CN107760611A - 一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺优化方法及工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺优化方法，其采取一种新型的亚硒酸钠的添加方式，不仅不会影响菌丝的产量，而且大大提高了硒的利用率，使无机硒尽可能的转化为有机硒，减少产品的毒性，具有极高的工业化应用，根据上述结果，调节摇床培养温度为23 ℃、初始 pH 为6.0、转速为120 rpm，培养基中含有1.0 g/L硫酸镁、2.0 g/L氯化钠、0.5 g/L磷酸二氢钾、2 g/L亚硒酸钠时，并且我们将亚硒酸钠均分为三等分，分别在发酵第一、二、三天加入培养基中，发酵7天可以获得约11.4 g干重菌丝、富硒量约331.7 μg/g，并且有机硒转化率高达90.0 %，相对与现存的产品，本发明大大节约了成本，适合现代化工业发展。

Description

一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺优化方法及工艺

技术领域

本发明涉及一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺优化方法，属于黄牛肝菌的液体发酵技术领域。

背景技术

我国西南地区由于其独特的地貌和环境特征，蕴含了大量的珍惜植物、动物和食用真菌。如今，食用菌的食药用价值已经得到世界各地的广泛认可，特别是在中国、印度、日本和韩国，这些食用菌已成为重要的中药成分，至少有270种食用菌被研究并确认具有生物活性。同时，食用菌是能量和脂肪含量低，但富含蛋白质、碳水化合物和膳食纤维的营养物质，由于真菌细胞中富含大量非淀粉类多糖，其中β-葡萄糖是最具有功能价值的部分，因此，蘑菇可以作为膳食纤维的潜在来源，此外，食用菌还具有抗癌、抗菌、抗病毒，降血压血脂，降血糖，免疫调节等作用。

牛肝菌类，是牛肝菌科和松塔牛肝菌科等真菌的统称，其中除少数品种有毒或味苦而不能食用外，大部分品种均可食用。我国牛肝菌类资源丰富，主要有白、黄、黑、红牛肝菌。现有的研究表明，黄牛肝菌是最具有抗氧化活性的一类菌种，但是关于黄牛肝菌的培养仍存在较大的困难。

硒为人和动物体内必需的微量元素，是人体内最强的抗氧化酶-谷胱甘肽过氧化酶的重要组成部分，因此，硒与酶的活性密切相关。缺硒会造成部分酶活性降低，导致组织细胞抗氧化损伤能力减弱，直接影响细胞的分裂、繁殖、遗传及生长，进而干扰核酸、蛋白质、多糖及酶的合成及代谢。流行病学研究证明人体的低硒状态与克山病、癌症、心血管病、白内障、糖尿病、艾滋病等多种疾病的发病率密切相关。

土壤缺硒是全世界广泛存在的问题，在我国有72％的国土为不同程度的缺硒区，形成食物链的普遍低硒状态，只靠天然食品补硒难以从根本上改善缺硒状况。同时，研究表明有机硒补剂产品在毒理安全性、生理活性和吸收率上具有优越性，因此这类产品的开发与研究一直广为关注。据最新研究发现，食用菌具有很强的富硒潜能，对有机硒源的开发可通过菌丝细胞的代谢实现硒的有机化。

本发明针对以上问题，提供一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺优化方法，其通过对黄牛肝菌富硒培养条件的优化，以获得高效高产的富硒黄牛肝菌菌丝体，实现硒的最大化利用。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺优化方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)选取黄牛肝菌；

(2)培养基的培养：以PDA培养基为基础，同时添加不同的矿质元素来促进菌丝的生长；

(3)培养条件的优化：采用正交实验，优化转速、温度、初始pH这三个变量，其中，装液量为50mL/250mL，接种量为5％，设置多种温度、pH和转速，发酵7d后测定其菌丝生物量，从而选取一个黄牛肝菌菌丝生长的最适条件；

(4)培养基中矿质元素含量的优化：通过正交实验选择一种不同矿质元素的最适含量，其中，添加的矿质元素至少包括硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾、亚硒酸钠；

(5)富硒条件的优化：将亚硒酸钠按不同的添加时间以及添加方式添加进去，以获得硒的最大转换效率；

(6)生产效率测定：采用干重法，将菌丝发酵液5000rpm离心5min，弃去上清液并收集菌丝，之后将培养的菌丝冷冻干燥机中冻干，其中，生产效率g/L＝富硒产品干重g÷液体培养基的体积L；

(7)硒的测定：利用3,3-二氨基联苯胺比色法对硒的含量进行测定；

(8)数据处理与分析：试验数据进行单因子方差分析，多重比较，结果以平均数±标准差表示，并根据分析结果来确定工艺的最优参数。

进一步，作为优选，所述步骤(5)中，富硒条件的优化的具体步骤如下：

①按不同添加时间添加：将亚硒酸钠的最适浓度分别在发酵第1、2、3、4、5、6天加入培养基；

②按不同的添加方式添加：分为六组分别进行添加，具体如下：

组Ⅰ：在发酵第一天就将亚硒酸钠加入培养基；

组Ⅱ：将最适亚硒酸钠含量等分为两份，分别在发酵第一天和第二天加入；

组Ⅲ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵第一天，第二天和第三天加入；

组Ⅳ：将最适亚硒酸钠含量等分为四份，分别在发酵第一天，第二天，第三天和第四天加入；

组Ⅴ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵第一天，第三天和第五天加入；

组Ⅵ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵第二天，第四天和第六天加入。

进一步，作为优选，所述步骤(7)中，硒的测定的具体步骤如下：

①硒总含量：

黄牛肝菌菌丝中硒含量测定：准确称取1g富硒产物，放入烧瓶中，加入10mL消化液，4℃消化至无色透明为止，待冷却后，将此消化液转入50mL容量瓶中，用氢氧化钠调节pH到7.0左右，最后将溶液定容到50mL，取10mL消化样液，按DAB比色法计算硒含量。

②有机硒含量：

准确称取黄牛肝菌富硒产物0.5g，放入透析袋中，充分透析24h后去除无机硒，取透析袋中物质，按上述方法进行硒含量测定；

③综合考虑富硒量和有机硒转化率，以确定最优的培养基硒浓度，其中，

富硒量μg/g＝硒总含量μg÷菌丝干重g

有机硒转化率％＝有机硒含量μg÷硒总含量μg×100％。

进一步，作为优选，所述10ml的消化液为5g钼酸钠加入混合溶液中配制而成，其中，混合溶液为蒸馏水:浓硫酸:高氯酸的体积比为3:3:4的溶液中配置而成。

进一步，本发明还提供了一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺，PDA培养基作为培养介质，培养温度为23℃，初始pH为6.0，摇床转速为120rpm，培养基中含有1.0g/L硫酸镁，2.0g/L氯化钠，0.5g/L磷酸二氢钾，2g/L亚硒酸钠。

进一步，作为优选，加入亚硒酸钠时采用分批次加入的方式进行添加。

进一步，作为优选，将亚硒酸钠均分为三等分，分别在发酵第一，二，三天加入培养基中。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明采用一种独特的优化方式，采取正交实验，既涵盖了各个条件之间的协同与拮抗作用，还大大减少了实验次数，提高了实验效率；

(2)本发明采取不同的亚硒酸钠添加时间与添加方式，从而获得最大菌丝生物量，富硒量和有机硒转化率，相对于传统工业大大减少了食用原料，节约了成本。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

材料与方法：

1.试验菌株：

黄牛肝菌，本发明采用HNG-1四川农业大学食品学院实验室分离保藏。

2.培养条件及培养介质的优化：

本发明在实验过程中以PDA培养基为基础，同时添加不同的矿质元素(硫酸镁，氯化钠，磷酸二氢钾，亚硒酸钠)来促进菌丝的生长。旨在培养条件和培养介质中选取一个黄牛肝菌菌丝生长的最适条件，从而获得黄牛肝菌的最大菌丝量，富硒量以及有机硒的最大转化率，实现黄牛肝菌和亚硒酸钠的最大化利用，从而开拓黄牛肝菌市场。

2.1培养条件的优化：

众所周知，摇床转速，温度和初始pH值对菌体的生长影响较大，故本发明采用正交实验，，具体因素如表1，优化转速、温度、初始pH这三个变量。其中，装液量为50mL/ 250mL，接种量为5％，温度为23℃，pH为自然，转速为120rpm，发酵7d后测定其菌丝生物量，从而选取一个黄牛肝菌菌丝生长的最适条件。

表1：培养条件的因素水平表

2.2矿质元素含量的优化：

PDA培养基中总会添加不同的矿质元素为菌种生长提供营养，但是不同的矿质元素之间会有不同的协同及拮抗作用，故本发明通过正交实验选择一种不同矿质元素的最适含量，减少不同元素之间的相互影响。其中，培养条件为上述优化后的最适条件，装液量为50mL/250mL，接种量为5％，发酵7d后测定其菌丝生物量，如表2。

表2：矿质元素含量的因素水平表

3富硒条件的优化：

根据以上正交实验结果，确定了最适的培养条件及培养介质，但是，亚硒酸钠的添加会抑制黄牛肝菌菌丝体的生长，过早添加会使黄牛肝菌菌丝体含量比较少，过晚添加则会影响硒的转化与吸收，一般菌种处于对数生长期时富硒能力最强。因此，我们以上述结果为基础，将亚硒酸钠按不同的添加时间以及添加方式添加进去，以获得硒的最大转换效率。

3.1按不同添加时间添加：

将亚硒酸钠的最适浓度分别在发酵第1，2，3，4，5，6天加入培养基；

3.2按不同的添加方式添加：

组Ⅰ：在发酵第一天就将亚硒酸钠加入培养基；

组Ⅱ：将最适亚硒酸钠含量等分为两份，分别在发酵第一天和第二天加入；

组Ⅲ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵第一天，第二天和第三天加入。

组Ⅳ：将最适亚硒酸钠含量等分为四份，分别在发酵第一天，第二天，第三天和第四天加入。

组Ⅴ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵第一天，第三天和第五天加入。

组Ⅵ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵第二天，第四天和第六天加入。 4生产效率测定：

采用干重法(将菌丝发酵液5000rpm离心5min，弃去上清液并收集菌丝)，将培养的菌丝冷冻干燥机中冻干。

生产效率g/L＝富硒产品干重g÷液体培养基的体积L

5硒的测定：

利用3,3-二氨基联苯胺(DAB)比色法对硒的含量进行测定。

5.1硒总含量：

黄牛肝菌菌丝中硒含量测定：准确称取1g富硒产物，放入烧瓶中，加入10mL消化液(5g钼酸钠加入蒸馏水:浓硫酸:高氯酸/3:3:4的溶液中配置而成)，4℃消化至无色透明为止。待冷却后，将此消化液转入50mL容量瓶中，用氢氧化钠调节pH到7.0左右，最后将溶液定容到50mL，取10mL消化样液，按DAB比色法计算硒含量。

5.2有机硒含量；

准确称取黄牛肝菌富硒产物0.5g，放入透析袋中，充分透析24h后(去除无机硒)，取透析袋中物质，按上述方法进行硒含量测定。

5.3综合考虑富硒量和有机硒转化率，以确定最优的培养基硒浓度。

富硒量μg/g＝硒总含量μg÷菌丝干重g

有机硒转化率％＝有机硒含量μg÷硒总含量μg×100％

6数据处理与分析：

试验数据采用IBM SPSS Statistics 22软件进行单因子方差分析，多重比较，结果以平均数±标准差表示。

结果与讨论：

1.培养条件及培养介质的优化：

根据表3的结果显示，仅以PDA培养基作为培养介质，在培养温度为23℃，初始pH为6.0，摇床转速为120rpm时可以获得最大菌丝产量，但是，一般情况下，食用菌的生长都需要一定的矿质元素，使用综合PDA培养基可以更大程度的提高食用菌的生产，更利于工业化应用，故我们在最适条件下添加一定的无机盐，根据表4结果显示，四种无机盐的成分对菌丝产量的影响极大，根据现有的研究结果，亚硒酸钠的影响最大。同时，我们发现，黄牛肝菌菌丝具有十分出色的富硒能力，随着培养基中硒浓度的增加，菌丝的富硒量也随之增高。在硒浓度为300μg/mL时，干重为1g的菌丝即含有约320μg硒；但我们同时发现，在硒浓度达到300μg/mL时，菌丝的产量也相对降低，1L发酵液只能获得约8.7g干重菌丝，相对最大量时减少了约27.6％，而在硒浓度低于200μg/mL 时，菌丝生产效率达10.0g以上。低浓度的硒对菌丝的生长并没有促进作用，但高浓度硒对菌丝生长有抑制作用，随着培养基中硒浓度的增加，菌丝中会出现红硒现象。

综合表3，4的结果，我们可以得到黄牛肝菌的最适培养条件：培养温度为23℃，初始pH为6.0，摇床转速为120rpm，培养基中含有1.0g/L硫酸镁，2.0g/L氯化钠，0.5g/L磷酸二氢钾，2g/L亚硒酸钠时，不仅可以获得最大菌丝产量，还可以达到有机硒的较大转换量。

表3：培养条件的正交实验设计及结果

每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(P<0.05)；

表4：矿质元素含量的正交实验设计及结果

每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(P<0.05)；

2.硒的添加方式的确立：

硒的必须摄入值和毒性值之间的阈值非常接近，因此必须充分考虑这个因素，以免造成硒中毒。

根据发酵过程中培养基颜色的改变以及表5的数据，我们发现随着发酵天数向培养基中添加亚硒酸钠，菌液中出现红硒现象的时间越短，这说明有较多的菌丝以极快的速度利用了亚硒酸钠，但是，随着发酵天数的增加，后加硒的培养基中获得的菌丝量没有过大的差异，富硒量却大大减少，并且在发酵过程中存在着不稳定性，在发酵第二天或第三天加入亚硒酸钠时，可以获得更高的富硒量，相对于最少量增加了166.8％；对比不同添加时间下的有机硒的转化率，随着发酵天数的增加，最后加硒的培养基中有机硒转化率极小，最小时可达33.1％，尽管可以获得相对高产的菌丝体，但是有机硒含量的急剧减少不利于工业化应用，故我们选择在发酵第三天加入亚硒酸钠，从而获得硒的最大化利用，减少工业成本。

但是，一次性加入亚硒酸钠可能由于亚硒酸钠浓度过高从而抑制了菌丝的生长，所以我们又采用了分批次加入的方式，根据表6的结果，我们发现分批次加亚硒酸钠可以稍微提高菌丝的产量，这说明分批次加入亚硒酸钠后，由于菌液中菌丝含量较高，亚硒酸钠对菌丝的抑制作用减弱；同时，我们发现分三次，分别在发酵第一，二，三天加入亚硒酸钠可以获得更高的富硒量，且有机硒转化率也达最高，相对于一次性加入亚硒酸钠，富硒量提高了12.3％，同时，有机硒转化率提高了16.9％。

表5：不同时间加入亚硒酸钠对菌丝生长的影响

每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(P<0.05)；

表6：不同亚硒酸钠的添加方式对菌丝生长的影响

每个数值均表示为三次测试的平均值(mean)±标准差(SD)，同一列中不同的字母表示具有显著差异(P<0.05)；

总结：

本实验采取一种新型的亚硒酸钠的添加方式，不仅不会影响菌丝的产量，而且大大提高了硒的利用率，使无机硒尽可能的转化为有机硒，减少产品的毒性，具有极高的工业化应用。

根据上述结果，我们调节摇床培养温度为23℃，初始pH为6.0，转速为120rpm，培养基中含有1.0g/L硫酸镁，2.0g/L氯化钠，0.5g/L磷酸二氢钾，2g/L亚硒酸钠时，并且我们将亚硒酸钠均分为三等分，分别在发酵第一，二，三天加入培养基中，发酵7天可以获得约11.4g干重菌丝，富硒量约331.7μg/g，并且有机硒转化率高达90.0％，相对与现存的产品，本发明大大节约了成本，适合现代化工业发展。

优点：

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本发明采用一种独特的优化方式，采取正交实验，既涵盖了各个条件之间的协同与拮抗作用，还大大减少了实验次数，提高了实验效率；(2)本发明采取不同的亚硒酸钠添加时间与添加方式，从而获得最大菌丝生物量，富硒量和有机硒转化率，相对于传统工业大大减少了食用原料，节约了成本。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺优化方法，其特征在于，其包括以下步骤：

（1）选取黄牛肝菌；

（2）培养基的培养：以 PDA 培养基为基础，同时添加不同的矿质元素来促进菌丝的生长；

（3）培养条件的优化：采用正交实验，优化转速、温度、初始 pH 这三个变量，其中，装液量为 50 mL/ 250 mL，接种量为 5 %，设置多种温度、pH和转速，发酵 7 d 后测定其菌丝生物量，从而选取一个黄牛肝菌菌丝生长的最适条件；

（4）培养基中矿质元素含量的优化：通过正交实验选择一种不同矿质元素的最适含量，其中，添加的矿质元素至少包括硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾、亚硒酸钠；

（5）富硒条件的优化：将亚硒酸钠按不同的添加时间以及添加方式添加进去，以获得硒的最大转换效率；

（6）生产效率测定：采用干重法，将菌丝发酵液 5000 rpm 离心 5 min，弃去上清液并收集菌丝，之后将培养的菌丝冷冻干燥机中冻干，其中，生产效率 g/L = 富硒产品干重 g÷ 液体培养基的体积 L；

（7）硒的测定：利用 3,3-二氨基联苯胺比色法对硒的含量进行测定；

（8）数据处理与分析：试验数据进行单因子方差分析，多重比较，结果以平均数±标准差表示，并根据分析结果来确定工艺的最优参数。

2.根据权利要求1所述的一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺优化方法，其特征在于：所述步骤（5）中，富硒条件的优化的具体步骤如下：

①按不同添加时间添加：将亚硒酸钠的最适浓度分别在发酵第 1、2、3、4、5、6 天加入培养基；

②按不同的添加方式添加：分为六组分别进行添加，具体如下：

组Ⅰ：在发酵第一天就将亚硒酸钠加入培养基；

组Ⅱ：将最适亚硒酸钠含量等分为两份，分别在发酵第一天和第二天加入；

组Ⅲ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵第一天，第二天和第三天加入；

组Ⅳ：将最适亚硒酸钠含量等分为四份，分别在发酵第一天，第二天，第三天和第四天加入；

组Ⅴ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵第一天，第三天和第五天加入；

组Ⅵ：将最适亚硒酸钠含量等分为三份，分别在发酵第二天，第四天和第六天加入。

3.根据权利要求1所述的一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺优化方法，其特征在于：所述步骤（7）中，硒的测定的具体步骤如下：

①硒总含量：

黄牛肝菌菌丝中硒含量测定：准确称取 1 g 富硒产物，放入烧瓶中，加入 10 mL 消化液， 4 ℃消化至无色透明为止，待冷却后，将此消化液转入 50 mL 容量瓶中，用氢氧化钠调节 pH 到 7.0 左右，最后将溶液定容到 50 mL，取 10 mL 消化样液，按 DAB 比色法计算硒含量，

②有机硒含量：

准确称取黄牛肝菌富硒产物 0.5 g，放入透析袋中，充分透析 24 h 后去除无机硒，取透析袋中物质，按上述方法进行硒含量测定；

③综合考虑富硒量和有机硒转化率，以确定最优的培养基硒浓度，其中，

富硒量 µg/g = 硒总含量µg ÷ 菌丝干重g

有机硒转化率 % = 有机硒含量µg÷硒总含量 µg×100%。

4.根据权利要求3所述的一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺优化方法，其特征在于：所述10ml的消化液为5 g 钼酸钠加入混合溶液中配制而成，其中，混合溶液为蒸馏水:浓硫酸:高氯酸的体积比为3:3:4 的溶液中配置而成。

5.一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺，其特征在于：PDA 培养基作为培养介质，培养温度为23 ℃，初始 pH 为 6.0，摇床转速为 120 rpm，培养基中含有 1.0 g/L 硫酸镁，2.0g/L 氯化钠，0.5 g/L 磷酸二氢钾，2 g/L 亚硒酸钠。

6.根据权利要求5所述的一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺，其特征在于：加入亚硒酸钠时采用分批次加入的方式进行添加。

7.根据权利要求6所述的一种富硒黄牛肝菌的液体发酵工艺，其特征在于：将亚硒酸钠均分为三等分，分别在发酵第一，二，三天加入培养基中。