CN107722130A - 荧光标记红芪多糖的方法和使用该方法标记的红芪多糖及其用途 - Google Patents

荧光标记红芪多糖的方法和使用该方法标记的红芪多糖及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN107722130A
CN107722130A CN201710970407.0A CN201710970407A CN107722130A CN 107722130 A CN107722130 A CN 107722130A CN 201710970407 A CN201710970407 A CN 201710970407A CN 107722130 A CN107722130 A CN 107722130A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hps
fluorescent material
water
fluorescence labeling
amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710970407.0A
Other languages
English (en)
Inventor
赵良功
封士兰
师志强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou University
Original Assignee
Lanzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou University filed Critical Lanzhou University
Priority to CN201710970407.0A priority Critical patent/CN107722130A/zh
Publication of CN107722130A publication Critical patent/CN107722130A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/14—Macromolecular compounds
    • C09K2211/1441—Heterocyclic
    • C09K2211/145—Heterocyclic containing oxygen as the only heteroatom

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供一种以荧光物质为探针对红芪多糖(HPS)的还原性末端进行荧光标记的方法，以及使用该方法标记的HPS在研究其定量分析、细胞定位、组织分布、口服吸收、代谢排泄、药理及其机制等方面的用途。本发明利用HPS具有还原性末端的特性，通过还原胺化反应，使还原性末端直接或间接与荧光物质反应，使HPS接上荧光基团。通过该方法使不带有发光基团的HPS成为易于检测的带有荧光的红芪多糖，并且该标记方法对于HPS的内部结构和生物活性均无明显影响。使用本发明的方法制备的荧光标记的HPS可以用于其定量分析、细胞定位、组织分布、口服吸收、代谢排泄、药理及其机制等多方面的基础研究。

Description

荧光标记红芪多糖的方法和使用该方法标记的红芪多糖及其 用途
技术领域
本发明涉及一种荧光标记红芪多糖(HPS)的方法，及使用该方法标记的HPS，以及一种研究HPS的定量分析、细胞定位、组织分布、吸收、代谢、药理及其机制的方法。
背景技术
植物多糖类化合物具有多种生物活性，近年来受到广泛关注。大量研究表明，植物多糖参与及介导细胞内各种生命活动的调节，具有免疫调节、降血糖、抗氧化、降血脂、抗肿瘤、抗衰老等药理活性。因此，以植物多糖为基础的药物研究和开发已成为医药领域的前沿课题。由于多糖结构中缺少发光基团，难以直接检测，这使得多糖化合物的分子作用机制和代谢动力学研究进展缓慢。为解决上述问题，人们想到利用荧光物质对多糖进行标记，利用标记后的多糖具有荧光特性，进行多糖的检测、多糖的分子作用机制和代谢动力学研究。
红芪系豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪(Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz)的根，为甘肃特产名贵药材，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌之功效。红芪多糖(Hedysarum polybotys saccharide,HPS)是红芪发挥功效的重要成分之一,研究发现HPS由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，其活性较好，有抗氧化、降血糖、抗骨质疏松、抗肝纤维化等功效。
因此，研发一种操作简单且不影响多糖活性结构的荧光标记方法已成为进一步研究红芪多糖定量分析、细胞定位、组织分布、吸收、代谢、药理及其机制的重要途径。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种荧光标记HPS的方法，由于组成红芪多糖的单糖基都是醛糖，其多糖基末端开环后均为有还原性的醛基，因此，本发明的方法利用红芪多糖具有还原性末端的特性，通过还原胺化反应，使还原性末端直接或间接与荧光物质反应，使红芪多糖接上荧光基团。
本发明的第一个目的是提供荧光标记HPS的方法，利用糖HPS具有还原性末端的特性，通过还原胺化反应，使还原性末端直接或间接与荧光物质反应，使HPS接上荧光基团。
作为优选，所述荧光物质包括含有氨基的荧光物质和不含有氨基的荧光物质；利用含有氨基的荧光物质对HPS进行荧光标记的方法为：首先通过还原胺化反应，利用HPS的还原末端结构自动开环形成羰基与荧光物质的氨基反应生成亚胺，然后用氰基硼氢化钠还原成胺，从而使HPS键合上荧光基团；利用不含有氨基的荧光物质对HPS进行荧光标记的方法为：首先用酪胺与HPS的还原末端反应生成亚胺，然后用氰基硼氢化钠将亚胺还原成胺，引入氨基，之后利用荧光物质结构中异硫氰基可与氨基反应形成硫碳氨基键，从而使HPS键合上荧光基团。
作为进一步优选方案，所述利用含有氨基的荧光物质对HPS进行荧光标记的具体方法为：将HPS溶解于水中后,加入含有氨基的荧光物质，60℃-100℃水浴反应，反应时间为20-60分钟,然后加入0.5-1.5mol/l氰基硼氢化钠溶液，60℃-100℃水浴反应，反应时间为60-120分钟，对反应终止后得到的溶液进行纯化，得到荧光标记的HPS；
作为优选，所述含有氨基的荧光物质为8-氨基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐(APTS)、8-氨基-1,3,6-萘三磺酸二钠盐(ANTS)、5-氨基荧光素、6-氨基荧光素或刚果红(CR)。
HPS、含有氨基的荧光物质和氰基硼氢化钠溶液的用量比没有限制，只要三者存在就能进行荧光标记，用量不同时所带来的仅是荧光标记产物量的不同。在选择实施例1中的用量比时，各原料反应的较完全。
作为优选，所述纯化包括以下步骤：在反应终止后得到的溶液中加入乙醇进行沉淀，使溶液中乙醇的体积浓度达到40-85％，然后将沉淀用水复溶，再加乙醇沉淀，如此反复2-3次，最后一次用水复溶后进行透析，然后将透析液过葡聚糖凝胶柱，用质量百分数为0-20％氯化钠水溶液洗脱纯化；优选用蒸馏水进行洗脱纯化，此时洗脱效果最佳。
作为又一优选方案，所述利用不含有氨基的荧光物质对HPS进行荧光标记的具体方法为：
(1)将HPS和酪胺溶于pH8.0的磷酸盐缓冲溶液，室温反应12-48h，反应结束后，加入氰基硼氢化钠，30-40℃水浴反应60-120小时，对反应终止后得到的溶液进行纯化，冷冻干燥，得到HPS-Tyr；
(2)将冷冻干燥的HPS-Tyr加水溶解，调pH至8-10，加入不含有氨基的荧光物质，避光反应后，纯化得到荧光标记的HPS；
作为优选，所述不含有氨基的荧光物质为含有异硫氰基的荧光物质。
HPS、酪胺、不含有氨基的荧光物质和氰基硼氢化钠溶液的用量比没有限制，只要四者存在就能进行荧光标记，用量不同时所带来的仅是荧光标记产物量的不同。在选择实施例3中的用量比时，各原料反应的较完全。
作为优选，所述不含有氨基的荧光物质为异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明-5(6)异硫氰酸酯(TRITC)、6-异硫氰酸荧光素或罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)。
作为优选，步骤(2)中所述纯化包括以下步骤：在反应终止后得到的溶液中加入乙醇进行沉淀，使溶液中乙醇的体积浓度达到40-85％，然后将沉淀用水复溶，再加乙醇沉淀，如此反复2-3次，最后一次用水复溶后进行透析，然后将透析液过葡聚糖凝胶柱，用质量百分数为0-20％氯化钠水溶液洗脱纯化；优选用蒸馏水进行洗脱纯化，此时洗脱效果最佳。
本发明的第二个目的是提供使用上述任一方法制备的带有荧光标记的红芪多糖。
本发明的第三个目的是提供上述的带有荧光标记的红芪多糖在研究红芪多糖的定量分析、细胞定位、组织分布、吸收、代谢、药理及其作用机制中的应用。
所述机制包括红芪多糖的代谢及药理等方面。
本发明的研究红芪多糖的定量分析、细胞定位、组织分布、吸收、代谢、药理及其机制的方法包括：(1)使用由本发明方法制备的荧光标记的HPS；(2)使用步骤(1)得到的荧光标记的HPS研究该多糖的定量分析、细胞定位、组织分布、口服吸收及其机制。通过本发明的方法使不带有发光基团的HPS成为易于检测的带有荧光的红芪多糖，并且该标记方法对于HPS的内部结构和生物活性均无明显影响。使用本发明的方法制备的荧光标记的HPS可以用于其定量分析、细胞定位、组织分布、口服吸收、代谢排泄及药理等多方面的基础研究。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为ANTS标记的红芪多糖HPS-3反应过程示意图。
图2为FITC标记的红芪多糖HPS-3反应过程示意图。
图3为HPS-3-ANTS的葡聚糖凝胶色谱洗脱曲线。
图4为HPS-3、ANTS、HPS-3-ANTS的紫外可见扫描图谱。
图5为HPS-3的高效凝胶色谱图。
图6为HPS-3-ANTS的高效凝胶色谱图。
图7为HPS-3-FITC的高效凝胶色谱图。
图8为HPS-3-Tyr、HPS-3-FITC的葡聚糖凝胶色谱洗脱曲线。
图9为HPS-3、HPS-3-Tyr、HPS-3-FITC的紫外可见扫描图谱。
图10为HPS-3-ANTS的组织分布直方图。
图11为HPS-3-FITC的组织分布直方图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。如无特殊说明，在本发明中，“％”表示体积浓度百分比，“倍量”为质量体积比(药材为质量单位：g，乙酸乙酯和乙醇为体积单位：ml)。
红芪多糖可以是市售的多糖或者可以采用本领域中的常规方法制备。以下以HPS-3为例介绍本发明的荧光标记方法，如前述：由于组成红芪多糖的单糖基都是醛糖，其多糖基末端开环后均为有还原性的醛基，因此，本发明方法并不局限于HPS-3的荧光标记，任何红芪多糖的荧光标记均可利用本发明的方法，比如HPS-1、HPS-2、HPS-4等。
实施例1 ANTS标记的红芪多糖HPS-3的制备
将红芪药材粉碎，加入6倍量的乙酸乙酯80℃回流提取3次，每次1.5h，挥干溶剂；然后加入6倍量的乙醇80℃回流提取3次，每次1.5h，挥干溶剂；最后加入10倍量的水60℃温浸3次，每次1h，过滤，合并滤液。滤液加乙醇使乙醇的终浓度为50％，静置离心，上清液再加乙醇使乙醇的终浓度为70％，静置离心得沉淀为粗HPS-3，将粗HPS-3用Sevage法除蛋白，H2O2法除色素，透析，冷冻干燥，得到纯化的HPS-3。
取500mg HPS-3加水溶解，加入58.5ml的0.02mol/l的ANTS冰乙酸溶液，混匀，60℃水浴孵育20分钟，加入29.25ml 0.8mol/l氰基硼氢化钠(NaBH3CN，溶解于二甲亚砜)，混匀，60℃水浴孵育120min，加入无水乙醇使终浓度为50％，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，再加入无水乙醇使乙醇的浓度为50％进行沉淀，离心，如此重复3次。沉淀加水复溶后流水透析24小时，透析液上Sephadex G-25柱纯化，蒸馏水洗脱，每管收集10ml洗脱液，采用苯酚-硫酸法测定各管糖含量，荧光光度计(λex＝366nm,λem＝500nm)测定各管荧光强度，按洗脱曲线合并洗脱液，冷冻干燥，得淡绿色粉末，即为ANTS标记的HPS-3，反应示意图参见图1。
图1为ANTS标记的红芪多糖HPS-3反应过程示意图。
实施例2实施例1中制备的荧光标记红芪多糖标记成功的确定
通过对实施例1中制备得到的HPS-3-ANTS进行Sephadex-G-25洗脱曲线分析，多糖峰与ANTS第一吸收峰重合,说明红芪多糖与ANTS成功结合，参见图3。
图3为HPS-3-ANTS的葡聚糖凝胶色谱洗脱曲线。
通过对HPS-3、ANTS、HPS-3-ANTS的紫外可见扫描图谱分析，HPS-3-ANTS在220nm，265nm，360nm左右有ANTS的特征吸收峰，进一步说明HPS-3与ANTS结合成功，参见图4。
图4为HPS-3、ANTS、HPS-3-ANTS的紫外可见扫描图谱。
通过对HPS-3、HPS-3-ANTS高效凝胶色谱图的分析，HPS-3在示差检测器(RI)上有信号，在荧光检测器(FLD)(λex＝366nm,λem＝500nm)上无信号，说明HPS-3无荧光，同时HPS-3-ANTS在示差检测器和荧光检测器均有信号，且峰型和保留时间基本一致，也进一步说明HPS-3与ANTS结合成功，参见图5和图6。
图5为HPS-3的高效凝胶色谱图。
图6为HPS-3-ANTS的高效凝胶色谱图。
实施例3 FITC标记的红芪多糖HPS-3的制备
取400mg HPS-3溶于100ml 0.2mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH8.0)，加入400mg酪胺(Tyr)室温反应24h。反应结束后，加150mg氰基硼氢化钠(固体)，于30℃水浴反应60h，间或震荡。反应完毕，离心，取上清液，过Sephadex G-25柱，蒸馏水洗脱，每管收集10ml洗脱液，苯酚-硫酸法测各管糖含量，紫外可见分光光度计测280nm紫外吸收值,绘制HPS-3-Tyr的洗脱曲线，按洗脱曲线合并洗脱液，冷冻干燥，得HPS-3-Tyr。
实验发现，加入固态的氰基硼氢化钠和加入溶于二甲亚砜的氰基硼氢化钠在反应时间和反应结果上差别不大，因此，优选将固态的氰基硼氢化钠直接加入，这样能够节约成本，也能够节省氰基硼氢化钠溶解所用的时间。
将冻干HPS-3-Tyr溶于水，用0.5mol·L-1的Na2CO3调pH至8，加50mg FITC，室温下避光反应过夜，加适量乙醇使终浓度为50％，有沉淀析出，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，再加入无水乙醇使乙醇的浓度为50％进行沉淀，离心，如此重复3次。沉淀加水复溶流水透析24小时，透析液上Sephadex G-25柱纯化，蒸馏水洗脱，每管收集10ml洗脱液，测定各管糖含量和荧光吸收值(λex＝492nm,λem＝518nm)，收集相应洗脱液，冷冻干燥，得HPS-3-FITC，避光保存。反应示意图参见图2。
图2为FITC标记的红芪多糖HPS-3反应过程示意图。
实施例4实施例3中制备的荧光标记的红芪多糖标记成功的确定
通过对实施例3中制备得到的HPS-3-FITC进行Sephadex-G-25洗脱曲线分析，多糖峰与FITC第一吸收峰重合说明，多糖与FITC成功结合，参见图8。
图8为HPS-3-Tyr、HPS-3-FITC的葡聚糖凝胶色谱洗脱曲线。
通过对HPS-3、FITC、HPS-3-FITC的紫外可见扫描图谱分析，HPS-3-FITC在280nm左右有酪胺的特征吸收峰，490nm左右有FITC的特征吸收峰，也能说明HPS-3与FITC结合成功，参见图9。
图9为HPS-3、HPS-3-Tyr、HPS-3-FITC的紫外可见扫描图谱。
通过对HPS-3、HPS-3-FITC高效凝胶色谱图的分析,HPS-3在示差检测器(RI)上有信号，在荧光检测器(FLD)(λex＝492nm,λem＝518nm)上无信号，说明HPS-3无荧光，同时HPS-3-FITC在示差检测器和荧光检测器均有信号，且峰型和保留时间基本一致，也进一步说明HPS-3与FITC结合成功，参见图5和图7。
图5为HPS-3的高效凝胶色谱图。
图7为HPS-3-FITC的高效凝胶色谱图。
实施例5 ANTS标记的红芪多糖HPS-3的组织分布研究
取昆明小鼠48只，随机分成8组，以160mg·kg-1的剂量尾静脉给予HPS-3-ANTS，分别在给药后0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4h时间点脱颈椎处死，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑等组织，用生理盐水冲净表面血液及内容物后，分别称量各脏器湿重，装入离心管,加入9倍体积的生理盐水，制备匀浆，离心，取上清液于-80℃冻存。临用时室温融化，使用荧光光度计(λex＝366nm,λem＝500nm)测定其荧光强度，将荧光强度代入相应的标准方程中求得药物浓度，依据各组织脏器中的药物浓度绘制组织浓度-时间曲线，梯形法计算各组织中药物的AUC，结果心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑的AUC值分别为20.575、163.313、23.051、39.914、147.847、10.916、11.767、0μg·h·mL-1；以各组织的AUC总和为参比，计算各组织的靶向效率Te，Te(％)＝AUC/∑AUC×100，结果心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑的Te值依次为4.84、38.43、5.42、11.17、34.79、2.57、2.77、0，组织分布直方图参见图10。
图10为HPS-3-ANTS的组织分布直方图。
实施例6 FITC标记的红芪多糖HPS-3的组织分布研究
取昆明小鼠48只，随机分成8组，以160mg·kg-1的剂量尾静脉给予HPS-3-FITC，分别在给药后0、0.25、0.5、1、2、4、8、24h时间点脱颈椎处死，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑等组织，用生理盐水冲净表面血液及内容物后，分别称量各脏器湿重，装入离心管，加入9倍体积的生理盐水，制备匀浆，离心，取上清液于-80℃冻存。临用时室温融化，使用荧光光度计(λex＝492nm,λem＝518nm)测定其荧光强度，将荧光强度代入相应的标准方程中求得药物浓度，依据各组织脏器中的药物浓度绘制组织浓度-时间曲线，梯形法计算各组织中药物的AUC，结果心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑的AUC值分别为31.51、291.81、23.67、103.65、326.14、21.89、23.53、0.36μg·h·mL-1；以各组织的AUC总和为参比，计算各组织的靶向效率Te，Te(％)＝AUC/∑AUC×100，结果心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑的Te值依次为3.83、35.48、2.88、12.60、39.65、2.66、2.86、0.04，组织分布直方图参见图11。
图11为HPS-3-FITC的组织分布直方图。
实施例7 ANTS标记的红芪多糖HPS-3的制备
取500mg HPS-3加水溶解，加入10ml的0.02mol/l的ANTS冰乙酸溶液，混匀，80℃水浴孵育60分钟，加入20ml 0.5mol/l氰基硼氢化钠(NaBH3CN，溶解于二甲亚砜)，混匀，100℃水浴孵育100min，加入无水乙醇使终浓度为50％，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，再加入无水乙醇使乙醇的浓度为40％进行沉淀，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶后流水透析24小时，透析液上Sephadex G-25柱纯化，用质量百分数为10％氯化钠水溶液洗脱，每管收集10ml洗脱液，采用苯酚-硫酸法测定各管糖含量，荧光光度计(λex＝366nm,λem＝500nm)测定各管荧光强度，按洗脱曲线合并洗脱液，冷冻干燥，得淡绿色粉末，即为ANTS标记的HPS-3。
实施例8 ANTS标记的红芪多糖HPS-3的制备
取500mg HPS-3加水溶解，加入30ml的0.02mol/l的ANTS冰乙酸溶液，混匀，100℃水浴孵育40分钟，加入12.5ml 1.5mol/l氰基硼氢化钠(NaBH3CN，溶解于二甲亚砜)，混匀，80℃水浴孵育60min，加入无水乙醇使终浓度为85％，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，再加入无水乙醇使乙醇的浓度为70％进行沉淀，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，再加入无水乙醇使乙醇的浓度为75％进行沉淀，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶后流水透析24小时，透析液上Sephadex G-25柱纯化，用质量百分数为20％氯化钠水溶液洗脱，每管收集10ml洗脱液，采用苯酚-硫酸法测定各管糖含量，荧光光度计(λex＝366nm,λem＝500nm)测定各管荧光强度，按洗脱曲线合并洗脱液，冷冻干燥，得淡绿色粉末，即为ANTS标记的HPS-3。
实施例9 FITC标记的红芪多糖HPS-3的制备
取400mg HPS-3溶于120ml 0.2mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH8.0)，加入300mg酪胺(Tyr)室温反应24h。反应结束后，加160mg氰基硼氢化钠(固体)，于35℃水浴反应80h，间或震荡。反应完毕，离心，取上清液，过Sephadex G-25柱，蒸馏水洗脱，每管收集10ml洗脱液，苯酚-硫酸法测各管糖含量，紫外可见分光光度计测280nm紫外吸收值,绘制HPS-3-Tyr的洗脱曲线，按洗脱曲线合并洗脱液，冷冻干燥，得HPS-3-Tyr。
将冻干HPS-3-Tyr溶于水，用0.4mol·L-1的Na2CO3调pH至8，加40mg FITC，室温下避光反应过夜，加适量乙醇使终浓度为85％，有沉淀析出，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，再加入无水乙醇使乙醇的浓度为50％进行沉淀，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶流水透析24小时，透析液上Sephadex G-25柱纯化，用质量百分数为20％氯化钠水溶液洗脱，每管收集10ml洗脱液，测定各管糖含量和荧光吸收值(λex＝492nm,λem＝518nm)，收集相应洗脱液，冷冻干燥，得HPS-3-FITC，避光保存。
实施例10 FITC标记的红芪多糖HPS-3的制备
取400mg HPS-3溶于150ml 0.2mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH8.0)，加入510mg酪胺(Tyr)室温反应24h。反应结束后，加15ml 0.6mol/l氰基硼氢化钠(NaBH3CN，溶解于二甲亚砜)，于40℃水浴反应120h，间或震荡。反应完毕，离心，取上清液，过SephadexG-25柱，蒸馏水洗脱，每管收集10ml洗脱液，苯酚-硫酸法测各管糖含量，紫外可见分光光度计测280nm紫外吸收值,绘制HPS-3-Tyr的洗脱曲线，按洗脱曲线合并洗脱液，冷冻干燥，得HPS-3-Tyr。
将冻干HPS-3-Tyr溶于水，用0.6mol·L-1的Na2CO3调pH至8，加70mg FITC，室温下避光反应过夜，加适量乙醇使终浓度为40％，有沉淀析出，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，再加入无水乙醇使乙醇的浓度为60％进行沉淀，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，再加入无水乙醇使乙醇的浓度为50％进行沉淀，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶流水透析24小时，透析液上Sephadex G-25柱纯化，用质量百分数为5％氯化钠水溶液洗脱，每管收集10ml洗脱液，测定各管糖含量和荧光吸收值(λex＝492nm,λem＝518nm)，收集相应洗脱液，冷冻干燥，得HPS-3-FITC，避光保存。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.荧光标记红芪多糖(HPS)的方法，其特征在于：利用HPS具有还原性末端的特性，通过还原胺化反应，使还原性末端直接或间接与荧光物质反应，使HPS接上荧光基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光物质包括含有氨基的荧光物质和不含有氨基的荧光物质；利用含有氨基的荧光物质对HPS进行荧光标记的方法为：首先通过还原胺化反应，利用HPS的还原末端结构自动开环形成羰基与荧光物质的氨基反应生成亚胺，然后用氰基硼氢化钠还原成胺，从而使HPS键合上荧光基团；利用不含有氨基的荧光物质对HPS进行荧光标记的方法为：首先用酪胺与HPS的还原末端反应生成亚胺，然后用氰基硼氢化钠将亚胺还原成胺，引入氨基，之后利用荧光物质结构中异硫氰基可与氨基反应形成硫碳氨基键，从而使HPS键合上荧光基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述利用含有氨基的荧光物质对HPS进行荧光标记的具体方法为：将HPS溶解于水中后，加入含有氨基的荧光物质，60℃-100℃水浴反应，反应时间为20-60分钟，然后加入0.5-1.5M氰基硼氢化钠溶液，60℃-100℃水浴反应，反应时间为60-120分钟，对反应终止后得到的溶液进行纯化，得到荧光标记的HPS；
作为优选，所述含有氨基的荧光物质为8-氨基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐、8-氨基-1,3,6-萘三磺酸二钠盐、5-氨基荧光素、6-氨基荧光素或刚果红。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述纯化包括以下步骤：在反应终止后得到的溶液中加入乙醇进行沉淀，使溶液中乙醇的体积浓度达到40-85％，然后将沉淀用水复溶，再加乙醇沉淀，如此反复2-3次，最后一次用水复溶后进行透析，然后将透析液过葡聚糖凝胶柱，用质量百分数为0-20％氯化钠水溶液洗脱纯化。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述利用不含有氨基的荧光物质对HPS进行荧光标记的具体方法为：
(1)将HPS和酪胺溶于pH8.0的磷酸盐缓冲溶液，室温反应12-48h，反应结束后，加入氰基硼氢化钠，30-40℃水浴反应60-120小时，对反应终止后得到的溶液进行纯化，冷冻干燥，得到HPS-Tyr；
(2)将冷冻干燥的HPS-Tyr加水溶解，调pH至8-10，加入不含有氨基的荧光物质，避光反应后，纯化得到荧光标记的HPS。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述不含有氨基的荧光物质为含有异硫氰基的荧光物质。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述不含有氨基的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明-5(6)异硫氰酸酯、6-异硫氰酸荧光素或罗丹明B异硫氰酸酯。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述纯化包括以下步骤：在反应终止后得到的溶液中加入乙醇进行沉淀，使溶液中乙醇的体积浓度达到40-85％，然后将沉淀用水复溶，再加乙醇沉淀，如此反复2-3次，最后一次用水复溶后进行透析，然后将透析液过葡聚糖凝胶柱，用质量百分数为0-20％氯化钠水溶液洗脱纯化。
9.使用权利要求1-8中任一项所述的方法制备的带有荧光标记的HPS。
10.权利要求9所述的带有荧光标记的HPS在研究HPS的定量分析、细胞定位、组织分布、吸收、代谢、药理及其作用机制中的应用。
CN201710970407.0A 2017-10-16 2017-10-16 荧光标记红芪多糖的方法和使用该方法标记的红芪多糖及其用途 Pending CN107722130A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710970407.0A CN107722130A (zh) 2017-10-16 2017-10-16 荧光标记红芪多糖的方法和使用该方法标记的红芪多糖及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710970407.0A CN107722130A (zh) 2017-10-16 2017-10-16 荧光标记红芪多糖的方法和使用该方法标记的红芪多糖及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107722130A true CN107722130A (zh) 2018-02-23

Family

ID=61211836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710970407.0A Pending CN107722130A (zh) 2017-10-16 2017-10-16 荧光标记红芪多糖的方法和使用该方法标记的红芪多糖及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107722130A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109265573A (zh) * 2018-08-20 2019-01-25 华中科技大学 一种用于近红外成像的石斛多糖荧光标记物及其合成方法
CN110132680A (zh) * 2019-06-05 2019-08-16 山东大学 一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用
CN112986193A (zh) * 2021-01-29 2021-06-18 华中科技大学 一种铁皮石斛多糖特异性荧光标记物及其合成方法和应用
CN115895047A (zh) * 2022-11-17 2023-04-04 南通大学 用于生物胺检测的比率荧光复合薄膜材料及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991005256A1 (en) * 1989-09-27 1991-04-18 Astroscan Limited Analysis of carbohydrates
CN103709266A (zh) * 2013-12-30 2014-04-09 兰州大学 一种红芪多糖1、其四种分离物及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991005256A1 (en) * 1989-09-27 1991-04-18 Astroscan Limited Analysis of carbohydrates
CN103709266A (zh) * 2013-12-30 2014-04-09 兰州大学 一种红芪多糖1、其四种分离物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
唐孝威等: "《分子影像学导论（第1版）》", 31 January 2006, 浙江大学出版社 *
王再林: "几种真菌多糖荧光标记的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
赵长琦等: "《抗肿瘤植物药及其有效成分（第1版）》", 31 May 1997, 中国中医药出版社 *
陈义: "《毛细管电泳技术及应用（第1版）》", 30 September 2000, 化学工业出版社 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109265573A (zh) * 2018-08-20 2019-01-25 华中科技大学 一种用于近红外成像的石斛多糖荧光标记物及其合成方法
CN110132680A (zh) * 2019-06-05 2019-08-16 山东大学 一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用
CN110132680B (zh) * 2019-06-05 2020-06-30 山东大学 一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用
CN112986193A (zh) * 2021-01-29 2021-06-18 华中科技大学 一种铁皮石斛多糖特异性荧光标记物及其合成方法和应用
CN115895047A (zh) * 2022-11-17 2023-04-04 南通大学 用于生物胺检测的比率荧光复合薄膜材料及其制备方法
CN115895047B (zh) * 2022-11-17 2024-05-10 南通大学 用于生物胺检测的比率荧光复合薄膜材料及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107722130A (zh) 荧光标记红芪多糖的方法和使用该方法标记的红芪多糖及其用途
CN102617745B (zh) 灵芝多糖f31的制备方法及其降血糖功能
CN101340921A (zh) 一种预防或治疗血栓性疾病的提取物
CN103724445B (zh) 灰树花多糖f2的制备方法及其降血糖功能
CN103884811B (zh) 一种生物色谱比较筛选系统及其应用
JP7414303B2 (ja) 刺五加均質多糖とその調製方法および応用
CN103251926B (zh) 一种中药水蛭提取物及其用途
Bi et al. Study on pharmacokinetics and tissue distribution of Polygonatum sibiricum polysaccharide in rats by fluorescence labeling
CN104327176A (zh) 一种高纯度眼镜蛇神经毒素的提取方法及含有该毒素的药物组合物
CN107012184B (zh) 一种酶法提取的川白芷多糖及制备方法和应用
CN113248631B (zh) 一种螺旋藻多糖及其在制备精华液中的应用
CN110305235A (zh) 一种甘草均一多糖gup及其制法和用途
Lin et al. Peach gum polysaccharides promotes epithelial proliferation to attenuate ulcerative colitis by PI3K/AKT pathway
CN102846704B (zh) 一种益母草注射液、其制备方法和总生物碱的检测方法
CN108676061B (zh) 甘露聚糖肽及其纯化方法
CN101167755B (zh) 具有抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物的制备方法及用途
CN103479711B (zh) 杜仲木脂素提取物在制备治疗肾间质纤维化药物中的应用
CN107625852B (zh) 一种清热利湿化瘀止带中药组合物及其制备工艺和应用
CN102319420B (zh) 甲鱼肽在制药中的应用
CN111471090B (zh) 人参糖蛋白及其制备方法与应用
CN104274727A (zh) 清营口服液的质量检测方法
CN106333966A (zh) 鹿茸提取物的制备方法及其相关产品
CN106986949B (zh) 罗布麻花多糖、提取方法及其应用
CN113880959B (zh) 一种黄精均一多糖及其制备方法与应用
Wang et al. Study on the characteristics of pharmacokinetics of different doses of gastrodin in mice

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180223