CN107760710A - 一种印楝毛状根的诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种印楝毛状根的诱导方法，包括如下步骤：1)将发根农杆菌菌液在YEB固体培养基上划线培养，于YEB液体培养基中，摇床培养,并稀释；2)用步骤1)所得的农杆菌菌悬液感染印楝外植体；3)将步骤2)所得外植体，在特定条件下培养生根，切取从外植体产生毛状根转入含500±10mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基上进行单根除菌培养,6‑8天后取出并转至新鲜的含相同浓度头胞噻肟钠的培养基中继续除菌培养，4‑5次继代除菌后，获得无菌的毛状根。本发明通过对各步骤的选择和配合，成功培育出了印楝素的毛状根，为今后利用自主生长的印楝毛状根的规模培养来生产印楝素等活性成分奠定了基础，从根本上解决了印楝原料受限的问题。

Description

一种印楝毛状根的诱导方法
技术领域
本发明涉及一种印楝毛状根的诱导方法，属于木本植物毛状根的诱导领域。
背景技术
印楝(Azadirachta indica A.Juss)为楝科楝属植物，原产于印-巴次大陆及南亚和东南亚的干旱地区，如印度、缅甸等国。印楝作为一种多用途的传统药用植物，在印度已有2000多年的使用历史。它具有杀虫、抗菌、抗病毒、抗生育、抗癌、保肝和降血糖等多种生物活性，现被认为是一种极具开发价值的药用植物资源。在印度阿育吠陀医学和尤那尼医学中都有广泛的应用，有“乡村药房”、“天然药库”之美称。近十几年来，印楝已经成为现代医学的研究热点。
由于印楝药效成分主要在果实中，但是印楝不耐寒，在热带地区才能种植，在我国能够种植的地区十分有限。目前，国内纯植物源生物农药生产商所用的印楝原料几乎全部从国外进口。这不仅在原料数量上受供应商的控制，而且制约了生产成本，限制了以印楝素为主要原料的植物源生物农药的推广和应用。
根中的有效成分是植物的次级代谢产物，具有较高的应用价值，因此利用根的体外培养生产次级代谢产物越来越受到学者们的关注。毛状根培养技术是20世纪80年代后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项新技术，目前美国、英国、加拿大、日本、中国及韩国都在对药用植物毛状根的诱导培养进行了大量的基础研究。研究结果表明，毛状根具有细胞培养和一般器官培养所不能兼备的特点，几乎所有双子叶植物中由根部合成的次级代谢物质都可以通过毛状根来生产，这一生物技术为植物有用成分的大量生产提供了新的途径，日益引起人们的关注。
毛状根是由发根农杆菌感染植物细胞后，其Ri质粒的T-DNA片段在植物细胞核基因组中插入、整合与稳定表达的结果，因其外形像毛发一样，故称其为毛状根。利用发根农杆菌感染诱导药用植物形成毛状根，并对毛状根进行离体培养增殖，是对药用资源植物可持续利用的有效途径之一。毛状根培养技术已经逐步成为一些植物次生代谢产物规模化培养的重要生物技术手段。
目前已公开的对毛状根的诱导主要是草本植物的研究，由于草本植物与木本植物的基因的区别，导致了木本植物毛状根的诱导显著难于草本植物毛状根的诱导，由于基于现有已公开的草本植物毛状根的诱导本领域技术人员并得不到木本植物毛状根的诱导，因此，导致目前鲜有木本植物毛状根的诱导的相关报道，尤其是对印楝的毛状根诱导国内外尚无任何报道。
发明内容
本发明提供一种印楝毛状根的诱导方法，实现了对印楝毛状根的诱导。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种印楝毛状根的诱导方法，包括如下步骤：
1)将发根农杆菌菌液在YEB固体培养基上划线培养，28±3℃过夜培养后，挑取单菌落并置于YEB液体培养基中，摇床培养30±3h,并用液体YEB培养基或液体MS培养基稀释菌液，取OD 600值达到0.8-1.0的农杆菌悬液用于外植体感染；
2)用步骤1)所得的农杆菌菌悬液感染印楝外植体；
3)将步骤2)所得外植体，转入添加500±10mg/L头胞噻肟钠(cefotaxime)的MS固体培养基中，在25±3℃每天14h散射光下诱导毛状根的产生，7-10天后外植体产生出白色的毛状根，15-20天后，切取从外植体产生的、长3-4厘米的毛状根转入含500±10mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基上进行单根除菌培养,6-8天后取出并转至新鲜的含相同浓度头胞噻肟钠的培养基中继续除菌培养，4-5次继代除菌后，获得无菌的毛状根。
上述诱导方法中各步骤的参数控制非常关键，经验证，任意一参数的改变，都会导致诱导的失败，本领域技术人员根据目前已经公开的草本植物的诱导方法，是得不到本申请木本植物印楝如何诱导就能生根的方法，现有已公开的草本植物与本申请的印楝组织差异甚远，导致了申请日前，尚无印楝毛状根成功诱导的前例，本申请通过印楝毛状根的成功诱导，从根本上解决了印楝原料受限的问题。
上述步骤1)中稀释前菌液的浓度为106/ml，然后稀释至OD600值为0.8-1.0；步骤3)中散射光的光强度优选为500-1000lex(勒克斯)。
上述印楝毛状根的诱导方法，还包括4)将步骤3)所得到的无菌毛状根系采用冠瘿碱的薄层层析法和/或农杆菌Ri质粒rol基因(生根基因)的PCR扩增鉴定法进行毛状根的遗传转化鉴定。
冠瘿碱的滤纸层析分析结果能证实含冠瘿碱合成酶基因的Ri质粒T-DNA右臂基因已在所获得的毛状根中表达。冠瘿碱的滤纸层析时，取无菌的印楝毛状根根系以及发根农杆菌ATCC15834菌体各适量，充分研磨成粉状后，加入70％乙醇浸泡过夜后，离心取上清液，经浓缩后，用毛细管点样于定性滤纸上，展层、染色和拍照(结果见附图2)，出现阳性斑点(有斑点)则在生化水平上证实所获得的毛状根是发根农杆菌Ri质粒遗传转化产生的毛状根。在采用农杆菌Ri质粒rol基因PCR扩增鉴定毛状根时，选取可在无外源激素MS培养基中自主生长的无菌毛状根根系，采用CTAB法提取其基因组DNA后，用标准的rolB和rolC的扩增引物，并进行rolB和rolC基因片段的PCR扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳来分析PCR扩增结果，如果能出现与rolB或rolC基因对应片段大小的条带，则从分子水平上证实所获得的毛状根是发根农杆菌Ri质粒遗传转化产生的毛状根。上述经遗传转化后呈阳性的毛状根置于无外源激素的MS培养基上继代和保存，供离体培养产生印楝素所使用。
为了提高生根效果，步骤1)中，发根农杆菌为含农杆碱型Ri质粒的发根农杆菌菌株。
优选，步骤1)中，发根农杆菌菌液在-20℃甘油管中保存。
优选，步骤1)中，摇床培养时的温度为28±3℃，转速为160-200rpm/min。这样更利于提高生根率。
作为本申请的一种方案，步骤2)为：将印楝无菌苗的茎段外植体在切口处涂抹农杆菌悬液或针刺感染农杆菌悬液，然后在黑暗条件下培养。当在切口处涂抹菌悬液时，需将印楝无菌苗切成1-2cm长的茎段外植体；黑暗条件下培养为：将感染发根农杆菌菌液的外植体置于无外源激素的MS培养基或添加0.1-0.5mg/L NAA的MS培养基中，于25-28℃黑暗条件下培养3天。
作为本申请的另一种方案，步骤2)为：将印楝无菌苗的叶片外植体先置于MS固体培养基中预培养后，再置于农杆菌菌悬液中浸泡，然后在黑暗条件下培养。
为了更加利于生根，优选，步骤2)为：将印楝无菌苗的叶片切成1.5x1.5cm2的叶片外植体后，先置于添加NAA(萘乙酸)0.1-0.5mg/L的MS固体培养基中预培养24-48h，再置于OD 600值达到0.8-1.0的农杆菌菌悬液中浸泡20-30分钟后，取出，并用无菌吸水纸吸干外植体表面的多余菌液后，将感染发根农杆菌菌液的外植体置于无外源激素的MS培养基或添加0.1-0.5mg/L NAA的MS培养基中，于25-28℃黑暗条件下培养3天。
统计分析表明，叶片外植体的生根率约为30％；而茎尖(段)外植体的生根率约60％。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明印楝毛状根的诱导方法，通过对各步骤的选择和配合，成功培育出了印楝素的毛状根，为今后利用自主生长的印楝毛状根的规模培养(发酵培养或生物反应器培养)来生产印楝素等活性成分奠定了基础，从根本上解决了印楝原料受限的问题。
附图说明
图1为实施例3感染发根农杆菌后印楝外植体产生毛状根的图片(a：一周左右的初始毛状根；b：继代后的毛状根)；
图2为各实施例印楝毛状根的冠瘿碱薄层层析结果(道1和道2为对照(没有感染发根农杆菌的外植体)，道3-4为实施例1印楝毛状根样品，道6-7为实施例2印楝毛状根样品，道8-9为实施例3印楝毛状根样品，道10为实施例4印楝毛状根样品，道11为实施例5印楝毛状根样品)；
图3为实施例1中rol B 16hr 59min PCR扩增图；
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
印楝毛状根的诱导方法，包括如下步骤：
1)发根农杆菌菌株活化：所用的发根农杆菌菌株为含农杆碱型Ri质粒(root)inducing plasmid的野生型发根农杆菌ATCC15834(购自美国典型培养物保存中心)。菌种活化培养时，先取-20℃甘油管保存的发根农杆菌菌液在YEB(组成：牛肉膏5g/L,酵母提取物1g/L,蛋白腖5g/L,蔗糖5g/L,MgSO4·7H2O,0.002mol/L,琼脂15g/L,pH7.2)固体培养基上划线培养，28℃过夜培养后，挑取其单菌落并置于YEB液体培养基(YEB组成：牛肉浸膏5g/L,酵母浸膏1g/L,蛋白胨5g/L,蔗糖5g/L,MgSO4·7H2O 0.002mol/L,pH7.2)中，于28℃、160-200rpm/min摇床培养30h,并用液体YEB培养基(YEB组成：牛肉浸膏5g/L,酵母浸膏1g/L,蛋白胨5g/L,蔗糖5g/L,MgSO4.7H2O 0.002mol/L,pH7.2)稀释菌液，并在OD 600nm下测定其OD值，取其OD 600值达到0.8-1.0的农杆菌菌悬液用于外植体感染实验；
2)发根农杆菌感染过程：将无菌苗切成1.5cm长的茎段外植体，并在切口处涂抹菌悬液，并将感染发根农杆菌菌液的外植体置于无外源激素的MS培养基中，于26℃黑暗条件下培养3天；
3)毛状根的产生：将上述所得外植体转入添加500mg/L头胞噻肟钠(cefotaxime)的MS固体培养基中，在25℃每天14h散射光(强度为600-800lex)下诱导毛状根的产生，7天后，可见从发根农杆菌感染的茎段外植体产生出白色的毛状根，茎尖(段)外植体的生根率约60％；16天后，切取从印楝外植体产生的、长约3-4厘米的毛状根转入含500mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基上进行单根除菌培养,一周后取出并转至新鲜的含500mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基中继续除菌培养，约4-5次继代除菌后，直至获得无菌的毛状根(结果见附图1)；
4)毛状根的鉴定：将上面所获得的能在无外源激素的MS培养基中快速自主生长的无菌的毛状根，分别采用冠瘿碱的薄层层析法和农杆菌Ri质粒rol基因(生根基因)的PCR扩增鉴定法进行毛状根的遗传转化鉴定；其中，冠瘿碱的滤纸层析分析结果证实含冠瘿碱合成酶基因的Ri质粒T-DNA右臂基因已在所获得的毛状根中表达，冠瘿碱的滤纸层析时，取无菌的印楝毛状根根系以及发根农杆菌ATCC15834菌体各适量，充分研磨成粉状后，加入70％乙醇浸泡过夜后，离心取上清液，经浓缩后，用毛细管点样于定性滤纸上，展层、染色和拍照(结果见附图2)，出现阳性斑点则在生化水平上证实所获得的毛状根是发根农杆菌Ri质粒遗传转化产生的毛状根；在采用农杆菌Ri质粒rol基因PCR扩增鉴定毛状根时，选取可在无外源激素的MS培养基中自主生长的无菌毛状根根系，采用CTAB法提取其基因组DNA后，设计出rolB(rolB引物:P1:5′-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3′,P2:5′-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3′；)和rolC(rolC引物:P1:5′-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3′,P2:5′-TGCTTC"GAGTTATGGGTACA-3′；)的扩增引物，并进行rolB和rolC基因片段的PCR扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳来分析PCR扩增结果，出现与rolB或rolC基因对应片段大小的条带，则从分子水平上证实所获得的毛状根是发根农杆菌Ri质粒遗传转化产生的毛状根，上述经遗传转化后呈阳性的毛状根置于无外源激素的MS培养基上继代和保存，供离体培养产生印楝素所使用。
实施例2
与实施例1基本相同，所不同的是：步骤1)中，摇床培养30h后，用液体MS(Murashige&Skoog,1962)培养基稀释菌液；分别采用冠瘿碱的薄层层析法和农杆菌Ri质粒rol基因(生根基因)的PCR扩增鉴定法进行毛状根的遗传转化鉴定，证实所获得的毛状根是发根农杆菌Ri质粒遗传转化产生的毛状根。
实施例3
与实施例1基本相同，所不同的是：步骤2)为将茎部外植体进行针刺感染接种，并将感染发根农杆菌菌液的外植体置于无外源激素的MS培养基中，于25-28℃黑暗条件下培养3天，茎尖(段)外植体的生根率约60％；分别采用冠瘿碱的薄层层析法和农杆菌Ri质粒rol基因(生根基因)的PCR扩增鉴定法进行毛状根的遗传转化鉴定，证实所获得的毛状根是发根农杆菌Ri质粒遗传转化产生的毛状根。
实施例4
与实施例1基本相同，所不同的是：步骤2)中将无菌苗的叶片切成1.5x1.5cm2的叶片外植体后，先置于添加NAA(萘乙酸)0.3mg/L的MS固体培养基中预培养36h后，再置于OD值达到0.8-1.0的农杆菌菌悬液中浸泡25分钟后，取出，并用无菌吸水纸吸干外植体表面的多余菌液后，最后将感染发根农杆菌菌液的外植体置于无外源激素的MS培养基中，于26℃黑暗条件下培养3天；步骤3)中8天后，农杆菌感染的叶片外植体生出白色的毛，叶片外植体的生根率约为30％；分别采用冠瘿碱的薄层层析法和农杆菌Ri质粒rol基因(生根基因)的PCR扩增鉴定法进行毛状根的遗传转化鉴定，证实所获得的毛状根是发根农杆菌Ri质粒遗传转化产生的毛状根。
实施例5
与实施例1基本相同，所不同的是：步骤2)中将感染发根农杆菌菌液的外植体置于添加0.3mg/L NAA的MS培养基中，于26℃黑暗条件下培养3天，茎尖(段)外植体的生根率约60％；分别采用冠瘿碱的薄层层析法和农杆菌Ri质粒rol基因(生根基因)的PCR扩增鉴定法进行毛状根的遗传转化鉴定，证实所获得的毛状根是发根农杆菌Ri质粒遗传转化产生的毛状根。

Claims (9)

1.一种印楝毛状根的诱导方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将发根农杆菌菌液在YEB固体培养基上划线培养，28±3℃过夜培养后，挑取单菌落并置于YEB液体培养基中，摇床培养30±3h,并用液体YEB培养基或液体MS培养基稀释菌液，取OD 600值达到0.8-1.0的农杆菌悬液用于外植体感染；
2)用步骤1)所得的农杆菌菌悬液感染印楝外植体；
3)将步骤2)所得外植体，转入添加500±10mg/L头胞噻肟钠的MS固体培养基中，在25±3℃每天14h散射光下诱导毛状根的产生，7-10天后外植体产生出白色的毛状根，15-20天后，切取从外植体产生的、长3-4厘米的毛状根转入含500±10mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基上进行单根除菌培养,6-8天后取出并转至新鲜的含相同浓度头胞噻肟钠的培养基中继续除菌培养，4-5次继代除菌后，获得无菌的毛状根。
2.如权利要求1所述的印楝毛状根的诱导方法，其特征在于：还包括4)将步骤3)所得到的无菌毛状根系采用冠瘿碱的薄层层析法和/或农杆菌Ri质粒rol基因的PCR扩增鉴定法进行毛状根的遗传转化鉴定。
3.如权利要求1或2所述的印楝毛状根的诱导方法，其特征在于：步骤1)中，发根农杆菌为含农杆碱型Ri质粒的发根农杆菌菌株。
4.如权利要求1或2所述的印楝毛状根的诱导方法，其特征在于：步骤1)中，发根农杆菌菌液在-20℃甘油管中保存。
5.如权利要求1或2所述的印楝毛状根的诱导方法，其特征在于：步骤1)中，摇床培养时的温度为28±3℃，转速为160-200rpm/min。
6.如权利要求1或2所述的印楝毛状根的诱导方法，其特征在于：步骤2)为：将印楝无菌苗的茎段外植体在切口处涂抹农杆菌悬液或针刺感染农杆菌悬液，然后在黑暗条件下培养。
7.如权利要求6所述的印楝毛状根的诱导方法，其特征在于：当在切口处涂抹菌悬液时，需将印楝无菌苗切成1-2cm长的茎段外植体；黑暗条件下培养为：将感染发根农杆菌菌液的外植体置于无外源激素的MS培养基或添加0.1-0.5mg/L NAA的MS培养基中，于25-28℃黑暗条件下培养3天。
8.如权利要求1或2所述的印楝毛状根的诱导方法，其特征在于：步骤2)为：将印楝无菌苗的叶片外植体先置于MS固体培养基中预培养后，再置于农杆菌菌悬液中浸泡，然后在黑暗条件下培养。
9.如权利要求8所述的印楝毛状根的诱导方法，其特征在于：步骤2)为：将印楝无菌苗的叶片切成1.5x1.5cm2的叶片外植体后，先置于添加NAA(萘乙酸)0.1-0.5mg/L的MS固体培养基中预培养24-48h，再置于OD 600值达到0.8-1.0的农杆菌菌悬液中浸泡20-30分钟后，取出，并用无菌吸水纸吸干外植体表面的多余菌液后，将感染发根农杆菌菌液的外植体置于无外源激素的MS培养基或添加0.1-0.5mg/L NAA的MS培养基中，于25-28℃黑暗条件下培养3±0.2天。
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