CN107811998B - 和厚朴酚在制备抑杀鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物防治领域，涉及一种和厚朴酚在制备抑杀鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，本发明公开了和厚朴酚在抑制鱼类体外寄生纤毛虫的活性，并将其应用于制备抑杀鱼类体外寄生纤毛虫药物，特别是用于抑杀刺激隐核虫，在有效剂量范围内可完全抑杀寄生虫，达到防治海水小瓜虫病的效果，和厚朴酚为天然化合物，毒副作用小，易于降解消除，能够有效避免化学药品的滥用而造成的环境污染和药物残等留问题，有利于促进水产养殖业的健康发展。

Description

和厚朴酚在制备抑杀鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用

技术领域

本发明属生物防治领域，涉及一种和厚朴酚，具体是一种以和厚朴酚作为主药成分制备鱼类抑杀体外寄生纤毛虫药物中的应用。

背景技术

由寄生纤毛虫引起的鱼类疾病，是水产养殖中的常见病、多发病。刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown)是一种能够寄生在热带和亚热带海水硬骨鱼类的纤毛虫。海水小瓜虫病，又称“白点病”，是一种由刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown)引起的寄生虫疾病。海水鱼类感染刺激隐核虫后体表和鳃部出现肉眼可见的“小白点”，导致其严重缺氧、造成体表破损引发继发性细菌感染，进而导致大量鱼死亡。近年来，我国海水渔业集约化养殖程度逐渐提高，养殖环境逐渐恶化，海水小瓜虫病爆发频率逐年增多，危害日益严重。据调查统计，刺激隐核虫几乎可以感染我国南方所有养殖海水鱼类，该病导致石斑鱼、大黄鱼和卵形鲳鲹的死亡率最高可分别达到50％、75％和100％。海水小瓜虫病给我国海水养殖业造成巨额的经济损失。目前，海水小瓜虫病主要依靠硝酸亚汞、甲醛或次甲基兰等化学药物进行防治，然而这些化学药物存在病原虫耐药、环境污染和药物残留等负面影响，急需寻找环境友好、安全高效的防治方法。

天然化合物具有易降解、低残留、环境友好、容易制备和价格低廉等优点，将天然化合物作为药物或者饲料添加剂，用于防治水产养殖病害完全符合发展无公害水产业和生产绿色水产品的病害防治准则。

和厚朴酚是一种从木兰科落叶乔木植物厚朴或凹叶厚朴的干皮、根皮及枝皮分离纯化的酚类化合物，其分子式为C₁₈H₁₈O₂。和厚朴酚为棕褐色粉末，气香，味辛辣，微苦，具有抗炎、抗菌、抗病原微生物、抗溃疡、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤和降低胆固醇等药理作用，主要适应症为急性肠炎、细菌性、阿米巴痢疾和慢性胃炎等。目前尚未有和厚朴酚抗寄生虫药理作用的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种和厚朴酚在制备抑杀鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，该药物高效、低毒和来源广泛，可有效防治体外寄生纤毛虫引发的鱼类疾病，特别是对由刺激隐核虫引发的海水“小瓜虫”病有良好的防治效果。

本发明所采用的技术方案：

和厚朴酚在制备抑杀鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。

所述鱼类体外寄生纤毛虫是指刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown)。

所述的药物的剂型优选为拌料药液、浸泡药液或与药学上可接受的载体和赋形剂一起制备的不同剂型药物。

所述的和厚朴酚的有效治疗量大于100mg每kg鱼饲料。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点和效果：

1、本发明首次将和厚朴酚应用于制备抑杀鱼类体外寄生纤毛虫药物，特别是用于抑杀刺激隐核虫，在有效剂量范围内可完全抑杀寄生虫，达到防治海水小瓜虫病的效果。

2、本发明中所用主药成分和厚朴酚来源广泛、具有工业化制备工艺，具有开发成新型防治鱼类体外寄生纤毛虫渔药的巨大潜力，应用前景广阔。

3、通过体外抑杀虫实验和人工感染动物模型实验，所发明的以和厚朴酚作为主药成分的药物具有良好的防治海水小瓜虫病效果：用于预防，对刺激隐核虫寄生感染抑制率最高可达99.31％；用于治疗，治愈率可达50％-60％。同时和厚朴酚为天然化合物，毒副作用小，易于降解消除，能够有效避免化学药品的滥用而造成的环境污染和药物残等留问题，有利于促进水产养殖业的健康发展。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施案例中用到的宿主模型鱼为卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)，来源于海南省某养殖网箱。寄生虫模型为刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown)，分离于海南省临高县某网箱发病卵形鲳鲹,通过形态学和18S rRNA分子生物学方法鉴定为刺激隐核虫。

实施例1、和厚朴酚对刺激隐核虫感染性幼虫的抑杀作用

(1)药物的配制：用50％乙醇作为溶剂，制备浓度为0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10mg/mL的和厚朴酚溶液。

(2)取24孔板，每孔加入940μL经0.22μm滤膜过滤的无菌海水，吸取50μL包囊孵化30min内的刺激隐核虫幼虫加入到24孔细胞培养板，虫量为100-200只/孔，然后加入10μL不同浓度和厚朴酚溶液，使体系中和厚朴酚的终浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μg/mL。每个药物浓度平行3个孔。50倍镜倒置光学显微镜下观察30min内刺激隐核虫幼虫的死亡情况，计算其致死率。致死率(％)＝死亡幼虫个数/幼虫总数×100％，结果见表1，和厚朴酚药液30min内对刺激隐核虫幼虫半数致死率(LD₅₀)为0.79μg/mL。

表1和厚朴酚对刺激隐核虫感染性幼虫抑杀效果

实施例2、和厚朴酚对刺激隐核虫滋养体的抑杀作用

(1)药物的配制：同实施例1，配置成0.00、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50和2.00mg/mL和厚朴酚药液。

(2)取24孔细胞培养板，每孔加入2mL经0.22μm滤膜过滤的无菌海水，吸取刺激隐核虫滋养体加入到细胞培养板的中，每孔20个，然后加入20μL不同浓度和厚朴酚药液，使其终浓度分别为0.0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0μg/L，每个浓度平行3个孔，24孔细胞培养板放置27℃光照培养箱，12h光照12h黑暗培养，每天8：00换水1mL，2天后滋养体形成包囊，形成包囊后7天，40倍体视显微镜下观察包囊孵化情况。孵化率(％)＝(孵化包囊数/所形成的包囊总数)×100％，包囊孵化抑制率(％)＝((所形成的包囊总数-孵化包囊数)/所形成的包囊总数)×100％。结果见表2，和厚朴酚对刺激隐核虫滋养体体外形成包囊的孵化半数抑制率(ED₅₀)为0.83μg/mL。

表2和厚朴酚对刺激隐核虫滋养体体外形成包囊的孵化抑制效果

实施例3、和厚朴酚对刺激隐核虫包囊的抑杀作用

(1)药物的配制：同实施案例1，配制成0.000、0.005、0.010、0.025、0.050和0.100mg/mL和厚朴酚药液。

(2)取24孔细胞培养板，每孔加入2mL经0.22μm滤膜过滤的无菌海水，吸取刺激隐核虫包囊加入到细胞培养板中，每孔20个，然后加入20μL不同浓度和厚朴酚药液，使其终浓度分别为0.00、0.05、0.10、0.25、0.50和1.00μg/mL，每个浓度平行3孔。细胞培养板放置在27℃光照培养箱12h光照12h黑暗培养，每天8：00换水1mL，在40倍体视显微镜下观察包囊孵化情况，并统计7d内包囊孵化率。孵化率(％)＝(孵化包囊数/包囊总数)×100％，包囊孵化抑制率(％)＝((所形成的包囊总数-孵化包囊数)/所形成的包囊总数)×100％。结果见表3，和厚朴酚对刺激隐核虫包囊体的孵化半数抑制率(ED₅₀)为0.62μg/mL。

表3和厚朴酚对刺激隐核虫包囊体抑杀效果

实施例4、和厚朴酚预防卵形鲳鲹小瓜虫病的效果

(1)饲料制备：以某市售海水鱼复合饲料(颗粒直径大小为3mm)为基础饲料。将一定量的和厚朴酚溶于50％乙醇溶液，均匀喷洒至基础饲料，使其浓度分别为100、200和400mg/kg(和厚朴酚/饲料，w/w)，将乙醇自然挥干，制成高中低剂量含药饲料，4℃保存至使用。

(2)将卵形鲳鲹(体长10～15cm)从养殖场运回实验室，暂养于水族箱(75×60×65cm)中，每个水族箱8条，24h连续充氧，水体温度为27±2℃，开启2L/min循环水，每天按鱼体重3％的量投喂基础饲料，暂养7d，挑选暂养后健康、活力好的卵形鲳鲹，分成对照组、高、中、低剂量用药组，每组16尾，两个平行，对照组投喂基础饲料，高、中、低剂量用药组分别投喂高中低剂量含药饲料，按鱼体重3％的量进行投喂，一日两次，连续投喂7d，然后以8000只刺激隐核虫幼虫/尾，对卵形鲳鲹进行感染，继续投喂7d，关闭循环水，每天换水1/2。在感染后的第三天和第八天取样统计卵形鲳鲹右二鳃的刺激隐核虫滋养体数量，平行取3尾鱼，计算和厚朴酚对刺激隐核虫寄生感染抑制率，刺激隐核虫寄生感染抑制率＝(对照组滋养体数-实验组滋养体数)/对照组滋养体数×100％，结果见表4。结果表明，和厚朴酚浓度大于100mg/kg能够有效地抑杀寄生于卵形鲳鲹体表的刺激隐核虫。

表4和厚朴酚对刺激隐核虫引发的海水小瓜虫病的预防效果

实施例5、和厚朴酚对卵形鲳鲹小瓜虫病的疗效

(1)饵料配制：以某市售海水鱼复合饲料(颗粒直径大小为3mm)为基础饲料。将一定量的和厚朴酚溶于50％乙醇溶液，均匀喷洒至基础饲料，使其浓度为400mg/kg(和厚朴酚/饲料，w/w)，将乙醇自然挥干，制成高中剂量含药饲料，4℃保存至使用。

(2)2017年9月20日海南省澄迈县某水产养殖专业合作社的深水网箱养殖的卵形鲳鲹感染刺激隐核虫，9月26日，本实验选取该合作社41号网箱为用药组、12号网箱和42号网箱为对照组，三个网箱的周长分别为60、100和60m，养殖密度分别为15、35和15万尾/网箱，鱼的规格均约为50g。用药组前7天投喂400mg/kg含药饲料，每天的投喂量分别为60、100、140、130、80、160和160kg，对照组不投喂饲料，从第8天开始实验组和对照组都不投喂饲料。每天早上(9:00)或下午(16:00)打捞浮出水面的卵形鲳鲹并统计死亡数，结果见表5。第三天和第八天分别取10尾鱼统计卵形鲳鲹右二鳃上的刺激隐核滋养体数目，结果见表6，采用t检验进行用药组与对照组间显著性差异分析。由于在网箱中，死亡的卵形鲳鲹先沉底，过1～2天方浮出水面，故打捞统计浮出水面的卵形鲳鲹死亡数有1～2天的滞后，从表5可以看出，第3天统计的浮出水面卵形鲳鲹死亡鱼的数量开始减少，即用药后第1天或第2天鱼的死亡数量即开始下降，第5-7天，每天卵形鲳鲹的死亡数量较第1天减少45.5、45.5和54.5％，而第8天停药后，卵形鲳鲹死亡数量有所回升。而对照组的卵形鲳鲹的每天死亡数量在不断增加。从表6可以看出，第8天用药组卵形鲳鲹鳃部寄生的刺激隐核虫的数量极显著小于对照组，表明和厚朴酚有着较好的治疗刺激隐核虫引发的海水小瓜虫病。

表5和厚朴酚体内对刺激隐核虫病的治疗效果

注：表格内死亡数单位为尾；--表示没有去网箱打捞统计。

表6和厚朴酚体内对刺激隐核虫的抑杀效果

投喂时间	第3天	第8天
			41号网箱	92±37<sup>a</sup>	81±47<sup>a</sup>
42号网箱	84±47<sup>a</sup>	168±31<sup>c</sup>
			12号网箱	119±58<sup>a</sup>	141±62<sup>d</sup>

注：^a,b,c相同字母的组别无显著性差异，而不同字母间的组别存在极显著差异

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (3)

1.和厚朴酚作为唯一活性成分在制备抑杀鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，所述鱼类体外寄生纤毛虫是指刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown)。

2.根据权利要求1所述的和厚朴酚在制备抑杀鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，其特征在于：所述的药物的剂型为拌料药液、浸泡药液或与药学上可接受的载体一起制备的不同于拌料药液和浸泡药液的其它剂型药物。

3.根据权利要求1所述的和厚朴酚在制备抑杀鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，其特征在于：所述的和厚朴酚的有效治疗量大于100mg每kg鱼饲料。