CN107711822A - 一种大鳞副泥鳅精子保存液、活化液和孵化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大鳞副泥鳅精子保存液、活化液和孵化方法，属于水产养殖的技术领域，其中，精子保存液的组分包括：0.5％‑1.0％柠檬酸三钠、1.0％‑3.0％葡萄糖、0.1％‑0.3％碳酸氢钠、0.02％‑0.04％氯化钾、0.01％‑0.02％VC；活化液的组分包括：1‑2％葡萄糖、0.35％氯化钠；孵化方法步骤包括：将利用精子保存液保存的精液用活化液激活，再与卵子结合，受精卵置于网片上静水孵化。与现有技术相比，本发明通过创新大鳞副泥鳅在特定精子保存液中的激活方式，可确保精子具有最大活力，提高鱼卵受精率和孵化率，指导育苗生产。
Description
技术领域
本发明涉及的是水产养殖的技术领域，尤其涉及的是一种大鳞副泥鳅精子保存液、活化液和孵化方法。
背景技术
泥鳅被人们称为“水中人参”，其所含蛋白质、人体所需的氨基酸较一般鱼、肉类高，得到广大消费者的青睐。大鳞副泥鳅已经成为名特优水产品重点开发对象之一，继而全国各地开展了大鳞副泥鳅人工养殖和人工繁殖。但在人工繁殖过程中，大鳞副泥鳅精液很难挤出，且其精液相对较少，一般需杀鱼取精，剪碎研磨，并需加一定量的精子活化液，若处理不当常会影响精子活力，降低鱼卵受精率，影响苗种生产。
随着鱼类养殖业的迅速发展以及杂交育种、优良品种的选育与提纯复壮等工作的开展，鱼类精液保存技术的应用越来越广泛。目前，常用精子保存液保藏鱼类精子，这种技术可以保持精子的活力，广泛应用在鱼类精液常温、低温和冷冻保存方法中，而精子保存液的选择，成为影响精子保存效果的关键因素之一。万全等在“5种配方和5种糖类对大鳞副泥鳅精子保存效果的研究”(水生态学杂志，2009年9月，第2卷第5期)一文中公开了五种精子保存液A、B、C、D、E及其配方，并通过对比试验进行比较，发现这5种精子保存液的保存效果依次为C＞B＞A＞E＞D。而胡一中在“Na+、K+、Ca2+、葡萄糖及渗透压对泥鳅精子活力的影响”一文中发现，Na+有促进精子活动的作用，K+对精子活动则起明显抑制作用，Ca2+能引起精子的聚集，且随Ca2+浓度增加，聚集现象更趋明显，而葡萄糖、半乳糖和果糖是精子活动存活的可选择和次级的能源，体外受精鱼类精子有利用细胞外源性葡萄糖的能力，以补偿自身活动过程中所消耗的部分能量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种大鳞副泥鳅精子保存液、活化液和孵化方法，以提高大鳞副泥鳅精子的激活率、鱼卵受精率和孵化率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种大鳞副泥鳅精子保存液，该精子保存液的组分及其质量百分比包括：0.5％-1.0％柠檬酸三钠、1.0％-3.0％葡萄糖、0.1％-0.3％碳酸氢钠、0.02％-0.04％氯化钾、0.01％-0.02％VC；该精子保存液的pH为7.5-8.0。
本发明还提供了一种大鳞副泥鳅精子活化液，该精子活化液的组分及其质量百分比包括：1-2％葡萄糖、0.35％氯化钠。
进一步地，所述葡萄糖的质量百分比为1.5％。
本发明还提供了一种大鳞副泥鳅的孵化方法，包括以下步骤：
(1)采集雄泥鳅精液；
(2)精液保存：将采集的大鳞副泥鳅精液用上述精子保存液稀释，置于4℃下避光保存待用。
(3)采集雌泥鳅卵子；
(4)活化：将上述精子活化液加入步骤(2)的经精子保存液稀释的精液中，搅拌，预激活精子；1-2％的葡萄糖和0.35％的氯化钠溶液为一种低渗溶液，利用1-2％的葡萄糖和0.35％的氯化钠混合溶液对精子进行预激活，可保证泥鳅精子的寿命和快速运动时间更长，为后续提高人工授精的成功率奠定基础；
(5)人工授精：将步骤(4)激活的精子与步骤(3)的卵子混合，搅拌，完成人工授精过程；
(6)孵化：将受精卵均匀摊开在80目的网片上，放入水泥池水中下层，进行静水孵化，网片上方安装一水龙头处于滴水状态。
进一步地，所述步骤(1)中，采集雄泥鳅精液的方法为：先用鱼用安定剂将成熟雄泥鳅麻醉，再用毛巾擦干雄泥鳅生殖孔区域，轻压腹部，用吸管收集挤出的精液；该方法避免了直接杀鱼取精巢，精液挤出后立即放入精子保存液中保存，最大程度保持了精子活力。
进一步地，所述步骤(2)中，将采集的大鳞副泥鳅精液用10-20倍精液体积的精子保存液保存。
进一步地，所述步骤(3)中，先用鱼用安定剂将雌泥鳅麻醉，再采用两指挤卵方式采集卵子，即一只手抓住大鳞副泥鳅头部，另一只手大拇指和食指轻扣腹部，沿生殖孔方向轻轻滑动挤压，将卵挤出；每批鱼卵的采集时间控制20min之内。
进一步地，所述步骤(4)中，取300-500ml的精子活化液，加入2-4ml步骤(2)的经精子保存液稀释的精液中，搅拌3-5s预激活精子。
进一步地，所述步骤(6)中，将载有受精卵的网片放入面积20-30m2，水深30-40cm的水泥池水中下层进行静水孵化。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种大鳞副泥鳅精子保存液、活化液和孵化方法，通过创新大鳞副泥鳅在特定精子保存液中的激活方式，确保精子具有最大活力，提高鱼卵受精率和孵化率，指导育苗生产。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1制备精子保存液
按重量计，把0.5％-1.0％柠檬酸三钠、1.0％-3.0％葡萄糖、0.1％-0.3％碳酸氢钠、0.02％-0.04％氯化钾、0.01％-0.02％VC和双蒸水混合，置于磁力搅拌器搅拌3-5分钟，待充分溶解后定容，调节pH为7.5-8.0。
2.2采集精液
用鱼用安定剂将成熟雄泥鳅麻醉，用毛巾擦干雄鱼生殖孔区域，轻压腹部，用吸管收集挤出的精液。
2.3精液保存
将采集的精液加入相当于精液体积10-20倍的精子保存液中，分成两组，分别置于常温和4℃下避光保存。
2.4配制精子活化液
按重量计，把1-2％的葡萄糖、0.35％氯化钠与双蒸水混合，搅拌混匀，待充分溶解后备用。
2.5精子活化液预激活效果检测
吸取一滴活化液于载玻片上，在10×10的倍数下对准视野，所述活化液包括：水(组I)、0.5％葡萄糖溶液+0.35％氯化钠(组II)、1.0％葡萄糖溶液+0.35％氯化钠(组III)、1.5％葡萄糖溶液+0.35％氯化钠(组IV)、2.0％葡萄糖溶液+0.35％氯化钠(组V)、1.5％葡萄糖溶液(组VI)、0.35％NaCl溶液(组VII)。分别将常温和4℃保存的精液摇匀，滴在载玻片的活化液液滴中，搅匀并迅速观察其运动情况，每个样品循环观察3次。记录的方法为：“+++”表示100％精子快速运动，“++”表示80％左右的精子在快速运动，“+”表示50％左右的精子在快速运动，“+-”表示10％～30％精子快速运动，“-”表示全都死亡或少量在原地振动。
结果如下：
表1中可以看出，本发明的精子保存液在4℃下对泥鳅精液具有较好的保存效果，其保存时间可达14天。表1中还可以看出，利用1-2％葡萄糖+0.35％氯化钠混合溶液对保存的精液进行预激活，相比较用水、或单独用葡萄糖或NaCl，其激活效果显著，当精液在常温保存8h后或在4℃保存14天后，激活后仍然有100％的精子具有显著活力，为后续受精率的提高打下基础。
2.6人工受精
将经注射激素催情发情的雌泥鳅用鱼用安定剂麻醉，采用两指挤卵方式采集卵子，即一只手抓住雌泥鳅头部，另一只手大拇指和食指轻扣腹部，沿生殖孔方向轻轻滑动挤压，将卵挤入干燥碗中或盆中，每批鱼卵的采集时间控制20min之内；
取300-500ml左右的1.5％葡萄糖+0.35％氯化钠的活化液，分别加入2-4ml经精子保存液常温保存8小时的精液和4℃保存14天的精液，搅拌3-5s预激活精子，然后将混合液倒入到500-1000g的卵子中，搅拌20-30s左右，完成人工受精过程，获得受精卵并统计受精率。
2.7孵化
将200-300万粒泥鳅受精卵均匀摊开在80目的网片上，网片放入面积20-30m2，水深30-40cm的水泥池水中下层，进行静水孵化，网片上方安装一水龙头处于滴水状态。
3、结论
本发明提供了一种大鳞副泥鳅精子保存液、活化液和人工受精方法，试验结果表明，将大鳞副泥鳅精液保存于所述的保存液中，置于常温下8小时，利用活化液激活后100％的精子具有活力，用于受精，受精率达95％；在4℃冷藏条件下保存14天，利用活化液激活后100％的精子具有活力，用于受精，受精率达90％。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
Claims (9)
1.一种大鳞副泥鳅精子保存液，其特征在于，该精子保存液的组分及其质量百分比包括：0.5％-1.0％柠檬酸三钠、1.0％-3.0％葡萄糖、0.1％-0.3％碳酸氢钠、0.02％-0.04％氯化钾、0.01％-0.02％VC，该精子保存液的pH为7.5-8.0。
2.一种大鳞副泥鳅精子活化液，其特征在于，该精子活化液的组分及其质量百分比包括：1-2％葡萄糖、0.35％氯化钠。
3.根据权利要求2所述的一种大鳞副泥鳅精子活化液，其特征在于，所述葡萄糖的质量百分比为1.5％。
4.一种大鳞副泥鳅的孵化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集雄泥鳅精液；
(2)精液保存：将采集的大鳞副泥鳅精液用如权利要求1所述的精子保存液稀释，置于4℃下避光保存待用。
(3)采集雌泥鳅卵子；
(4)活化：将如权利要求2-3任一所述的精子活化液与步骤(2)的经精子保存液稀释的精液混合，搅拌，预激活精子；
(5)人工授精：将步骤(4)激活的精子与步骤(3)的卵子混合，搅拌，进行人工受精，获得受精卵；
(6)孵化：将受精卵均匀摊开在80目的网片上，放入水泥池水中下层位置，进行静水孵化，网片上方的水面上安装一水龙头处于滴水状态。
5.根据权利要求4所述的一种大鳞副泥鳅的孵化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采集雄泥鳅精液的方法为：先用鱼用安定剂将成熟雄泥鳅麻醉，再用毛巾擦干雄泥鳅生殖孔区域，轻压腹部，用吸管收集挤出的精液。
6.根据权利要求4所述的一种大鳞副泥鳅的孵化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将采集的大鳞副泥鳅精液用10-20倍精液体积的精子保存液保存。
7.根据权利要求4所述的一种大鳞副泥鳅的孵化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，先用鱼用安定剂将雌泥鳅麻醉，再采用两指挤卵方式采集卵子，且每批鱼卵的采集时间控制20min之内。
8.根据权利要求4所述的一种大鳞副泥鳅的孵化方法，其特征在于，所述步骤(4)中，取300-500ml的精子活化液，加入2-4ml步骤(2)的经精子保存液稀释的精液中，搅拌3-5s预激活精子。
9.根据权利要求4所述的一种大鳞副泥鳅的孵化方法，其特征在于，所述步骤(6)中，将载有受精卵的网片放入面积20-30m2，水深30-40cm的水泥池水中下层进行静水孵化。
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