CN107688066A - 一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法 - Google Patents
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Abstract
一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法，包括下列步骤：第一步：将沉积物或泥沙土冷冻干燥，然后粉碎过200目筛得到样品；第二步：将第一步得到的样品和内标液置于一离心管内；第三步：向第二步的离心管内加入萃取剂，超声处理15~30分钟后离心取上清液，重复至少两次；第四步：将第三步得到的上清液蒸发至体积不再变化，然后用超纯水复溶到300mL，再调节pH值至2~9得到水样；第五步：样品提取。本发明耗费较小，并且克服了因抗生素的稳定性较差，加速溶剂萃取过程的温度较高可会造成抗生素的损失的不足。
Description
技术领域
本发明属于沉积物环境中微量有机污染物残留检测领域，具体涉及一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法。
背景技术
根据中国科学院发布的“中国首份抗生素的全国使用量与排放量清单”，2013年中国抗生素的生产量为24.8万吨，使用量为16.2万吨，其中，兽用52%，人用48%，一年超过5万吨抗生素排放进入水土环境中。我国珠江、黄河、长江、海河、太湖等均有不同程度的检出，且某些抗生素的含量处于较高的水平，达数千ng·L-1。沉积物作为水环境中污染物重要的“汇”和难削减的内负荷，对于水环境具有重要的影响，相关研究表明部分抗生素易于被颗粒物吸附最终沉降到水体底部，抗生素在河流、湖泊沉积物中广泛检出。张盼伟等研究了太湖表层沉积物中PPCPs的污染特征及其风险水平，其中抗生素磺胺甲恶唑、甲氧苄氨嘧啶等均被检出，浓度范围处于ND到几十ng·g-1之间，磺胺甲恶唑风险熵处于较高风险。张婉如在大连近海岸沉积物中监测到了磺胺类抗生素和抗性基因，抗生素含量范围分别ND~699.62ng·g-1，抗性水平为0~33.20%。另外，在水产养殖区、饮用水源地等地区的沉积物中均监测出抗生素的残留。阮悦斐等在天津市近郊淡水养殖去沉积物中监测出磺胺甲基异噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲氧嘧啶、诺氟沙星等物质，最高浓度达30ng·g-1。任珂君等在广东一饮用水源地河流沉积物监测出喹诺酮类抗生素，诺氟沙星的最高含量达248.5 ng·g-1。残留在沉积物中的抗生素一方面会对底栖生物产生毒害作用，另一方面给微生物产生选择性压力，诱导其形成抗生菌株及抗性基因，对生态环境和人体健康造成重大潜在威胁。
沉积物的成分较为复杂，含有大量的有机质等干扰物质，导致沉积物中抗生素的提取方法较为繁琐耗时较长，且由于基质影响导致效果并不理想。目前沉积物中抗生素的提取方法大多用加速溶剂萃取（ASE）、索氏提取及微波辅助萃取法等。公开号为CN104698107A的发明专利公开了一种快速溶剂萃取土壤中残留多种抗生素的前处理方法，首先将土样冷冻干燥后研磨，称取过筛后的土样以及硅藻土，均匀混合后加入底部垫有纤维素滤膜的萃取池中，用硅藻土填满萃取池后旋紧萃取池盖后放入加速溶剂萃取仪中循环萃取，萃取后用氮气吹扫，萃取溶剂为甲醇与pH为5~6缓冲液的混合液，收集萃取液导入固相萃取小柱进行富集净化，后用甲醇作为洗脱液将固相萃取柱中的抗生素洗脱出来，用氮气吹扫浓缩，最后用甲醇定容，并用高效液相色谱串联质谱进行检测。加速溶剂萃取（ASE）的实验门槛较高，加速溶剂萃取仪及萃取池的价位较高；索氏提取的耗时较长和步骤繁琐；微波辅助萃取法处理样品的耗时较长，且需要耗费较多的人力。
发明内容
本发明目的在于提供一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法，包括下列步骤：
第一步：将沉积物或泥沙土冷冻干燥，然后粉碎过200目筛得到样品；
第二步：将第一步得到的样品和内标液置于一离心管内；
第三步：向第二步的离心管内加入萃取剂，超声处理15~30分钟后离心取上清液，重复至少两次；
第四步：将第三步得到的上清液蒸发至体积不再变化，然后用超纯水复溶到300mL，再调节pH值至2~9得到水样；
第五步：用甲醇和超纯水在自然重力下活化两种小柱，该两种小柱中各保持一段超纯水柱后串联得到固相萃取柱，第四步得到的水样过固相萃取柱后，依次用超纯水和体积百分比浓度为1~5%的甲醇水溶液淋洗所述固相萃取柱，然后将固相萃取小柱在真空下抽干，再依次用甲醇和氨水甲醇洗脱，最后在40℃水浴条件下用氮吹仪吹扫，再用体积比为1:9的甲醇水溶液定容至1mL，过 0.22µm膜至进2mL棕色样瓶中得到待测样本。
优选的技术方案为：所述内标液含有环丙沙星-D8、磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄氨嘧啶-13C3、去甲基金霉素和磺胺嘧啶-13C6中的至少一种。
优选的技术方案为：所述萃取溶剂为乙腈与EDTA-McIIvaine或柠檬酸缓冲液构成的混合液。
优选的技术方案为：将沉积物或泥沙土放入冰箱中预冻，而后置于冷冻干燥机的托盘中，冷冻干燥温度为-50℃。
优选的技术方案为：第三步中，萃取剂的体积为30mL，重复次数为3次。
优选的技术方案为：第四步中，蒸发的温度条件为40℃，调节pH值至3。
优选的技术方案为：所述氨水甲醇中的氨水与甲醇两者之间的体积比为5：95。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明利用超声波清洗仪萃取，在功率40W条件下，用萃取液对沉积物样品萃取3次，每次超声时间为15min，相对于索氏提取，方法简单，耗时较短，适应性广，整个过程消耗时间仅为为2-3h，省下将近4倍的时间，相比如加速溶剂萃取，实验门槛较低，常规的实验室即可进行实验，一台加速溶剂萃取仪加上萃取池需要几十万，而本发明所有的仪器加和费用仅为约1万元，耗费较小，并且克服了因抗生素的稳定性较差，加速溶剂萃取过程的温度较高可会造成抗生素的损失的不足。
2、本发明在固相萃取时，将SAX与HLB小柱的转接头进行了改造，提高了串联体系的密闭性，保证SAX与HLB小柱上下流速同步，不会出现HLB小柱出现干燥的状态，降低抗生素回收率。
3、本发明采用了10ml超纯水与5%的甲醇水溶液淋洗小柱，可以促进杂质的去除，检测时能够降低样品的基质影响。本实验采用的洗脱液为6ml甲醇和6ml5%的氨水甲醇溶液，可以更高效地将固相萃取柱富集的抗生素洗脱下来，提高回收率。
附图说明
图1 超声萃取多种抗生素的流程图。
图2 不同洗脱液下12种抗生素的回收率图。
图3不同参数下土样品中12种抗生素回收率。
图4为固相萃取柱的连接结构示意图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
发明提供了一种超声萃取沉积物中残留多种抗生素的前处理方法，可以用于富集提取沉积物样中磺胺类、磺胺增效剂、喹诺酮类和四环素类12种抗生素，采用以下仪器和试剂：
仪器：超声仪（昆山超声波仪器有限公司，KQ5200B）；旋转蒸发仪（RE052AA, 上海亚荣生化仪器厂），固相萃取装置（Agilent 5982-9110，12孔），UPLC-MS/MS高效液相串联质谱（ACQUITY UPLC-XEVO-TQMSUSA，Waters），UPLC BEH -C18 column (50mm×2.1mm, 1.7um)；氮吹仪（南京铭奥仪器设备有限公司，N-EVAP-111）；离心机（上海安亭科学仪器厂，GL-20B），冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司，LGJ-10），涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有上海司，VORTEX-5）。
试剂：乙腈、甲醇和氨水均为色谱纯，超纯水（Millipore超纯水系统，USA），SAX固相萃取小住（6ml，500mg）（ 上海安谱实验科技股份有限公司）、Waters Oasis HLB（6 mL，500mg），Na2EDTA、七水合柠檬酸和磷酸氢二钠购自国药集团化学试剂有限公司（优级纯）。
实施例1：一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法
参见附图1~4所示，称取2g硅藻土，将其放入30mL的玻璃离心管中，加入20ul内标混合液（环丙沙星-D8、磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄氨嘧啶-13C3、去甲基金霉素，磺胺嘧啶-13C6）过夜。然后制备萃取剂，所述的萃取剂可以为体积比1:1的乙腈和EDTA-McIIvaine或柠檬酸缓冲液的混合液，萃取液30mL，超声15min，萃取次数为3次，旋蒸温度40℃。
依次用10mL甲醇和10mL超纯水在重力作用下活化SAX和HLB小柱，将两小柱用改造好的连接头串联，水样过柱后，用10mL超纯水和10mlL1-5%的甲醇水溶液淋洗小柱，后将固相萃取小柱在真空下抽2h至干，再用6mL甲醇和6mL含5%的氨水甲醇洗脱（靠自然重力流下），而后在40℃水浴条件下用氮吹仪吹至近干，而后用1:9的甲醇水溶液定容至1mL，过0.22µm膜至进2mL的棕色样瓶中，待分析。
利用Waters UPLC-MS/MS高效液相串联质谱对样品进行测定，分析条件具体为：流动相A为0.3% 甲酸和0.1%甲酸铵溶液，B为1:1 乙腈:甲醇，按照梯度洗脱条件检测样品中的抗生素，梯度洗脱条件见表1。流速0.3mL·min-1；进样量为10μL；柱温40℃；自动进样盘温度为4℃。质谱模式为电喷雾正离子源（ESI+）；检测方式：多反应监测，MRM；雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；离子源温度和去溶剂气温度分别为140℃和500℃；锥孔气和去溶剂气流量分别为70hr和450L·h-1；电离电压和电喷雾电压分别为3.5KV和5.5KV。对于化合物的定量采用两组离子对，并从中选择一组仪器响应较高的离子对用于定量目标抗生素。
| Time | A（%） | B（%） | flow rate（ML·min-1） |
| 0 | 80 | 20 | |
| 2.8 | 45 | 55 | |
| 5 | 45 | 55 | |
| 5.1 | 0 | 100 | 0.3 |
| 7 | 0 | 100 | |
| 7.2 | 80 | 20 | |
| 8 | 80 | 20 |
实施例2：一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法
称取2g硅藻土，将其放入30mL的玻璃离心管中，加入20µL内标混合液（环丙沙星-D8、磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄氨嘧啶-13C3、去甲基金霉素，磺胺嘧啶-13C6）过夜。然后制备萃取剂，所述的萃取剂可以为体积比1:1的乙腈和EDTA-McIIvaine的混合液，萃取液30ml，涡旋，超声15min，萃取次数为3次，旋蒸温度40℃。
依次用10mL甲醇和10mL超纯水在重力作用下活化HLB小柱，水样过柱后，用10mL超纯水和10mlL1-5%的甲醇水溶液淋洗小柱，后将固相萃取小柱在真空下抽2h至干，再用6mL甲醇和6mL含5%的氨水甲醇洗脱（靠自然重力流下），而后在40℃水浴条件下用氮吹仪吹至近干，而后用1:9的甲醇水溶液定容至1mL，过 0.22µm膜至进2mL的棕色样瓶中，待分析。
利用Waters UPLC-MS/MS高效液相串联质谱对样品进行测定，分析条件具体为：流动相A为0.3% 甲酸和0.1%甲酸铵溶液，B为1:1 乙腈:甲醇，按照梯度洗脱条件检测样品中的抗生素，梯度洗脱条件见表1。流速0.3mL·min-1；进样量为10μL；柱温40℃；自动进样盘温度为4℃。质谱模式为电喷雾正离子源（ESI+）；检测方式：多反应监测，MRM；雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；离子源温度和去溶剂气温度分别为140℃和500℃；锥孔气和去溶剂气流量分别为70hr和450L·h-1；电离电压和电喷雾电压分别为3.5KV和5.5KV。对于化合物的定量采用两组离子对，并从中选择一组仪器响应较高的离子对用于定量目标抗生素。
实施例3：一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法
称取2g硅藻土，将其放入30mL的玻璃离心管中，加入20µL内标混合液（环丙沙星-D8、磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄氨嘧啶-13C3、去甲基金霉素，磺胺嘧啶-13C6）过夜。然后制备萃取剂，所述的萃取剂可以为体积比1:1的乙腈和EDTA-McIIvaine的混合液，萃取液30mL，涡旋，超声30min，萃取次数为3次，旋蒸温度40℃。
依次用10mL甲醇和10mL超纯水在重力作用下活化SAX和HLB小柱，将两小柱用改造好的连接头串联，水样过柱后，用10mL超纯水和10mL 5%的甲醇水溶液淋洗小柱，后将固相萃取小柱在真空下抽2h至干，再用6mL甲醇和6mL含5%的氨水甲醇洗脱（靠自然重力流下），而后在40℃水浴条件下用氮吹仪吹至近干，而后用1:9的甲醇水溶液定容至1ml，过 0.22um膜至进2mL的棕色样瓶中，待分析。
利用Waters UPLC-MS/MS高效液相串联质谱对样品进行测定，分析条件具体为：流动相A为0.3% 甲酸和0.1%甲酸铵溶液，B为1:1 乙腈:甲醇，按照梯度洗脱条件检测样品中的抗生素，梯度洗脱条件见表1。流速0.3mL·min-1；进样量为10μL；柱温40℃；自动进样盘温度为4℃。质谱模式为电喷雾正离子源（ESI+）；检测方式：多反应监测，MRM；雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；离子源温度和去溶剂气温度分别为140℃和500℃；锥孔气和去溶剂气流量分别为70hr和450L·h-1；电离电压和电喷雾电压分别为3.5KV和5.5KV。对于化合物的定量采用两组离子对，并从中选择一组仪器响应较高的离子对用于定量目标抗生素。
实施例4：一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法
称取2g硅藻土，将其放入30mL的玻璃离心管中，加入20μL内标混合液（环丙沙星-D8、磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄氨嘧啶-13C3、去甲基金霉素，磺胺嘧啶-13C6）过夜。然后制备萃取剂，所述的萃取剂可以为体积比1:1的乙腈和EDTA-McIIvaine的混合液，萃取液20mL，涡旋，超声15min，萃取次数为3次，旋蒸温度40℃。
依次用10mL甲醇和10mL超纯水在重力作用下活化SAX和HLB小柱，将两小柱用改造好的连接头串联，水样过柱后，用10mL超纯水和10mL 5%的甲醇水溶液淋洗小柱，后将固相萃取小柱在真空下抽2h至干，再用6mL甲醇和6mL含5%的氨水甲醇洗脱（靠自然重力流下），而后在40℃水浴条件下用氮吹仪吹至近干，而后用1:9的甲醇水溶液定容至1ml，过 0.22um膜至进2mL的棕色样瓶中，待分析。
利用Waters UPLC-MS/MS高效液相串联质谱对样品进行测定，分析条件具体为：流动相A为0.3% 甲酸和0.1%甲酸铵溶液，B为1:1 乙腈:甲醇，按照梯度洗脱条件检测样品中的抗生素，梯度洗脱条件见表1。流速0.3mL·min-1；进样量为10μL；柱温40℃；自动进样盘温度为4℃。质谱模式为电喷雾正离子源（ESI+）；检测方式：多反应监测，MRM；雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；离子源温度和去溶剂气温度分别为140℃和500℃；锥孔气和去溶剂气流量分别为70hr和450L·h-1；电离电压和电喷雾电压分别为3.5KV和5.5KV。对于化合物的定量采用两组离子对，并从中选择一组仪器响应较高的离子对用于定量目标抗生素。
实施例5：一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法
称取2g硅藻土，将其放入30mL的玻璃离心管中，加入20μL内标混合液（环丙沙星-D8、磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄氨嘧啶-13C3、去甲基金霉素，磺胺嘧啶-13C6）过夜。然后制备萃取剂，所述的萃取剂可以为体积比1:1的乙腈和柠檬酸缓冲溶液的混合液，萃取液30ml，涡旋，超声15min，萃取次数为3次，旋蒸温度40℃。
依次用10mL甲醇和10mL超纯水在重力作用下活化SAX和HLB小柱，将两小柱用改造好的连接头串联，水样过柱后，用10mL超纯水和10mL1-5%的甲醇水溶液淋洗小柱，后将固相萃取小柱在真空下抽2h至干，再用6mL甲醇和6mL含5%的氨水甲醇洗脱（靠自然重力流下），而后在40℃水浴条件下用氮吹仪吹至近干，而后用1:9的甲醇水溶液定容至1mL，过 0.22um膜至进2mL的棕色样瓶中，待分析。
利用Waters UPLC-MS/MS高效液相串联质谱对样品进行测定，分析条件具体为：流动相A为0.3% 甲酸和0.1%甲酸铵溶液，B为1:1 乙腈:甲醇，按照梯度洗脱条件检测样品中的抗生素，梯度洗脱条件见表1。流速0.3mL·min-1；进样量为10μL；柱温40℃；自动进样盘温度为4℃。质谱模式为电喷雾正离子源（ESI+）；检测方式：多反应监测，MRM；雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；离子源温度和去溶剂气温度分别为140℃和500℃；锥孔气和去溶剂气流量分别为70hr和450L·h-1；电离电压和电喷雾电压分别为3.5KV和5.5KV。对于化合物的定量采用两组离子对，并从中选择一组仪器响应较高的离子对用于定量目标抗生素。
实施例6：一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法
利用实验室已有泥沙样品，对泥沙样本进行冷冻干燥：将泥沙样本放入冰箱预冷冻，在将冻好后的样本置于冷冻干燥机中并覆盖遮光袋，冷冻干燥温度-50℃，将冷冻干燥好的沉积物样品研磨，过200目筛后待用。
称取步骤（1）制备的样品2g，将其放入30mL的玻璃离心管中，加入20μL内标混合液（环丙沙星-D8、磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄氨嘧啶-13C3、去甲基金霉素，磺胺嘧啶-13C6）过夜。然后制备萃取剂，所述的萃取剂可以为体积比1:1的乙腈和柠檬酸缓冲溶液的混合液，萃取液30ml，涡旋，超声15min，萃取次数为3次，旋蒸温度40℃。
依次用10mL甲醇和10mL超纯水在重力作用下活化SAX和HLB小柱，将两小柱用改造好的连接头串联，水样过柱后，用10mL超纯水和10mlL5%的甲醇水溶液淋洗小柱，后将固相萃取小柱在真空下抽2h至干，再用6mL甲醇和6mL含5%的氨水甲醇洗脱（靠自然重力流下），而后在40℃水浴条件下用氮吹仪吹至近干，而后用1:9的甲醇水溶液定容至1mL，过 0.22μL膜至进2ml的样瓶中，待分析。
利用Waters UPLC-MS/MS高效液相串联质谱对样品进行测定，分析条件具体为：流动相A为0.3% 甲酸和0.1%甲酸铵溶液，B为1:1 乙腈:甲醇，按照梯度洗脱条件检测样品中的抗生素，梯度洗脱条件见表1。流速0.3mL·min-1；进样量为10μL；柱温40℃；自动进样盘温度为4℃。质谱模式为电喷雾正离子源（ESI+）；检测方式：多反应监测，MRM；雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；离子源温度和去溶剂气温度分别为140℃和500℃；锥孔气和去溶剂气流量分别为70hr和450L·h-1；电离电压和电喷雾电压分别为3.5KV和5.5KV。对于化合物的定量采用两组离子对，并从中选择一组仪器响应较高的离子对用于定量目标抗生素。
实施例7：一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法
采集沉积物样品，对沉积物样本进行冷冻干燥：将沉积物本放入冰箱预冷冻，在将冻好后的样本置于冷冻干燥机中并覆盖遮光袋，冷冻干燥温度-50℃，将冷冻干燥好的沉积物样品研磨，过200目筛后待用。
称取步骤（1）制备的样品2g，将其放入30mL的玻璃离心管中，加入20μL内标混合液（环丙沙星-D8、磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄氨嘧啶-13C3、去甲基金霉素，磺胺嘧啶-13C6）过夜。然后制备萃取剂，所述的萃取剂可以为体积比1:1的乙腈和柠檬酸缓冲溶液的混合液，萃取液30ml，涡旋，超声15min，萃取次数为3次，旋蒸温度40℃。
依次用10mL甲醇和10mL超纯水在重力作用下活化SAX和HLB小柱，将两小柱用改造好的连接头串联，水样过柱后，用10mL超纯水和10mL5%的甲醇水溶液淋洗小柱，后将固相萃取小柱在真空下抽2h至干，再用6mL甲醇和6mL含5%的氨水甲醇洗脱（靠自然重力流下），而后在40℃水浴条件下用氮吹仪吹至近干，而后用1:9的甲醇水溶液定容至1ml，过 0.22um膜至进2mL的棕色样瓶中，待分析。
利用Waters UPLC-MS/MS高效液相串联质谱对样品进行测定，分析条件具体为：流动相A为0.3% 甲酸和0.1%甲酸铵溶液，B为1:1 乙腈:甲醇，按照梯度洗脱条件检测样品中的抗生素，梯度洗脱条件见表1。流速0.3mL·min-1；进样量为10μL；柱温40℃；自动进样盘温度为4℃。质谱模式为电喷雾正离子源（ESI+）；检测方式：多反应监测，MRM；雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；离子源温度和去溶剂气温度分别为140℃和500℃；锥孔气和去溶剂气流量分别为70hr和450L·h-1；电离电压和电喷雾电压分别为3.5KV和5.5KV。对于化合物的定量采用两组离子对，并从中选择一组仪器响应较高的离子对用于定量目标抗生素。
以上五组实例例中的优化参数如下表所示：
| 萃取液 | 超声时间 | 萃取柱 | 样本 | |
| 实验组S1 | 15mL EDTA-McIIvaine+15mL 乙腈 | 15min | SAX+HLB | 硅藻土 |
| 实验组S2 | 15mL EDTA-McIIvaine+15mL 乙腈 | 15min | HLB | 硅藻土 |
| 实验组S3 | 15mL EDTA-McIIvaine+15mL 乙腈 | 30min | SAX+HLB | 硅藻土 |
| 实验组S4 | 10mL EDTA-McIIvaine+10mL 乙腈 | 15min | SAX+HLB | 硅藻土 |
| 实验组S5 | 15mL 柠檬酸缓冲溶液+15mL 乙腈 | 15min | SAX+HLB | 硅藻土 |
| 实验组S6 | 15mL EDTA-McIIvaine+15mL 乙腈 | 15min | SAX+HLB | 泥沙土 |
| 实验组S7 | 15mL EDTA-McIIvaine+15mL 乙腈 | 15min | SAX+HLB | 沉积物 |
针对每组实验组增加一个未加标的空白样本，加标的样品与没加标对应水样一同上机测样，计算回收率，公式如下：
R：回收率，%
M1：空白样本的检出含量，ng
M2：加标样本的检出含量，ng
M=C×V, C为检测出浓度ng/mL，V=1mL
表1为不同超声萃取参数条件下土样中12种抗生素的回收率对比，2表2可知，回收率的方法为实验S1，也就是本发明最终选定的方法。通过对比实验S1和S4可知，萃取液的体积对磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、氧氟沙星和土霉素的影响较大，对其余抗生素的影响较小；对比实验S1和S3可知，超声时间对抗生素的回收率影响较大的，较长的超声时间不利于抗生素的提取；对比实验S1和S5可知，不同的缓冲液对抗生素的回收率影响较大的，EDTA-McIlvaine缓冲液的效果较好；对比实验S1和S5可知，增加SAX柱，可以提高抗生素的回收率。
本实验首先通过硅藻土确定最优的试验方法S1，并应用于泥沙土和沉积物中，得到较好的效果，实验的门槛低，方法简单，耗时相对较短，总体上说回收率较好，可大规模应用。
实施例8：一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法
一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：将沉积物或泥沙土冷冻干燥，然后粉碎过200目筛得到样品；
第二步：将第一步得到的样品和内标液置于一离心管内；
第三步：向第二步的离心管内加入萃取剂，超声处理30分钟后离心取上清液，重复三次；
第四步：将第三步得到的上清液蒸发至体积不再变化，然后用超纯水复溶到300mL，再调节pH值至3得到水样；
第五步：用甲醇和超纯水在自然重力下活化两种小柱，该两种小柱中各保持一段超纯水柱后串联得到固相萃取柱，第四步得到的水样过固相萃取柱后，依次用超纯水和体积百分比浓度为5%的甲醇水溶液淋洗所述固相萃取柱，然后将固相萃取小柱在真空下抽干，再依次用甲醇和氨水甲醇洗脱，最后在40℃水浴条件下用氮吹仪吹扫，再用体积比为1:9的甲醇水溶液定容至1mL，过 0.22µm膜至进2mL棕色样瓶中得到待测样本。
优选的实施方式为：所述内标液含有环丙沙星-D8、磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄氨嘧啶-13C3、去甲基金霉素和磺胺嘧啶。
优选的实施方式为：所述萃取溶剂为乙腈与EDTA-McIIvaine或柠檬酸缓冲液构成的混合液。
优选的实施方式为：将沉积物或泥沙土放入冰箱中预冻，而后置于冷冻干燥机的托盘中，冷冻干燥温度为-50℃。
优选的实施方式为：第三步中，萃取剂的体积为30mL，重复次数为3次。
优选的实施方式为：第四步中，蒸发的温度条件为40℃，调节pH值至3。
优选的实施方式为：所述氨水甲醇中的氨水与甲醇两者之间的体积比为5：95。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (7)
1.一种超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：将沉积物或泥沙土冷冻干燥，然后粉碎过200目筛得到样品；
第二步：将第一步得到的样品和内标液置于一离心管内；
第三步：向第二步的离心管内加入萃取剂，超声处理15~30分钟后离心取上清液，重复至少两次；
第四步：将第三步得到的上清液蒸发至体积不再变化，然后用超纯水复溶到300mL，再调节pH值至2~9得到水样；
第五步：用甲醇和超纯水在自然重力下活化两种小柱，该两种小柱中各保持一段超纯水柱后串联得到固相萃取柱，第四步得到的水样过固相萃取柱后，依次用超纯水和体积百分比浓度为1~5%的甲醇水溶液淋洗所述固相萃取柱，然后将固相萃取小柱在真空下抽干，再依次用甲醇和氨水甲醇洗脱，最后在40℃水浴条件下用氮吹仪吹扫，再用体积比为1:9的甲醇水溶液定容至1mL，过 0.22µm膜至进2mL棕色样瓶中得到待测样本。
2.根据权利要求1所述的超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法，其特征在于：所述内标液含有环丙沙星-D8、磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄氨嘧啶-13C3、去甲基金霉素和磺胺嘧啶-13C6中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法，其特征在于：所述萃取溶剂为乙腈与EDTA-McIIvaine或柠檬酸缓冲液构成的混合液。
4.根据权利要求1所述的超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法，其特征在于：将沉积物或泥沙土放入冰箱中预冻，而后置于冷冻干燥机的托盘中，冷冻干燥温度为-50℃。
5.根据权利要求1所述的超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法，其特征在于：第三步中，萃取剂的体积为30mL，重复次数为3次。
6.根据权利要求1所述的超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法，其特征在于：第四步中，蒸发的温度条件为40℃，调节pH值至3。
7.根据权利要求1所述的超声萃取沉积物中多种抗生素的前处理方法，其特征在于：所述氨水甲醇中的氨水与甲醇两者之间的体积比为5：95。
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