CN107668036A - 含瑞香素的烟草青枯病控制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物病害防治技术领域，尤其涉及含瑞香素的烟草青枯病控制剂及其制备方法与应用，控制剂包括瑞香素和亲水性骨架材料，瑞香素与亲水性骨架材料的质量比为1:3，制备方法是称取瑞香素和亲水性骨架材料加入乙醇溶液中搅拌，加热至40～55℃，搅拌至完全溶解，用0.25μm的微滤膜过滤得到的滤液经喷雾干燥后，得到烟草青枯病控制剂，将控制剂溶于5wt％二甲基亚砜水溶液中，得到控制剂溶液，用控制剂溶液对烟草植株进行灌根处理。本发明的控制剂为烟草青枯病防治提供了一种新途径，对青枯菌具有高效的抑菌作用，具有来源广、易降解、对环境安全、友好等特点，不易使烟草青枯病产生抗药性及避免了农残超标等问题。

Description

含瑞香素的烟草青枯病控制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及植物病害防治技术领域，尤其涉及含瑞香素的烟草青枯病控制剂及其制备方法与应用。
背景技术
烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌土传病害，在我国烟草上俗称为“烟瘟”、“半边疯”，是烟草生产上最具毁灭性的细菌病害。1864年在印度尼西亚首次报道了青枯菌对烟草的毁灭性危害。目前，烟草青枯病在世界范围内分布广泛，危害严重，并逐渐向高海拔、冷凉烟区蔓延，严重制约了我国烟叶的可持续发展，造成了严重的经济损失。
目前针对烟草青枯病的防治措施主要包括化学防治、生物防治、农业防治和抗病品种选育。其中在化学防治方面，烟草青枯病并无特效的杀菌药剂，田间防治效果差；其次在生物防治方面，主要集中在筛选拮抗菌剂和植物内生菌，微生物菌剂在室内效果较好，但田间效果比较差；在农业防治方面，采用高畦栽培和减少田间人为活动等方法能有效延缓烟草青枯病发生，但在含菌量高的地块难以达到理想的防治效果；我国在烟草青枯病抗病品种选育上投入巨大，但由于青枯病菌具有寄主多样性和基因组变异性等特点，常常导致耐病品种的抗性丧失，也有研究发现了烟草青枯病的抗病品种，但仅局限在某一个生态区有效，难以全国大面积推广。我国青枯病菌的致病力分化、发病条件日趋多样化，同时在我国青枯病发生区域存在许多不同的生理小种，加大了烟草青枯病防治难度。因此，急需一种能有效防治烟草青枯病，同时对环境友好的药剂。
近年来，针对烟草青枯病，筛选有效的植物源化合物愈发重要，有研究表明黄皮新肉桂酰胺B对青枯菌抑菌效果明显，MIC(最小抑菌浓度)为125mg/L，接菌后21d的防治效果分别达到了86.38％，是农用链霉素的40倍，有可能成为一种防治青枯病的新型药剂。也有研究发现没食子酸甲酯对青枯菌具有很好的抑菌活性，使用扫描电镜观察表明没食子酸甲酯对菌株的细胞膜有严重的损伤，抑制了菌株蛋白质的合成和琥珀酸盐脱氢酶(SDH)的活性等。植物源化合物在发挥抑菌效果的基础上，还可能存在抑制青枯菌的致病因子的功能。香豆素类化合物作为一大类植物次生代谢物，具有很多生物活性，在医学上应用于抗菌研究较多，在农业病害防治方面，蛇床子素作为一种香豆素类衍生物，已经发展成为一种生物农药，主要用于作物真菌病害的防治。因此，筛选一种能够抑制青枯菌生长的植物源化合物，具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供含瑞香素的烟草青枯病控制剂及其制备方法与应用，该控制剂来源广、易降解，能够有效防治烟草青枯病，有效避免农药残留超标问题。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
含瑞香素的烟草青枯病控制剂，所述控制剂包括瑞香素和亲水性骨架材料，所述瑞香素与亲水性骨架材料的质量比为1:3。
瑞香素作为一种天然活性化合物，对青枯菌具有高效的抑菌作用，具有来源广、易降解、对环境安全、友好等特点，不易使烟草青枯病产生抗药性及避免了农残超标等问题。
进一步，所述亲水性骨架材料是羟丙基-β-环糊精与改性碳纳米管结合的复合材料。
其中的改性碳纳米管是经硫酸溶液/高锰酸钾/过氧化氢对多壁碳纳米管进行超声波羧基化改性制得。通过硫酸溶液/高锰酸钾/过氧化氢，并在超声波辅助的作用下在碳纳米管上引入了如羧基、羟基等含氧官能团，提高了碳纳米管的分散性能，避免发生团聚现象；且硫酸溶液/高锰酸钾/过氧化氢氧化体系对碳纳米管的破坏程度较小，碳纳米管未出现明显的缩短。
将上述改性碳纳米管与羟丙基-β-环糊精复合，作为瑞香素的亲水性骨架材料，既能对瑞香素起到稳定作用，又能对瑞香素起到很好的分散作用，提高瑞香素的生物利用率。
进一步，所述制备方法采用如下步骤：称取瑞香素和亲水性骨架材料加入乙醇溶液中搅拌，加热至40～55℃，搅拌至完全溶解，用0.25μm的微滤膜过滤得到滤液，滤液经喷雾干燥后，即得到烟草青枯病控制剂。
进一步，所述乙醇溶液的质量浓度为15％～40％。
进一步，所述控制剂防治烟草青枯病中控制瑞香素的浓度为10～100mg/L。
进一步，所述控制剂防治烟草青枯病中控制瑞香素的浓度为50mg/L或100mg/L。瑞香素在50mg/L和100mg/L浓度下能够完全抑制青枯菌的生长。
进一步，所述应用方法是将控制剂溶于5wt％二甲基亚砜水溶液中，得到控制剂溶液，用控制剂溶液对烟草植株进行灌根处理。
本发明的有益效果：本发明公开了含瑞香素的烟草青枯病控制剂及其制备方法与应用，以亲水性骨架材料为载体，负载瑞香素得到烟草青枯病控制剂，为烟草青枯病防治提供一种新途径，瑞香素在低浓度处理下、短时间内对青枯菌具有高效的抑菌作用，在50mg/L和100mg/L浓度下能够完全抑制青枯菌的生长；盆栽试验表明，利用含瑞香素的烟草青枯病控制剂进行灌根处理，能够有效延缓烟草青枯病发生，烟草青枯病的发病率和病情指数明显低于对照组，50mg/L灌根处理效果最佳，发病后7d和14d的防治效果分别达到76.68％和53.07％。
附图说明
图1是本发明瑞香素对烟草青枯雷尔氏菌生长曲线的影响图；
图2是本发明烟草青枯雷尔氏菌在含有瑞香素的NA培养基上的生长情况图；
图3是本发明瑞香素对烟草青枯雷尔氏菌细胞结构影响的透射电镜扫描图；
图4是本发明瑞香素对烟草青枯病的病情指数的影响图。
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明：
本发明的含瑞香素的烟草青枯病控制剂包括质量比为1:3的瑞香素和亲水性骨架材料，其中的亲水性骨架材料是羟丙基-β-环糊精与改性碳纳米管结合的复合材料，改性碳纳米管是经硫酸溶液/高锰酸钾/过氧化氢对多壁碳纳米管进行超声波羧基化改性制得。
改性碳纳米管的制备如下：取0.5g多壁碳纳米管、0.5g硝酸钠和68wt％的硫酸溶液350mL于0～2℃的冰水混合浴中，超声波分散均匀，随后加入1g高锰酸钾，升温至40℃继续超声波2.5h后，缓慢升温至65℃，再滴入80mL双氧水溶液，回流反应1h，随后冷却至室温，抽滤得到的滤饼用去离子水洗涤至中性，真空干燥后，加入5mL乙醇充分研磨后再干燥便得到羧基化碳纳米管。
亲水性骨架材料是将羟丙基-β-环糊精与改性碳纳米管复合的材料，亲水性骨架材料的制备如下：取100mg改性碳纳米管、50mL亚硫酰氯和4mL N,N-二甲基甲酰胺混合，并于常温下超声波分散25min，加热至85℃搅拌反应20h，随后真空浓缩以便除去未反应的亚硫酰氯，加入2g羟丙基-β-环糊精、0.8mL三乙胺和18mLN,N-二甲基甲酰胺于85℃下搅拌反应72h后，去离子水离心分离，真空干燥便得到由羟丙基-β-环糊精与改性碳纳米管复合的亲水性骨架材料。
本发明的含瑞香素的烟草青枯病控制剂的制备方法如下：称取瑞香素和亲水性骨架材料加入质量浓度为15％～40％的乙醇溶液中搅拌，并加热至40～55℃，搅拌至完全溶解后，用0.25μm的微滤膜过滤得到滤液，滤液经喷雾干燥后，即得到烟草青枯病控制剂。
本发明的含瑞香素的烟草青枯病控制剂的应用是将烟草青枯病控制剂溶于5wt％二甲基亚砜水溶液中，配制得到瑞香素的浓度为10～100mg/L的控制剂溶液，用控制剂溶液对烟草植株进行灌根处理。
本发明中以下实施例中使用的烟草青枯雷尔氏菌，是由西南大学天然产物农药研究室在重庆市彭水县润溪乡发病烟株上分离得到，其菌株编号为CQPS-1。
实施例一
本实施例研究了瑞香素对烟草青枯雷尔氏菌的抑菌活性，具体如下：
将含瑞香素的烟草青枯病控制剂溶解于5wt％二甲基亚砜水溶液中，配制成瑞香素浓度为10mg/mL的药剂母液；在灭菌三角瓶中加入25mL金氏B培养基，然后依次加入25μL、62.5μL、125μL、187.5μL、250μL药剂母液，配制成瑞香素浓度为10mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L的含药培养基，以不含有瑞香素的B培养基为对照组，随后加入50μL过夜培养的OD600＝1.0的青枯菌悬浮液，然后放在30℃、180r/min摇床中振荡培养，从4h开始，每隔2h测定样品在600nm处的紫外线吸收值，即OD600nm。结合OD值和对应的时间绘制细菌生长曲线，结果如图1所示。
由图1可知，瑞香素对烟草青枯雷尔氏菌的生长具有明显的抑制作用，能够延缓青枯菌生长进入对数期，同时在75mg/L、100mg/L浓度处理完全抑制了青枯菌的生长。
向高温灭菌后的NA培养基中加入含瑞香素的烟草青枯病控制剂，配成25mg/L、50mg/L、100mg/L含药培养基，并设置不含有瑞香素的NA培养基为对照组，随后加入50μl过夜培养的OD600＝1.0的青枯菌悬浮液，放在30℃恒温培养箱培养48h，观察菌落生长情况，结果如图2所示。
由图2可知，瑞香素50mg/L和100mg/L完全抑制了烟草青枯菌的生长，说明瑞香素对烟草青枯菌具有明显的抑菌活性。
实施例二
本实施例研究了瑞香素对烟草青枯雷尔氏菌细胞结构的影响，具体如下：
将OD600＝1.0的青枯菌悬浮液与含瑞香素的烟草青枯病控制剂混匀，控制瑞香素浓度为25mg/L，在30℃孵育10～12h，并于6000rmp离心处理，得到的菌饼重新悬浮于1mL灭菌去离子水中，洗涤3次，然后用丙二醛固定过夜，离心收集菌体，再用无菌水制成菌悬液，并调整菌液浓度为108CFU/mL，得到最终菌悬液。取等量的最终菌悬液与等量的质量浓度为2％的锇酸水溶液混合染色，制成混合菌染色液，用无菌毛细吸管吸取混合菌悬液在铜网膜上，经过1min后，放置在透射电子显微镜下观察，结果如图3所示。
由图3可知，瑞香素通过破坏烟草青枯雷尔氏菌的细胞膜结构，造成细胞结构损伤，细胞质外泄，最后导致青枯菌的死亡，达到较好的抑菌活性。
实施例三
本实施例利用盆栽试验研究了瑞香素对烟草青枯病的控制效果，具体如下：
盆栽试验所用烟苗统一采用烟草漂浮育苗专用基质，在昼夜温度为26/20℃，相对湿度60％，昼夜光照时间为14h/10h的温室条件下培育。烟草品种选择感病品种云烟87，选择3-4叶龄的烟苗，分成五组，每组16株烟苗。取含瑞香素的烟草青枯病控制剂溶于5wt％二甲基亚砜水溶液中，配制得到瑞香素浓度为25mg/L、50mg/L和100mg/L的控制剂溶液。对其中三组烟草采用瑞香素浓度为25mg/L、50mg/L和100mg/L的控制剂溶液分别进行灌根处理，对其中另外两组一组采用噻菌铜进行灌根处理，另一组采用5wt％二甲基亚砜水溶液进行灌根处理，每组每株灌根15mL，并在灌根后24h，采用无伤根的方式进行青枯雷尔氏菌接种，接种青枯菌悬浮液浓度为1×108cfu/mL，并放置在温度为28℃，湿度为80％的温室内培养，至少重复3次，结果如图4所示。
由图4可知，瑞香素延缓了青枯病的发生、危害，烟草青枯病的发病率和病情指数明显低于对照，50mg/L灌根处理效果最佳，发病后7d和14d的防治效果分别达到76.68％和53.07％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (7)

1.含瑞香素的烟草青枯病控制剂，其特征在于，所述控制剂包括瑞香素和亲水性骨架材料，所述瑞香素与亲水性骨架材料的质量比为1:3。
2.根据权利要求1所述的含瑞香素的烟草青枯病控制剂，其特征在于，所述亲水性骨架材料是羟丙基-β-环糊精与改性碳纳米管结合的复合材料。
3.根据权利要求1或2所述的含瑞香素的烟草青枯病控制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法采用如下步骤：称取瑞香素和亲水性骨架材料加入乙醇溶液中搅拌，加热至40～55℃，搅拌至完全溶解，用0.25μm的微滤膜过滤得到滤液，滤液经喷雾干燥后，即得到烟草青枯病控制剂。
4.根据权利要求3所述的含瑞香素的烟草青枯病控制剂的制备方法，其特征在于，所述乙醇溶液的质量浓度为15％～40％。
5.根据权利要求1或2所述的含瑞香素的烟草青枯病控制剂的应用，其特征在于，所述控制剂防治烟草青枯病中控制瑞香素的浓度为10～100mg/L。
6.根据权利要求5所述的含瑞香素的烟草青枯病控制剂的应用，其特征在于，所述控制剂防治烟草青枯病中控制瑞香素的浓度为50mg/L或100mg/L。
7.根据权利要求6所述的含瑞香素的烟草青枯病控制剂的应用，其特征在于，所述应用方法是将控制剂溶于5wt％二甲基亚砜水溶液中，得到控制剂溶液，用控制剂溶液对烟草植株进行灌根处理。
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李三清等: ""羟丙基-β-环糊精-多壁碳纳米管复合材料与扁桃酸的吸附作用"", 《科技导报》 *
梁绍磊等: ""改性 Ｈｕｍｍｅｒ法制备高羧基化多壁碳纳米管及其性能研究"", 《功能材料》 *
罗倩茜等: ""植物源药剂及化学药剂联合施用单一防治烤烟青枯病的效果及对烟叶产值的影响"", 《农学学报》 *

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