CN107771217A - 谷氨酸草酰乙酸转氨酶1 (got1)、制剂和产生它们的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本文公开一种包含谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(GOT1)多肽分子的蛋白制剂，GOT1的序列与人血清中存在的相同。制剂的100%GOT1多肽分子在GOT1多肽的第1位具有丙氨酸。GOT多肽分子构成制剂中至少95%的蛋白。本文还公开了产生它们的方法及其用途。

Description

谷氨酸草酰乙酸转氨酶1 (GOT1)、制剂和产生它们的方法及 其用途

发明的领域和背景

本发明在其某些实施方案中涉及纯化的谷氨酸草酰乙酸转氨酶1 (GOT1)制剂和产生它们的方法。

谷氨酸草酰乙酸转氨酶1 (GOT1)为一种通过把谷氨酸转变成α-酮戊二酸来调控谷氨酸血液水平的血清酶。在动物模型中，全身性给予重组谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(rGOT)已显示能够在已知在脑内释放过多谷氨酸的多种医学指征之后清除在脑内累积的过多的兴奋毒性谷氨酸，所述医学指征包括缺血性卒中、创伤性脑损伤和脑神经胶质瘤肿瘤。

脑内过多的谷氨酸是引起神经损伤的主要原因之一。多形性胶质母细胞瘤(GBM)型脑瘤的侵袭性和快速生长被认为是无法治愈的。其快速生长及其与疾病相关的神经损伤的原因之一是GBM细胞持续分泌兴奋毒性谷氨酸分子，其累积在脑内，引起邻近肿瘤的正常脑细胞死亡。这转而也产生了快速肿瘤膨胀需要的颅内空间。

在GBM小鼠模型中共同给予rGOT1和标准治疗药物替莫唑胺(TMZ)明显延缓肿瘤生长，并且与单独接受TMZ治疗组相比，将其寿命从45天延长至76天(Ruban A等, Invest NewDrugs (2012) 30(6): 2226-2235)。

先前已经显示，在缺血性卒中大鼠模型中给予rGOT1引起的血液谷氨酸水平减少导致脑内累积的过多的兴奋毒性谷氨酸分子快速外流(15分钟内)，通过血脑屏障进入血流(F. Campos, 等, Journal of Cereb. Blood Flow Metabol. 2011, 31, 1387; M.Perez-Mato, 等, Cell Death & Dis. 2014, 5, e992)。

另外的背景技术包括：Prakash等. Microbial Cell Factories 2012, 11:92;Marblestone等, Protein Sci. 2006年1月; 15(1): 182-189; 和美国专利申请第20100021987号。

发明概述

本发明某些实施方案的一个方面提供一种包含谷氨酸草酰乙酸转氨酶1 (GOT1)多肽分子的蛋白制剂，其中100%的GOT1多肽分子在GOT1多肽的第1位具有丙氨酸，并且其中GOT1多肽分子构成制剂中至少95%的蛋白。

本发明某些实施方案的一个方面提供一种包含本文描述的蛋白制剂作为活性剂和药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明某些实施方案的一个方面提供一种包含目标多肽和小泛素相关修饰物(SUMO)的融合蛋白，其中目标多肽的N末端翻译融合至SUMO的C末端，其中融合蛋白缺少异源亲和标签。

本发明某些实施方案的一个方面提供一种包含GOT1和小泛素相关修饰物(SUMO)的谷氨酸草酰乙酸转氨酶1 (GOT1)融合蛋白，其中GOT1的N末端翻译融合至SUMO的C末端，其中融合蛋白缺少亲和标签。

本发明某些实施方案的一个方面提供一种编码本文描述的融合蛋白的分离的多核苷酸。

本发明某些实施方案的一个方面提供一种包含本文描述的分离的多核苷酸的核酸构建体。

本发明某些实施方案的一个方面提供一种在有需要的受试者中治疗与谷氨酸过多有关的疾病或病况的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的本文描述的制剂或药物，从而治疗疾病或病况。

本发明某些实施方案的一个方面提供一种纯化多肽的方法，所述方法包括：

(a) 在宿主细胞内表达包含多肽和SUMO的融合蛋白，其中多肽的N末端翻译融合至SUMO的C末端，其中融合蛋白缺少异源亲和标签；

(b) 自融合蛋白去除SUMO；和

(c) 自宿主细胞分离多肽，从而纯化多肽。

按照本发明的某些实施方案，蛋白构成制剂中至少98%的分子。

按照本发明的某些实施方案，GOT1包含与SEQ ID NO: 2具有至少90%同源性的氨基酸序列。

按照本发明的某些实施方案，GOT1由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成。

按照本发明的某些实施方案，GOT1在第1位包含丙氨酸。

按照本发明的某些实施方案，亲和标签为多聚组氨酸标签。

按照本发明的某些实施方案，GOT1的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2具有至少90%同源性。

按照本发明的某些实施方案，SUMO的氨基酸序列与SEQ ID NO: 5具有至少90%同源性。

按照本发明的某些实施方案，融合蛋白包含与SEQ ID NO: 1具有至少90%同源性的氨基酸序列。

按照本发明的某些实施方案，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

按照本发明的某些实施方案，SUMO为酵母SUMO。

按照本发明的某些实施方案，酵母SUMO为酿酒酵母的mif two 3抑制因子(suppressor of mif two 3, Smt3)。

按照本发明的某些实施方案，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO: 3具有至少90%同源性的核酸序列。

按照本发明的某些实施方案，疾病或病况为脑疾病或病况。

按照本发明的某些实施方案，脑疾病为中枢神经系统的癌症。

按照本发明的某些实施方案，癌症为胶质母细胞瘤。

按照本发明的某些实施方案，脑病况为脑缺血。

按照本发明的某些实施方案，疾病为神经退行性疾病。

按照本发明的某些实施方案，步骤(b)先于步骤(c)实现。

按照本发明的某些实施方案，多肽为GOT1。

按照本发明的某些实施方案，去除是使用SUMO蛋白酶实现。

按照本发明的某些实施方案，分离是采用选自热沉淀、盐诱导沉淀、混合模式色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱的技术实现。

按照本发明的某些实施方案，分离是采用热沉淀、盐诱导沉淀、混合模式色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱实现。

按照本发明的某些实施方案，分离是通过以下实现：

(a) 通过热处理纯化GOT1；

(b) 通过盐诱导沉淀纯化GOT1；

(c)通过混合模式色谱纯化GOT1；

(d)通过阳离子交换色谱纯化GOT1；和

(e)通过阴离子交换色谱纯化GOT1，其中步骤(e)在步骤(d)之后，步骤(d)在步骤(c)之后，步骤(c)在步骤(b)之后，和步骤(b)在步骤(a)之后。

热沉淀、盐诱导沉淀包括硫酸铵诱导沉淀。

热沉淀，宿主细胞选自细菌、酵母、哺乳动物细胞和昆虫细胞。

按照本发明的某些实施方案，宿主细胞为细菌细胞。

除非另外定义，本文使用的所有技术和/或科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的具有相同含义。尽管与本文描述的那些类似或相当的方法和材料可用于本发明实施方案的实施或测试，但以下描述示例性的方法和/或材料。如果发生冲突，以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的，并非旨在必然限制。

附图简述

参照附图和图像，本文仅通过实例来描述本发明的某些实施方案。现具体详细地参照附图，需强调的是，通过实例和为了本发明实施方案的说明性讨论目的而显示细节。在这方面，与附图一起所做的描述使本领域技术人员明白可如何实施本发明的实施方案。

附图中：

图1显示SUMO-GOT生物合成过程的完整方案。

图2显示生物合成期间发酵罐中的pH、pO₂、搅拌器、温度、气流和培养物光密度监测。

图3为在化学定义的中和高密度期间得到的生物质的代表性SDS-PAGE图示。

图4为纯化方案的流程图。

图5显示PPA Hyper Cel的代表性色谱图。

图6显示CM Sepharose FF的代表性色谱图。

图7显示Q Sepharose FF的代表性色谱图。

图8为SDS-PAGE滴定的照片。条带3-2.5 µg；条带5-5.0 µg；条带7-10.0 µg；条带9-20 µg。

图9显示最终GOT1溶液的代表性RP-HPLC色谱图。

图10显示最终GOT1溶液的代表性SEC-HPLC色谱图。

图11为对照和GOT1样品肽作图的覆盖色谱图。

图12为说明基于等电点聚焦的杂质的考马斯染色凝胶照片。1-宽范围pI标志物；2-参比溶液A；3-参比溶液B；4-批次1；5-批次2；6-批次3；7-批次4；8-批次5；9-宽范围pI标志物。

发明具体实施方案的描述

本发明在其某些实施方案中涉及纯化的谷氨酸草酰乙酸转氨酶1 (GOT1)制剂和产生它们的方法。

在详细阐释本发明的至少一个实施方案之前，应该理解本发明不必然将其应用限于在下文说明书中示出或通过实施例例示的细节。本发明能够进行其他实施方案或以不同方式实施或进行。

血液谷氨酸清除为一种引人注目的保护性策略，用以减少包括多形性胶质母细胞瘤(GBM)和缺血性脑损伤在内的各种障碍期间释放的细胞外谷氨酸的兴奋毒性作用。

直到最近，在大肠杆菌系统中制备了重组人rGOT，其包括通常用于重组蛋白的方便直接的亲和纯化的组氨酸-6标签。因为含有His标签的重组蛋白由于免疫学含意不能用于人，所以需要产生与人的酶相同的rGOT 1制剂，人的酶在其N-末端位置具有丙氨酸部分(JM, Doyle等. The amino acid sequence of cytosolic aspartate aminotransferasefrom human liver. Biochem. J. 1990, 270: 651-7)。

重组细菌表达系统产生包含N-末端甲硫氨酸的重组多肽。取决于接下来的5个N末端氨基酸的序列，该氨基酸可被甲硫氨酸氨基肽酶(MAP2)切割。然而，研究发现，在采用MAP2细菌酶自rGOT1切割N-末端甲硫氨酸的过程中，该酶不仅切割N-末端甲硫氨酸，而且切割继甲硫氨酸切割之后暴露出来的接下来的3个氨基酸(丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸)。因此，产生异质蛋白群，其中某些成员含有N-末端丙氨酸，而其他成员在第二或第三个N-末端氨基酸上被切割。这种异质蛋白制剂不适合于人治疗。

为解决这个问题，本发明人通过使GOT1基因与编码SUMO实体(Smt3，酵母酿酒酵母来源)的基因无缝融合来产生嵌合蛋白。在细菌系统表达、自融合蛋白切割SUMO实体和生化纯化rGOT1之后，本发明人得到纯度超过95%的生物活性rGOT1制剂，如图11和图12及下文表6所示。

因此，本发明的第一方面提供一种纯化多肽的方法，所述方法包括：

(a) 在宿主细胞内表达包含多肽和SUMO的融合蛋白，其中多肽的N末端翻译融合至SUMO的C末端，其中融合蛋白缺少异源亲和标签；

(b) 自融合蛋白去除SUMO；和

(c) 自宿主细胞分离多肽，从而纯化多肽。

术语“融合蛋白”指的是包含源于超过一种亲本蛋白或多肽的多肽组分的蛋白。本发明这方面的融合蛋白自融合基因表达，其中编码一种目标蛋白的多肽序列的核苷酸序列与编码SUMO的多肽序列的核苷酸序列框内连接(并且没有接头)。如下文进一步描述的那样，融合基因然后可由重组宿主细胞表达为单一蛋白。

按照本发明的这一方面，融合蛋白缺少如下文进一步详述的异源亲和纯化标签。

本文使用的术语“SUMO”指的是小泛素相关修饰物(或SUMO)蛋白家族成员的多肽。SUMO蛋白通常较小，大多数为长度约100个氨基酸和质量为12 kDa。准确的长度和质量在SUMO家族成员之间不同，并且取决于蛋白所源自的生物。SUMO可为酵母SUMO (例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的mif two 3抑制因子(Smt3))、人SUMO-1、人SUMO-2、人SUMO-3和拟南芥(Arabidopsis thalania)SUMO-1至SUMO-8中的任一种、番茄SUMO、爪蟾(Xenopus laevis)SUMO-1至SUMO-3中的任一种、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Smt3、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)SMO-1、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)Pmt3、疟原虫镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)SUMO、霉菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)SUMO。

按照一个特定实施方案，SUMO蛋白为酿酒酵母SUMO (Smt3)，并且与SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列具有至少90%同源性、至少91%同源性、至少92%同源性、至少93%同源性、至少94%同源性、至少95%同源性、至少96%同源性、至少97%同源性、至少98%同源性、至少99%的同源性和甚至更优选100%的同源性，如使用NCBI的标准蛋白-蛋白BLAST[blastp]软件测定的。

本发明该方面融合蛋白的第二多肽(或目标多肽)可为用于研究和工业环境(例如用于生产治疗剂、疫苗、诊断剂、生物燃料和许多其他目标应用)的任何多肽。

多肽可为细胞内多肽(例如胞浆蛋白)、跨膜多肽或分泌多肽。多肽可为全长多肽或其片段。根据一个实施方案，多肽为少于10个氨基酸、20个氨基酸、50个氨基酸或100个氨基酸。

按照一个特定实施方案，多肽为人多肽，并且具有与野生型蛋白的氨基酸序列具有至少95%同源性、更优选96%同源性、97%同源性、98%同源性、99%同源性和甚至更优选100%同源性的氨基酸序列，如使用NCBI的标准蛋白-蛋白BLAST[blastp]软件测定的。

可通过采用主题组合物和方法产生的示例性治疗蛋白包括但不限于：某些天然和重组人体激素(例如胰岛素、生长激素、胰岛素样生长因子1、促卵泡激素和绒毛膜促性腺激素)、造血蛋白(例如红细胞生成素、C-CSF、GM-CSF和IL-11)、血栓蛋白与止血蛋白(例如组织纤溶酶原激活物和活化蛋白C)、免疫蛋白(例如细胞因子、趋化因子、淋巴因子)、抗体和其他酶(例如脱氧核糖核酸酶I)。可通过主题组合物和方法产生的示例性疫苗包括但不限于针对以下的疫苗：各种流感病毒(例如甲型、乙型和丙型以及每种类型的不同血清型，比如甲型流感病毒的H5N2、H1N1、H3N2)、HIV、肝炎病毒(例如甲型、乙型、丙型或丁型肝炎)、莱姆病和人乳头瘤病毒(HPV)。异源产生的蛋白诊断剂的实例包括但不限于分泌素、促甲状腺激素(TSH)、HIV抗原和丙型肝炎抗原。

具体的多肽或蛋白的实例包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、集落刺激因子(CSF)、干扰素β (IFN-β)、干扰素γ (IFN-γ)、干扰素γ诱导因子I (IGIF)、转化生长因子β (IGFβ)、RANTES (调控激活正常T-细胞表达分泌因子)、巨噬细胞炎性蛋白(例如MIP-1-α和MIP-1-β)、利士曼原虫伸长起始因子(LEIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)；生长因子，例如表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-2 (NT-2)、神经营养因子-3 (NT-3)、神经营养因子-4 (NT-4)、神经营养因子-5 (NT-5)、胶质细胞系来源神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)；TNFα II型受体；红细胞生成素(EPO)；胰岛素；和可溶性糖蛋白，例如糖蛋白gp120和gp160。其他实例包括分泌素、奈西立肽(人B型利钠肽(hBNP))和GYP-I。

其他示例性多肽在美国专利申请第2012032909号中公开，其内容通过参照结合到本文中。

在某些实施方案中，异源生成的蛋白为酶或其生物活性片段。合适的酶包括但不限于：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。在某些实施方案中，异源生成的蛋白为酶学委员会(Enzyme Commission, EC)第1类的酶，例如EC 1.1-1.21或1.97中任一项的酶。酶也可为EC第2、3、4、5或6类的酶。例如，酶可选自EC 2.1-2.9、EC 3.1-3.13、EC4.1-4.6，EC 4.99、EC 5.1-5.11、EC 5.99或EC 6.1-6.6中的任一项。

根据一个特定实施方案，多肽为谷氨酸草酰乙酸转氨酶1型(GOT1；MM_002079.2；p17174)。该酶为具有EC编号2.6.1.1的磷酸吡哆醛(PLP)依赖性胞质酶。GOT1在氨基酸代谢、尿素和三羧酸循环中起作用。天冬氨酸氨基转移酶活性参与发育期间肝葡萄糖合成和参与脂肪细胞甘油异生。GOT1也为血清谷氨酸水平的重要调控剂。与在血液循环中存在的高水平谷氨酸(约40微摩尔)相比，正常大脑的细胞外谷氨酸水平很低(约1微摩尔)。少量的脑谷氨酸作为脊椎动物中枢神经系统的神经递质起重要作用。

本发明该方面融合蛋白的GOT1具有血清GOT1的氨基酸序列(即在其N末端包含丙氨酸(在蛋白序列的第1位)。

优选地，GOT1包含与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有至少90%同源性、至少91%同源性、至少92%同源性、至少93%同源性、至少94%同源性、至少95%同源性、至少96%同源性、至少97%同源性、至少98%同源性、至少99%同源性和甚至更优选100%同源性的氨基酸序列，如使用NCBI的标准蛋白-蛋白BLAST[blastp]软件测定的(其中蛋白的第一个氨基酸为丙氨酸和不为甲硫氨酸)。

按照一个具体实施方案，GOT1由SEQ ID NO: 2所示的序列组成。

优选地，SUMO-GOT1融合蛋白包含与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有至少90%同源性、至少91%同源性、至少92%同源性、至少93%同源性、至少94%同源性、至少95%同源性、至少96%同源性、至少97%同源性、至少98%同源性、至少99%同源性和甚至更优选100%同源性的氨基酸序列，如使用NCBI的标准蛋白-蛋白BLAST[blastp]软件测定的。

按照另一个实施方案，SUMO-GOT1融合蛋白由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成。

为了采用重组技术产生SUMO融合蛋白(例如SUMO-GOT1融合蛋白)，可使用包含编码这样多肽的核酸序列的分离的多核苷酸。示例性的核酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

术语“核酸序列”指的是由天然存在的碱基、糖类和共价核苷间键(例如骨架)组成的脱氧核糖核酸序列以及具有非天然存在部分(其功能与相应天然存在的部分类似)的寡核苷酸。本发明能够进行这样的修饰，条件是仍然允许重组表达。

本发明该方面融合蛋白的核酸序列可为互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如以上的组合)。

本文使用的短语“互补多核苷酸序列”指的是使用逆转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶自信使RNA的逆转录生成的序列。这样的序列可随后在体内或体外利用DNA依赖性DNA聚合酶扩增。

本文使用的短语“基因组多核苷酸序列”指的是源自(分离自)染色体的序列，并且因此其代表染色体的连续部分。

本文使用的短语“复合多核苷酸序列”指的是至少部分互补且至少部分基因组的序列。复合序列可包括某些编码本发明多肽所需要的外显子序列以及插入其间的某些内含子序列。内含子序列可为任何来源，包括属于其他基因，并且一般地包括保守的剪接信号序列。这样的内含子序列可进一步包括顺式作用表达调控元件。

使用标准分子生物学技术，包括使用PCR、连接酶和限制性内切酶，可实现编码SUMO的多核苷酸序列和编码目标蛋白的多核苷酸序列的连接。应该意识到，SUMO的5’末端连接至编码目标蛋白的基因3’末端，使得产生在N末端具有SUMO和在C末端具有目标多肽的融合蛋白。

产生的编码融合蛋白的多核苷酸一般地缺少任何编码异源亲和标签的序列。

本文使用的短语“异源亲和标签”指的是不天然包含在SUMO或目标多肽(即野生型序列)中的氨基酸序列，其可用于亲和纯化融合蛋白或目标多肽。

因此，例如，本发明该方面的分离的多核苷酸缺少编码以下标签的核酸序列：多聚组氨酸标签、多聚精氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、S-标签、流感病毒HA标签、硫氧还蛋白、葡萄球菌A蛋白标签、FLAG^TM表位、AviTag表位和c-myc表位。

为了采用重组技术产生本发明的融合蛋白，将编码该融合蛋白的多核苷酸连接到核酸表达载体中，使得多核苷酸序列在顺式调控序列(例如启动子序列)的转录控制下。

各种原核或真核细胞可用作宿主表达系统以表达本发明的多肽。这些包括但不限于：微生物，比如用含有多肽编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有多肽编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(比如Ti质粒)转化的植物细胞系统。

可用于表达融合蛋白的示例性细菌细胞为大肠杆菌，比如大肠杆菌蛋白缺陷型菌株，例如大肠杆菌BL21或Rosetta gami-2，最优选地为大肠杆菌BL21。

可用于表达融合蛋白的示例性酵母细胞为乳酸克鲁维酵母(K. lactis)或酿酒酵母。

适合用于本发明该实施方案的组成型启动子包括在大多数环境条件下和大多数类型细胞比如巨细胞病毒(CMV)的劳氏肉瘤病毒(RSV)中具有功能(即能够指导转录)的序列。

适合用于本发明该实施方案的诱导型启动子包括例如四环素诱导型启动子(Srour, M.A.等, 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405)或lac操纵子。在后者情况下，于20-30℃之间的温度(例如25℃)下，使用0.1 mM-1 mM浓度的异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导基因表达。

本发明该实施方案的表达载体可包括另外的序列，其使该载体适合于在原核生物、真核生物或优选地在两者中复制和整合(例如穿梭载体)。代表性的克隆载体含有转录和翻译起始序列(例如启动子、增强子)及转录和翻译终止子(例如多聚腺苷酸化信号)。

真核启动子一般地含有两种类型的识别序列，即TATA盒和上游启动子元件。位于转录起始位点上游25-30个碱基对的TATA盒被认为参与指导RNA聚合酶开始RNA合成。其他上游启动子元件决定转录起始的速率。

增强子元件可刺激所连接的同源或异源启动子的转录达1000倍。增强子在置于转录起始位点下游或上游时有活性。许多源自病毒的增强子元件具有广泛的宿主范围，并在多种组织中有活性。例如，SV40早期基因增强子适合于多种细胞类型。适合于本发明的其他增强子/启动子组合，包括源自多瘤病毒、人或鼠巨细胞病毒(CMV)的那些、来自各种逆转录病毒比如鼠白血病病毒、鼠或劳氏肉瘤病毒和HIV的长重复序列(long term repeat)。参见：Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y. 1983，其通过参照结合到本文中。

多聚腺苷酸化序列也可被添加到表达载体，以提高自本发明的表达载体表达的多肽的翻译效率。两个不同的序列元件是准确和有效的多聚腺苷酸化所需要的：位于多聚腺苷酸化位点下游的富GU或U序列和位于上游11-30个核苷酸的高度保守的6个核苷酸的序列AAUAAA。适合于本发明的终止和多聚腺苷酸化信号包括源自SV40的那些。

除已描述的元件以外，本发明的表达载体一般地可含有其他意欲增加克隆核酸的表达水平或便于识别携带重组DNA的细胞的特化元件。例如，一些动物病毒含有促进病毒基因组在允许的细胞类型中进行额外染色体复制的DNA序列。携带这些病毒复制子的质粒进行游离基因复制，只要质粒上携带的基因或宿主细胞基因组提供合适的因子。

载体可或可不包含真核复制子。如果真核复制子存在，那么可使用适当的选择性标志物在真核细胞内扩增载体。如果载体不包含真核复制子，则不可能进行游离基因扩增。而是重组DNA整合到被改造细胞的基因组中，其中启动子指导期望的核酸表达。

适合于本发明的细菌表达载体的实例包括但不限于pET21b+、pBR322或pET28+。

哺乳动物表达载体的实例包括但不限于：pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81(它们可得自Invitrogen)；可得自Promega的pCI；可得自Strategene的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV；可得自Clontech的pTRES；及其衍生物。

本发明也可使用含有源自真核病毒比如逆转录病毒的调控元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。源自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，源自埃-巴二氏病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括PMSG、pAV009/A⁺、pMTO10/A⁺、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体启动子或其他显示在真核细胞中对于表达有效的启动子的指导下允许蛋白表达的任何其他载体。

各种方法可用于把本发明的表达载体引入到细胞内。这样的方法通常描述于Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs HarborLaboratory, New York(1989, 1992); Ausubel等, Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989); Chang等, Somatic GeneTherapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995); Vega等, Gene Targeting, CRCPress, Ann Arbor, Mich. (1995); Vectors: A Survey of Molecular CloningVectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)；和Gilboa等[Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]；并且包括例如稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和感染重组病毒载体。另外，正负选择方法参见美国专利申请第5464764和5487992号。

转化的细胞在允许表达高含量的重组多肽的有效条件下培养。有效的培养条件包括但不限于允许蛋白产生的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效培养基指的是培养细胞以产生本发明重组多肽的任何培养基。这样的培养基一般地包括具有可同化的碳、氮和磷源以及合适的盐、矿物质、金属和其他营养物(比如维生素)的水溶液。

本发明的细胞可在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿(microtiterdish)和皮氏培养皿中培养。培养可在适合于重组细胞的温度、pH和氧含量下实施。这样的培养条件处于本领域普通技术人员的专门知识范围内。

取决于用于产生的载体和宿主系统，生成的本发明多肽可保持在重组细胞内、分泌到发酵培养基中、分泌到两细胞膜之间的空间(比如大肠杆菌的周质空间)或保留在细胞或病毒膜的外表面上。

在培养预定的时间之后，实现重组融合蛋白的回收。

如果融合蛋白在细胞内表达，那么优选地破碎细胞膜以释放融合蛋白。

细胞破碎可采用本领域已知的方法包括匀浆化实现。

融合蛋白通过加入SUMO蛋白酶(EC 3.4.22.68)去SUMO化。

去SUMO化可在纯化过程的任何阶段实现。按照一个特定实施方案，该过程在热变性之后和盐沉淀和/或交换色谱之前实现，如在下文进一步描述的。

SUMO蛋白酶可包含源自酿酒酵母的酿酒酵母ULP1 (Ubl特异性蛋白酶1)、Ulp2、人SENP1、人SENP2、人SENP3、人SENP5、人SENP6、人SENP7、小鼠SENP1、小鼠SENP2、小鼠SENP3、小鼠SENP5、小鼠SENP6、小鼠SENP7、拟南芥Ulp1a-Ulp1d中的任一种、拟南芥Ulp2a-Ulp2h中的任一种、拟南芥ESD4、秀丽隐杆线虫Ulp-1、秀丽隐杆线虫Ulp-2、黑腹果蝇ULP1、粟酒裂殖酵母Ulp1、粟酒裂殖酵母ULP2、构巢曲霉Ulp、爪蟾XSENP1a、爪蟾XSENP1b、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XopD、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)Ulp1、镰状疟原虫Ulp、其等价物、其同源物、其催化结构域或其组合。

融合蛋白可采用本领域已知的任何方法纯化，包括但不限于热变性、盐诱导沉淀、混合模式色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。

热变性：

不同的蛋白在升高的温度下稳定性不同，并且如果靶蛋白比污染蛋白具有更大的热稳定性，则在升高的温度下温育从几分钟变化至几小时的时间段通常沉淀不需要的蛋白，其然后可通过离心去除。在某些情况下，靶蛋白在升高温度下的稳定性可通过存在底物或其他增强其折叠的特异性配体来提高。在α-酮戊二酸(例如10 mM)和5-磷酸吡哆醛(例如20 µM)存在下，GOT1在70℃下是热稳定的。因此，通过把温度增加至约70℃、变性的污染蛋白可能会沉淀。

盐诱导沉淀：

蛋白的溶解度随溶液的离子强度而变化，并因此随盐浓度变化。人们观察到两种截然不同的效果：在低盐浓度时，蛋白的溶解度随盐浓度的增加(即离子强度的增加)而增加，这种效应称为盐溶。随着盐浓度(离子强度)的进一步增加，蛋白的溶解度开始下降。在足够高的离子强度下，蛋白将几乎完全从溶液中沉淀出来(盐析)。由于蛋白在高的离子强度下其溶解度明显不同，所以盐析(或盐诱导沉淀)是助于给定蛋白纯化的非常有用的过程。常用的盐为硫酸铵，因为它非常易溶于水，形成霍夫迈斯特序列中高的两种离子，并且对酶的活性没有不良影响。其通常被用作饱和水溶液，稀释到所需的浓度，表示为饱和溶液(100%溶液)的百分比浓度。

色谱树脂：

术语“色谱树脂”或“色谱介质”在本文中可互换使用，并且指的是使目标分析物(例如目标多肽或本发明的融合蛋白)与混合物中存在的其它分子分离的任何种类的固相。通常，目标分析物与其他分子由于混合物中的单个分子在流动相的影响下迁移通过固定的固相或在结合和洗脱过程中的速率差异而分离。非限制性的实例包括阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和混合模式树脂。所采用柱的树脂体积、长度和直径以及动态容量和流速取决于几个参数，比如待处理的流体体积、要经受本发明方法的流体中的蛋白浓度等。对用于每步的这些参数的确定完全处于本领域技术人员的普通技能范围内。

混合模式色谱：

混合模式色谱是采用色谱配体的混合模式的色谱。在某些实施方案中，这样的配体指的是能够提供至少两种不同但合作的与被结合的物质相互作用的位点的配体。其中一种位点在配体和目标物质之间提供吸引型的电荷-电荷相互作用。另一种位点一般地提供电子受体-供体相互作用和/或疏水和/或亲水相互作用。电子供体-受体相互作用包括相互作用比如氢键、π-π、阳离子-π、电荷转移、偶极-偶极、诱导偶极等。

在某些实施方案中，混合模式色谱介质由直接或通过间隔物偶联至有机或无机载体(有时意指基质)的混合模式配体组成。载体可呈颗粒(比如基本上球形的粒子)、整料、过滤器、滤膜、表面、毛细管等形式。在某些实施方案中，载体自天然聚合物制备，比如交联的碳水化合物材料，比如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、魔芋胶(konjac)、卡拉胶、结冷胶(gellan)、藻酸盐等。为了获得高的吸附容量，载体可为多孔的，并然后把配体偶联到外表面以及孔表面。这样的天然聚合物载体可按照标准方法比如反相悬浮凝胶化(SHjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964))制备。或者，载体可自合成聚合物制备，比如交联的合成聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺类、丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、乙烯基酯类、乙烯基酰胺类等。这样的合成聚合物可按标准方法产生，参见例如“Styrene based polymer supports developed by suspensionpolymerization”(R Arshady: Chimica e L’Industria 70(9), 70-75 (1988))。多孔天然或合成聚合物载体也可得自商业来源，比如GE Healthcare, Uppsala, Sweden。

在某些实施方案中，混合模式树脂包含能够阴离子交换和疏水相互作用的官能团。这样树脂的实例包括但不限于Butyl-Sepharose、Octyl-Sepharose、Phenyl-Sepharose(例如在pH 7-9范围内)、MEP HyperCel、PPA HyperCel (例如在pH 4.0-8.0范围内)、HEAHyperCel (全部由Pall Corp.制备)、Capto Adhere或Capto MMC。

阳离子交换色谱：

在实施分离时，通过采用多种技术中的任一种，例如采用分批纯化技术或色谱技术，可使蛋白混合物与阳离子交换材料接触。存在于pH低于蛋白pI的缓冲液中时具有总体正电荷的蛋白与含有带负电荷官能团的阳离子交换材料结合良好。洗脱通常通过增加缓冲液的离子强度(即电导率)，以与溶质竞争离子交换基质的荷电位点来实现。改变pH，并从而改变溶质的电荷是实现溶质洗脱的另一种方法。电导率或pH的变化可为逐渐的(梯度洗脱)或逐步的(分步洗脱)。阳离子取代基可连接于基质上以形成用于色谱的阳离子载体。阳离子交换取代基的非限制性实例包括羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸基(P)和磺酸基(S)。

优选地，CEX树脂包含CM官能团。

纤维素离子交换树脂比如DE23™、DE32™、DE52™、CM-23™、CM-32™和CM-52™可得自Whatman Ltd., Maidstone, Kent, U.K.。基于SEPHADEX®的和交联的离子交换树脂也为已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-和SP- SEPHADEX®以及DEAE-、Q-、CM-和S-SEPHAROSE®和SEPHAROSE® Fast Flow全部可得自Pharmacia AB。另外，DEAE和CM两者衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物比如TOYOPEARL™ DEAE-650S或M以及TOYOPEARL™ CM-650S 或M可得自Tosoh, Philadelphia, Pa。

进一步地，DEAE和CM两者衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物比如TOYOPEARL™DEAE-650S或M以及TOYOPEARL™ CM- 650S或M可得自Tosoh, Philadelphia, PA，或者Nuvia S和U OSphere™ S可得自BioRad, Hercules, CA, Eshmuno® S可得自EMDMillipore, Billerica, CA。

阴离子交换色谱：

各种阴离子交换色谱载体可被使用，并可选自：DEAE-Sepharose CL-6B、DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF、Q-Sepharose HP、Q-Sepharose XL、DEAE-Sephacel、DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex、DEAE-Toyopearl、QAE-Toyopearl、Mini-Q、Mono-Q、Mono-P、Source 15Q、Source 30Q、ANX-Sepharose等。优选地，阴离子交换色谱在Q-Sepharose或DEAE-Sepharose (例如在pH 4.0-9.0范围内)上实施。

按照一个特定实施方案，当蛋白为GOT1时，纯化通过以下技术以如公开的次序实现：

(a) 通过热处理(例如65-70℃持续10分钟)纯化GOT1；

(b) 通过盐诱导沉淀(例如硫酸铵沉淀)纯化GOT1；

(c) 通过混合模式色谱(例如在pH 4.0-8.0范围内PPA HyperCel)纯化GOT1；

(d) 通过阳离子交换色谱(例如在pH 4.0-7.0范围内SP-Sepharose或CM-Sepharose)纯化GOT1；和

(e) 通过阴离子交换色谱(例如在pH 4.0-9.0范围内Q-Sepharose或DEAE-Sepharose)纯化GOT1。

采用本文描述的方法，本发明人产生在蛋白第1位上具有丙氨酸(而不是甲硫氨酸)的高度纯化的GOT1蛋白制剂。

因此，本发明的另一方面提供一种包含谷氨酸草酰乙酸转氨酶1 (GOT1)多肽分子的蛋白制剂，其中100%的GOT1多肽分子在GOT1多肽的第1位具有丙氨酸，并且GOT1多肽分子构成制剂中至少95%的蛋白。

本文使用的短语“蛋白制剂”指的是至少一种蛋白的液体混合物，例如细胞溶解物、不含原始细胞内存在的所有蛋白的部分细胞溶解物或者几种细胞溶解物的组合。术语“蛋白制剂”也包括溶解的纯化蛋白。一般地，蛋白制剂缺少其他细胞组分，比如脂质、脂肪、核酸等。

GOT1多肽在蛋白制剂中以溶解状态存在。

按照一个实施方案，制剂中至少90%的蛋白为GOT1多肽分子。

按照一个实施方案，制剂中至少91%的蛋白为GOT1多肽分子。

按照一个实施方案，制剂中至少92%的蛋白为GOT1多肽分子。

按照一个实施方案，制剂中至少93%的蛋白为GOT1多肽分子。

按照一个实施方案，制剂中至少94%的蛋白为GOT1多肽分子。

按照一个实施方案，制剂中至少95%的蛋白为GOT1多肽分子。

按照一个实施方案，制剂中至少96%的蛋白为GOT1多肽分子。

按照一个实施方案，制剂中至少97%的蛋白为GOT1多肽分子。

按照一个实施方案，制剂中至少98%的蛋白为GOT1多肽分子。

按照一个实施方案，制剂中至少99%的蛋白为GOT1多肽分子。

按照一个实施方案，制剂中100%的蛋白为GOT1多肽分子。

蛋白制剂中的GOT1多肽在N末端(在蛋白的第1位)具有丙氨酸。

按照本发明的这一方面，当与在细菌细胞内表达的重组GOT1蛋白制剂(其中使用甲硫氨酸氨基肽酶切割甲硫氨酸)相比时，在蛋白的第1位具有丙氨酸的制剂中GOT1蛋白的百分比更高。

因此，当与在细菌细胞内表达的重组GOT1蛋白的制剂(其中使用甲硫氨酸氨基肽酶切割甲硫氨酸)相比时，GOT1蛋白在本发明该方面制剂中的百分比可为1%更高、2%更高、3%更高、4%更高、5%更高或者更多。

按照本发明的这一方面，至少99.9%的GOT1分子在第1位包含丙氨酸，至少99.99%的GOT1分子在第1位包含丙氨酸，至少99.999%的GOT1分子在第1位包含丙氨酸，和优选地至少99.9999%或100%的GOT1分子在第1位包含丙氨酸。

本文描述的重组GOT1多肽可用于治疗与谷氨酸过多有关的疾病或病况。

与谷氨酸过多相关的疾病的实例包括但不限于脑缺氧、脑卒中、围产期脑损伤、创伤性脑损伤、细菌性脑膜炎、蛛网膜下腔出血、癫痫、急性肝衰竭、青光眼、肌萎缩性侧索硬化症、HIV、痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、痉挛性病况、心脏直视手术、动脉瘤手术、冠状动脉旁路移植术和阿尔茨海默病。

按照一个特定实施方案，疾病为中枢神经系统的癌症。

本文使用的短语“中枢神经系统的癌症”指的是脑瘤(原发性或继发性)，其通常以足以使谷氨酸对邻近的健康神经元细胞发挥兴奋毒性的水平释放谷氨酸。因此，中枢神经系统的癌症包括神经胶质、神经元、施旺氏细胞、松果体细胞的原发性肿瘤、脑膜瘤和黑色素瘤以及肉瘤、淋巴瘤和在脑中转移的多系统恶性肿瘤。

具体实例包括但不限于星形细胞瘤和胶质母细胞瘤及其相关的神经和神经胶质肿瘤、神经胶质瘤(例如包括1和2级)、少突神经胶质瘤、神经细胞瘤、发育不良性神经上皮肿瘤、原发性神经外胚层瘤和神经节细胞瘤。

可用GOT-1治疗的另外病况包括创伤性脑损伤和脑震荡、复发性偏头痛、脑瘫、复苏和窒息、反复癫痫发作、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、细菌性脑膜炎和帕金森病。

可以提供GOT-1多肽本身或作为药物组合物的部分提供。本文使用的“药物组合物”指的是一种或多种在上文描述的活性成分与其它组分比如生理学上合适的载体和赋形剂、渗透剂等一起的制剂。药物组合物的目的为便于给予生物体化合物。

本文术语“活性成分”指的是造成生物学效应的制剂(例如GOT1)。在下文，可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指的是对生物体不引起明显的刺激性并且不废除所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐剂被包括在这些短语内。在药学上可接受的载体中包含的成分之一可为例如聚乙二醇(PEG)，其为在有机和水性介质两者中具有广泛溶解度的生物相容性聚合物(Mutter等(1979))。

本文术语“赋形剂”指的是加入到药物组合物中以进一步便于给予活性成分的惰性物质。赋形剂的实例非限制性地包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

用于配制和给予药物的技术可见于"Remington's Pharmaceutical Sciences",Mack Publishing Co., Easton, Pa.，最新版本，其通过参照结合到本文中。

本发明药物组合物的合适给予途径可例如包括口、直肠、经粘膜，尤其是经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接脑室内、静脉内、腹膜内、鼻内、骨内和眼内注射。

按照一个特定实施方案，途径为全身性模式并且给药使得其减少血液(血浆)谷氨酸水平和提高脑-血谷氨酸水平。

给予模式也可取决于患者的状况。例如，在癫痫的情况下，骨内给予或肾内(intravenal)给予可为优选的。

本发明的药物组合物可通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规混合、溶解、制粒、裹覆糖衣、研磨、乳化、胶囊化、包埋或冻干过程。

用于本发明用途的药物组合物可使用包括赋形剂和助剂在内的一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体有助于把活性成分加工成可药用的制剂。合适的制剂取决于所选择的给予途径。

对于注射，本发明的活性成分可以在水溶液，优选生理学上相容的缓冲液比如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液中配制。对于经粘膜给予，在配制中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常为本领域已知的。

对于口服给予，可通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体相混合而容易地配制化合物。这样的载体使本发明的化合物可配制成用于患者口服摄入的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、药浆、混悬剂等。用于口服使用的药物制剂可使用固体赋形剂制备，任选地研磨生成的混合物，并在视需要加入合适的助剂后加工混合物颗粒以得到片剂或糖衣丸芯。具体地讲，合适的赋形剂有：填充剂比如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，比如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可添加崩解剂，比如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，比如藻酸钠。

可给糖衣丸芯提供合适的包衣。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波泊尔凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆(lacquer)溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可加入到片剂或糖衣丸包衣中，用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可口服使用的药物组合物包括明胶制成的推装胶囊(push-fit capsule)以及由明胶和增塑剂(比如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。推装胶囊可含有与填充剂比如乳糖、粘合剂比如淀粉、润滑剂比如滑石粉或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可溶解或悬浮于合适的液体，比如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可添加稳定剂。所有用于口服给予的制剂应以适合于选择的给予途径的剂量存在。

对于含服给予，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于经鼻吸入给予，用于本发明用途的活性成分以气溶胶喷雾呈现形式自加压包装或使用合适的喷射剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)的喷雾器便利地递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供递送计量量的阀门来确定。例如用于在分配器中使用的明胶的胶囊和药筒可配制成含有化合物和合适的粉末基料(比如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

本文描述的制剂可配制成用于肠胃外给予，例如通过大剂量注射或连续输注。用于注射的制剂可以单位剂型，例如以任选地添加防腐剂的安瓿或以多剂量容器呈现。组合物可为在油或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并可含有配制剂比如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液剂。另外，活性成分的混悬剂可作为合适的油性或水基注射混悬剂制备。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油比如芝麻油或合成脂肪酸酯比如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。注射水混悬剂可含有提高混悬液粘度的物质，比如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度以制备高度浓缩溶液的物质。

或者，活性成分可以用于临用前用合适的溶媒例如无菌、无热源的水基溶液构成的粉末形式存在。

本发明的药物组合物也可使用例如常规栓剂基质比如可可脂或其它甘油酯类，以直肠组合物比如栓剂或保留灌肠剂配制。

适合于本发明上下文用途的药物组合物包括活性成分以有效实现预期目的的量包含的组合物。更具体地讲，治疗有效量意指有效预防、减轻或改善疾病的症状或者延长受治疗受试者的存活的活性成分量。

治疗有效量的确定完全处于本领域技术人员的能力范围内。

对于本发明治疗方法使用的任何药物组合物，治疗有效量或剂量可根据体外试验初步估计。例如，剂量可在动物模型中配制，并且这样的信息可用于更准确地确定人的可用剂量。

本文描述的活性成分的毒性和治疗效力可通过标准制药过程在体外、在细胞培养物或实验动物中确定。自体外和细胞培养试验和动物研究的这些得到的数据可用于配制用于人的剂量范围。剂量可视使用的剂型和采用的给予途径而变化。精确的配方、给予途径和剂量可由个体的医生鉴于患者的病况选择(参见例如Fingl等, 1975, "ThePharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. 1)。

神经系统癌症的动物模型可易于得到。

因此，异种移植模型良好地适合于评价临床前疗法的剂量响应特性，和适合于评价肿瘤部位对治疗反应的影响。Weissenberger等J. Neurosurg. 2007年4月; 106(4):652-9已经产生自GFAP启动子表达v-src的转基因的种系插入(限制对星形细胞的表达)，导致形成星形细胞瘤。V-src激活几个也在人神经胶质瘤中激活的信号传导途径。这些GFAP/v-src神经胶质瘤主要为低级的或间变性的，但在某些情况下获得胶质母细胞瘤的组织学特征。

Guha等. Am J Pathol. 2005年9月; 167(3):859-67已开发了自GFAP启动子过度表达致癌H-Ras的转基因小鼠。这些小鼠的不同奠基品系(founder line)表达不同水平的致癌Ras。H-Ras的最高生成者发生伴有胶质母细胞瘤所有特征的星形细胞瘤。适度的H-ras表达者继续种系传递，并在3个月龄发生患病率高的低级和间变性星形细胞瘤。Reilly等.Nat. Genet. 2000年9月; 26(1):109-13已经生成伴有NF-1和p53组合缺失的星形细胞特性的神经胶质瘤。Nf-1为下调Ras活性的RasGAP蛋白，因此Nf-1缺失导致Ras活性升高。在小鼠内所有细胞的Nf-1突变单独导致星形胶质细胞增生，而不是形成神经胶质瘤；然而，当结合p53的突变时，小鼠发生伴有人胶质母细胞瘤特性的星形细胞瘤。逆转录病毒载体基因转移PDGF-B至体细胞已被Uhrbom等. Nat. Med. 2004年11月; 10(11):1257-60用于生成星形胶质细胞瘤。在这些实验中，可复制型MMLV载体系统导致形成各种CNS肿瘤的形态学。在这些实验中观察到的最常见组织学为伴有胶质母细胞瘤特性的高级神经胶质瘤。用基于组织特异性ALV的RCAS逆转录病毒载体转移体细胞基因也显示小鼠形成胶质母细胞瘤。在将编码激活的Ras和Akt的基因联合基因转移至表达巢蛋白的CNS祖细胞之后出现这些肿瘤。在该系统中，无论是单独的Ras还是Akt都不足以生成这些胶质母细胞瘤。通过星形胶质细胞特异性失活pRb和相关蛋白p107和p130，开发了伴有人WHO第Ⅲ级星形细胞瘤特征的转基因小鼠模型(Xiao等，2002)。这通过GFAP启动子驱动的T121基因的单个拷贝的表达来实现。T121为SV40 T抗原的121个氨基酸的N末端片段，其主要使pRb蛋白失活，但不干扰p53的功能。百分之百的TgG(Z) T121小鼠在约6个月龄发生高级星形细胞瘤。类似人疾病的组织学特征包括粘附于神经元和脉管系统。

取决于待治疗病况的严重性和响应性，给药可为单次或多次给予，疗程持续数天至数周，或直至实现治愈或者减少疾病状态或症状。

当然，所给予的药物组合物的量取决于受治疗的受试者、疾病的严重程度、给予方式、处方医生的判断等。

也可制备包括以相容的药用载体配制的本发明制剂的组合物，置于合适的容器中并标示用于治疗适应症。

如果需要，本发明的组合物可以包装或分配器装置比如FDA批准的药盒呈现，其可包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。包装可例如包括金属或塑料箔，比如泡罩包装或含有用于患者个人每天注射的预填充剂量的自动注射器(PEN)。包装或分配器装置可附有给予说明书。包装或分配器也可以规范药品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式在容器上附有注意事项，其注意事项是由机构批准的对组合物的形式或者人或兽医给予的反映。这样的注意事项例如可为美国食品药品监督管理局批准的处方药的标签或批准的产品说明书。

应该意识到，本剂可(作为辅助疗法)与用于脑瘤的其他治疗方式一同提供，其基于恶性肿瘤的部位、细胞类型和程度进行选择。常规疗法包括手术、放疗和化疗。替莫唑胺为能够有效穿透血脑屏障并用于治疗的化疗药物。对于复发性高级胶质母细胞瘤，最近的研究已利用血管生成阻断剂比如贝伐单抗组合常规化学疗法，取得令人鼓舞的结果。其他药物包括但不限于temodal、亚硝基脲类、卡莫司汀和顺铂以及基于抗体的药物，例如西妥昔单抗。

可与本发明的药物共同给予的其他抗癌药物包括但不限于阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿霉素、阿多来新、阿地白介素、六甲蜜胺、安波霉素、醋酸阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、安曲霉素、门冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、比折来新、硫酸博莱霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡普睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺铂、克拉屈滨、甲磺酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线霉素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马铂、地扎胍宁、甲磺酸地扎胍宁、地吖醌、多西紫杉醇、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、枸橼酸屈洛昔芬、屈他雄酮丙酸酯、达佐霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、依沙芦星、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氯苯乙嘧胺、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟尿苷、磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶、氟西他宾、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、美登木素、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美伦孕酮、美法仑、美诺立尔、巯嘌呤、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、氯苯氨啶、美乌替派、米丁度胺、米托卡星、米托罗明、米托洁林、米托马星、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、麦可酚酸、诺考达唑、诺加霉素、奥马铂、奥昔舒仑、紫杉醇、培门冬酶、培利霉素、奈莫司汀、硫酸培洛霉素、培磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌呤霉素、嘌呤霉素盐酸盐、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、罗谷亚胺、沙芬戈、沙芬戈盐酸盐、司莫司汀、辛曲秦、斯帕福斯特钠、司帕霉素、盐酸螺旋锗、螺莫司汀、螺铂、链黑菌素、链佐星、磺氯苯脲、他利霉素、紫杉醇、替可加兰钠、替加氟、替洛蒽醌盐酸盐、替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、噻替哌、噻唑呋林、替拉扎明、盐酸拓扑替康、枸橼酸托瑞米芬、醋酸曲托龙、磷酸曲西瑞宾、三甲曲沙、三甲曲沙葡萄糖醛酸盐、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、乌拉莫司汀、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春留绕辛、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼铂、净司他丁、盐酸佐柔比星。另外的抗肿瘤剂包括在Antineoplastic Agents (PaulCalabresi和Bruce A. Chabner)第52章及其前言、Goodman和Gilman的“ThePharmacological Basis of Therapeutics”, 第8版, 1990, McGraw-Hill, Inc.(Health Professions Division)的1202-1263页中公开的那些。

本文使用的术语“约”指的是±10%。

术语“包含”、“含有”、“包括”、“具有”及其变化形式意指“包括但不限于”。

术语“由……组成”指的是“包括并限于”。

术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅当另外的成分、步骤和/或部分不实质上改变请求保护的组合物、方法或结构的基本和新的特性时。

贯穿该申请，本发明的各实施方案可以范围形式呈现。应该理解，以范围形式描述只是为了方便和简洁，并且不应解释为对本发明范围的刻板限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。例如，应考虑范围比如1-6的描述具体公开了所述范围内的子范围比如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及单个数值，例如1、2、3、4、5和6。其应用不须考虑范围的宽度。

本文使用的术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的实践者已知的方式、手段、技术和程序，或者容易地由已知的方式，手段，技术和程序开发的那些。

本文使用的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学症状或者基本上防止病况的临床或美学症状的出现。

可按照本发明的方面治疗的受试者包括哺乳动物受试者-例如人受试者。

应该意识到，为清晰起见在单独的实施方案上下文中描述的本发明的某些特征也可在单一实施方案中组合提供。反之，为简便起见在单独的实施方案上下文中描述的本发明的各种特征也可单独地或以任何合适的亚组合或在任何其他描述的本发明实施方案中合适地提供。在各种实施方案上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方案的基本特征，除非实施方案没有那些元素是无效的。

在上文描述的和在以下权利要求部分请求保护的本发明的各实施方案和方面在以下实施例中找到实验性支持。

实施例

现参考以下实施例，其同以上描述一起以非限制性方式说明本发明的某些实施方案。

通常，本文使用的命名法和本发明采用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这样的技术在文献中得到充分的阐释。参见例如“Molecular Cloning: Alaboratory Manual”Sambrook等, (1989);“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷 Ausubel, R. M.编辑(1994); Ausubel等,“Current Protocols in MolecularBiology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal,“A PracticalGuide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York(1988); Watson等,“Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren等(编辑)“GenomeAnalysis: A Laboratory Manual Series, 第1-4卷, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York (1998); 如在美国专利第4666828、4683202、4801531、5192659和5272057号中阐述的方法学;“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, 第I-III卷Cellis, J.E.编辑(1994);“Culture of Animal Cells - A Manual of BasicTechnique”, Freshney, Wiley-Liss, N.Y. (1994), 第3版; “Current Protocols inImmunology”第I-III卷Coligan J.E.编辑(1994); Stites等(编辑),“Basic andClinical Immunology”(第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell和Shiigi (编辑),“Selected Methods in Cellular Immunology”, W.H.Freeman and Co.,New York (1980); 可得到的免疫测定在专利和科学文献中广泛描述，参见例如美国专利第3791932、3839153、3850752、3850578、3853987、3867517、3879262、3901654、3935074、3984533、3996345、4034074、4098876、4879219、5011771和5281521号; “OligonucleotideSynthesis”Gait, M.J.编辑(1984);“Nucleic Acid Hybridization”Hames, B.D.和Higgins S.J.编辑(1985);“Transcription and Translation”Hames, B.D.和HigginsS.J.编辑(1984);“Animal Cell Culture”Freshney, R.I.编辑(1986);“ImmobilizedCells and Enzymes”IRL出版社(1986);“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal, B., (1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷, Academic Press; “PCRProtocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego,CA(1990); Marshak等,“Strategies for Protein Purification and Characterization- A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)；其全部通过参照结合，如同其全文示于此。贯穿该文件提供其他一般性参考文献。其中的程序被认为是本领域熟知的，并为读者方便而提供。其中包含的所有信息通过参照结合到本文中。

一般材料和方法

在还原和非还原条件下基于SDS-PAGE的纯度：在还原和非还原条件下，在洗涤剂十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下，通过在预制聚丙烯酰胺凝胶中的垂直电泳实施rGOT1的纯度测定。在聚丙烯酰胺凝胶板上按分子大小分离还原和非还原蛋白的样品。

为了电泳分离rGOT1 DS样品，使用NuPAGE^TM 4-12% Bis-Tris Gel与MES缓冲液(作为用于还原SDS-Page的运行缓冲液)和MOPS缓冲液(用于非还原SDS-PAGE)。样品用得自Invitrogen的LDS NuPAGE^TM样品缓冲液(4x)稀释。用0.5 M DTT还原用于还原SDS-PAGE的样品。轻轻振摇初始的和制备的负载样品，并随后加热。在不同的凝胶上彼此分开进行还原和非还原SDS-PAGE分析。

在电泳后凝胶，用PageBlue^TM染色试剂染色凝胶，并测定条带的迁移。

为测定蛋白纯度，通过用于定量图像分析的TotalLab软件评价关于所有条带中各条带的强度。

基于SE-HPLC的聚集体：通过尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)，基于组分分子的不同形状，使rGOT1二聚体形式与其相关的高分子量和单体杂质分离。

在长度300 mm和内径7.8 mm，填充有适合于以10000-500000 Da分子量区间分级分离球蛋白的5 µm大小亲水化硅胶粒子的不锈钢柱上，通过采用含有0.3M NaCl的0.05M磷酸盐缓冲液的等度流动、流动相和在214 nm下检测，对受试溶液的样品进行色谱。

为了测定受试溶液中的rGOT1聚集体形式，评价就所有峰面积总和而言保留时间短于二聚体峰的所有峰的总面积百分比。

基于RP-HPLC的纯度和相关蛋白：rGOT1相对于其疏水性不同的rGOT1相关蛋白(即rGOT1氧化/还原和脱酰胺形式及其他未知的相关种类)的纯度通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定。在装填有孔径30 nm的丁基硅胶(粒度5 µm)的柱(250 mm × 4.6 mm)上，使用乙腈中的0.1%三氟乙酸的梯度和在215 nm下检测，对受试溶液和参比溶液的样品进行色谱。为了测定受试溶液中rGOT1纯度及其相关物质的量，评价就所有峰面积总和而言每种组分峰面积的百分比。

基于等电点聚焦的杂质：等电点聚焦(IEF)为根据其等电点分离蛋白的电泳方法。在含有两性电解质(两性电解质)混合物的聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶的平板上实施分离。当受到电场影响时，两性电解质在凝胶中迁移建立pH梯度。在某些情况下，使用通过在制备凝胶过程中向凝胶网络的特定区域掺入弱酸和碱制备的含有固定化pH梯度的凝胶。当所施加的蛋白到达与其等电点(pI)具有相同pH的凝胶部分时，其电荷被中和并且停止迁移。

样品在得自GE Healthcare的预制凝胶上，在恒定功率下运行至少1.25小时，直到标准品PI标志物急剧聚焦。板用考马斯亮蓝染料染色。

基于UV的蛋白含量：在280 nm下测量配制材料的光密度，通过紫外分光光度法测定蛋白浓度。比消光系数(1.461 ml mg^-1 cm^-1)用于计算蛋白浓度。

Labelguard^TM Microliter细胞用于测量。这是用于蛋白浓度测定的创新光途径。细胞被设计成对0.7 μl至10 μl未稀释样品的亚微升样品体积范围具有最佳测量结果。

基于Karmen法的酶活性：rGOT1的酶活性基于Karmen法的原理(Karmen A,Wroblewski F, La Due JS. Transaminase activity in human blood. J Clin Invest.1955; 34:126-31)，其掺入使用苹果酸脱氢酶(MD)的偶联酶促反应作为指示反应，并在25℃下NADH氧化为NAD⁺时，连续监测340 nm下吸光度变化。反应的pH为8.3。

酶活性的单位被定义为在25℃下每分钟产生1 µmol草酰乙酸的酶量。

肽作图(mapping)：制备rGOT1样品用于胞内蛋白酶Glu-C消化。使蛋白变性以展开它，切割二硫键并然后烷基化以避免蛋白再折叠。消化之后，在装填有孔径100 Å的十八烷基硅胶(粒度5 µm)的柱上实施色谱分离，采用梯度洗脱，流动相由在水中的0.1%三氟乙酸和在90%乙腈/水中的0.1%三氟乙酸组成。同时对两个波长建立UV检测：215 nm和280 nm。

实施肽峰保留时间、峰数以及整体洗脱模式的目视评价。其次，样品中肽和参比标准品的数值比较作为组分峰面积相对于所有峰面积总和的百分比以及各峰高度相对于所有峰高度总和的百分比进行评价。

基于苯肼法的PLP：5’-磷酸吡哆醛(PLP)为维生素B6的活性形式，并且作为辅酶存在于GOT1。PLP测定方法基于吡哆醛或5’-磷酸吡哆醛用苯肼处理时形成强烈黄色的肼(Wada H和Snell E. Journal of Biological Chemistry, 1961; 236(7), 2089-95)。形成的肼吸收410 nm的紫外光。为了测定rGOT1样品中PLP的量，必须获得0-25 µM范围内PLP的校准曲线。rGOT1根据校准曲线的吸光度线性范围进行稀释，并计算。

基于ESI-MS的分子量：rGOT1蛋白样品通过用10 mM乙酸溶液将其脱盐，采用PDMiniTrap G25柱来制备。对于MS分析，通过将其配制成40%乙腈、0.25%甲酸溶液把脱盐的样品稀释5次。

MicroTOF，配有Apollo Source(ESI)电离源的Bruker质谱仪用于分析。物质的分子量自解卷积质谱计算。蛋白N-末端的同质性作为特定组分峰值强度相对于所有峰值强度的百分比进行评价。

基于Edman降解测定蛋白N-末端氨基酸：肽的循环降解基于异硫氰酸苯酯与N-末端残基的游离氨基反应，使得氨基酸一次去除一个，并鉴别为其乙内酰苯硫脲衍生物。乙内酰苯硫脲(PTH)-氨基酸转移至反相C-18柱用于在270 nm下检测。19 PTH-氨基酸的标准品混合物(图5)也注入到柱上用于分离(通常作为测序运行的第一个循环)。该色谱图提供氨基酸的标准保留时间用于与每个Edman降解循环色谱图比较。采用计算机数据分析系统收集HPLC色谱图。为了测定特定残基编号上存在的氨基酸，通过把一个叠加在另一个上面，比较来自目标残基的色谱图与先前残基的色谱图。由此，特定残基的氨基酸得以确定。

生物合成：生物合成在Applikon生物反应器中实施，伴有供给空气和纯氧混合物以维持所需水平的溶解氧饱和度。生物合成在控制温度和pH下实施，伴有连续自适应进料微量元素/碳源溶液。培养在化学定义的培养基上实施，提供足够混合以确保高密度过程。

实施例1

SUMO-GOT1的表达

来自大肠杆菌BL21 (DE3) pET28/GOT1(Δhis)的构建体用作GOT1基因扩增的主要基质。以全基因(SEQ ID NO: 4)扩增(剔除编码起始甲硫氨酸的初始ATG密码子)这样的方式设计引物。引物序列如下：正向SUMO2: 5’- GCACCTCCGTCAGTCTTTG -3’ SEQ ID NO: 6 反向SUMO2: 3’-CTACTGGATTTTGGTGACTGCTTCATGGAT -5’ SEQ ID NO: 7。

在以下条件下，采用Taq DNA聚合酶扩增基因：95℃-5分钟；然后95℃-1分钟、56℃-30秒、72℃-1分钟重复30个循环；最后保持在72℃下10分钟。扩增的序列具有1293 bp长度(编码GOT1基因，包括限制性核酸内切酶靶标，用于融合至SUMO实体)，并在琼脂糖电泳凝胶上大量可见。PCR产物然后采用T4 DNA连接酶连接至pET-SUMO质粒中，并选择定向阳性克隆和大小以用作第二轮PCR的基质。第二轮PCR使用以下引物序列实施：SUMO-FOR-NCOI:AAA CCA TGG GAC GGA CTT AGA AGT CAA TCA A-SEQ ID NO: 8和REV-GOT1: AAA AAG CTTCTA CTG GAT TTT GGT GAC TGC TTC A-SEQ ID NO: 9 (5‘→3‘方向)。在以下条件下，采用Pfu DNA聚合酶实施第二轮PCR：95℃-5分钟；然后95℃-1分钟、58℃-80秒、72℃-1分钟重复30个循环；最后保持在72℃下10分钟。得到的PCR产物具有1549 bp长度，并含有NcoI 和HindIII限制性位点用于克隆到pET28质粒中。第二轮PCR把SUMO实体添加到GOT1序列以及特定的限制性位点。

这样的PCR产物不含在pET-SUMO质粒中存在的任何亲和标签(His、MYKD等)，并严格编码SUMO实体，无缝融合至GOT1重组序列。把产物克隆至适当消化的pET28b+质粒(Novagen)中，转化至瞬时大肠杆菌菌株JM109中用于最初的克隆选择。将具有经测序和限制性核酸内切酶消化两者证实的正确结构的克隆产物转化至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)(购自Novagen)中。自证实的克隆制备含有10%最终体积甘油的研究细胞库，并用于进一步的工艺开发。

大肠杆菌BL21(DE3) pET28/SUMO-GOT1(Δhis)菌株在具有以下组成(g/L)的培养基中进行培养：

a) 对于在烧瓶中制备接种物(培养) (g/L)：磷酸氢二钠(17.0)、磷酸二氢钾(1.82)、硫酸铵(3.0)、七水硫酸镁(0.5)、D(+)-葡萄糖一水合物(15.0)和微量元素储备溶液(0.16mL)；

b) 对于发酵(g/L)：磷酸氢二铵(4.0)、七水硫酸镁(0.5)、磷酸二氢钾(13.3)、枸橼酸一水合物(1.6)、D(+)-葡萄糖一水合物(30.0)和微量元素储备溶液e) (0.25 mL)；

c) 进料液A (g/L)：D(+)-葡萄糖一水合物(700.0)、七水硫酸镁(20.7) 和微量元素储备溶液e) (2.2 mL/L)；

d) 进料液B (g/L)：磷酸氢二铵(360.0)和磷酸二氢钾(306.7)；和

e) 微量元素(痕量元素)储备溶液(g/L)：六水合氯化铁(III) (30.0)、二水合氯化钙(4.05)、七水合硫酸锌(II) (6.75)、一水合硫酸锰(II) (1.5)、五水合硫酸铜(II) (3.0)、六水合氯化钴(II) (1.14)、二水合钼酸钠(0.3)和硼酸(0.69)。

图1显示SUMO-GOT生物合成过程的完整方案。

接种物制备：用0.20 mL存储培养物WCB (工作细胞库)大肠杆菌BL21 (DE3)pET28/SUMO-GOT1(Δhis)接种在烧瓶中含有500 mL培养用无菌培养基的锥形烧瓶[a)]。之后，把烧瓶在搅拌速度300 rpm的旋转式振动器中，于30℃温度下温育18小时。温育后的光密度必须等于或高于4.50 o.u. (光学单位) [λ=595 nm]。

发酵：将来自研究细胞库的重组生物体大肠杆菌SUMO-GOT1/ΔHis/pET28/大肠杆菌BL21(DE3)在含有0.5 L生长培养基的1 L锥形烧瓶中培养17-19小时。在振动温育箱中，于30±2℃和300±50 rpm振动速度下温育烧瓶。之后在600 nm波长下测量接种物的光密度，并重新计算接种体积，以在发酵罐(12 L工作容积(15 L总容积) Applikon发酵罐)中得到约0.5 A.U.细胞密度。采集用于培养物纯度的样品，并通过铺板在营养培养基上测试。

制备7.7 L发酵培养基，并与15 L发酵罐一起高压灭菌。分别制备700 mL葡萄糖和磷酸盐溶液并高压灭菌，且在发酵之前无菌转移至发酵罐。在生物合成之前还分别制备用于保持pH的碱溶液和用于泡沫控制的消泡剂溶液，并连接到发酵罐系统。在生物合成之前制备磷酸盐进料液和葡萄糖进料液，并高压灭菌。制备用于在生物合成期间诱导SUMO-GOT1细胞的IPTG溶液，并在临用前采用无菌0.2 µm滤器灭菌。接种之前，建立计算的接种物体积、pH、温度、搅拌和溶解氧控制。

发酵参数的设定值为：通过控制夹套式发酵罐中的水流确保37℃(直到诱导点)和25℃(诱导点之后)的温度；用氨溶液调控的pH 6.8；用空气和氧气流保持20% O₂浓度。培养物在37℃下生长到细胞光密度达到65-85 A.U.，此时加入无菌IPTG溶液。诱导后使培养物在新的温度下生长3.5小时。在细胞密度达到20 A.U.后每30分钟和细胞密度达到60-70A.U.后每15分钟测量葡萄糖的浓度(进料点保持在17.0 g/L浓度)。根据在生长培养基中测量的葡萄糖浓度实施供碳。在发酵期间加入4等份磷酸盐进料液。在细胞密度达到60-70A.U.时加入第一份和按照以下时间加入其余的：诱导后1小时、1.5小时和2小时。发酵之后收获生物质并实施离心。发酵之后立即通过在营养培养基上铺板样品来实施培养物纯度测试。

把来自发酵罐的生物质转移至离心瓶，并以12227×g在4℃离心20分钟。然后自离心机转鼓去除生物质并转移至塑料袋进一步储存。把袋置于-33℃的冰箱中。

不早于冷冻储存后12小时取出样品，并测试总蛋白浓度(Lowry)、进行SDS-PAGE分析和凝胶扫描SUMO-GOT1量(图3)。

实施例2

主要纯化工艺描述

自袋去除生物质的冷冻块(1570-1830 g)。将细胞在容器中用缓冲溶液W-A02 3 ml/克细胞糊(cell paste)于温度4-8℃下重构。采用高压匀浆器在900巴压力下破坏细胞3个循环。把悬液离心，弃去沉淀，并把蛋白溶液用于下一步。于水浴中搅拌加热悬液，并在温度达到50℃时加入α-酮戊二酸和5-磷酸吡哆醛水合物至终浓度为10 mM (α-酮戊二酸)和20 µM(5-磷酸吡哆醛)。使温度增加至65-70℃并把溶液温育10±1分钟。在冷却至2-10℃后，通过离心去除变性材料。倾析并收集上清液。在加热处理后向蛋白溶液加入1 mM的DTT。加入100000 U的SUMO蛋白酶，并在4-10℃的切割温度下保持10-24小时。在去SUMO化后，向蛋白溶液加入固体硫酸铵至浓度为300 g/L。在室温下搅拌该溶液20分钟并离心。弃去沉淀，并在连续搅拌下向上清液加入另外量的硫酸铵(130 g/L)。在4-10℃下储存20分钟后，通过离心收集最后的沉淀，并以20 ml/g沉淀溶解于PBS缓冲液中。

实施例3

纯化工艺描述

3个色谱步骤用于纯化rGOT1中间产物：混合模式相互作用采用中效PPA Hyper Cel树脂(床高15.3-15.8 cm)，离子交换色谱采用CM-Sepharose FF (床高9.4-9.9 cm)和QSepharose FF (床高9.2-10.2 cm)。

混合模式PPA Hyper Cel：在沉淀溶解后，实施PPA Hyper Cel色谱。把蛋白溶液的pH调控至7.30-7.50，负载并然后用低pH缓冲溶液(pH 3.95-4.05)直接洗脱至容器中。收集光密度80 mAU (上)-45 mAU (下)的流分(图5)。

阳离子交换色谱CM-Sepharose FF：把混合模式色谱后洗脱的蛋白负载并用增加的pH (W-E02)洗脱至洁净的容器中。收集80 mAU (上)-35 mAU (下)的蛋白流分，把pH调控至5.90-6.10，和把电导率调控至2.0-2.2 mS/cm (图6)。

阴离子色谱Q Sepharose FF：稀释蛋白流分到电导率< 2 mS/cm，把pH调控至pH6.00并负载到柱上。收集35 mAU (上)-30 mAU (下；图7)流经的蛋白流分。

实施例4

配制

使用30 kDa膜浓缩来自阴离子交换色谱的蛋白溶液至15-20 mg/ml。100渗滤体积用于缓冲液交换成20 mM乙酸钠(pH 5.0)。终蛋白浓度为10±2 mg/ml。膜压差为0.3-0.6。发现纯度为>99%和配制的GOT通过在还原条件和非还原条件两者下SDS-PAGE(图8)、RP-HPLC(图9)和SE-HPLC (图10)分析。RP-HPLC分析的结果概述在下文表1中。

表1

SE-HPLC分析的结果概述在下文的表2-5中。

表2

表3

表4

表5

肽作图结果在图11中阐示。等电点聚焦研究的结果在图12中阐示。纯化的余量呈现在下文表6中。

表6

采用Karmen法测量的酶比活性显示为200 U/mg。

尽管已结合其具体实施方案描述本发明，但是显然许多备选方案、修饰和变化对本领域技术人员是显而易见的。因此，意欲包括落入附加权利要求的精神和广泛范围内的所有这样的备选方案、修饰和变化。

在该说明书提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过参照以其全部结合到说明书中，至如同表明每个个体出版物、专利或专利申请具体和单独通过参照结合于此的相同程度。另外，在该说明书中任何参考文献的引用或鉴别不应解释成认同这样的参考文献可作为本发明现有技术获得。在使用章节标题的程度上，它们不应解释成必然的限制。

Claims (36)

1. 一种包含谷氨酸草酰乙酸转氨酶1 (GOT1)多肽分子的蛋白制剂，其中100%的GOT1多肽分子在GOT1多肽的第1位具有丙氨酸，并且GOT1多肽分子构成制剂中至少95%的蛋白。

2.权利要求1的蛋白制剂，其中蛋白构成制剂中至少98%的分子。

3.一种药物组合物，其包含权利要求1或2的蛋白制剂作为活性剂和药学上可接受的载体。

4. 权利要求1或3的制剂或药物组合物，其中所述GOT1包含与SEQ ID NO: 2具有至少90%同源性的氨基酸序列。

5. 权利要求1或3的制剂或药物组合物，其中所述GOT1由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列组成。

6.一种包含目标多肽和小泛素相关修饰物(SUMO)的融合蛋白，其中所述目标多肽的N末端翻译融合至所述SUMO的C末端，所述融合蛋白缺少异源亲和标签。

7. 一种包含谷氨酸草酰乙酸转氨酶1 (GOT1)和小泛素相关修饰物(SUMO)的GOT1融合蛋白，其中所述GOT1的N末端翻译融合至所述SUMO的C末端，所述融合蛋白缺少亲和标签。

8.权利要求7的融合蛋白，其中所述GOT1在第1位包含丙氨酸。

9.权利要求6或7的融合蛋白，其中所述亲和标签为多聚组氨酸标签。

10. 权利要求7的融合蛋白，其中所述GOT1的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2具有至少90%同源性。

11. 权利要求6或7的融合蛋白，其中所述SUMO的氨基酸序列与SEQ ID NO: 5具有至少90%同源性。

12. 权利要求7的融合蛋白，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少90%同源性的氨基酸序列。

13. 权利要求7的融合蛋白，其由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成。

14.权利要求6或7的融合蛋白，其中所述SUMO为酵母SUMO。

15. 权利要求14的融合蛋白，其中所述酵母SUMO为酿酒酵母的mif two 3抑制因子(Smt3)。

16.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求6-15中任一项的融合蛋白。

17. 权利要求16的分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO: 3具有至少90%同源性的核酸序列。

18.一种核酸构建体，其包含权利要求16或17中任一项的分离的多核苷酸。

19.一种在有需要的受试者中治疗与谷氨酸过多有关的疾病或病况的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的权利要求1-5中任一项的制剂或药物组合物，从而治疗所述疾病或病况。

20.权利要求1的蛋白制剂，其用于治疗与谷氨酸过多有关的疾病或病况。

21.权利要求3的药物组合物，其用于治疗与谷氨酸过多有关的疾病或病况。

22.权利要求19-21中任一项的方法、制剂或组合物，其中所述疾病或病况为脑疾病或病况。

23.权利要求19-21中任一项的方法、制剂或组合物，其中所述脑疾病为中枢神经系统的癌症。

24.权利要求23的方法、制剂或组合物，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。

25.权利要求22的方法、制剂或组合物，其中所述脑病况为脑缺血。

26.权利要求19-21中任一项的方法、制剂或组合物，其中所述疾病为神经退行性疾病。

27.一种纯化多肽的方法，所述方法包括：

(a) 在宿主细胞内表达包含所述多肽和SUMO的融合蛋白，其中所述多肽的N末端翻译融合至所述SUMO的C末端，所述融合蛋白缺少异源亲和标签；

(b) 自所述融合蛋白去除所述SUMO；和

(c) 自所述宿主细胞分离所述多肽，从而纯化多肽。

28.权利要求27的方法，其中步骤(b)先于步骤(c)实现。

29.权利要求27的方法，其中所述多肽为GOT1。

30.权利要求27或29的方法，其中所述去除是使用SUMO蛋白酶实现。

31.权利要求27的方法，其中所述分离采用选自热沉淀、盐诱导沉淀、混合模式色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱的技术实现。

32.权利要求31的方法，其中所述分离采用热沉淀、盐诱导沉淀、混合模式色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱实现。

33.权利要求29的方法，其中所述分离通过以下实现：

(a) 通过热处理纯化GOT1；

(b) 通过盐诱导沉淀纯化GOT1；

(c) 通过混合模式色谱纯化GOT1；

(d) 通过阳离子交换色谱纯化GOT1；和

(e) 通过阴离子交换色谱纯化GOT1，其中步骤(e)在步骤(d)之后，步骤(d)在步骤(c)之后，步骤(c)在步骤(b)之后，和步骤(b)在步骤(a)之后。

34.权利要求31-33中任一项的方法，其中所述盐诱导沉淀包括硫酸铵诱导沉淀。

35.权利要求27-34中任一项的方法，其中所述宿主细胞选自细菌、酵母、哺乳动物细胞和昆虫细胞。

36.权利要求35的方法，其中所述宿主细胞为细菌细胞。