洗脱，获得融合蛋白His-MBP-PNAP。
实施例5 重组蛋白PNAP的纯化
（1）融合蛋白His-MBP-PNAP的TEV酶切处理
酶切反应体系：His-MBP-PNAP 1.0mg、TEV 1.0U、H2O 补足至50μl；20°C酶切48h。
（2）用50mM Tris、500mM NaCl，pH8.0的Tris 缓冲液平衡麦芽糖亲和色谱，酶切体系反复上样2次，用50mM Tris、500mM NaCl、10 mM Maltose、pH8.0的Tris 缓冲液洗脱，收集穿透组份；
（3）将穿透组份上样凝胶层析柱，用50mM Tris、500mM NaCl、pH8.0的Tris缓冲液洗脱，获得重组蛋白PNAP。
实施例6 重组蛋白PNAP对肿瘤MCF7细胞的抗增殖作用
（1）将乳腺癌MCF7细胞按1×105cfu/mL的浓度接种于96孔板，每孔100μL，37℃培养24小时；
（2）加入10μL 0.25mg/mL的重组蛋白PNAP，37℃培养48小时，以天然抗肿瘤活性蛋白作对照；
（3）每孔加入25µL三氯醋酸（500mg/mL），4℃放置1小时；
（4）蒸馏水洗涤5次，每孔加入4mg/mL SRB，染色30min；
（5）醋酸洗涤5 次，每孔加入100µL Tris缓冲液（10mmol/L），测定490nm处吸光值。
半抑制浓度（IC50）是评价肿瘤细胞增殖抑制活性的常用指标，重组蛋白PNAP和天然抗肿瘤活性蛋白对乳腺癌MCF7细胞的IC50分别为6.18μmol/L和10.79μmol/L，表明本发明的重组蛋白PNAP对乳腺癌MCF7细胞的抗增殖活性更强。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津农学院
<120> 一种来源于光帽鳞伞的抗肿瘤活性蛋白的重组表达和纯化方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 555
<212> DNA
<213> 光帽鳞伞(Pholiota nameko)
<400> 1
gcgggtagga catttattgg gtacaacggc tttagcggcc ccgagcgccc ccctcaagcc 60
agcgcaggag gcgaattagg tgctgtattt tacgtcgcag atgccgtgga tctggcaaga 120
ctgttctctc atggagcgaa cccgtcacag gatcggattt gtctgattca tgtcgacagt 180
acccaatgga cgaatgtccc taagacctgg gttccagaac gaattttggc gcaaggtggg 240
aatgcggtca atgcctttgc acctggggcg gtcgtttttg ccggacatac gaacgcagga 300
cttccaccac aggcgccagc tagggttttc caacttggtg tccgccaggc tcagatttct 360
cgcctagttc ttacctcgac atgtagtcca gcaggggatt tcgccaacca acaccagacg 420
ctgaattatg cgagtttaaa taccacctgg aacatacagc gacctgcttt tacagctgga 480
caagtcgatg cggtggatca gtcgggagga ttgtggggaa ttgccaagga atttctcatg 540
aaatcctggg tgcgc 555
<210> 2
<211> 185
<212> PRT
<213> 光帽鳞伞(Pholiota nameko)
<400> 2
Ala Gly Arg Thr Phe Val Gly Tyr Asn Gly Phe Ser Gly Pro Glu Arg
1 5 10 15
Pro Pro Gln Ala Ser Ala Gly Gly Glu Leu Gly Ala Val Phe Tyr Val
20 25 30
Ala Asp Ala Val Asp Leu Ala Arg Leu Phe Ser His Gly Ala Asn Pro
35 40 45
Ser Gln Asp Arg Ile Cys Leu Ile His Val Asp Ser Thr Gln Trp Thr
50 55 60
Asn Val Pro Lys Thr Trp Val Pro Glu Arg Ile Leu Ala Gln Gly Gly
65 70 75 80
Asn Ala Val Asn Ala Phe Ala Pro Gly Ala Val Val Phe Ala Gly His
85 90 95
Thr Asn Ala Gly Leu Pro Pro Gln Ala Pro Ala Arg Val Phe Gln Leu
100 105 110
Gly Val Arg Gln Ala Gln Ile Ser Arg Leu Val Leu Thr Ser Thr Cys
115 120 125
Ser Pro Ala Gly Asp Phe Ala Asn Gln His Gln Thr Leu Asn Tyr Ala
130 135 140
Ser Leu Asn Thr Thr Trp Asn Ile Gln Arg Pro Ala Phe Thr Ala Gly
145 150 155 160
Gln Val Asp Ala Val Asp Gln Ser Gly Gly Leu Trp Gly Ile Ala Lys
165 170 175
Glu Phe Leu Met Lys Ser Trp Val Arg
180 185
<210> 3
<211> 6480
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 3
ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 60
agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 120
tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 180
ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 240
cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 300
tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 360
tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 420
caaaaattta acgcgaattt taacatataa taacgtttac aatttcaggt ggcacttttc 480
ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 540
cgctcatgaa ttaattctta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc 600
atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac 660
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tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gtttatgcat ttctttccag 840
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ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacgatgttt 1020
tcacctgaat caggatattc ttctaatacc tggaatgctg ttttcccggg gatcgcagtg 1080
gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata 1140
aattccgtca gccagtttag tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct 1200
ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc 1260
gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg 1320
ttggaattta atcgcggcct agagcaagac gtttcccgtt gaatatggct cataacaccc 1380
cttgtattac tgtttatgta agcagacagt tttattgttc atgaccaaaa tcccttaacg 1440
tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 1500
tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 1560
ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 1620
agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 1680
ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 1740
tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 1800
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cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 1920
ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 1980
agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 2040
tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 2100
ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 2160
ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 2220
ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta 2280
ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tatggtgcac tctcagtaca 2340
atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg 2400
tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 2460
tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 2520
tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt 2580
gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa 2640
gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg 2700
tcactgatgc ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac 2760
gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt 2820
gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc 2880
aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag cagcatcctg 2940
cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt ccgcgtttcc agactttacg 3000
aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt ttgcagcagc 3060
agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta aggcaacccc 3120
gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt ggggccgcca 3180
tgccggcgat aatggcctgc ttctcgccga aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg 3240
cttgagcgag ggcgtgcaag attccgaata ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc 3300
tccagcgaaa gcggtcctcg ccgaaaatga cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga 3360
gttgcatgat aaagaagaca gtcataagtg cggcgacgat agtcatgccc cgcgcccacc 3420
ggaaggagct gactgggttg aaggctctca agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat 3480
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tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 3600
ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt gcccttcacc 3660
gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa 3720
tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat 3780
cccactaccg agatgtccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg 3840
cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc 3900
atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc 3960
ggctgaattt gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag 4020
acagaactta atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc 4080
tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg 4140
tcagagacat caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca 4200
tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg 4260
tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg 4320
gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg 4380
gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc 4440
acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc 4500
gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca 4560
tactctgcga catcgtataa cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct 4620
tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag gttttgcgcc attcgatggt gtccgggatc 4680
tcgacgctct cccttatgcg actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc 4740
gttgagcacc gccgccgcaa ggaatggtgc atgcaaggag atggcgccca acagtccccc 4800
ggccacgggg cctgccacca tacccacgcc gaaacaagcg ctcatgagcc cgaagtggcg 4860
agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg cacctgtggc 4920
gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatcgatc tcgatcccgc 4980
gaaattaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat 5040
aattttgttt aactttaaga aggagatata catatgcacc atcatcatca tcattcttct 5100
ggtgtagatc tgggtaccaa aatcgaagaa ggtaaactgg taatctggat taacggcgat 5160
aaaggctata acggtctcgc tgaagtcggt aagaaattcg agaaagatac cggaattaaa 5220
gtcaccgttg agcatccgga taaactggaa gagaaattcc cacaggttgc ggcaactggc 5280
gatggccctg acattatctt ctgggcacac gaccgctttg gtggctacgc tcaatctggc 5340
ctgttggctg aaatcacccc ggacaaagcg ttccaggaca agctgtatcc gtttacctgg 5400
gatgccgtac gttacaacgg caagctgatt gcttacccga tcgctgttga agcgttatcg 5460
ctgatttata acaaagatct gctgccgaac ccgccaaaaa cctgggaaga gatcccggcg 5520
ctggataaag aactgaaagc gaaaggtaag agcgcgctga tgttcaacct gcaagaaccg 5580
tacttcacct ggccgctgat tgctgctgac gggggttatg cgttcaagta tgaaaacggc 5640
aagtacgaca ttaaagacgt gggcgtggat aacgctggcg cgaaagcggg tctgaccttc 5700
ctggttgacc tgattaaaaa caaacacatg aatgcagaca ccgattactc catcgcagaa 5760
gctgccttta ataaaggcga aacagcgatg accatcaacg gcccgtgggc atggtccaac 5820
atcgacacca gcaaagtgaa ttatggtgta acggtactgc cgaccttcaa gggtcaacca 5880
tccaaaccgt tcgttggcgt gctgagcgca ggtattaacg ccgccagtcc gaacaaagag 5940
ctggcaaaag agttcctcga aaactatctg ctgactgatg aaggtctgga agcggttaat 6000
aaagacaaac cgctgggtgc cgtagcgctg aagtcttacg aggaagagtt ggcgaaagat 6060
ccacgtattg ccgccaccat ggaaaacgcc cagaaaggtg aaatcatgcc gaacatcccg 6120
cagatgtccg ctttctggta tgccgtgcgt actgcggtga tcaacgccgc cagcggtcgt 6180
cagactgtcg atgaagccct gaaagacgcg cagactgatt acgatatccc aggtaccgag 6240
aacctgtact tccaatccaa tattggaagt ggataacgga tccgaattcg agctccgtcg 6300
acaagcttgc ggccgcactc gagcaccacc accaccacca ctgagatccg gctgctaaca 6360
aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc 6420
ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat 6480
<210> 4
<211> 7042
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 4
ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 60
agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 120
tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 180
ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 240
cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 300
tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 360
tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 420
caaaaattta acgcgaattt taacatataa taacgtttac aatttcaggt ggcacttttc 480
ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 540
cgctcatgaa ttaattctta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc 600
atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac 660
tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt 720
ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa 780
tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gtttatgcat ttctttccag 840
acttgttcaa caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg 900
ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa 960
ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacgatgttt 1020
tcacctgaat caggatattc ttctaatacc tggaatgctg ttttcccggg gatcgcagtg 1080
gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata 1140
aattccgtca gccagtttag tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct 1200
ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc 1260
gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg 1320
ttggaattta atcgcggcct agagcaagac gtttcccgtt gaatatggct cataacaccc 1380
cttgtattac tgtttatgta agcagacagt tttattgttc atgaccaaaa tcccttaacg 1440
tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 1500
tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 1560
ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 1620
agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 1680
ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 1740
tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 1800
gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 1860
cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 1920
ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 1980
agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 2040
tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 2100
ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 2160
ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 2220
ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta 2280
ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tatggtgcac tctcagtaca 2340
atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg 2400
tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 2460
tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 2520
tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt 2580
gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa 2640
gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg 2700
tcactgatgc ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac 2760
gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt 2820
gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc 2880
aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag cagcatcctg 2940
cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt ccgcgtttcc agactttacg 3000
aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt ttgcagcagc 3060
agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta aggcaacccc 3120
gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt ggggccgcca 3180
tgccggcgat aatggcctgc ttctcgccga aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg 3240
cttgagcgag ggcgtgcaag attccgaata ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc 3300
tccagcgaaa gcggtcctcg ccgaaaatga cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga 3360
gttgcatgat aaagaagaca gtcataagtg cggcgacgat agtcatgccc cgcgcccacc 3420
ggaaggagct gactgggttg aaggctctca agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat 3480
gagtgagcta acttacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 3540
tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 3600
ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt gcccttcacc 3660
gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa 3720
tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat 3780
cccactaccg agatgtccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg 3840
cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc 3900
atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc 3960
ggctgaattt gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag 4020
acagaactta atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc 4080
tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg 4140
tcagagacat caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca 4200
tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg 4260
tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg 4320
gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg 4380
gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc 4440
acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc 4500
gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca 4560
tactctgcga catcgtataa cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct 4620
tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag gttttgcgcc attcgatggt gtccgggatc 4680
tcgacgctct cccttatgcg actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc 4740
gttgagcacc gccgccgcaa ggaatggtgc atgcaaggag atggcgccca acagtccccc 4800
ggccacgggg cctgccacca tacccacgcc gaaacaagcg ctcatgagcc cgaagtggcg 4860
agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg cacctgtggc 4920
gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatcgatc tcgatcccgc 4980
gaaattaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat 5040
aattttgttt aactttaaga aggagatata catatgcacc atcatcatca tcattcttct 5100
ggtgtagatc tgggtaccaa aatcgaagaa ggtaaactgg taatctggat taacggcgat 5160
aaaggctata acggtctcgc tgaagtcggt aagaaattcg agaaagatac cggaattaaa 5220
gtcaccgttg agcatccgga taaactggaa gagaaattcc cacaggttgc ggcaactggc 5280
gatggccctg acattatctt ctgggcacac gaccgctttg gtggctacgc tcaatctggc 5340
ctgttggctg aaatcacccc ggacaaagcg ttccaggaca agctgtatcc gtttacctgg 5400
gatgccgtac gttacaacgg caagctgatt gcttacccga tcgctgttga agcgttatcg 5460
ctgatttata acaaagatct gctgccgaac ccgccaaaaa cctgggaaga gatcccggcg 5520
ctggataaag aactgaaagc gaaaggtaag agcgcgctga tgttcaacct gcaagaaccg 5580
tacttcacct ggccgctgat tgctgctgac gggggttatg cgttcaagta tgaaaacggc 5640
aagtacgaca ttaaagacgt gggcgtggat aacgctggcg cgaaagcggg tctgaccttc 5700
ctggttgacc tgattaaaaa caaacacatg aatgcagaca ccgattactc catcgcagaa 5760
gctgccttta ataaaggcga aacagcgatg accatcaacg gcccgtgggc atggtccaac 5820
atcgacacca gcaaagtgaa ttatggtgta acggtactgc cgaccttcaa gggtcaacca 5880
tccaaaccgt tcgttggcgt gctgagcgca ggtattaacg ccgccagtcc gaacaaagag 5940
ctggcaaaag agttcctcga aaactatctg ctgactgatg aaggtctgga agcggttaat 6000
aaagacaaac cgctgggtgc cgtagcgctg aagtcttacg aggaagagtt ggcgaaagat 6060
ccacgtattg ccgccaccat ggaaaacgcc cagaaaggtg aaatcatgcc gaacatcccg 6120
cagatgtccg ctttctggta tgccgtgcgt actgcggtga tcaacgccgc cagcggtcgt 6180
cagactgtcg atgaagccct gaaagacgcg cagactgatt acgatatccc aggtaccgag 6240
aacctgtact tccaatccaa tgccgcgggt aggacattta ttgggtacaa cggctttagc 6300
ggccccgagc gcccccctca agccagcgca ggaggcgaat taggtgctgt attttacgtc 6360
gcagatgccg tggatctggc aagactgttc tctcatggag cgaacccgtc acaggatcgg 6420
atttgtctga ttcatgtcga cagtacccaa tggacgaatg tccctaagac ctgggttcca 6480
gaacgaattt tggcgcaagg tgggaatgcg gtcaatgcct ttgcacctgg ggcggtcgtt 6540
tttgccggac atacgaacgc aggacttcca ccacaggcgc cagctagggt tttccaactt 6600
ggtgtccgcc aggctcagat ttctcgccta gttcttacct cgacatgtag tccagcaggg 6660
gatttcgcca accaacacca gacgctgaat tatgcgagtt taaataccac ctggaacata 6720
cagcgacctg cttttacagc tggacaagtc gatgcggtgg atcagtcggg aggattgtgg 6780
ggaattgcca aggaatttct catgaaatcc tgggtgcgct agcattggaa gtggataacg 6840
gatccgaatt cgagctccgt cgacaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac 6900
cactgagatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct 6960
gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg 7020
aaaggaggaa ctatatccgg at 7042
<210> 5
<211> 582
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 5
Met His His His His His His Ser Ser Gly Val Asp Leu Gly Thr Lys
1 5 10 15
Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr
20 25 30
Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile
35 40 45
Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln
50 55 60
Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp
65 70 75 80
Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro
85 90 95
Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val
100 105 110
Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu
115 120 125
Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp
130 135 140
Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser
145 150 155 160
Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile
165 170 175
Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp
180 185 190
Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr
195 200 205
Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp
210 215 220
Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr
225 230 235 240
Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn
245 250 255
Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro
260 265 270
Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys
275 280 285
Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly
290 295 300
Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys
305 310 315 320
Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met
325 330 335
Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser
340 345 350
Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly
355 360 365
Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asp Tyr Asp
370 375 380
Ile Pro Gly Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Asn Ala Ala Gly Arg
385 390 395 400
Thr Phe Val Gly Tyr Asn Gly Phe Ser Gly Pro Glu Arg Pro Pro Gln
405 410 415
Ala Ser Ala Gly Gly Glu Leu Gly Ala Val Phe Tyr Val Ala Asp Ala
420 425 430
Val Asp Leu Ala Arg Leu Phe Ser His Gly Ala Asn Pro Ser Gln Asp
435 440 445
Arg Ile Cys Leu Ile His Val Asp Ser Thr Gln Trp Thr Asn Val Pro
450 455 460
Lys Thr Trp Val Pro Glu Arg Ile Leu Ala Gln Gly Gly Asn Ala Val
465 470 475 480
Asn Ala Phe Ala Pro Gly Ala Val Val Phe Ala Gly His Thr Asn Ala
485 490 495
Gly Leu Pro Pro Gln Ala Pro Ala Arg Val Phe Gln Leu Gly Val Arg
500 505 510
Gln Ala Gln Ile Ser Arg Leu Val Leu Thr Ser Thr Cys Ser Pro Ala
515 520 525
Gly Asp Phe Ala Asn Gln His Gln Thr Leu Asn Tyr Ala Ser Leu Asn
530 535 540
Thr Thr Trp Asn Ile Gln Arg Pro Ala Phe Thr Ala Gly Gln Val Asp
545 550 555 560
Ala Val Asp Gln Ser Gly Gly Leu Trp Gly Ile Ala Lys Glu Phe Leu
565 570 575
Met Lys Ser Trp Val Arg
580
<210> 6
<211> 187
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 6
Asn Ala Ala Gly Arg Thr Phe Val Gly Tyr Asn Gly Phe Ser Gly Pro
1 5 10 15
Glu Arg Pro Pro Gln Ala Ser Ala Gly Gly Glu Leu Gly Ala Val Phe
20 25 30
Tyr Val Ala Asp Ala Val Asp Leu Ala Arg Leu Phe Ser His Gly Ala
35 40 45
Asn Pro Ser Gln Asp Arg Ile Cys Leu Ile His Val Asp Ser Thr Gln
50 55 60
Trp Thr Asn Val Pro Lys Thr Trp Val Pro Glu Arg Ile Leu Ala Gln
65 70 75 80
Gly Gly Asn Ala Val Asn Ala Phe Ala Pro Gly Ala Val Val Phe Ala
85 90 95
Gly His Thr Asn Ala Gly Leu Pro Pro Gln Ala Pro Ala Arg Val Phe
100 105 110
Gln Leu Gly Val Arg Gln Ala Gln Ile Ser Arg Leu Val Leu Thr Ser
115 120 125
Thr Cys Ser Pro Ala Gly Asp Phe Ala Asn Gln His Gln Thr Leu Asn
130 135 140
Tyr Ala Ser Leu Asn Thr Thr Trp Asn Ile Gln Arg Pro Ala Phe Thr
145 150 155 160
Ala Gly Gln Val Asp Ala Val Asp Gln Ser Gly Gly Leu Trp Gly Ile
165 170 175
Ala Lys Glu Phe Leu Met Lys Ser Trp Val Arg
180 185

Claims (7)

1.一种来源于光帽鳞伞的抗肿瘤活性蛋白的重组表达和纯化方法，其特征在于所述蛋白的重组表达和纯化方法包括以下步骤：将目的基因克隆于原核表达载体pET-MBP构建融合表达载体pET-MBP-PNAP，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白His-MBP-PNAP，采用TEV酶处理切除His-MBP标签，麦芽糖亲和色谱层析和凝胶过滤层析获得重组蛋白PNAP。
2.一种如权利要求1所述的抗肿瘤活性蛋白，其特征在于所述抗肿瘤活性蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.一种如权利要求1所述的原核表达载体pET-MBP，其特征在于所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4.一种如权利要求1所述的融合表达载体pET-MBP-PNAP，其特征在于所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
5.一种如权利要求1所述的融合蛋白His-MBP-PNAP，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示。
6.一种如权利要求1所述的重组蛋白PNAP，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO 6所示。
7.一种如权利要求1所述的重组蛋白PNAP，其特征在于，与来源于光帽鳞伞的天然抗肿瘤活性蛋白相比，所述的重组蛋白PNAP对乳腺癌MCF7细胞抗增殖活性更强，而且制备工艺简单，生产成本低，产量高，适于工业化生产。
CN201711154305.8A 2017-11-20 2017-11-20 一种来源于光帽鳞伞的抗肿瘤活性蛋白的重组表达和纯化方法 Pending CN107828813A (zh)

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