CN107708723B - 神经生长因子组合物和注射粉剂 - Google Patents

Abstract

一种神经生长因子组合物和注射粉剂。所述神经生长因子组合物包括神经生长因子、稳定剂、支持剂、pH缓冲剂和水；所述稳定剂为精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和异亮氨酸。所述神经生长因子组合物还包括表面活性剂。通过使用氨基酸代替白蛋白作为稳定剂，能够避免因白蛋白中携带病毒或其他未知成分带来的潜在风险；不仅对mNGF具有保护作用，同时可保证hNGF以及rhNGF在制备、运输及储存过程中保持良好的稳定性、临床用药安全性及质量可控性；组合物中成分明确，易于定性及定量，所用稳定剂纯度高，来源广，容易进行长期大量生产，便于控制成本及提高产品质量。

Description

神经生长因子组合物和注射粉剂

技术领域

本发明涉及神经生长因子组合物和注射粉剂，属于医药生物领域。

背景技术

神经生长因子(NGF)是一种具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF包含α、β、γ三个亚单位，β亚单位是活性区，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成。1953年，意大利科学家Levi-Montalcini发现了NGF并获得了诺贝尔奖。目前，国内外已有多个NGF产品上市，临床上主要用于治疗神经系统发育不良，包括弱视、神经瘤、各种神经损伤及神经系统病变等疾病。

NGF与其他蛋白质药物相似，由于蛋白质半衰期较短，当暴露于极端温度、湿度条件下，或受物理、化学因素的影响，蛋白质的空间构象容易发生改变而引起变性，变性的蛋白质丧失了原有的生物活性；此外，因蛋白质常易粘附于固体表面，在灌装过程中，部分蛋白质会粘附于容器内壁上而造成活性成分的损失。为保证其生物活性，需加入稳定剂以防止其生物活性丧失。

通常，白蛋白作为一种优良的稳定剂以及块状(cake)成型剂被广泛应用于各种生物制品中。然而，由于白蛋白主要来源于人血、胎盘血，NGF组合物作为一种非经过灭菌的无菌制剂，血液中携带着一些不易检测的未知成分容易给制剂带来污染；同时，白蛋白的长期、大量应用也容易受到血源供应的限制以及生产成本的影响；再次，在中间体及制剂成品含量测定时，白蛋白可能会对相对少量的NGF产生干扰从而影响产品的品质管理。因此，为避免上述问题，需寻求一种稳定的去白蛋白NGF组合物。

发明内容

本发明的目的是提供神经生长因子组合物和注射粉剂，不仅对鼠源性神经生长因子(mNGF)具有保护作用，同时还能够保证人源性神经生长因子(hNGF)以及重组人神经生长因子(rhNGF)在制备、运输及储存过程中保持良好的稳定性、具有更好的临床用药安全性及质量可控性。

本发明提供的一种神经生长因子组合物，它包括神经生长因子、稳定剂、支持剂、pH缓冲剂和水；

所述稳定剂为精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和异亮氨酸。

上述神经生长因子的组合物中：

所述神经生长因子的质量体积浓度为10μg/mL～100μg/mL；

所述稳定剂的质量体积浓度为6mg/mL～30mg/mL；

所述支持剂的质量体积浓度为20mg/mL～50mg/mL；

所述pH缓冲剂维持所述神经生长因子组合物的pH值为6.80～7.00；

溶剂为水。

上述神经生长因子组合物中，稳定剂的添加可避免或降低由制备或储存过程中引起的蛋白质聚集和解聚，术语“稳定剂”是指一种能防止活性成分在水溶液中聚集或解聚的物质，除了稳定作用之外，稳定剂通常也可作为支持剂以改善产品的成型性，且不排除还有其它作用；

上述神经生长因子组合物中，优选地，所述稳定剂的质量体积浓度为10mg/mL～20mg/mL，更优选地，所述稳定剂的质量体积浓度为13mg/mL；

上述神经生长因子组合物中，所述稳定剂中精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和异亮氨酸各组分质量比为1：(1～3)：(1～3)：(1～3.6)，具体可为1：(1～1.3)：(1～1.8)：(1～1.3)、1：(1.3～3)：(1.8～3.0)：(1.3～3.6)、1：(1.2～2)：(1.5～2.0)：(1.2～1.5)、1：(1.25～2.8)：(1.6～2.8)：(1.25～3.0)、1：1：1：1、1：1.2：3：1.3、1：2：3：1、1：1.25：1.5：1.25、1：1：2.8：1.5、1：2：2：3.6、1：1.3：3：1.3、1：3：3：3、1：1.2：1.6：1.2或1：2.8：1.8：1.5，优选地，所述稳定剂中精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和异亮氨酸各组分质量比为1：1.25：1.5：1.25，。

上述神经生长因子组合物中，支持剂的加入可改善成品的外观，保证本品冻干后具有较好的成型性；

上述神经生长因子组合物中，优选地，所述支持剂的质量体积浓度为30mg/mL～50mg/mL，更优选地，所述支持剂的质量体积浓度为50mg/mL；

所述支持剂为甘露醇、糊精和山梨醇中任一种。

上述神经生长因子组合物中，为保证组合物具有最大的生物活性，通常需要控制一个最适的pH范围，这种稳定性的最适pH范围需要在处方筛选时确定，通常采用影响因素试验(光照、高温、高湿)、加速及长期稳定性试验等方法进行确定，确定处方后，组合物在生产及贮存过程中必须保持在其最适pH范围。由于缓冲剂具有良好的缓冲能力，在一定范围内能保持产品pH的相对稳定，因此，处方中经常添加缓冲剂用于控制pH值；

上述神经生长因子组合物中，所述pH缓冲剂的摩尔浓度为10mM～50mM，优选地，所述pH缓冲剂的摩尔浓度为20mM～25mM，更优选地，所述pH缓冲剂的摩尔浓度为25mM。

上述神经生长因子组合物中，优选地，维持所述神经生长因子组合物的pH值为6.81～6.91，更优选地，维持所述神经生长因子组合物的pH值为6.82。

上述神经生长因子组合物中，所述pH缓冲剂选自磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐中的一种或几种，具体可为下述1)-5)中任一种：1)精氨酸盐酸盐、2)磷酸盐、3)柠檬酸盐、4)醋酸盐、5)组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐。

上述神经生长因子组合物中，所述水为注射用水。

上述神经生长因子组合物中，所述神经生长因子是一种具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用；

上述神经生长因子组合物中，优选地，所述神经生长因子的质量体积浓度为40μg/mL～80μg/mL，更优选地，所述神经生长因子的质量体积浓度为50μg/mL。

上述神经生长因子组合物中，所述神经生长因子选自鼠源性神经生长因子、人源性神经生长因子或重组人神经生长因子。

上述神经生长因子的组合物中，各组分的浓度具体可为下述1)-15)中的任一种：

1)神经生长因子：10～50μg/mL、稳定剂：6～13mg/mL、支持剂：20mg/mL～40mg/mL、pH缓冲剂：10mM～25mM；

2)神经生长因子：60～100μg/mL、稳定剂：6.5～14mg/mL、支持剂：30mg/mL～50mg/mL、pH缓冲剂：25mM～50mM；

3)神经生长因子：40～80μg/mL、稳定剂：8.9～15mg/mL、支持剂：30mg/mL～50mg/mL、pH缓冲剂：20mM～30mM；

4)神经生长因子：40～80μg/mL、稳定剂：10～20mg/mL、支持剂：30mg/mL～50mg/mL、pH缓冲剂：20mM～25mM；

5)神经生长因子：50～80μg/mL、稳定剂：10～20mg/mL、支持剂：40mg/mL～50mg/mL、pH缓冲剂：20mM～25mM；

6)神经生长因子：10μg/mL、稳定剂：6mg/mL、支持剂：20mg/mL、pH缓冲剂：10mM；

7)神经生长因子：40μg/mL、稳定剂：6.5mg/mL、支持剂：30mg/mL、pH缓冲剂：20mM；

8)神经生长因子：50μg/mL、稳定剂：8.9mg/mL、支持剂：40mg/mL、pH缓冲剂：25mM；

9)神经生长因子：60μg/mL、稳定剂：10mg/mL、支持剂：50mg/mL、pH缓冲剂：30mM；

10)神经生长因子：80μg/mL、稳定剂：13mg/mL、支持剂：50mg/mL、pH缓冲剂：30mM；

11)神经生长因子：100μg/mL、稳定剂：14mg/mL、支持剂：50mg/mL、pH缓冲剂：30mM；

12)神经生长因子：100μg/mL、稳定剂：15mg/mL、支持剂：50mg/mL、pH缓冲剂：30mM；

13)神经生长因子：100μg/mL、稳定剂：20mg/mL、支持剂：50mg/mL、pH缓冲剂：30mM；

14)神经生长因子：100μg/mL、稳定剂：30mg/mL、支持剂：50mg/mL、pH缓冲剂：30mM；

15)神经生长因子：50μg/mL、稳定剂：10mg/mL、支持剂：40mg/mL、pH缓冲剂：25mM。

上述神经生长因子的组合物中，所述神经生长因子组合物的pH值可为6.80～7.00，具体可为6.80、6.81、6.83、6.85、6.91或7.00。

上述神经生长因子组合物中，由于蛋白质具有较高的与表面相互作用的倾向，这使它们在气-液、瓶-液界面容易经受吸附和/或变性。这种相互作用与蛋白浓度成反比，并导致形成可溶性的和不可溶的蛋白质聚集体、或者溶液中的蛋白质通过吸附到界面而损失。

表面活性剂通常用于蛋白质配方中以防止表面相互作用引发的吸附和/或变性。表面活性剂为两性分子，对于界面位置能竞争过蛋白质。表面活性剂分子中的疏水部分占据界面位置(如气-液)，而分子中的亲水部分保持指向溶剂主体。在足够的浓度下(通常在表面活性剂的临界胶束浓度左右)，表面活性剂分子的表面层起到防止蛋白质分子在界面吸附的作用。此外，在生物制品的冷冻干燥全过程中，表面活性剂既能在冻结和脱水过程中降低冰水界面张力所引起的冻结和脱水变性；又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用。

上述神经生长因子组合物还可以包括表面活性剂。所述表面活性剂的质量体积浓度为0mg/mL～1.0mg/mL，但不为0；优选地，所述表面活性剂的质量体积浓度为0.2mg/mL～1.0mg/mL；优选地，所述表面活性剂的质量体积浓度为0.2～0.5mg/ml；更优选地，所述表面活性剂的质量体积浓度为0.2mg/mL。

上述神经生长因子组合物中，所述表面活性剂为泊洛沙姆、聚山梨酯、15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯(简称HS 15，下同)中任一种，优选地，所述表面活性剂为泊洛沙姆188(简称F68)，聚山梨酯20(简称TW-20)聚山梨酯80(简称TW-80)及HS 15。

本发明进一步提供了一种神经生长因子组合物注射粉剂的制备方法，将上述的神经生长因子组合物冷冻干燥即可得到所述神经生长因子组合物注射粉剂。

本发明也提供了一种神经生长因子组合物注射粉剂，为注射给药。

上述神经生长因子组合物注射粉剂，其含水率可为1.0～3.0％，优选为1.0％～2.0％，具体可为1.1％～1.9％、1.1％、1.3％、1.5％、1.6％、1.7％或1.9％。

上述神经生长因子组合物在治疗神经损伤或制备治疗神经损伤的药物中的应用，也在本发明的保护范围内。所述神经生长因子组合物具体可为神经生长因子组合物注射粉剂。所述神经损伤可以是视神经损伤，其致伤原因具体可为拳脚伤、车祸、物体崩伤或眼部爆炸伤。

本发明进一步提供了一种治疗神经损伤的方法，它包括如下步骤：给神经损伤患者施用有效剂量的神经生长因子组合物。所述神经生长因子组合物具体可为神经生长因子组合物注射粉剂。所述施用具体可为肌肉注射。所述神经损伤可以是视神经损伤，其致伤原因具体可为拳脚伤、车祸、物体崩伤或眼部爆炸伤。

本发明制备得到的神经生长因子组合物及注射粉剂，在制备、运输及储存过程中均保持良好的稳定性：(1)在制备过程中，将本发明制备得到的神经生长因子组合物注射粉剂在室温条件下放置24小时后，其中NGF的含量和活性均无明显变化；(2)与参比制剂相比，在常规(6±2℃)在运输及储存过程中，本发明NGF组合物注射粉剂在12月后，其有效含量仅降低2.4％～3.4％，其活性降低也很少，具有优异的稳定性。

本发明制备得到的神经生长因子组合物注射粉剂，在临床试验中，能够明显降低不良反应发生率，临床治疗效果好，与现有的参比制剂相比，具有更好的临床用药安全性及质量可控性。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明神经生长因子组合物及注射粉剂，通过使用氨基酸代替白蛋白作为稳定剂，能够避免因白蛋白中携带病毒或其他未知成分带来的潜在风险。

(2)本发明神经生长因子组合物注射粉剂，不仅对鼠神经生长因子(mNGF)具有保护作用，同时能够保证人神经生长因子(hNGF)以及重组人神经生长因子(rhNGF)在制备、运输及储存过程中保持良好的稳定性、更好的临床用药安全性及质量可控性。

(3)本发明神经生长因子组合物及注射粉剂，组合物中成分明确，易于定性及定量，所用稳定剂纯度高，来源广，容易进行长期大量生产，便于控制成本及提高产品质量。

(4)本发明神经生长因子组合物注射粉剂能够很好地解决产品长期贮存稳定性问题，并且临床有效性更高。

附图说明

图1为在加速条件下(25℃，RH 60±10％)，实施例中制备得到的NGF组合物注射粉剂及参比制剂中NGF的平均含量随时间的变化曲线。

图2为在加速条件下(25℃，RH 60±10％)，实施例中制备得到的NGF组合物注射粉剂及参比制剂的平均活性随时间的变化曲线。

图3为在长期稳定性条件下(6±2℃)，实施例中制备得到的NGF组合物注射粉剂及参比制剂中NGF的平均含量随时间的变化曲线。

图4为在长期稳定性条件下(6±2℃)，实施例中制备得到的NGF组合物注射粉剂及参比制剂的平均活性随时间的变化曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的mNGF及hNGF原液由舒泰神(北京)生物制药股份有限公司提供，rhNGF原液由北京义翘神州生物技术有限公司提供，其余辅料除非特别说明，均为注射级别。

为了寻找具有更佳稳定性的物质作为NGF的稳定剂，本发明根据NGF的结构特性，通过对氨基酸种类及用量进行筛选及优化，进行了大量探索性实验，最终采用不同浓度和比例的甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、异亮氨酸制备了各NGF组合物注射用无菌粉末，并测定了冷冻干燥后成品的水分、pH、渗透压、含量及活性。

实施例1、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量精氨酸盐酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、甘露醇、F68搅拌至完全溶解，加入rhNGF原液，用精氨酸或HCl调pH至表1中所示pH 6.85，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为10μg/mL的组合物。

将上述rhNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即rhNGF组合物注射粉剂。

实施例2、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量磷酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和甘露醇搅拌至完全溶解，加入hNGF原液，用NaOH或H₃PO₄调pH至表1中所示pH 6.83，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为40μg/mL的组合物。

将上述hNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即hNGF组合物注射粉剂。

实施例3、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量柠檬酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和甘露醇搅拌至完全溶解，加入hNGF原液，用NaOH或柠檬酸调pH至表1中所示pH 6.80，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为40μg/mL的组合物。

将上述hNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即hNGF组合物注射粉剂。

实施例4、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量磷酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和甘露醇搅拌至完全溶解，加入hNGF原液，用NaOH或H₃PO₄调pH至表1中所示pH 6.91，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为80μg/mL的组合物。

将上述hNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即hNGF组合物注射粉剂。

实施例5、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量醋酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和甘露醇搅拌至完全溶解，加入rhNGF原液，用NaOH或HAc调pH至表1中所示pH 6.82，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为80μg/mL的组合物。

将上述rhNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即rhNGF组合物注射粉剂。

实施例6、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量柠檬酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和山梨醇搅拌至完全溶解，加入hNGF原液，用NaOH或柠檬酸调pH至表1中所示pH 6.82，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为50μg/mL的组合物。

将上述hNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即hNGF组合物注射粉剂。

实施例7、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量醋酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和甘露醇搅拌至完全溶解，由于处方中TW-80在注射用水中呈球形聚集状态，不易混合均匀，本发明先将TW-80溶解于热的注射用水(40～80℃)中配制成1％水溶液，待冷却至室温后按处方量经折算后加入上述溶液中混合均匀，加入hNGF原液，用NaOH或HAc调pH至表1中所示pH 6.81，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为60μg/mL的组合物。

将上述hNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即hNGF组合物注射粉剂。

实施例8、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和糊精搅拌至完全溶解，加入mNGF原液，用精氨酸或HCl调pH至表1中所示pH 6.85，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为60μg/mL的组合物。

将上述mNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末。

实施例9、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和甘露醇搅拌至完全溶解，加入hNGF原液，用精氨酸或HCl调pH至表1中所示pH 6.83，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为50μg/mL的组合物。

将上述hNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即hNGF组合物注射粉剂。

实施例10、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量磷酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和甘露醇搅拌至完全溶解，加入mNGF原液，用NaOH或H₃PO₄调pH至表1中所示pH 7.00，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为100μg/mL的组合物。

将上述mNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即mNGF组合物注射粉剂。

实施例11、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量醋酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和甘露醇搅拌至完全溶解，加入hNGF原液，用NaOH或HAc调pH至表1中所示pH 6.83，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为60μg/mL的组合物。

将上述hNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即hNGF组合物注射粉剂。

实施例12、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量柠檬酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和山梨醇搅拌至完全溶解，由于HS 15在常温条件下为块状固体，不易混合均匀，本发明先将HS 15溶解于热的注射用水(40～80℃)中配制成1％水溶液，待冷却至室温后按处方量经折算后加入上述溶液中混合均匀，加入hNGF原液，用NaOH或柠檬酸调pH至表1中所示pH 6.85，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为50μg/mL的组合物。

将上述hNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即hNGF组合物注射粉剂。

实施例13、NGF组合物和注射粉剂的制备

按下述步骤制备NGF组合物及注射粉剂：

按照表1中处方组成称取处方量磷酸盐，加入适量注射用水并搅拌至完全溶解，再加入处方量的谷氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和甘露醇搅拌至完全溶解，由于处方中TW-20在注射用水中呈球形聚集状态，不易混合均匀，本发明先将TW-20溶解于热的注射用水(40～80℃)中配制成1％水溶液，待冷却至室温后按处方量经折算后加入上述溶液中混合均匀，加入hNGF原液，用NaOH或HAc调pH至表1中所示pH 6.82，并加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μm微孔滤膜过滤至无菌容器中，制备成NGF浓度约为50μg/mL的组合物。

将上述hNGF组合物，按0.63±0.03mL/瓶分装至中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，冷冻干燥，制备成注射用无菌粉末即hNGF组合物注射粉剂。

表1、实施例1～13中各组分用量

实施例14、实施例1-13中制备得到的NGF组合物注射粉剂性能测试

下述性能测试中的参比制剂均采用发明名称为“去白蛋白神经生长因子制剂”，公开号为CN 1318087C的专利中实施例14中的去白蛋白神经生长因子冻干粉针制剂。

(1)外观、水分、渗透压、pH、含量及活性测试

分别观察实施例1-13中制备得到的NGF组合物注射粉剂及参比制剂的外观，测定其水分、渗透压、pH、含量及活性。其中，NGF含量测定按照专利申请号200510130348.3，专利名称为“测定神经生长因子含量的方法”中实施例1所述方法进行操作。活性测试方法采用细胞法进行测定，详细操作方法按照专利公开号为CN103376248A，专利名称为“神经生长因子活性定量测定方法”中实施例1中的方法进行操作。实验结果如表2所示。

表2各实施例检查项目检测结果

因渗透压与组合物中的离子浓度有关，上述各实施例中渗透压有所差异，本发明各实施例浓度略低于等渗浓度，但不会引起患者明显不适。由上表结果可知，本发明制备得到的NGF组合物注射粉剂的其余各项指标均符合质量标准要求。

(2)稳定pH范围筛选

根据实施例3中处方组成配制3份NGF组合物，保持柠檬酸盐总量不变，调节柠檬酸与柠檬酸钠相对比例，使NGF组合物pH值分别为6.0、6.8及7.4，分别灌装于西林瓶中，冷冻干燥制成注射用无菌粉末。取样，加入适量灭菌注射用水配制成溶液，置于室温条件下，分别于第0、4、8、12、24h观察外观、测定pH、含量及活性变化情况，测定结果如下表所示。

表3 NGF组合物pH范围筛选

由上表数据可知，三种不同pH的NGF组合物在室温下放置24h后，各项指标较0h无明显变化，均符合质量标准要求，说明室温条件下样品溶液pH在6.0～7.4范围内24h内能保持稳定。

(3)加速稳定性试验

根据《生物制品稳定性研究技术指导原则》要求，将参比制剂与实施例1-13中制备得到的NGF组合物注射粉剂样品置于25℃，RH 60±10％条件下进行0～6月加速稳定性考察，观察样品外观，测定水分、渗透压、pH、含量及活性。结果见表4及图1(平均含量随时间的变化曲线)、图2(平均活性随时间的变化曲线，活性单位：U/瓶，每瓶装量：0.63±0.03mL)。

表4 NGF组合物注射粉剂及参比制剂加速稳定性试验结果

由图1可以看出，在加速条件下(25℃，RH 60±10％)下放置，随着时间的变化，参比制剂及各实施例制备得到的NGF组合物注射粉剂中NGF的平均含量呈下降趋势，其中，参比制剂中NGF的平均含量的下降速度大于本发明实施例。由表4结果可知，在加速条件下(25℃，RH 60±10％)下放置6个月，各样品外观、水分、pH及渗透压无明显变化，但参比制剂含量降低约8.2％，实施例1～13含量降低率分别为7.1％、7.0％、4.9％、3.8％、6.9％、2.7％、3.6％、6.4％、4.5％、5.5％、3.8％、4.8％及4.9％，因此，加速条件下实施例1～13稳定性均优于参比制剂，其中，实施例3、实施例4、实施例6、实施例7和实施例11的稳定性明显优于参比制剂，尤其是实施例4、实施例6、实施例7和实施例11。

由图2可以看出，在加速条件下(25℃，RH 60±10％)下放置，随着时间的变化，参比制剂及各实施例制备得到的NGF组合物注射粉剂中NGF的平均活性呈下降趋势，但由图可以看出参比制剂的平均活性下降速度大于本发明制备得到的NGF组合物注射粉剂。由表4结果可知，在加速条件(25℃，RH 60±10％)下放置6个月，各样品外观、水分、pH及渗透压无明显变化，参比制剂活性降低10.2％，实施例1～13分别降低9.3％、8.7％、8.1％、5.8％、9.5％、4.8％、5.4％、7.8％、7.0％、6.1％、5.6％、7.5％及7.8，因此，加速条件下，实施例1～13稳定性均优于参比制剂，其中，实施例4、实施例6、实施例7和实施例11的稳定明明显优于参比制剂，尤其是实施例4、实施例6、实施例7和实施例11。

B、长期稳定性试验

根据《生物制品稳定性研究技术指导原则》要求，将参比制剂与实施例1-13中制备得到的NGF注射粉剂样品均置于6±2℃条件下进行0～12月长期稳定性考察，观察样品外观，测定水分、渗透压、pH、含量及活性，结果见表5及图3(平均含量随时间变化曲线)、图4(平均活性随时间变化曲线，活性单位：U/瓶，每瓶装量：0.63±0.03mL)。

表5 NGF组合物注射粉剂及参比制剂长期稳定性试验结果

由图3可以看出，在长期稳定性条件下(6±2℃)下放置，随着时间的变化，参比制剂及各实施例制备得到的NGF组合物注射粉剂中NGF的平均含量均呈下降趋势，其中，参比制剂中NGF的平均含量的下降速度大于本发明实施例。由表5结果可知，在长期条件下放置12个月，各样品外观、水分、pH及渗透压无明显变化，参比制剂含量降低约5.9％，实施例1～13含量降低率分别为4.8％、4.9％、3.6％、3.3％、5.4％、2.2％、2.9％、5.0％、4.0％、4.7％。3.7％、3.8％及3.9％，因此，长期条件下实施例1～13稳定性均优于参比制剂，其中，实施例3、实施例4、实施例6、实施例7和实施例11的稳定性明显优于参比制剂，尤其是实施例4、实施例6、实施例7和实施例11。

由图4可以看出，在长期稳定性条件下(6±2℃)下放置，随着时间的变化，参比制剂及各实施例制备得到的NGF组合物注射粉剂中NGF的平均活性整体均呈下降趋势，然而，由图可以看出，参比制剂的活性下降速度大于本发明实施例。由表5结果可知，在长期条件下放置12个月，各样品外观、水分、pH及渗透压无明显变化，参比制剂活性降低8.4％，实施例1～13活性分别降低7.7％、7.8％、5.4％、4.8％、7.9％、4.1％、4.5％、7.7％、5.5％、5.9％、4.8％、5.6％及5.8％，因此，长期条件下实施例1～13稳定性均优于参比制剂，其中，实施例3、实施例4、实施例6、实施例7和实施例11的稳定性明显优于参比制剂，尤其是实施例4、实施例6、实施例7和实施例11。

由上述稳定性测试结果可以看出，本发明NGF组合物注射粉剂采用精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和异亮氨酸四种氨基酸作为稳定剂，相对于参比制剂采用丙氨酸、精氨酸和甘氨酸作为稳定剂，具有更加优异的稳定性，尤其是实施例4、实施例6、实施例7和。

(4)临床评价

采用多中心非随机对照研究设计，271名视神经损伤患者进行为期12周的临床试验，受试者年龄为14周岁以上，所有受试者均能够与研究者进行良好沟通，理解并服从本临床试验要求，能够理解本临床试验并签署知情同意书。

受试者条件：14周岁以上。

性别：男性或女性。

受试者来源：在以各大眼科研究单位纳入各种原因所致的视神经损伤患者409例。

致伤原因：拳脚伤136例(136眼)，车祸152例(152眼)，物体崩伤73例(73眼)，眼部爆炸伤49例(49眼)。所有病例均不伴眼球破裂伤及眶壁骨折压迫视神经所致损伤。

治疗方法：治疗组分别采用参比制剂及本发明NGF组合物注射粉剂进行肌肉注射，每日1次，每次30μg，所有病例连续给药12周。安慰剂组采用阴性对照(不含活性成分，其余辅料同NGF组合物)。

治疗组271例(271眼)，年龄18～63岁，平均34.2岁；男189例(189眼)，女82例(82眼)；右眼147眼，左眼124眼。安慰剂组138例(138眼)，年龄13～55岁，平均33.9岁，男96例(96眼)，女42例(42眼)；右眼45眼，左眼93眼。

分组设计，按照下表所示进行分组：

表6临床试验分组及受试者数量

注：上表中的NGF组合物组采用实施例6制得的神经生长因子组合物，下同。

药物临床疗效：分别给予患者安慰剂、参比制剂及NGF组合物注射粉剂进行肌肉注射，治疗效果按痊愈、显效、好转及无效等进行评价，结果如下：

表7 NGF临床疗效对比

上述表格中的临床疗效采用如下临床疗效评价标准进行评价：

①痊愈：视力恢复到1.0以上，视野中心暗点消失；

②显效：视力提高4行上，视野中心暗点缩小或绝对暗点变为相对暗点；

③好转：视力提高2行以上，视野无变化；

④无效：视力和视野与治疗前相同或有退步。

由上表的结果可知，与安慰剂组相比，本发明的NGF组合物能够有效治疗各种原因所致的视神经损伤，对视神经损伤治疗的有效率优于参比制剂组，临床治疗效果好。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案及实施例对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，所属技术领域的技术人员可以在不偏离本发明主旨的范围内对之进行修改和改进，这些修改或改进均属于本发明要求保护的范围。

Claims (33)

1.一种神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子组合物包括神经生长因子、稳定剂、支持剂、pH缓冲剂和水；

所述稳定剂为精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和异亮氨酸；

所述稳定剂中精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和异亮氨酸各组分质量比为1：(1～3)：(1～3)：(1～3.6)；

所述神经生长因子的组合物中：

所述神经生长因子的质量体积浓度为10μg/mL～100μg/mL；

所述稳定剂的质量体积浓度为6mg/mL～30mg/mL；

所述支持剂的质量体积浓度为20mg/mL～50mg/mL；

所述pH缓冲剂维持所述神经生长因子组合物的pH值为6.80～7.00；

溶剂为水。

2.根据权利要求1所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述稳定剂的质量体积浓度为10mg/mL～20mg/mL。

3.根据权利要求1所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述稳定剂中精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和异亮氨酸各组分质量比为1：1.25：1.5：1.25。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述支持剂为甘露醇、糊精和山梨醇中任一种。

5.根据权利要求1所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述pH缓冲剂的摩尔浓度为10mM～50mM。

6.根据权利要求5所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述pH缓冲剂的摩尔浓度为20mM～25mM。

7.根据权利要求1-3、5和6中任一项所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述pH缓冲剂选自磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐中的一种或几种。

8.根据权利要求4所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述pH缓冲剂选自磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐中的一种或几种。

9.根据权利要求1所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子的质量体积浓度为40μg/mL～80μg/mL。

10.根据权利要求1-3、5、6和8中任一项所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子组合物还包括表面活性剂。

11.根据权利要求4所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子组合物还包括表面活性剂。

12.根据权利要求7所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子组合物还包括表面活性剂。

13.根据权利要求10所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述表面活性剂的质量体积浓度为0mg/mL～1.0mg/mL，但不为0。

14.根据权利要求13所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述表面活性剂的质量体积浓度为0.2mg/mL～0.5mg/mL。

15.根据权利要求11或12所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述表面活性剂的质量体积浓度为0mg/mL～1.0mg/mL，但不为0。

16.根据权利要求15所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述表面活性剂的质量体积浓度为0.2mg/mL～0.5mg/mL。

17.根据权利要求10所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述表面活性剂为非离子表面活性剂。

18.根据权利要求17所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述表面活性剂为泊洛沙姆、聚山梨酯和15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯中的至少一种。

19.根据权利要求11-14任一项所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述表面活性剂为非离子表面活性剂。

20.根据权利要求19所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述表面活性剂为泊洛沙姆、聚山梨酯和15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯中的至少一种。

21.根据权利要求15所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述表面活性剂为非离子表面活性剂。

22.根据权利要求21所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述表面活性剂为泊洛沙姆、聚山梨酯和15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯中的至少一种。

23.根据权利要求1所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子的组合物中：

所述神经生长因子的质量体积浓度为50μg/mL；

所述稳定剂的质量体积浓度为10mg/mL；

所述支持剂的质量体积浓度为40mg/mL；

所述pH缓冲剂的摩尔浓度为25mM。

24.根据权利要求1-3、5-6、8-9、11-14、16-18和20-22中任一项所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子选自鼠源性神经生长因子、人源性神经生长因子或重组人神经生长因子。

25.根据权利要求4所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子选自鼠源性神经生长因子、人源性神经生长因子或重组人神经生长因子。

26.根据权利要求7所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子选自鼠源性神经生长因子、人源性神经生长因子或重组人神经生长因子。

27.根据权利要求10所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子选自鼠源性神经生长因子、人源性神经生长因子或重组人神经生长因子。

28.根据权利要求15所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子选自鼠源性神经生长因子、人源性神经生长因子或重组人神经生长因子。

29.根据权利要求19所述的神经生长因子组合物，其特征在于：所述神经生长因子选自鼠源性神经生长因子、人源性神经生长因子或重组人神经生长因子。

30.一种神经生长因子组合物注射粉剂制备方法，其特征在于：将权利要求1-29中任一项所述的神经生长因子组合物冷冻干燥得到所述神经生长因子组合物注射粉剂。

31.权利要求30所述的制备方法制备得到的神经生长因子组合物注射粉剂。

32.权利要求1-29中任一项所述的神经生长因子组合物在制备治疗神经损伤的药物中的应用。

33.根据权利要求32所述的应用，其特征在于：所述神经损伤是视神经损伤。

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