CN107782821B - 一种神经肌肉阻滞剂的分析方法 - Google Patents

一种神经肌肉阻滞剂的分析方法 Download PDF

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Abstract

一种神经肌肉阻滞剂的分析方法，所述方法包括采用高效液相色谱法进行米库氯铵的分离的步骤，所述高效液相色谱法中，以十八烷基键合硅胶为固定相，检测波长为250～300nm，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中，所述的流动相A为水溶液:有机溶剂＝100:0～50:50(v/v)，流动相B为水溶液:有机溶剂＝0:100～50:50(v/v)。本发明方法可以有效分离、检测、定量测定米库氯铵的三种异构体和四种已知杂质以及多种其他的杂质，有利于保证米库氯铵的用药安全性和有效性；而且本发明方法条件温和，对高效液相色谱仪器、分析试剂和色谱柱没有苛刻要求。

Description

一种神经肌肉阻滞剂的分析方法
技术领域
本发明涉及一种神经肌肉阻滞剂的分析方法。
背景技术
在麻醉中，神经肌肉阻滞剂用于外科手术和气管插管期间提供骨骼肌松弛作用。神经肌肉阻滞剂一般根据作用机制分为去极化和非去极化两类；根据作用持续时间分为短效、中效、长效三类。去极化药物包括琥珀胆碱和癸双胺，由于它们的去极化作用机制，这些药物具有严重的副作用，例如心跳停止和死亡、血钾过多、恶性高温、严重肌肉疼痛、心律失常、增加眼内压和增加胃内紧张等。非去极化神经肌肉阻滞剂包括长效药物例如d-筒箭毒碱、泮库溴铵、弛肌碘、二烯丙基毒马钱碱和毒马钱碱，中效药物例如阿曲库铵和维库溴铵，以及短效药物如米库氯铵。普遍认为非去极化药物比去极化药物更加安全并且临床上更合乎需要。短效药物比长效药物更安全，因为在急诊情况下，药物持续时间极为重要，使用持续时间较长的药物能导致严重的脑损伤和死亡。
米库氯铵是目前最短效的非去极化神经肌肉阻滞剂，于1992年在美国上市，商品名为Mivacron，常用于气管插管和手术中维持肌松。其作用与氯筒箭毒碱相似，临床剂量下无明显蓄积，促使组胺释放作用较小，对颅内压和眼内压无不良影响，易于控制肌松浓度和范围，术后恢复快。米库氯铵能灵活运用于各种手术中，除了一般病人，还可应用于神经肌肉疾患和血钾增高的病人；特别是在小儿手术中很少影响小儿的心血管，被视为琥珀胆碱的替代药。由于米库氯铵具有良好的临床表现，在麻醉手术中得到了越来越多的关注。
米库氯铵属于多手性中心化合物，目前市场上销售的成药是反-反式、顺-反式、顺-顺式三种异构体的混合物，这三种异构体的比例通常为50-60％、34-40％、4-8％。经过分析，米库氯铵成品中还含有四种明显的杂质，即反式季铵醇(杂质A)、顺式季铵醇(杂质B)、反式季铵酯(杂质C)、顺式季铵酯(杂质D)，结构分别如下：
Figure BDA0001388982570000011
Figure BDA0001388982570000021
以上四种杂质都是米库氯铵合成过程中的工艺杂质，其中，杂质A和杂质B为米库氯铵合成过程中的重要中间体；杂质C和杂质D为米库氯铵合成过程中的副产物。
从目前公开的文献来看，有关米库氯铵的分析检测方法报道非常少。专利US4761418报道了检测米库氯铵三种异构体和四种主要杂质的色谱分离条件，色谱柱为Whatman Partisil 10w(25cm*4.6mm)，流动相为甲醇-乙酸乙酯-三氟乙酸-硫酸(61.1:38.5:0.3:0.1)。其流动相中含有三氟乙酸和硫酸两种强酸，不仅对检测样品的稳定性会造成影响，而且还会腐蚀检测分析的仪器设备，尽管此类型色谱柱具有一些耐酸性能，但强酸对色谱柱的伤害是显而易见的，会严重缩短色谱柱的寿命并影响方法的耐用性，这样必然会降低实验的重现性、重复性，以及实验结果的可靠性，同时还会增加米库氯铵成品药的研发和生产成本。并且，在此条件下分析检测时，上述七种物质在非常短的时间内全部出峰，仅能达到检测这些特定物质的目的，而不能对其他杂质进行分析检测，其他极性大的杂质无法被分离，而极性小的杂质无法在较短的时间内被洗脱检测，因此无法达到全面、准确地检测米库氯铵成分的要求。
米库氯铵中的杂质能否被全面准确地分析检测，包括潜在杂质的检测在内，直接关系到米库氯铵的质量与安全性，杂质研究是保证药品安全性和质量的前提和关键环节，是药物一致性评价的重要指标。如果色谱条件不能有效检测到潜在杂质的存在和含量，将对用药安全性和有效性带来极大威胁。
目前还没有关于米库氯铵的对上述已知结构的杂质、未知结构的杂质有效的分析检测方法的报道。因此，为了更好的对米库氯铵进行分析检测，保证米库氯铵的用药安全性和有效性，有必要建立合理、高效、条件温和的分析检测方法对其三种主成分和四个主要杂质，以及其他未知杂质进行分析检测。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供一种新的米库氯铵的分离方法。本发明方法能够有效地分离并检测米库氯铵的顺-顺式、顺-反式、反-反式三种异构体和反式季铵醇、顺式季铵醇、反式季铵酯、顺式季铵酯四种已知杂质，或多种其他的杂质。
本发明提供一种米库氯铵的分离方法，其特征在于，所述方法包括采用高效液相色谱法进行米库氯铵的分离的步骤，所述高效液相色谱法中，以十八烷基键合硅胶为固定相，检测波长为250～300nm，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中，所述的流动相A为水溶液:有机溶剂＝100:0～50:50(v/v)，流动相B为水溶液:有机溶剂＝0:100～50:50(v/v)。
可选地，上述的分离方法，其特征在于：
所述流动相A为水溶液:有机溶剂＝97:3～55:45(v/v)；
所述流动相B为水溶液:有机溶剂＝5:95～45:55(v/v)；
所述梯度洗脱的条件为：
a.流动相B从0％～5％变化至15％～30％，此阶段的运行时间为10～20min，
b.在阶段a的基础上，流动相B保持15％～30％比例不变，此阶段的运行时间为0～10min，
c.在阶段b的基础上，流动相B从15％～30％变化至40％～65％，此阶段的运行时间为15～40min，
其中，在每个阶段内，流动相B的百分比随时间而变化或保持不变，流动相A所占百分比与流动相B所占百分比之和为100％；
可选地，所述梯度洗脱还包括阶段d：在阶段c的基础上，流动相B从40％～65％变化至65％～100％并保持运行，此阶段的运行时间为15～30min。
可选地，上述的分离方法，其特征在于：
所述流动相A和流动相B中的水溶液各自独立地选自纯水或含盐缓冲液中的至少一种；
所述流动相A和流动相B中的有机溶剂各自独立地选自醇类、乙腈、酰胺类、酮类、酯类、环氧醚中的至少一种；
可选地，所述流动相A和流动相B中的有机溶剂各自独立地选自甲醇、乙醇、异丙醇、甲酰胺、丙酮、乙酸乙酯、二氧六环、四氢呋喃中的至少一种；
可选地，所述流动相A和流动相B中的有机溶剂各自独立地选自乙腈、甲醇中的至少一种；
可选地，所述含盐缓冲液选自磷酸二氢钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钾、乙酸钠、乙酸铵、甲酸铵、磷酸二氢铵缓冲液中的至少一种；
可选地，所述含盐缓冲液的浓度为1.0mol/L～0.001mol/L，可选为0.5mol/L～0.005mol/L，或可选为0.3mol/L～0.01mol/L；
可选地，所述含盐缓冲液的pH为2.0-7.0，可选为2.0～6.0，或可选为2.0～5.0；
可选地，所述含盐缓冲液的pH采用选自氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸、甲酸、乙酸及它们各自的水溶液中的至少一种调节。
可选地，上述的分离方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100～95 0～5
10 95～85 5～15
15 85～70 15～30
20 85～70 15～30
25 80～65 20～35
35 75～60 25～40
55 60～35 40～65
或者，所述梯度洗脱的条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100～95 0～5
10 95～85 5～15
15 85～70 15～30
20 85～70 15～30
25 80～65 20～35
35 75～60 25～40
55 60～35 40～65
60 35～0 65～100
80 35～0 65～100
可选地，上述的分离方法，其特征在于：
所述流动相的流速为0.5～2.0mL/min，可选为0.5～1.5mL/min，或可选为0.7～1.3mL/min；
检测波长为260～290nm，或可选为270～290nm；
柱温为20℃-60℃，可选为20℃-55℃，或可选为20℃-50℃；
进样量为1～100μL，可选为20μL。
本发明还提供上述分离方法在分离米库氯铵的顺-顺式、顺-反式、反-反式三种异构体，反式季铵醇，顺式季铵醇，反式季铵酯，顺式季铵酯，和/或其他杂质中的用途。
本发明还提供一种米库氯铵的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用上述分离方法进行米库氯铵的检测的步骤；
可选地，所述检测方法包括以下步骤：
(1)取米库氯铵样品，制成供试品溶液；
(2)取反式季铵醇和顺式季铵醇的混旋体，制成对照品溶液；
(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，采用上述分离方法进行测定；
可选地，所述检测方法包括以下步骤：
(1)取米库氯铵样品，用流动相A制成浓度为0.1mg/mL～5.0mg/mL的供试品溶液；可选地，所述供试品溶液的浓度为2mg/mL；
(2)取反式季铵醇和顺式季铵醇的混旋体，用流动相A制成浓度为0.2μg/mL～2mg/mL的对照品溶液；可选地，所述对照品溶液的浓度为2μg/mL；
(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，采用上述分离方法进行测定。
可选地，所述分离方法包括：
(1)取米库氯铵样品，用流动相A制成浓度为2mg/mL的供试品溶液；
(2)取反式季铵醇和顺式季铵醇的混旋体，用流动相A制成浓度为2μg/mL的对照品溶液；
(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，以十八烷基键合硅胶为固定相，检测波长为270～290nm，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中：
流动相A为水溶液：有机溶剂＝97:3～55:45(v/v)，流动相B为水溶液：有机溶剂＝5:95～45:55(v/v)；
其中，所述流动相A和流动相B中的水溶液各自独立地选自纯水或含盐缓冲液，所述含盐缓冲液为用选自磷酸二氢钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钾、乙酸钠、乙酸铵、甲酸铵、磷酸二氢铵中至少一种配制成0.3mol/L～0.01mol/L的pH为2.0～5.0的缓冲液，可选地，采用氨水、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、磷酸、甲酸、乙酸中的至少一种调节pH；所述流动相A和流动相B中的有机溶剂各自独立的选自乙腈和甲醇中的至少一种；
梯度洗脱的条件为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100～95 0～5
10 95～85 5～15
15 85～70 15～30
20 85～70 15～30
25 80～65 20～35
35 75～60 25～40
55 60～35 40～65
或者，梯度洗脱的条件为：
Figure BDA0001388982570000041
Figure BDA0001388982570000051
流速为0.7～1.3mL/min；柱温为20℃-50℃；进样量为20μL。
本发明还提供上述的检测方法在检测米库氯铵的顺-顺式、顺-反式、反-反式三种异构体，反式季铵醇，顺式季铵醇，反式季铵酯，顺式季铵酯，和/或其他杂质中的用途。
本发明还提供一种米库氯铵的含量测定方法，其特征在于，所述含量测定方法包括采用上述检测方法进行米库氯铵的含量测定的步骤；
可选地，所述含量测定方法采用外标法、面积归一化法或自身对照法计算；
可选地，所述含量测定方法采用外标法进行计算。
本发明还提供上述的含量测定方法在测定米库氯铵的顺-顺式、顺-反式、反-反式三种异构体，反式季铵醇，顺式季铵醇，反式季铵酯，顺式季铵酯，和/或其他杂质的含量中的用途。
本发明的米库氯铵的分离、检测以及含量测定方法具有以下优点：可以有效分离和检测米库氯铵的顺-顺式、顺-反式、反-反式三种异构体和反式季铵醇、顺式季铵醇、反式季铵酯、顺式季铵酯四种已知杂质以及多种其他的杂质，同时对它们各自的含量进行测定，以填补现有技术中对米库氯铵质量控制的技术空白，为米库氯铵质量标准的建立提供依据；并避免了用多种分析方法多次检测所造成的时间、人力、资金的耗费；本发明的分离、检测以及含量测定方法条件温和，对高效液相色谱仪器、分析试剂和色谱柱没有苛刻要求，能够适用于一般的色谱柱和高效液相分析仪器。
附图说明
图1为实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图；
图2～13分别为实施例1～12中系统适用性溶液的高效液相色谱图。
其中，纵坐标为响应值，单位为AU，横坐标为保留时间，单位为min。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.005mol/L磷酸二氢铵(用氨水调节pH至5.9)-乙腈(85:15)
流动相B：水-乙腈(5:95)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000061
波长：275nm
流速：0.5mL/min
柱温：50℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取米库氯铵样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000062
Figure BDA0001388982570000063
实施例2
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：水-乙腈(75:25)
流动相B：0.1mol/L磷酸二氢钠(用磷酸调节pH至2.0)-乙腈(10:90)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000064
Figure BDA0001388982570000071
波长：260nm
流速：1.3mL/min
柱温：55℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取米库氯铵样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000072
Figure BDA0001388982570000073
实施例3
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.3mol/L乙酸钠(用氨水调节pH至5.2)-甲醇(95:5)
流动相B：水-甲醇(25:75)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000074
Figure BDA0001388982570000081
波长：290nm
流速：1.0mL/min
柱温：40℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取米库氯铵样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000082
Figure BDA0001388982570000083
实施例4
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.01mol/L碳酸氢钾(用氢氧化钾调节pH至6.0)-甲醇(90:10)
流动相B：0.01mol/L碳酸氢钾(用氢氧化钾调节pH至6.0)-甲醇(15:85)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000084
波长：270nm
流速：1.2mL/min
柱温：20℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取米库氯铵样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000091
Figure BDA0001388982570000092
实施例5
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：水-乙腈(55:45)
流动相B：0.5mol/L乙酸铵(用氨水调节pH至5.0)-甲醇(40:60)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000093
波长：285nm
流速：0.7mL/min
柱温：35℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000101
Figure BDA0001388982570000102
实施例6
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.1mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇-乙腈(75:20:5)
流动相B：水-乙腈(20:80)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000103
波长：280nm
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取米库氯铵样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000111
Figure BDA0001388982570000112
实施例7
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.08mol/L乙酸铵(用乙酸调节pH至3.5)-甲醇-乙腈(80:10:10)
流动相B：0.08mol/L乙酸铵(用乙酸调节pH至3.5)-甲醇(10:90)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000113
波长：280nm
流速：0.8mL/min
柱温：30℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000121
Figure BDA0001388982570000122
实施例8
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.2mol/L甲酸铵(用甲酸调节pH至3.8)-甲醇-乙腈(60:30:10)
流动相B：0.2mol/L甲酸铵(用甲酸调节pH至3.8)-乙腈(45:55)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000123
波长：269nm
流速：1.5mL/min
柱温：50℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取米库氯铵样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000131
Figure BDA0001388982570000132
实施例9
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.02mol/L碳酸氢钠(用氢氧化钠溶液调节pH至5.6)-乙腈(80:20)
流动相B：0.02mol/L碳酸氢钠(用氢氧化钠溶液调节pH至5.6)-乙腈(10:90)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000133
波长：278nm
流速：1.0mL/min
柱温：45℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取米库氯铵样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000134
Figure BDA0001388982570000141
实施例10
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.07mol/L磷酸二氢钠(用氢氧化钠溶液调节pH至6.0)-乙腈(97:3)
流动相B：0.07mol/L磷酸二氢钠(用氢氧化钠溶液调节pH至6.0)-乙腈(40:60)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000142
波长：262nm
流速：1.1mL/min
柱温：55℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取米库氯铵样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000143
Figure BDA0001388982570000144
Figure BDA0001388982570000151
实施例11
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.3mol/L乙酸钠(用乙酸调节pH至3.9)甲醇-乙腈(80:15:5)
流动相B：0.3mol/L乙酸钠(用乙酸调节pH至3.9)-甲醇(20:80)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000152
波长：290nm
流速：1.2mL/min
柱温：35℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取米库氯铵样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000153
Figure BDA0001388982570000154
Figure BDA0001388982570000161
实施例12
主要实验仪器及色谱条件：
采用Waters e2695型高效液相色谱仪，配备waters2695分离单元、2489紫外可见光检测器，色谱分析处理系统采用Empower色谱工作站。
色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
流动相：流动相A：0.03mol/L磷酸二氢铵(用磷酸调节pH至3.6)甲醇-乙腈(80:5:15)
流动相B：0.03mol/L磷酸二氢铵(用磷酸调节pH至3.6)-甲醇(15:85)
梯度洗脱：
Figure BDA0001388982570000162
波长：274nm
流速：1.2mL/min
柱温：30℃
进样量：20μL
系统适用性溶液：称取米库氯铵样品，制备含有米库氯铵和杂质A、B、C、D的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液：称取米库氯铵样品，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2mg的溶液。
对照品溶液：称取杂质A和杂质B的混旋体，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2μg的溶液。
测定法：分别精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算。
供试品溶液测定结果：
Figure BDA0001388982570000163
Figure BDA0001388982570000164
从实施例1-12对系统适用性溶液的分析测试结果可以看出，本发明的分离和检测方法均能使上述米库氯铵的反-反、顺-反和顺-顺异构体以及杂质A、杂质B、杂质C、杂质D共7种物质得到非常好的分离和检测，由供试品溶液的测试结果可以看出，本发明方法还检出了多种其他的杂质，并且定量分析了米库氯铵三种异构体、四种已知杂质、其他杂质中峰面积最大的杂质的含量以及总的杂质含量，因此，本发明的分离、检测和含量测定方法可从米库氯铵的异构体含量和杂质含量两方面对米库氯铵的进行更加全面和准确的分析检测，有利于保证米库氯铵的用药安全性和有效性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种米库氯铵的分离方法，其特征在于，包括分离米库氯铵的顺-顺式、顺-反式、反-反式三种异构体，反式季铵醇
Figure FDA0003277564650000011
顺式季铵醇
Figure FDA0003277564650000012
反式季铵酯
Figure FDA0003277564650000013
顺式季铵酯
Figure FDA0003277564650000014
和/或其他杂质；所述方法包括采用高效液相色谱法进行米库氯铵的分离的步骤，所述高效液相色谱法中，以十八烷基键合硅胶为固定相，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中，
流动相：流动相A：用氨水调节pH至5.9的0.005mol/L磷酸二氢铵-乙腈体积比为85:15
流动相B：水-乙腈体积比为5:95
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000015
波长：275nm
流速：0.5mL/min
柱温：50℃
或者，
流动相：流动相A：水-乙腈体积比为75:25
流动相B：用磷酸调节pH至2.0的0.1mol/L磷酸二氢钠-乙腈体积比为10:90
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000016
波长：260nm
流速：1.3mL/min
柱温：55℃
或者，
流动相：流动相A：用氨水调节pH至5.2的0.3mol/L乙酸钠-甲醇体积比为95:5
流动相B：水-甲醇体积比为25:75
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000021
波长：290nm
流速：1.0mL/min
柱温：40℃
或者，
流动相：流动相A：用氢氧化钾调节pH至6.0的0.01mol/L碳酸氢钾-甲醇体积比为90:10
流动相B：用氢氧化钾调节pH至6.0的0.01mol/L碳酸氢钾-甲醇体积比为15:85梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000022
波长：270nm
流速：1.2mL/min
柱温：20℃
或者，
流动相：流动相A：水-乙腈体积比为55:45
流动相B：用氨水调节pH至5.0的0.5mol/L乙酸铵-甲醇体积比为40:60
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000023
Figure FDA0003277564650000031
波长：285nm
流速：0.7mL/min
柱温：35℃
或者，
流动相：流动相A：用磷酸调节pH至3.0的0.1mol/L磷酸二氢钾-甲醇-乙腈体积比为75:20:5
流动相B：水-乙腈体积比为20:80
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000032
波长：280nm
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
或者，
流动相：流动相A：用乙酸调节pH至3.5的0.08mol/L乙酸铵-甲醇-乙腈体积比为80:10:10
流动相B：用乙酸调节pH至3.5的0.08mol/L乙酸铵-甲醇体积比为10:90
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000033
波长：280nm
流速：0.8mL/min
柱温：30℃
或者，
流动相：流动相A：用甲酸调节pH至3.8的0.2mol/L甲酸铵-甲醇-乙腈体积比为60:30:10
流动相B：用甲酸调节pH至3.8的0.2mol/L甲酸铵-乙腈体积比为45:55
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000041
波长：269nm
流速：1.5mL/min
柱温：50℃
或者，
流动相：流动相A：用氢氧化钠溶液调节pH至5.6的0.02mol/L碳酸氢钠-乙腈体积比为80:20
流动相B：用氢氧化钠溶液调节pH至5.6的0.02mol/L碳酸氢钠-乙腈体积比为10:90
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000042
波长：278nm
流速：1.0mL/min
柱温：45℃
或者，
流动相：流动相A：用氢氧化钠溶液调节pH至6.0的0.07mol/L磷酸二氢钠-乙腈体积比为97:3
流动相B：用氢氧化钠溶液调节pH至6.0的0.07mol/L磷酸二氢钠-乙腈体积比为40:60
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000051
波长：262nm
流速：1.1mL/min
柱温：55℃
或者，
流动相：流动相A：用乙酸调节pH至3.9的0.3mol/L乙酸钠-甲醇-乙腈体积比为80:15:5
流动相B：用乙酸调节pH至3.9的0.3mol/L乙酸钠-甲醇体积比为20:80
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000052
波长：290nm
流速：1.2mL/min
柱温：35℃
或者，
流动相：流动相A：用磷酸调节pH至3.6的0.03mol/L磷酸二氢铵-甲醇-乙腈体积比为80:5:15
流动相B：用磷酸调节pH至3.6的0.03mol/L磷酸二氢铵-甲醇体积比为15:85
梯度洗脱：
Figure FDA0003277564650000053
波长：274nm
流速：1.2mL/min
柱温：30℃
其中，在每个阶段内，流动相B的百分比随时间而变化或保持不变，流动相A所占百分比与流动相B所占百分比之和为100％。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：进样量为1～100μL。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于：所述进样量为20μL。
4.权利要求1～3中任一项所述分离方法在分离米库氯铵的顺-顺式、顺-反式、反-反式三种异构体，反式季铵醇，顺式季铵醇，反式季铵酯，顺式季铵酯，和/或其他杂质中的用途。
5.一种米库氯铵的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用权利要求1～3中任一项所述分离方法进行米库氯铵的检测的步骤。
6.根据权利要求5所述的米库氯铵的检测方法，其特征在于，
所述检测方法包括以下步骤：
(1)取米库氯铵样品，制成供试品溶液；
(2)取反式季铵醇和顺式季铵醇的混旋体，制成对照品溶液；
(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，采用权利要求1～3中任一项所述分离方法进行测定。
7.根据权利要求5所述的米库氯铵的检测方法，其特征在于，
所述检测方法包括以下步骤：
(1)取米库氯铵样品，用流动相A制成浓度为0.1mg/mL～5.0mg/mL的供试品溶液；
(2)取反式季铵醇和顺式季铵醇的混旋体，用流动相A制成浓度为0.2μg/mL～2mg/mL的对照品溶液；
(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，采用权利要求1～3中任一项所述分离方法进行测定。
8.根据权利要求7所述的米库氯铵的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的浓度为2mg/mL。
9.根据权利要求7所述的米库氯铵的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的浓度为2μg/mL。
10.权利要求5～9任一项所述的检测方法在检测米库氯铵的顺-顺式、顺-反式、反-反式三种异构体，反式季铵醇，顺式季铵醇，反式季铵酯，顺式季铵酯，和/或其他杂质中的用途。
11.一种米库氯铵的含量测定方法，其特征在于，所述含量测定方法包括采用权利要求5～9任一项所述检测方法进行米库氯铵的含量测定的步骤。
12.根据权利要求11所述的米库氯铵的含量测定方法，其特征在于，
所述含量测定方法采用外标法、面积归一化法或自身对照法进行计算。
13.根据权利要求12所述的米库氯铵的含量测定方法，其特征在于，所述含量测定方法采用外标法进行计算。
14.权利要求11～13任一项所述的含量测定方法在测定米库氯铵的顺-顺式、顺-反式、反-反式三种异构体，反式季铵醇，顺式季铵醇，反式季铵酯，顺式季铵酯，和/或其他杂质的含量中的用途。
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